РЕГЕНЕРАЦИЯ ПОВРЕЖДЕННОЙ ТКАНИ Российский патент 2019 года по МПК A61K38/39 A61P41/00 

Область изобретения

Изобретение относится к заживлению раны, в частности, к усовершенствованию реэпителизации ран.

Предпосылки изобретения

Упоминание любого предшествующего уровня техники в описании не является и не должно приниматься в качестве признания или любой другой формы предположения, что этот предшествующий уровень техники формирует часть общепринятых знаний в Австралии или любой другой юрисдикции, или что этот предшествующий уровень техники, как можно было ожидать, устанавливается, понимается и рассматривается как соответствующий специалистом в данной области техники.

Кожа состоит из двух слоев, эпидермиса и дермы, причем последняя соединяется с содержащей жиры подстилающей структурой, подкожной гиподермой. Эпидермис является самым тонким и находящимся снаружи компонентом кожи, состоящим главным образом из клеток кератиноцитов. Дерма представляет собой плотную соединительную ткань, состоящую из коллагена, эластиновых волокон и межфибриллярного геля из гликозаминогликанов, солей и воды.

Эпидермис и дерма сцеплены выступающими книзу эпидермальными гребнями и выступающими кверху сосочками дермы. Они разделены базальной мембраной, высокоспециализированной формой внеклеточного матрикса (ЕСМ), состоящего из гликопротеинов и протеогликанов.

Дерма состоит из двух структурно различных слоев: поверхностного тонкого сосочкового слоя дермы и более глубокого сетчатого слоя дермы. Сосочковый слой дермы состоит из соединительной ткани, содержащей тонкие эластиновые волокна, и имеет форму небольших пальцевидных выростов, известных как сосочки дермы, которые, как обсуждалось ранее, соединяют дерму с эпидермисом. Сетчатый слой дермы включает плотную, нерегулярную соединительную ткань, содержащую пучки коллагена, переплетенные в сетчатую структуру, и толстые, горизонтально выровненные эластиновые волокна.

Заживление раны представляет собой сложный процесс, в котором ткань репарирует или регенерирует сама себя после повреждения. Некоторые ткани способны к регенерации, но могут иметь тенденцию к механизмам репарации с участием фиброза, если соответствующие условия не обеспечены. Кожа является одним из примеров. Другие ткани не способны к регенерации и могут подвергаться только механизмам репарации, ведущим к фиброзу и формированию рубца.

Классическую модель заживления раны можно разделить на три или четыре последовательные, даже перекрывающиеся, фазы: (1) гемостаз, (2) воспалительная, (3) пролиферативная и (4) ремоделирование. Пролиферативная фаза характеризуется ангиогенезом, отложением коллагена, формированием грануляционной ткани и реэпителизацией.

Ангиогенез происходит в то же самое время, что и пролиферация фибробластов. Ангиогенез является крайне необходимым для других этапов заживления раны, поскольку активность фибробластов и эпителиальных клеток требует кислорода и питательных веществ. Согласно настоящему способу стволовые клетки эндотелиальных клеток и других сосудистых клеток, происходящие из кровотока и частей неповрежденных кровеносных сосудов, развивают псевдоподии и проталкиваются через ЕСМ в раневой участок для создания новых кровеносных сосудов. Эндотелиальные клетки привлекаются в раневую область фибронектином, находящимся на фибриновой корке, и хемотактически с помощью ангиогенных факторов, высвобождаемых другими клетками, например макрофагами и тромбоцитами, в среде с низким содержанием кислорода. Чтобы мигрировать, эндотелиальные клетки нуждаются в коллагеназах и активаторе плазминогена, чтобы разрушить сгусток и часть ЕСМ. Цинк-зависимые металлопротеиназы расщепляют базальную мембрану и ЕСМ, чтобы обеспечить миграцию клеток, пролиферацию и ангиогенез. Когда ткань в достаточной мере перфузируется, миграция и пролиферация эндотелиальных клеток снижена. В конечном итоге кровеносные сосуды, в которых больше нет необходимости, погибают путем апоптоза.

Важной является выработка и отложение коллагена, поскольку это повышает прочность раны, обеспечивая большую устойчивость к воздействию, чем фибрин-фибронектиновый сгусток. Кроме того, клетки, участвующие в воспалении, ангиогенезе и построении соединительной ткани, прикрепляются к, растут и дифференцируются на коллагеновом матриксе, заложенном фибробластами. Коллаген III типа и фибронектин, как правило, начинают вырабатываться в значительных количествах где-то между приблизительно 10 часами и 3 днями в зависимости, главным образом, от размера раны. Их максимумы отложения от одной до трех недель. Они являются преобладающими эластичными веществами до поздней фазы созревания, в которой их замещает более прочный коллаген I типа. Даже если фибробласты вырабатывают новый коллаген, коллагеназы и другие факторы разрушают его. Вскоре после ранения синтез преобладает над распадом, так что уровень коллагена в ране растет, но позднее выработка и распад становятся равными, так что чистый прирост коллагена отсутствует. Этот гомеостаз сигнализирует о начале поздней стадии созревания. В первые два или три дня после повреждения фибробласты в основном мигрируют и пролиферируют, а позже, как описано выше, они являются основными клетками, которые закладывают коллагеновую матрицу в раневом участке. Считается, что эти фибробласты происходят из соседней неповрежденной кожной ткани. Первоначально фибробласты используют перекрестно сшивающиеся фибриновые волокна, которые образуются в конце фазы воспаления, чтобы мигрировать через рану, в дальнейшем прилипая к фибронектину. Затем фибробласты откладывают основное вещество в раневое ложе и позднее коллаген, к которому они могут прилипать для миграции, тем самым создавая основу для формирования грануляционной ткани. Грануляционная ткань функционирует в качестве зачаточной ткани и начинает появляться в ране уже во время фазы воспаления, от двух до пяти дней после ранения, и продолжает расти до тех пор, пока не покроет раневое ложе. Грануляционная ткань состоит из новых кровеносных сосудов, фибробластов, воспалительных клеток, эндотелиальных клеток, миофибробластов и компонентов нового, предварительного внеклеточного матрикса (ЕСМ). Предварительный ЕСМ отличается по составу от ЕСМ в нормальной ткани и его компоненты происходят из фибробластов. Такие компоненты включают фибронектин, коллаген, гликозаминогликаны, эластин, гликопротеины и протеогликаны. Его основными компонентами являются фибронектин и гиалуроновая кислота, которые создают очень гидратированный матрикс и облегчают миграцию клеток. Позднее этот предварительный матрикс заменяется на ЕСМ, который более близко напоминает находящийся в неповрежденной ткани. В конце фазы грануляции фибробласты подвергаются апоптозу, превращая грануляционную ткань из среды, богатой клетками, в среду, которая в основном состоит из коллагена.

Формирование грануляционной ткани в открытой ране делает возможным прохождение фазы реэпителизации, поскольку эпителиальные клетки мигрируют сквозь новую ткань с образованием барьера между раной и окружающей средой. Базальные кератиноциты с краев раны и кожные придатки, такие как волосяные фолликулы, потовые железы и жировые (сальные) железы, являются основными клетками, ответственными за фазу эпителизации при заживлении раны. Они продвигаются в слое по всему раневому участку и пролиферируют на его краях, прекращая движение, когда встречаются в середине.

Кератиноциты мигрируют без первоначальной пролиферации. Миграция может начаться уже в течение нескольких часов после ранения. Однако эпителиальным клеткам требуется жизнеспособная ткань, чтобы мигрировать сквозь нее, так что если рана глубокая, она должна быть сначала заполнена грануляционной тканью. Таким образом, время начала миграции варьирует и может иметь место приблизительно через день после ранения. Клетки на границах раны пролиферируют на второй и третий день после ранения, чтобы обеспечить больше клеток для миграции.

Если базальная мембрана не нарушена, эпителиальные клетки заменяются в течение трех дней путем деления и миграции клеток вверх в базальный слой таким же образом, который имеет место в неповрежденной коже. Однако если базальная мембрана в раневом участке разрушена, реэпителизация должна происходить с границ раны и из кожных придатков, таких как волосяные фолликулы, потовые и сальные железы, которые проникают в дерму, выстланную жизнеспособными кератиноцитами. Если рана очень глубокая, кожные придатки также могут быть разрушены и миграция может происходить только от краев раны.

Миграция кератиноцитов по раневому участку стимулируется отсутствием контактного ингибирования и химическими веществами, такими как оксид азота. Прежде чем они начинают мигрировать, клетки должны растворить свои десмосомы и гемидесмосомы, которые обычно прикрепляют клетки с помощью промежуточных филаментов цитоскелета к другим клеткам и к ЕСМ. Трансмембранные рецепторные белки, называемые интегринами, которые составлены из гликопротеинов и обычно прикрепляют клетку к базальной мембране с помощью ее цитоскелета, высвобождаются из промежуточных филаментов клетки и перемещаются в актиновые филаменты, чтобы служить в качестве средства крепления к ЕСМ для псевдоподий во время миграции. Таким образом кератиноциты отсоединяются от базальной мембраны и способны проникать в раневое ложе.

Прежде чем начать мигрировать, кератиноциты изменяют форму, становясь более длинными и плоскими, вытягивая клеточные отростки наподобие ламеллиподий и широкие отростки, которые выглядят как оборки. Актиновые филаменты и форма псевдоподий. Во время миграции интегрины на псевдоподии прикрепляются к ЕСМ, и актиновые филаменты в выступе тянут клетку вдоль. Взаимодействие с молекулами в ЕСМ через интегрины дополнительно способствует образованию актиновых филаментов, ламеллиподий и филоподий.

Эпителиальные клетки взбираются одна по другой для того, чтобы мигрировать. Этот растущий слой эпителиальных клеток часто называют эпителиальным языком. Первые клетки, которые прикрепляются к базальной мембране, образуют базальный слой. Эти базальные клетки продолжают мигрировать по всему раневому ложу, и эпителиальные клетки над ними также скользят вместе. Чем быстрее происходит эта миграция, тем меньшим будет рубец.

Фибрин, коллаген и фибронектин в ЕСМ могут дополнительно сигнализировать клеткам о делении и миграции. Подобно фибробластам, мигрирующие кератиноциты для переползания используют фибронектин, перекрестно сшитый с фибрином, который был отложен при воспалении, в качестве места прикрепления.

По мере того, как кератиноциты мигрируют, они перемещаются по грануляционной ткани, но ниже корки (если она была образована), отделяя ее от подстилающей ткани. Эпителиальные клетки способны к фагоцитозу дебриса, такого как мертвая ткань и бактериальное вещество, который мог бы загромождать их путь. Поскольку они должны растворять любую корку, которая образуется, миграция кератиноцитов лучшим образом усиливается во влажной среде, поскольку сухая ведет к образованию более крупной и жесткой корки. Для того, чтобы пройти по ткани, кератиноциты должны растворить сгусток, дебрис и части ЕСМ, чтобы пройти насквозь. Они секретируют активатор плазминогена, который активирует плазминоген, превращая его в плазмин, для растворения корки. Клетки могут мигрировать только по живой ткани, поэтому они должны экскретировать коллагеназы и протеазы, такие как матричные металлопротеиназы (ММР), чтобы растворить поврежденные части ЕСМ на их пути, в частности, впереди мигрирующего слоя. Кератиноциты также ремоделируют базальную мембрану посредством протеолитического распада, используя вместо этого новый ЕСМ, заложенный фибробластами, чтобы переползать.

По мере того, как кератиноциты продолжают мигрировать, новые эпителиальные клетки должны образовываться на краях раны, чтобы заменить их и обеспечить больше клеток для продвигающегося слоя. Пролиферация вслед за миграцией кератиноцитов обычно начинается через несколько дней после ранения и происходит со скоростью, которая в 17 раз выше на этой стадии эпителизации, чем в нормальных тканях. До тех пор, пока вся область раны не покрыта заново, только пролиферирующие эпителиальные клетки находятся на краях раны.

Факторы роста, стимулированные интегринами и ММР, вызывают пролиферацию клеток на краях раны. Кератиноциты также сами продуцируют и секретируют факторы, в том числе факторы роста и белки базальной мембраны, которые помогают как в эпителизации, так и в других фазах заживления. Факторы роста также важны для врожденной иммунной защиты кожных ран путем стимуляции продукции противомикробных пептидов и хемотаксических цитокинов нейтрофилов в кератиноцитах.

Кератиноциты продолжают мигрировать по всему раневому ложу до тех пор, пока клетки с обеих сторон не встретятся по середине, и в этот момент контактное торможение вызывает остановку их миграции. Когда кератиноциты заканчивают мигрировать, они секретируют белки, которые формируют новую базальную мембрану. Клетки отменяют морфологические изменения, которые они претерпели для инициации миграции; они восстанавливают десмосомы и гемидесмосомы и снова прикрепляются к базальной мембране. Базальные клетки начинают делиться и дифференцироваться таким же образом, как это происходит в нормальной коже, чтобы восстановить слои, находящиеся в реэпителизированной коже.

Заживление раны и, в частности, регенерация тканей находится под влиянием целого ряда факторов и условий. Когда эти факторы или условия не доступны, результатом может быть репарация тканей и фиброз вместо регенерации, хроническое воспаление и/или образование язв. Примеры соответствующих факторов включают местные факторы, такие как тип, размер и расположение раны, и системные факторы, такие как достаточность кровоснабжения, наличие инфекции, движение и метаболический статус. Hashimoto et al. 2004, Biomaterials 25: 1407-1414 обсуждают применение гибридных пептидов при реэпителизации раны. Примечательно, исследование показало, что полученный из эластина пептид VGVAPG не продемонстрировал увеличение реэпителизации или объема регенерированной ткани по сравнению с отрицательным контролем. Исследование показывает преимущество полученных из ламинина пептидов для заживления раны в контексте как реэпителизации ран, так и формирования грануляционной ткани, эффективной для поддержания реэпителизации.

Остается потребность в усовершенствовании или альтернативных подходах к заживлению ран, особенно кожных ран или ран кожной ткани.

В частности, существует необходимость усовершенствования реэпителизации ран.

Существует также необходимость ускорения процесса заживления раны, например, путем улучшения или ускорения темпов прогрессирования процессов, лежащих в основе заживления раны, и в частности, реэпителизации и тому подобного.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение направлено на решение одной или нескольких из указанных выше потребностей, или на обеспечение усовершенствования заживления раны и в одном варианте осуществления предлагает способ заживления раны, включающий:

- предоставление индивидуума, имеющего рану, при этом рана включает в себя множество эпидермальных клеток, расположенных вокруг раны, тем самым образуя край раны;

- приведение в контакт края раны с терапевтически эффективным количеством тропоэластина в условиях, обеспечивающих устойчивый контакт тропоэластина с краем раны в течение периода времени, обеспечивающего реэпителизацию раны;

где реэпителизация раны обеспечивает заживление раны;

тем самым заживляя рану.

В другом варианте осуществления предлагается способ улучшения реэпителизации раны, включающий:

- предоставление индивидуума, имеющего рану, при этом рана включает в себя множество эпидермальных клеток, расположенных вокруг раны, тем самым образуя край раны;

- приведение в контакт края раны с терапевтически эффективным количеством тропоэластина в условиях, обеспечивающих устойчивый контакт тропоэластина с краем раны в течение периода времени, обеспечивающего реэпителизацию раны;

тем самым улучшая реэпителизацию раны.

В другом варианте осуществления предлагается способ минимизации рубцовой ткани, включающий:

- предоставление индивидуума, имеющего рубцовую ткань;

- образование раны в рубцовой ткани, при этом рана включает в себя множество эпидермальных клеток, расположенных вокруг раны, тем самым образуя край раны;

- приведение в контакт края раны с терапевтически эффективным количеством тропоэластина в условиях, обеспечивающих устойчивый контакт тропоэластина с краем раны в течение периода времени, обеспечивающего реэпителизацию раны;

где реэпителизация раны минимизирует рубцовую ткань;

тем самым минимизируя рубцовую ткань.

В другом варианте осуществления предлагается тропоэластин для применения в заживлении раны или для применения в улучшении реэпителизации раны, где терапевтически эффективное количество тропоэластина приводят в контакт с краем раны в условиях, обеспечивающих устойчивый контакт тропоэластина с краем раны в течение периода времени, обеспечивающего реэпителизацию раны.

В другом варианте осуществления предлагается применение тропоэластина для заживления раны или для улучшения реэпителизации раны, где терапевтически эффективное количество тропоэластина приводят в контакт с краем раны в условиях, обеспечивающих устойчивый контакт тропоэластина с краем раны в течение периода времени, обеспечивающего реэпителизацию раны.

В другом варианте осуществления предлагается применение тропоэластина в изготовлении лекарственного препарата для заживления раны или для улучшения реэпителизации раны, где терапевтически эффективное количество тропоэластина приводят в контакт с краем раны в условиях, обеспечивающих устойчивый контакт тропоэластина с краем раны в течение периода времени, обеспечивающего реэпителизацию раны.

В вышеописанных вариантах осуществления тропоэластин может быть предоставлен для контакта с краем раны, но не с раневым ложем.

В описанных выше вариантах осуществления тропоэластин может быть предоставлен в мономерной форме, или он может быть предоставлен в перекрестно сшитой или не перекрестно сшитой форме.

В описанных выше вариантах осуществления тропоэластин может быть смешан с гелем перекрестно сшитой гиалуроновой кислоты с образованием состава, способствующего замедленному высвобождению тропоэластина.

Краткое описание графических материалов

Фигура 1 (А) представляет схему лечения ран на свиньях. Раны покрывали либо Integra (синие круги) или обрабатывали с кожной матрицей Integra, включающей 10% rH ТЕ (Integra с эластином; зеленые круги), или кожной матрицей Integra, покрывающей гидрогель 4% rH ТЕ (желтые круги). (В) Схема участков биопсии и перевязки раны.

Фигура 2: срез биопсии, окрашенный по VVG, из участка, обработанного Integra с эластином, демонстрирующий присутствие клеток фибробластов, новое отложение коллагена и присутствие эластиновых волокон.

Фигура 3: сравнение различных типов дермы, наблюдаемых в окрашенных по VVG образцах пункционной биопсии, взятых через две недели после операции. А) Исходная дерма; В) Дерма, которая по виду наполовину новообразованная и наполовину нормальная (обведено); С) Дерма новообразованного вида (обведено: менее эозинофильное окрашивание, коллагеновые волокна выглядят тоньше и менее организованными, более клеточная, чем дерма нормального вида); D) Дерма нормального вида (обведено: более эозинофильное окрашивание, коллагеновые волокна выглядят толще и более организованными, менее клеточная, чем дерма, которая выглядит новообразованной.)

Фигура 4: срез ткани из раневого участка, обработанного с кожной матрицей Integra + гидрогель 4% rH ТЕ, через две недели после операции. Эластиновые волокна можно видеть в направлении к основанию дермы ниже видимого геля rH ТЕ в кожной ткани, которая выглядит как нормального вида. Кожную ткань аналогичного вида также можно наблюдать в пределах гидрогеля rH ТЕ.

Фигура 5: сравнение количества кровеносных сосудов в каждом слое дермы в образцах пункционной биопсии, взятых через 2 недели после операции. Integra с эластином сравнили с соответствующим краниальным (кран) или каудальным (кауд) контролем только с кожной матрицей Integra от той же свиньи. Образцы VVG-окрашенной пункционной биопсии исследовали при 100-кратном увеличении и оценили с помощью программного обеспечения ImageJ. Микрофотографии взяли с нескольких уровней в дерме. Первый уровень дермы (уровень 1) получили путем перемещения поля зрения, видимого в камере, так, что гиподерма находилась как раз вне видимости. Последующие уровни получили путем перемещения образца на 0,5 полей зрения (как это наблюдается в микроскоп) в направлении эпидермиса. Таким образом, уровень 2 над гиподермой находится на 0,5 полей зрения (как это наблюдается в микроскоп) от изображения уровня 1. Три изображения взяли на каждом уровне дермы: по одному с каждого края образца и один в середине. Этот способ гарантировал, что изображения, полученные на различных уровнях дермы, не будут содержать одни и те же кровеносные сосуды, поскольку каждое поле зрения в микроскоп имело диаметр 2,5 мм, тогда как каждое изображение, взятое камерой, составило 650 мкм в ширину. Критериями для кровеносных сосудов были: а) размер просвета должен был быть равен или больше, чем 10 мкм; и б) просвет должен был быть выстлан по меньшей мере 2 клетками с темными удлиненными ядрами. Идентичность сосудов иногда была положительно подтверждена присутствием клеток крови в просвете и/или наличием гладко-мышечных клеток в средней оболочке стенки сосуда.

Фигура 6: (А) Пример небольших выступов эпидермиса в дерму в образце, обработанном только Integra. (В) Пример сетеподобных гребней эпидермиса в образце с Integra с эластином.

Фигура 7: Рекомбинантный человеческий тропоэластин предлагается для способствования процессу заживления раны через передачу сигналов хемотаксиса, которые содействуют привлечению фибробластов и кератиноцитов, а также васкуляризации регенерированной ткани.

Подробное описание вариантов осуществления

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что тропоэластин улучшает реэпителизацию в полнослойных ранах кожи.

Важно отметить, что, как показано в примерах в данном документе, авторы настоящего изобретения обнаружили, что контакт тропоэластина с краем раны в виде эпидермальных клеток, которые образуют границу вокруг раны, является критическим для улучшения реэпителизации кожи. Немаловажно, что там, где тропоэластин обеспечивают в раневое ложе при ограниченном устойчивом контакте с краем раны, нет почти никакого улучшения реэпителизации раны.

Несмотря на нежелание быть связанными гипотезой, авторы настоящего изобретения считают, что это устойчивый или постоянный контакт тропоэластина с краем раны или по меньшей мере постоянное размещение в непосредственной близости от края раны обеспечивает улучшение заживления раны, наблюдаемое в данном документе. Опять же, несмотря на нежелание быть связанными гипотезой, предполагают, что при контакте с краем раны или расположении в непосредственной близости от него, различные протеазы, экспрессированные в ходе процесса заживления раны, могут образовывать протеолитические фрагменты тропоэластина или облегчать высвобождение мономеров тропоэластина, которые способствуют различным процессам заживления раны и регенерации ткани. Примеры в данном документе показывают, что эти процессы включают неоваскуляризацию, клеточный хемотаксис, миграцию и пролиферацию, а также формирование основного вещества.

Усовершенствования в реэпителизации являются важными, поскольку как в терапевтической, так и в косметической перспективе может быть решающе важным, чтобы рана закрылась функциональной эпидермальной тканью. Если закрытие раны не наблюдается, существует опасность, что процесс регенерации ткани имеет тенденцию становиться похожим на репарацию ткани и фиброз, приводя к формированию ткани, имеющей нестандартную функцию и вид. Существует также опасность хронического воспаления и язвообразования. Усовершенствования в эпителизации в плане степени реэпителизации и времени до реэпителизации являются существенными в данном контексте.

Считается, что полученные результаты, описанные выше, особенно неожиданны, поскольку до настоящего времени, хотя существовали ограниченные ранние данные in vitro по биоактивности полученных из эластина пептидов, ранние раневые модели in vivo продемонстрировали, что полученные из эластина пептиды, такие как VGVAPG, неэффективны для получения улучшений, описанных в данном документе. См., например, Hashimoto supra. Несмотря на нежелание быть связанными гипотезой и по меньшей мере в том объеме, который соответствует реэпителизации раны, считается, что неспособность расположить эти пептиды в соответствии со структурой раны, описанной в данном документе, означает, что улучшения, описанные в данном документе, не возникали в этих более ранних исследованиях.

Таким образом, в одном варианте осуществления предлагается способ заживления раны. Способ включает предоставление индивидуума, имеющего рану. Рана может возникнуть из-за любого повреждения кожной ткани. Примеры повреждения включают в себя ожог, рваную рану, ссадину, резаную рану, прокол или прободение.

Обычно повреждение представляет собой такое, которое вызвано разрывом, прободением или ранением эпидермального слоя и дермы. Может быть также вызвано ранение ткани ниже дермы, в том числе подкожной клетчатки, мышцы или кости. Таким образом, рана может быть поверхностной раной, неполнослойной раной или полнослойной раной.

В целом настоящее изобретение применяется к регенеративным процессам, относящимся к дермальной и эпидермальной областям, включая формирование грануляционной ткани, и ассоциированным процессам, в том числе к ангиогенезу, отложению коллагена и тому подобному, и реэпителизации.

Повреждение может быть преднамеренным, например, хирургическим, или случайным, например, травмой.

Рана включает в себя множество эпидермальных клеток, расположенных вокруг раны, тем самым образуя край раны. Как правило, повреждение образует раненую область ткани, характеризующуюся отсутствием эпителиальных клеток, которые в норме образовывали бы эпителиальный слой над областью, в которой образовалась рана. Ткань, которая по существу не повреждена и располагается вокруг участка повреждения, обычно содержит нормальный эпидермальный слой из эпидермальных клеток. Именно эти клетки, которые примыкают к ране, образуют край раны. Как обычно понимается, край раны или граница раны становится местом пролиферации эпителиальных клеток во время процесса реэпителизации.

Согласно настоящему изобретению край раны или границу раны приводят в контакт с тропоэластином или полученными из эластина фрагментами в условиях, обеспечивающих устойчивый контакт тропоэластина с краем раны. Это считается важным этапом настоящего изобретения. Как описано в примерах в данном документе, реэпителизация имеет свойство быть обнаруженной там, где тропоэластин находится в контакте с, или расположен в непосредственной близости от края раны. Например, реэпителизация может быть более полной или естественно структурированной, и темп реэпителизации может быть ускоренным. Некоторые из этих характеристик не наблюдаются, например, когда тропоэластин находится в контакте только с раневым ложем.

Как описывается в данном документе, раневое ложе, как правило, представляет собой поверхность кожной ткани, возникающую из-за повреждения, на которой в конечном итоге формируется грануляционная ткань в функциональном регенеративном процессе. Под 'расположен в непосредственной близости от края раны' подразумевается, что тропоэластин обеспечивают так, что он или его различные протеолитические фрагменты расположены настолько близко к краю раны, чтобы легко допустить диффузию тропоэластина или его протеолитических фрагментов для контакта с краем раны. В этом контексте расположение тропоэластина или его фрагментов, полученных из эластина, только в или на раневом ложе, как показано в данном документе, не обеспечивает реэпителизацию, которую можно наблюдать, когда тропоэластин добавляют к краю раны. Следовательно, введение тропоэластина только в раневое ложе согласно настоящему изобретению не наблюдается, так как имеется расположение тропоэластина в непосредственной близости от края раны.

Существует ряд подходов для облегчения контакта тропоэластина или полученных из эластина фрагментов с краем раны. В одном варианте осуществления тропоэластин предоставляется в форме, которая обеспечивает постоянный контакт с краем раны. Например, тропоэластин может предоставляться в форме геля, имеющего вязкость или прилипание, обеспечивающие возможность гелю и, соответственно, тропоэластину или его фрагментам, оставаться в контакте с краем раны. Примеры конкретных составов геля включают те, которые в целом обсуждаются в WO 2012068619.

В другом варианте осуществления тропоэластин предоставляется внутри или на твердой фазе, такой как перевязочный материал, стент, устройство и т.п., которая приспособлена для устойчивого контакта твердой фазы (и, следовательно, тропоэластина, расположенного внутри или на твердой фазе) с краем раны. Например, твердая фаза, такая как каркас, объемообразующее средство или протез, может быть помещена в раневое ложе, так что апикальная поверхность каркаса совмещается с краем раны, позволяя обеспечить тропоэластин или полученный из эластина пептид в гелевом или другом формате на апикальной поверхности каркаса, или подобного, в контакте с краем раны. Примеры конкретных устройств с твердой фазой включают те, которые предполагают электропрядение тропоэластина, факультативно, с другими молекулами соединительной ткани, такими как коллаген, и те, которые предполагают совместное осаждение с другими молекулами соединительной ткани, такими как коллаген.

В альтернативном подходе это сами условия, в которых предоставляется тропоэластин, что обеспечивает устойчивый контакт тропоэластина с краем раны. Например, тропоэластин может предоставляться в растворителе, который распыляют или наносят на край раны, а затем обеспечивают условия для выпаривания растворителя с края раны, оставляя тропоэластин или его фрагмент в контакте с краем раны.

Тропоэластин или полученный из эластина фрагмент, как правило, предоставляют в терапевтически эффективном количестве. Как правило, это любое количество, которое приводит к улучшению реэпителизации в контексте либо степени реэпителизации, или времени для завершения реэпителизации по сравнению со степенью или временем реэпителизации в условиях, когда тропоэластин или полученный из эластина фрагмент предоставлен иначе. Обычно тропоэластин предоставляют в концентрации от приблизительно 0,1 мг/мл до приблизительно 250 мг/мл, хотя это будет зависеть от различных факторов, относящихся к регенерации кожной ткани, обсуждаемых выше. В этом диапазоне следующие концентрации могут быть особенно полезны: 1 мг/мл, 25 мг/мл, 50 мг/мл, 100 мг/мл, 150 мг/мл и 200 мг/мл.

Таким образом, в одном варианте осуществления предлагается способ заживления раны, включающий:

- предоставление индивидуума, имеющего рану, при этом рана включает в себя множество эпидермальных клеток, расположенных вокруг раны, тем самым образуя край раны;

- приведение в контакт края раны с тропоэластином в концентрации от приблизительно 0,1 мг/мл до приблизительно 250 мг/мл в условиях, обеспечивающих устойчивый контакт тропоэластина с краем раны в течение периода времени, обеспечивающего реэпителизацию раны, где реэпителизация раны способствует заживлению раны, тем самым заживляя рану. В этом варианте осуществления тропоэластин может предоставляться для использования в форме, которую можно наносить на край раны для устойчивого контакта тропоэластина с краем раны. Такой формой может быть гель. Предпочтительно, в этом варианте осуществления тропоэластин предоставляют в устойчивом контакте с краем раны в течение не более чем приблизительно от 1 до нескольких недель, предпочтительно без контакта с раневым ложем.

В соответствии с настоящим изобретением тропоэластин или полученные из эластина пептиды предоставляют на период времени, обеспечивающий реэпителизацию раны. Период времени обычно зависит от характера раны и других факторов, связанных с регенерацией тканей, указанных выше. Если рана представляет собой небольшую острую рану, возникшую из-за травмы, может быть необходимо предоставить тропоэластин в устойчивом контакте с краем раны на период времени от не более чем приблизительно 1 до приблизительно 2 недель. Может потребоваться всего лишь одно наложение тропоэластина. То же самое можно применить, если рана представляет собой чистую хирургическую рану, хотя это будет зависеть от размера и характера раны. Если рана является более сложной, например, в результате существенной потери кожной ткани или нижележащих тканей, например, как при обширной травме или хроническом повреждении, может быть необходимо предоставить тропоэластин согласно схемы применения, например в соответствии с периодом времени, в течение которого обычно перевязывают и очищают рану. В этих обстоятельствах может быть необходимо добавлять тропоэластин на край раны ежедневно в течение периода времени от 1 до 3 недель или более, или в форме, которая обеспечивает замедленное высвобождение терапевтически эффективного количества тропоэластина на край раны в течение от 1 до 3 недель или более.

В описанном выше варианте осуществления настоящего изобретения улучшенная реэпителизация раны возникает из устойчивого контакта тропоэластина с краем раны в процессе заживления раны, что приводит к заживлению раны. В варианте осуществления и как установлено в приведенных в данном документе примерах, можно улучшить реэпителизацию без существенного контакта тропоэластина с раневым ложем.

Как обычно понимается, раневое ложе, как правило, формируется в дермальном слое и может распространяться на подкожные слои или другие слои, расположенные ниже дермального слоя. Раневое ложе, как обычно понимается, это такая поверхность нормальной неповрежденной ткани, в частности, кожной ткани, которая расположена в пределах раны. Раневое ложе можно по-другому определить как часть раны, в которой происходит формирование грануляционной ткани. Раневое ложе обычно не включает эпидермальную ткань и, следовательно, раневое ложе само по себе не содержит 'край раны', как отражено в данном документе. Более подробно, как это обычно понимается, все кожные раны, которые прошли сквозь дермальный слой (например, неполнослойная или полнослойная рана), будут иметь край раны и раневое ложе. Кожные раны, которые являются поверхностными, будут иметь край раны, но не существенное раневое ложе (действительно, поверхностная рана может просто открыть в других отношениях неповрежденную кожную ткань). Следовательно, как обычно понимается и в соответствии с настоящим изобретением, 'край раны' и 'раневое ложе' представляют собой два различных понятия.

Одним из специфических применений настоящего изобретения, описанного в данном документе, является ремоделирование или существенное удаление рубца и связанной фиброзной ткани. Как обычно понимается, рубцовая ткань возникает в результате репарации тканей. Конечным результатом является формирование тканевой структуры, в которой отсутствуют структурные и функциональные аспекты соответствующей ткани, в которой расположен рубец или фиброз. В частности, обнаружили, что при расположении тропоэластина или полученного из эластина фрагмента относительно строения раны, описанного в данном документе, становится возможным индуцировать ключевые аспекты регенерации тканей и тогда становится возможным индуцировать рану, а затем процесс заживления раны в рубцовой ткани. Таким образом, в другом варианте осуществления предлагается способ минимизации рубцовой ткани, включающий:

- предоставление индивидуума, имеющего рубцовую ткань;

- образование раны в рубцовой ткани, при этом рана включает в себя множество эпидермальных клеток, расположенных вокруг раны, тем самым образуя край раны;

- приведение в контакт края раны с терапевтически эффективным количеством тропоэластина в условиях, обеспечивающих устойчивый контакт тропоэластина с краем раны в течение периода времени, обеспечивающего реэпителизацию раны;

где реэпителизация раны минимизирует рубцовую ткань;

тем самым минимизируя рубцовую ткань.

В одном варианте осуществления минимизация рубцовой ткани относится к удалению рубцовой ткани. В другом варианте осуществления рубцовую ткань минимизируют путем минимизации объема или минимизации распространенности рубцовой ткани в данной области кожи.

Рану можно создать различными методами, известными в данной области техники. Один особенно предпочтительный метод включает формирование множества микропункций вдоль рубцовой ткани таким образом, чтобы создать несколько ран в рубце. Затем тропоэластин или полученный из эластина пептид предоставляют в устойчивом контакте с краем раны или раневым ложем, чтобы обеспечить регенеративные процессы ткани, описанные в данном документе.

В одном варианте осуществления тропоэластин предоставляют в форме, в которой мономеры тропоэластина не являются перекрестно сшитыми.

В другом варианте осуществления тропоэластин предоставляют в форме композиции, которая не включает в себя лизилоксидазу или другой перекрестно-сшивающий реагент.

В другом варианте осуществления тропоэластин предоставляют в форме композиции, которая не включает в себя антиоксиданты на основе аминокислот.

Обычно тропоэластин для применения в настоящем изобретении представляет собой рекомбинантный или синтетический тропоэластин и предоставляется в бесклеточной композиции.

Как используется в данном документе, за исключением того, где контекст требует иного, термин "содержать" и вариации этого термина, такие как "содержащий", "содержит" и "содержащийся", не предназначены для исключения других добавок, компонентов, систем или этапов.

Дополнительные аспекты настоящего изобретения и дополнительные варианты осуществления аспектов, описанных в предыдущих пунктах, будут очевидны из следующего описания, приведенного в качестве примера и со ссылкой на прилагаемые графические материалы.

Будет понятно, что настоящее изобретение, раскрытое и описанное в данном описании, распространяется на все альтернативные комбинации двух или более отдельных особенностей, упомянутых или очевидных из текста или графических материалов. Все из этих отличающихся комбинаций составляют различные альтернативные аспекты настоящего изобретения.

Примеры

Пример 1 Регенерация дермы полнослойных хирургических ран

Настоящее исследование оценило влияние рекомбинантного человеческого тропоэластина (rH ТЕ) на регенерацию дермы полнослойных хирургических ран на свиной модели после применения кожной матрицы Integra с наличием и без rH ТЕ. Анализ регенерированной дермы в момент времени две недели показал, что наличие rH ТЕ в кожной матрице Integra привело к улучшенному процессу заживления раны. Улучшение было отмечено по увеличению числа фибробластов, повышению отложения коллагена, увеличению васкуляризации регенерированной кожной ткани и увеличению уровня обнаруженных эластиновых волокон в регенерированной дерме. Эти события сопровождались увеличением пролиферации кератиноцитов, приводящей к улучшению эпителизации раны благодаря присутствию rH ТЕ.

МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ

Тестируемые объекты

Три продукта оценивали в настоящем исследовании:

- Контроль: Кожная матрица Integra

- Тест А: Кожная матрица Integra, содержащая 10% rH ТЕ (Integra с эластином)

- Тест В: Кожная матрица Integra, покрывающая гидрогель 4% rH ТЕ

Полнослойная свиная модель

Две свиньи были использованы в данном исследовании, каждая с четырьмя раневыми участками, по два с каждой стороны животного, как показано на рисунке ниже.

На каждой свинье две раны с одной стороны покрывали с Integra, а две раны с другой стороны обрабатывали как тест А и В, как указано на Фигуре 1A.

День 0

Четыре полнослойных эксцизионных круглых раны 5 см в диаметре создавали в верхней области спины каждой свиньи, как отмечено в диаграмме выше.

Каждую рану обрабатывали либо контрольной кожной матрицей Integra, или тестируемым объектом А или В, как указано в диаграмме выше.

День 7 (неделя 1)

Замена перевязочного материала для всех ран.

День 14 (неделя 2)

Биопсии размером 4 мм были взяты из каждого раневого участка в нескольких миллиметрах от края ран, как показано на Фигуре 1B.

Анализ раны

Отбор образцов в раневом участке впервые предпринимали через две недели после хирургической операции и лечения. Биопсию раневого участка проводили, как описано выше. Образцы подвергали гистопатологическому и иммуногистохимическому анализу для оценки инфильтрации фибробластов, отложения коллагена и эластина, васкуляризации регенерированной ткани и регенерации эпителия.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Инфильтрация фибробластов кожной матрицы Integra:

Количество фибробластов возрастало во всех конструкциях, но наиболее повышено в присутствии rH ТЕ. Эффект был наиболее выраженным в Integra с эластином, когда rH ТЕ пропитывал всю конструкцию.

Отложение коллагена и эластина:

Повышенные уровни фибробластов приводили к увеличенному отложению коллагена в присутствии rH ТЕ, как было обнаружено с помощью окрашивания гематоксилином и эозином (Н&Е) и по Вирхову-Ван Гизону (VVG), как показано на Фигуре 2.

Наличие эластина (т.е. не rH ТЕ) в срезах биопсий, взятых из каждого из обработанных участков, оценивали с помощью окрашивания срезов биопсий по VVG. Поскольку было невозможно точно отличить эндогенные эластиновые волокна от тех, которые могли регенерировать в ходе процесса репарации кожи, срезы ткани из каждого обработанного участка просто оценивали на наличие или отсутствие эластиновых волокон в репарированной кожной ткани. Общее количество срезов анализировали в данном исследовании для кожной матрицы Integra отдельно, кожной матрицы Integra плюс гидрогель 4% rH ТЕ и Integra с эластином составляло 32, 16 и 16, соответственно. Результаты обобщены в Таблице 1 ниже.

Примеры кожной ткани, встретившейся в ходе анализа VVG-окрашенных срезов биопсий, представлены на Фигуре 3. Кроме того, пример эластиновых волокон, присутствующих в кожной ткани, смежной с гидрогелем rH ТЕ, представлен на Фигуре 4.

Васкуляризация регенерированной дермы:

Уровень васкуляризации в регенерированной дерме оценивали гистопатологически. Количество кровеносных сосудов на различных уровнях ткани срезов биопсии оценивали под микроскопом, начиная с гиподермы и двигаясь поступательно в направлении эпидермиса, как описано на Фигуре 5. Как можно видеть из данных, представленных на Фигуре 5, наличие rH ТЕ в кожной матрице Integra (Integra с эластином) приводило к увеличению числа кровеносных сосудов в регенерированной ткани, особенно в направлении поверхностной дермы, по сравнению с участками, обработанными кожной матрицей Integra. Аналогичная тенденция наблюдалась в участках, обработанных с кожной матрицей Integra поверх 4% геля rH ТЕ.

Регенерация эпителия:

Регенерация эпителия в раневых участках была одним из наиболее ярких преимуществ Integra с эластином над другим тестируемым и контрольным объектами. Как указано в Таблице 2 и изображено на Фигуре 6, Integra с эластином приводила к почти полной реэпителизации раневого участка на 2 неделе и сопровождалась наличием сетеподобных гребней, указывающих на более естественное дермально-эпидермальное соединение.

Таблица 2. Особенности эпителия в образцах пункционной биопсии, собранных через две недели после хирургической операции наблюдали при 100-кратном увеличении. Изучили в общей сложности 16 образцов с Integra, 8 образцов гель TE + Integra и 8 образцов Integra с эластином. Зарегистрировали наличие полной или частичной эпителизации в пределах каждого образца пункционной биопсии. Эпителий с редкими гребнями классифицировали отдельно от того, где хорошо развитые и плотные гребни (гребни в части эпителия и гребни во всем эпителии, соответственно).

Выводы и обсуждение

Данные объясняются с помощью модели, изображенной на Фигуре 7, где rH ТЕ обеспечивает биологический стимул для репаративного процесса в коже, когда включен в Integra с эластином. Это ведет к большему уровню инфильтрации фибробластов, неоваскуляризации регенерированной ткани и эпителизации раневого участка. Эти преимущества означают, что применение Integra с эластином может устранить потребность в трансплантации кожи. Этот биологический стимул согласуется с известными свойствами rH ТЕ по содействию репаративному процессу в тканях, поскольку тропоэластин является хемотаксическим для клеток, участвующих в репаративном процессе в тканях, в том числе моноцитов (способствует неоваскуляризации, дифференциации, например, в фиброциты) и фибробластов [Almine et al., 2012].

Подтверждение того, что эффекты возникли из-за присутствия rH ТЕ, предоставила кожная матрица Integra + гидрогель 4% rH ТЕ, которая показала аналогичную тенденцию к увеличению инфильтрации фибробластов и неоваскуляризации. Как и следовало ожидать для локализованной доставки с гидрогелем, эффекты были ограничены более глубокой дермой, где наносили rH ТЕ-содержащий гель. Поскольку эти эффекты были в основном ограничены более глубокими слоями дермы, эпителиальная регенерация не наблюдалась; т.е. гель rH ТЕ был отделен от поверхностной дермы и эпидермиса кожной матрицей Integra. Мы наблюдали больше эластиновых волокон в этих биопсиях из регенерированной дермы. Вероятно, это наблюдалось благодаря замедленному высвобождению rH ТЕ. Гель rH ТЕ содержит полноразмерный мономер тропоэластина, который немодифицирован и постепенно вымывается из геля, поставляя тропоэластин, который могут использовать регенеративные фибробласты для конструирования эластиновых волокон. Первичные фибробласты кожи человека используют rH ТЕ в качестве субстрата для роста клеток и ремоделируют rH ТЕ в эластиновые волокна в процессе, который зависит от лизилоксидазы (активность которой ингибируется BAPN), и результатом которого являются зрелые эластиновые волокна (о чем свидетельствуют измерения эластичности и характерных флуоресцентных свойств эластиновых волокон) [лаб. Weiss, неопубликованные данные].

В заключение, и признавая, что эти исследования проводятся на небольшом количестве животных, можно сделать вывод, что включение rH ТЕ в кожную матрицу Integra может существенно ускорить дермальную и эпидермальную регенерацию.

Пример 2: Применение составов на основе электропрядения, совместного осаждения и геля.

В данном исследовании использовали свиней, каждую с четырьмя круглыми, 5 см в диаметре, раневыми участками, по два с каждой стороны животного. У каждой свиньи две раны с одной стороны покрывали доступным для приобретения продуктом кожной матрицы и две раны с другой стороны обрабатывали любым из тестируемых объектов А, В или С.

День 0

Четыре полнослойные эксцизионные круглые раны 5 см в диаметре создавали в верхней области спины каждой свиньи, как отмечено в диаграмме выше.

Каждую рану обрабатывали либо контрольной кожной матрицей, либо тестируемым объектом А, В или С.

День 7 (неделя 1)

Замена перевязочного материала для всех ран.

День 14 (неделя 2)

Биопсии размером 4 мм брали из каждого раневого участка в нескольких миллиметрах от края раны, как показано на Фигуре 1 В.

Анализ раны

Отбор образцов в раневом участке впервые предпринимали через две недели после хирургической операции и лечения. Биопсию раневого участка проводили, как описано выше. Образцы подвергали гистопатологическому и иммуногистохимическому анализу для оценки инфильтрации фибробластов, отложения коллагена и эластина, васкуляризации регенерированной ткани и регенерации эпителия.

Получение тестируемого объекта А: Электроспряденные каркасы

В различных пропорциях комбинировали тропоэластин и коллаген в 20% (вес/об.) растворе белка в 1,1,1,3,3,3-гексафтор-2-пропаноле (HFP). Последние включали 100% тропоэластин, 80% тропоэластин с 20% коллагеном, 60% тропоэластин и 40% коллаген, 50% тропоэластин и 50% коллаген, и 100% коллаген. Растворы загружали в шприц, снабженный тупой иглой 18 калибра, и со скоростью потока 3 мл в час модулировали с помощью шприцевого насоса. Иглу соединяли с положительным источником питания 20 кВ и направляли на заземленный, 30 мм диаметром круглый латунный анод при расстоянии от анода 20 см. Электроспряденные каркасы химически перекрестно сшивали для стабилизации их структур в водном окружении. Каркасы помещали в эксикатор с открытым циклом и перекрестно сшивали паром из отдельного 25% (об./об.) водного раствора глутаральдегида, затем гасили путем погружения в раствор 0,2 М глицина в течение ночи. Затем каркасы несколько раз промывали в PBS. См. Rnjak-Kovacina J. et al. Acta Biomater. 2012 Oct; 8(10):3714-22. Этот объект более существенно перекрестно сшит, чем тестируемый ниже объект В. Он имеет тенденцию быть более склонным к клеточной инфильтрации.

Получение тестируемого объекта В: Коллагеновые губки, содержащие тропоэластин

Белый продукт совместного осаждения бычьего коллагена I типа, смешанного с 10% вес/вес тропоэластином в 0,05 М уксусной кислоте (pH 3,2), превращали в высокопористую белую мембрану посредством лиофилизации. Контроль среднего диаметра пор достигали путем установки начальной температуры полки быстрого замораживания в жидком азоте. Последующее воздействие на сухое твердое вещество температурой 105°C и вакуумом 6 кПа в течение 24 ч вводило ковалентные перекрестные сшивки между полипептидными цепями коллагена. Конструкцию погружали в ванну, содержащую 0,25% водный глутаральдегид в 0,05 М уксусной кислоте, и коллаген подвергался дополнительной перекрестной сшивке. Конструкции промывали в деионизованной воде в течение 24 часов. См. Kanematsu A. et al. Biomaterials. 2004 Aug; 25(18):4513-20. Они имеют тенденцию быть более устойчивыми к распаду, чем тестируемый выше объект А.

Получение тестируемого объекта С: Коллагеновые губки с нижней частью из тропоэластинового геля

Полноразмерный тропоэластин включали в гель гиалуроновой кислоты по существу как описано в WO 2012068619 и помещали в шприц перед применением. Гель наносили на поверхность открытого раневого ложа, затем покрывали коллагеновой губкой, полученной, как описано для тестируемого объекта В, но пропуская тропоэластин.

Пример 3: Оценка регенерации эпителия на свиной модели прокалывания кожи

Каждой свинье обрабатывали до десяти участков 2 см×2 см поперек спины. Каждый участок получал один из трех способов обработки:

1) Участок А: Получали пункционные раны с использованием микропункционной иглы приблизительно каждые 2 мм друг от друга по всей площади кожи, подлежащей обработке. После обработки иглами гель, содержащий от 1% до 5% вес/об. белка тропоэластина, наносили местно на обрабатываемую область и удерживали на месте с помощью повязки Tegaderm, позволяя гелю удерживаться и проходить в пункционные участки.

2) Участок В: Получали пункционные раны с использованием иглы для подкожных инъекций, при этом каждая пункция включала инъекцию от 0,05 до 0,5 мл геля 1-5% вес/об. тропоэластина в верхнюю часть дермы кожной ткани. Пункции/инъекции наносили приблизительно в 2 мм друг от друга по всей области кожи, подлежащей обработке, с последующей перевязкой раны.

3) Участок С: Получали имплантацию от 0,5 до 2 мл геля 1-5% вес/об. тропоэластина в верхнюю часть дермы с использованием метода введения с перекрестной штриховкой с последующим нанесением пункционных ран по всей обработанной области с помощью микропункционной иглы приблизительно в 2 мм друг от друга.

Фотографии и пункционные биопсии выполняли в день 0, 7 и 28. Образцы подвергали гистопатологическому и иммуногистохимическому анализу для оценки инфильтрации фибробластов, отложения коллагена и эластина, васкуляризации регенерированной ткани и регенерации эпителия.

Пример 4: Оценка регенерации эпителия после лазерно-стимулированной доставки тропоэластина на модели свиной кожи

Изменение поверхности фракционным лазером создает вертикальные каналы в коже приблизительно 3 мм глубиной, которые содействуют доставке местно нанесенных лекарственных препаратов в кожу. Каждой свинье обработали до десяти участков 2 см×2 см поперек спины. Каждый участок обрабатывали фракционным одноканальным CO₂ лазером по существу как описано Haedersdal et al. 2010 (Lasers Surg Med. 42(2):113-22). После обработки лазером тестируемые участки получали либо:

- гель гиалуроновой кислоты, содержащий 1-5% вес/об. тропоэластина, или

- контроль в виде геля гиалуроновой кислоты

Фотографии и пункционные биопсии выполняли в день 0, 7 и 28. Образцы подвергали гистопатологическому и иммуногистохимическому анализу для оценки инфильтрации фибробластов, отложения коллагена и эластина, васкуляризации и регенерации эпителия.

Литературные источники

Almine et at. 2012. Elastin Signaling in Wound Repair. Birth Defects Research (Part C) 96:248-257.

Группа изобретений относится к медицине и может быть использована для заживления раны или улучшения реэпителизации раны, где способ заживления раны или улучшения реэпителизации раны включает: предоставление индивидуума, имеющего рану, при этом рана включает в себя множество эпидермальных клеток, расположенных вокруг раны, тем самым образуя край раны; приведение в контакт края раны с терапевтически эффективным количеством тропоэластина в условиях, обеспечивающих устойчивый контакт тропоэластина с краем раны в течение периода времени, обеспечивающего реэпителизацию раны; где тропоэластин предоставляют в форме геля, содержащего перекрестно сшитую гиалуроновую кислоту и тропоэластин; где реэпителизация раны обеспечивает заживление раны; с заживлением тем самым раны. Группа изобретений обеспечивает устойчивый контакт тропоэластина с краем раны в течение периода времени, способствующего реэпителизации раны. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 7 ил., 2 табл., 4 пр.

1. Способ заживления раны или улучшения реэпителизации раны, включающий:

- предоставление индивидуума, имеющего рану, при этом рана включает в себя множество эпидермальных клеток, расположенных вокруг раны, тем самым образуя край раны;

- приведение в контакт края раны с терапевтически эффективным количеством тропоэластина в условиях, обеспечивающих устойчивый контакт тропоэластина с краем раны в течение периода времени, обеспечивающего реэпителизацию раны; где тропоэластин предоставляют в форме геля, содержащего перекрестно сшитую гиалуроновую кислоту и тропоэластин;

где реэпителизация раны обеспечивает заживление раны;

с заживлением тем самым раны.

2. Способ по п. 1, где гель имеет вязкость или адгезию, которые обеспечивают устойчивый контакт тропоэластина с краем раны.

3. Способ по п. 1, где тропоэластин предоставляют на апикальной поверхности твердой фазы и указанную твердую фазу помещают в раневое ложе так, что апикальную поверхность твердой фазы совмещают с краем раны, обеспечивая тем самым устойчивый контакт тропоэластина с краем раны.

4. Способ по п. 3, где твердая фаза представляет собой перевязочный материал, стент, каркас, объемообразующее средство или протез.

5. Способ по п. 1, где гель, содержащий перекрестно сшитую гиалуроновую кислоту и тропоэластин, наносят шприцем на край раны в условиях, обеспечивающих устойчивый контакт тропоэластина с краем раны.

6. Способ по п. 1, где тропоэластин предоставляют в количестве от 0,1 мг/мл до 250 мг/мл на край раны.

7. Способ по п. 1, где тропоэластин предоставляют в устойчивом контакте с краем раны в течение периода не более чем от 1 до 2 недель.

8. Способ по п. 1, где тропоэластин не приводят в контакт с раневым ложем для обеспечения устойчивого контакта тропоэластина с раневым ложем.

9. Способ заживления раны или улучшения реэпителизации раны, включающий:

- предоставление индивидуума, имеющего рану, при этом рана включает в себя множество эпидермальных клеток, расположенных вокруг раны, тем самым образуя край раны;

- приведение в контакт края раны с терапевтически эффективным количеством тропоэластина в условиях, обеспечивающих устойчивый контакт тропоэластина с краем раны в течение периода времени, обеспечивающего реэпителизацию раны; где тропоэластин предоставляют в форме композиции, содержащей перекрестно сшитый коллаген и тропоэластин;

где реэпителизация раны обеспечивает заживление раны;

с заживлением тем самым раны.

10. Способ по п. 9, где композиция тропоэластина содержит перекрестно сшитый тропоэластин.