СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЬНЫХ ВРОЖДЕННЫМ БУЛЛЕЗНЫМ ЭПИДЕРМОЛИЗОМ ПУТЕМ КОМБИНИРОВАННОГО ПРИМЕНЕНИЯ АЛЛОГЕННЫХ ФИБРОБЛАСТОВ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОГО ЭКВИВАЛЕНТА КОЖИ Российский патент 2022 года по МПК A61K35/33 A61P17/00 

Изобретение относится к области медицины и может применяться для лечения людей с врожденным буллезным эпидермолизом (ВБЭ), а именно для лечения длительно незаживающих эрозивно-язвенных дефектов кожи у больных ВБЭ.

ВБЭ - клинически и генетически гетерогенная группа наследственных заболеваний кожи, характеризующаяся образованием пузырей и/или эрозий в ответ на незначительное механическое воздействие. Механическая слабость кожи обусловлена мутациями в генах структурных белков эпидермиса и дермо-эпидермального соединения, которые отвечают за прочность соединения эпидермиса и дермы.

Для ВБЭ характерна манифестация заболевания с рождения или первых дней, иногда и месяцев, жизни. Клиническая картина ВБЭ характеризуется разнообразием и зависит от клинического подтипа.

Такие клинические подтипы, как например, тяжелый генерализованный рецессивный дистрофический буллезный эпидермолиз (РДБЭ) или тяжелый генерализованный пограничный буллезный эпидермолиз сопровождаются распространенным поражением кожного покрова, слизистых оболочек внутренних органов и наличием множественных эрозивно-язвенных дефектов.

Тяжелый генерализованный подтип РДБЭ считается одной из самых прогностически неблагоприятных форм ВБЭ. Отличительной особенностью при тяжелом генерализованном РДБЭ являются длительно незаживающие эрозивно-язвенные дефекты кожи, которые могут сохраняться на коже от 1 месяца до нескольких лет даже при рациональной наружной терапии.

Возникновение длительно незаживающих эрозивно-язвенных дефектов кожи у больных тяжелым генерализованным РДБЭ связывают с рядом патогенетических факторов, препятствующих нормальному заживлению: образование биопленок на поверхности эрозий/язв бактериями; повышенная экспрессия провоспалительных цитокинов (IL-6, CXCL13, МСР-1, HMGB-1 и др.); отсутствие сально-волосяных фолликулов, являющихся источником регионарных стволовых клеток, в очагах рубцовой атрофии; дефицит коллагена VII типа, приводящего к снижению скорости миграции кератиноцитов с краев раны и созревания грануляционной ткани.

Длительно незаживающие эрозивно-язвенные дефекты кожи являются предрасполагающим фактором развития плоскоклеточного рака кожи (ПРК) у больных тяжелым генерализованным РДБЭ, который характеризуется агрессивным течением, быстрым ростом и метастазированием и множественными первичными очагами опухоли. ПРК является основной причиной смерти больных РДБЭ. Следовательно, оптимальной терапией для этого заболевания будет та, которую можно было бы внедрить на ранней стадии, чтобы предотвратить появление рубцов, а также образование пузырей.

Традиционная терапия больных ВБЭ заключается в проведении наружного лечения, включающего регулярные перевязки, применение неадгезивных перевязочных средств и лекарственных препаратов, стимулирующих процессы репарации. Основными принципами наружной терапии больных ВБЭ являются:

- предупреждение избыточного травмирования кожи во избежание формирования новых пузырей/эрозий/язв;

- купирование боли и зуда;

- рациональный уход за эрозиями/язвами с применением неадгезивных атравматичных перевязочных средств;

- профилактика развития вторичной инфекции.

Основной задачей перечисленных традиционных методов является защита кожи и предотвращение образования эрозивно-язвенных дефектов кожи, однако данные методы имеют кратковременный эффект.

Наряду с наружной терапией в настоящее время разрабатываются этиопатогенетические методы лечения (протеиновая, клеточная и генная терапия).

Известен описанный в статье способ лечения больных РДБЭ с длительно незаживающими дефектами кожи с применением внутрикожного введения суспензии аллогенных фибробластов (Petrof G. et al., 2013). Способ отличается тем, что аллогенные фибробласты (фибробласты из крайней плоти детей) вводили пациентам с эрозиями кожи, локализующимися на конечностях или туловище, площадь поверхности которых составляла от 5 до 50 см². Суспензию фибробластов вводили внутрикожно в дозе 0,25 мл с концентрацией 20×10⁶ клеток/мл вдоль 1 см края эрозии. Перед инъекциями проводили местную анестезию с использованием крема, содержащего лидокаин и прилокаин. В контрольной группе пациенты получали инъекции физиологического раствора, не содержащего клеточную культуру фибробластов. В результате на 7 день после введения суспензии процент закрытия общей площади ран пациентов составил около 50%, что было выше, чем у пациентов в контрольной группе, не получавших фибробласты (32-29%). Однако разница между группами исчезла через 28 дней. Через 6 месяцев средний размер площади эрозий составил 6,7 (5,4) см в основной группе и 4,8 (7,1) см в группе с физиологическим раствором. Процентное изменение площади эрозий для групп фибробластов и носителя значимо не отличалось через 6 месяцев. Достоинством описанного способа можно считать стимуляцию сокращения кожных ран у пациентов в первую неделю после инъекции. К недостаткам данного способа можно отнести отсутствие биосовместимого покрытия, закрывающего открытую раневую поверхность. Так же к недостаткам описанного способа относится кратковременный (7 дней) эффект стимуляции скорости сокращения размера ран (Petrof G., Martinez-Queipo M., Mellerio J.E. Fibroblast cell therapy enhances initial healing in recessive dystrophic epidermolysis bullosa wounds: results of a randomized, vehicle-controlled trial. Br J Dermatol 2013; 169 (5): 1025-1033;).

Известен способ местного лечения ран с применением биологической повязки, содержащей живые клетки линии диплоидных фибробластов человека (RU 2526811 С1), применяемая у пациентов с длительно незаживающими ранами различной этиологии. Техническое решение упомянутого способа направлено на создание биологической повязки с улучшенными свойствами за счет применения фибробластов человека линии М-20, обладающих более высокой пролиферативной активностью в результате культивирования их с добавлением фибринолитически активной плазмы (ФАП), что обеспечивает улучшение репаративных процессов в ране и сокращение времени заживления. Недостатком применения данной повязки с одним типом клеток (фибробластов) в сравнении с заявленным нами способом является отсутствие в составе данной повязки второго важнейшего компонента кожи - эпидермальных кератиноцитов, которые стимулируют синтез фибробластами коллагенов разного типа, и самостоятельно способны участвовать в организации базальной мембраны, формирование которой способствует ускорению собственной краевой эпителизации ран. Кроме того, небольшое число клеток (4-5) ×10⁴, используемое на 1 см² повязки, и однократная трансплантация повязки на поверхность раны, не смогут достаточно стимулировать репаративные процессы при ВБЭ (Хубутия М.Ш. и др., Способ местного лечения ран с помощью биологической повязки, содержащей живые клетки диплоидных фибробластов человека, патент №RU 2526811 С1 от 2013.07.09)

Известен опубликованный способ использования тканеинженерной кожи (Аплиграф) (Falabella AF, 2000) для лечения кожных ран у больных ВБЭ. Последовательные трансплантации тканеинженерной кожи способствовали постепенной эпителизации ран у большинства пациентов в течение 12-18 недель. К недостаткам данного способа в сравнении с предлагаемым способом лечения можно отнести отсутствие стимуляции выработки коллагенов, в частности коллагена VII типа, который не вырабатывается или синтезируется в дефектном виде у больных РДБЭ, тогда как трансплантированные путем инъекции в дерму фибробласты здорового донора способны синтезировать достаточное количество коллагена для обеспечения соединения эпидермиса и дермы (Falabella A.F., Valencia I.C., Eaglstein W.H., Schachner L.A. Tissue-engineered skin (Apligraf) in the healing of patients with epidermolysis bullosa wounds. Arch. Dermatol. 2000;136:1225-1230).

Известен способ восстановления кожного покрова у пациентов с обширными травматическими ранами с дефектом мягких тканей. Для этого выполняют иссечение утильной кожи по краям раны. Далее выполняется трансплантация на дно раны аллогенных мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток (ММСК) путем проведения инъекций суспензии ММСК на глубину 0,1-0,3 мм с частотой 10 инъекций на 1 см². Объем каждой инъекции составляет 0,05-0,1 мл. Дно раны укрывают стерильным дермальным матриксом (ДМ), моделированным по форме раны, с перфорациями для создания оттока раневого отделяемого, предпочтительно с частотой 1 перфорация длиной 5 мм на 1 см², затем рану укрывают стерильной марлевой повязкой. Первую перевязку проводят через 48 часов, оценивают наличие признаков воспаления, характер и количество раневого отделяемого, степень фиксации дермального матрикса. В дальнейшем перевязки проводят каждые 48 часов. Недостатками указанного способа являются: необходимость получения лоскутов аллогенной кожи высокого качества, выполнения адекватных условий ее хранения и транспортировки в случае, если трансплантацию невозможно сделать в день забора, при невозможности обеспечения условий хранения - проведение операции по трансплантации пациенту в день забора аллогенной кожи у донора («Способ восстановления кожного покрова у пациентов с обширными ранами с дефектом мягких тканей (варианты)» // Хубутия М.Ш., Боровкова Н.В., Хватов В.Б., Филиппов О.П., Клюквин И.Ю., Похитонов Д.Ю., Пономарев И.Н., Андреев Ю.В., Миронов А.С., Конюшко О.И. Патент RU 2 526 814 С1 от 17.06.2013 г.).

Наиболее близким к заявленному способу лечения, является способ лечения ран (RU 2023424С1), заключающийся в применении трансплантата культуры клеток фибробластов человека и проведением последующей аутодермопластики с использованием расщепленного сетчатого лоскута с перфорацией 1:6 и более или культуры аутоэпидермоцитов. Применение вышеуказанного способа лечения продемонстрировало хорошие результаты у пациентов с ожогами III-IV степени и трофическими язвами. У больных было достигнуто полное приживление трансплантата и заживление дефектов на 15, 21 и 24 дни. Недостатком данного способа является то, что у больных с ВБЭ его применение нецелесообразно ввиду травматичности процедуры аутодермопластики (Федоров В.Д. Способ лечения ран, Патент №RU 2023424 С1 от 1993.01.13)

Техническим результатом, достигаемым при реализации заявляемого способа, является закрытие эрозивно-язвенных дефектов у больных с ВБЭ, в том числе длительно незаживающих раневых поверхностей, в более ранние сроки с формированием полноценной полнослойной кожи. При этом вследствие своевременного восстановления целостности кожных покровов уменьшается риск проникновения инфекции, снижается потеря белков плазмы, происходит экономия донорских ресурсов кожи пациента, за счет использования ЖЭК. К техническому результату можно отнести сокращение сроков эпителизации длительно незаживающих эрозивно-язвенных дефектов кожи, восстановление экспрессии структурных белков кожи и предотвращение развития плоскоклеточного рака кожи.

Достижение технического результата осуществляется с помощью применения комбинации двух биомедицинских клеточных продуктов суспензии аллогенных фибробластов и живого эквивалента кожи. Причем, заявляемый способ отличается тем, что фибробласты используют в двух формах: на первом этапе лечения в виде суспензии и на втором этапе в составе живого эквивалента кожи.

Для достижения результата, заключающегося в синтезе коллагена VII типа донорскими фибробластами в дерме пациента и стимуляции скорости регенерациии на первых этапах лечения, проводят однократно внутрикожные инъекции суспензии культивированных аллогенных фибробластов человека по периферии эрозивно-язвенных дефектов в концентрации 20×10⁶ клеток/мл в 0,9% в физиологическом растворе. Инъекции фибробластов проводят внутрикожно папульно при помощи шприца объемом 2 мл с иглой 0,3×4 мм. Суспензию вводят общим объемом 1 мл, на расстоянии не более 0,5 см от края дефекта, по 0,1 мкл с интервалом между местами инъекций не более 1 см. После проведения инъекций на очаги поражения в качестве первичной повязки накладывают атравматическое раневое покрытие. Поверх раневого покрытия накладывается стерильная марлевая салфетка, фиксируемая бинтами.

Через 14 дней после иньекций на эрозии трансплантируют живой эквивалент кожи (ЖЭК), представляющей собой тканеинженерную конструкцию, состоящую из биосовместимой основы-носителя, аналога стромы - коллагенового геля, с заключенными в него стромальными клетками - дермальными фибробластами и эпителиальными клетками на поверхности. Основа-носитель отличается тем, что представляет собой тонкую желатиновую мелкоячеистую губку, толщиной не более 0,5 мм. Аналог стромы - коллагеновый гель входящий в состав ЖЭК, отличается тем, что представляет собой трехмерный гель из коллагена 1 типа и содержит равномерно распределенные в своей структуре стромальные клетки - дермальные фибробласты в концентрации 100 тыс/см³. Эпителиальные клетки на поверхности ЖЭК представляют собой слой культивированных аллогенных эпидермальных кератиноцитов человека в концентрации 100 тыс/см².

Технический результат стимуляции эпителизации эрозивно-язвенных дефектов достигают путем нанесения на поверхность ЖЭК из расчета 1 см² трансплантата на 1 см² эрозии/язвы. ЖЭК переносят на поверхность дефекта кожи с помощью стерильных пинцетов. Способ отличается тем, что верхняя сторона ЖЭК должна быть ориентирована «вверх». Далее на поверхность трансплантата накладывают атравматическое раневое покрытие с захватом не менее 1-2 см от краев дефекта. В качестве вторичной повязки применяют стерильные марлевые салфетки. Затем проводят фиксацию ЖЭК, первичной и вторичной повязок с помощью бинтов. Первую перевязку после трансплантации необходимо осуществлять не позднее 4-5-и суток после трансплантации.

Оценивают эффективность применения заявленного способа по следующим признакам:

- наличие тонкой корочки от серого до коричневого цвета, не плотно спаянной с подлежащими тканями;

- наличие тонкого, не стратифицированного эпителия (по типу эпителия, наблюдаемого при краевой эпителизации на самом краю раны). Признаками лизиса трансплантата считается не только его видимое отсутствие на ране, но также его разрыхление и приобретение им жидкой консистенции.

На более поздних сроках эффективностью применения заявляемого способя является наличие полной эпителизации раны и экспрессии коллагена VII типа в области восстановленного кожного покрова.

Пример. Больной Ж., 21 года, был госпитализирован в ФГБУ «Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии» Минздрава России с направительным диагнозом дистрофический буллезный эпидермолиз с жалобами на высыпания на коже лица, туловища, верхних и нижних конечностей, сопровождавшиеся болезненностью в области эрозий, на выпадение волос, изменения зубов, затруднение глотания пищи и жидкости.

Семейный анамнез: не отягощен. Беременность у матери протекала нормально, родился в срок.

Сопутствующие заболевания: Сужение пищевода 2 степени; Псевдосиндактилии и контрактуры пальцев кистей и стоп Железодефицитная анемия 1 степени, гипохромная.

Считает себя больным с рождения, когда впервые, со слов бабушки, в возрасте 3-х месяцев отметили появление пузырей на видимо неизмененной коже нижних конечностей при выполнении активных движений, в связи с чем на основании клинической картины заболевания по месту жительства был выставлен диагноз "Буллезный эпидермолиз", проводилась наружная терапия, без эффекта. Кожный процесс в течение жизни непрерывно прогрессировал, при механическом воздействии появлялись пузыри с серозным или геморрагическим содержимым, с гнойным отделяемым, на месте эрозий формировалась рубцовая ткань, в связи с чем самостоятельно использовалась наружная терапия (раствор Фукорцина, крем и гель Солкосерил, Актовегин, мазь Ируксол, топические глюкокортикостероидные препараты), без значительного положительного эффекта. Со слов пациента, с момента рождения отмечалась анонихия, деформация и синдактилия пальцев стоп. С 4-летнего возраста наблюдалась деформация суставов кистей. К возрасту 6 лет высыпания локализовались на коже верхних конечностей, живота, нижних конечностей, после 8 лет высыпания появились на коже спины, отмечались периоды обострения кожного процесса с подъемами температуры тела до 40 градусов, отечности, нагноения. Пациент неоднократно госпитализировался в медицинские учреждения, где проводилась антибактериальная терапия, терапия иммуноглобулином, антигистаминные препараты, наружная терапия, без значительного положительного эффекта. С 2006 г. на фоне использования цинксодержащих мазей и паст на безвазелиновой основе, геля и раствора Пронтосан, перевязочного материала Бранолинд отмечается незначительный положительный эффект в виде уменьшения нагноения и образования рубцовой ткани.

На протяжении всего периода заболевания отмечается наличие длительно незаживающих эрозий/язв, которые не поддаются терапии с применением атравматичных перевязочных средств и лекарсвтенных препаратов из группы репарантов и регенерантов тканей. В связи с очередным образованием длительно незаживающей эрозии на коже спины обратился в ФГБУ «Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии» Минздрава России.

При поступлении проведено лабораторное обследование пациентки: общий анализ крови, биохимический анализ крови, общий анализ мочи. У пациентки выявлена анемия со снижением содержания гемоглобина до 10,1 г/дл (референсные значения: 12-16 г/дл). Показатели биохимического анализа крови, включая общий белок, железо, трансферрин, были в пределах нормы. В общем анализе мочи - без патологических изменений.

Локальный статус при поступлении: патологический процесс носит распространенный характер, занимающий около 80% кожного покрова. Локализуется на слизистой оболочке полости рта, туловище, верхних и нижних конечностях. В ротовой полости, на слизистой оболочке внутренней поверхности обеих щек, на кончике, боковой поверхности языка справа и слева, внутренней поверхности нижней губы визуализируются множественные эрозии неправильных очертаний, белесовато-желтого цвета, от 0,5 до 0,7 см в диаметре, с обрывками эпителия по периферии. Кожа туловища, верхних и нижних конечностей преимущественно представлена обширными очагами атрофии и рубцовой ткани. На коже грудной клетки и живота, на фоне атрофии, имеются многочисленные эрозии ярко-красного цвета, неправильных очертаний, размерами от 1 до 3 см в диаметре, местами с геморрагическим отделяемым. Кроме того, в области грудной клетки наблюдаются множественные, трудно отделяющиеся слоистые, плотноватые корки грязно-желтого цвета. В области левой лопатки визуализируются 2 эрозивных дефекта ярко-красного цвета, неправильных очертаний, размерами 5×3,5 см и 5×4 см с периодически возникающим геморрагическим отделяемым. Наиболее обширные эрозии наблюдаются в аксиллярной и ягодичной областях, захватывающие практически всю их поверхность. В ягодичной области эрозивная поверхность покрыта обильными гнойными наслоениями. Часть эрозий находится в стадии эпителизации. На коже туловища и нижних конечностей располагаются единичные пузыри как с вялой, так и с плотной покрышкой, неправильной формы, размерами от 1 до 2 см в диаметре. У больного имеются микростомия, анкилоглоссия, заращение вестибулярных складок, анонихии кистей и стоп, контрактуры суставов кистей и стоп.

С целью подтверждения клинического диагноза была проведена биопсия кожи с последующим иммунофлюоресцентным антигенным картированием биоптата с использованием антител к кератинам 5 и 14 типа, α3-, β3- и γ2-цепям ламинина, α6 и β4 субъединицам интегрина, коллагену XVII типа, коллагену VII типа, плакофилину-1, десмоплакину, плектину и киндлину-1. В качестве контроля для проведения исследования методом непрямой иммунофлюоресценции использовали биоптат кожи здорового человека. При проведении иммунофлюоресцентного антигенного картирования в биоптате кожи выявлено нарушение экспрессии коллагена VII типа. Пациенту был подтвержден диагноз рецессивного дистрофического буллезного эпидермолиза.

В связи с наличием у пациента длительно незаживающего эрозивного дефекта на коже спины размером 5×3,5 см проведено внутрикожное введение 1 мл суспензии аллогенных фибробластов в концентрации 20×10⁶ кл/мл в 0,9% физиологическом растворе на расстоянии 0,5 см от края эрозии, свободной от гнойного отделяемого. Во время каждой инъекции вводилось 0,1 мкл суспензии. Интервал между инъекциями составил 0,5-0,7 см.

За 1 час до введения на кожу по периферии эрозии проводена местная анестезия с использованием крема, содержащего лидокаин и прилокаин.

Через 14 суток после инъекции проведена оценка клинической эффективности терапии. На 14 сутки наблюдалось уменьшение размера эрозии до 1,1×1,6 см. Учитывая то, что полной эпителизации дефекта не наступило, пациенту была проведена трансплантация ЖЭК на поверхность эрозии. Размер трансплантата составил 1,5×2 см². После трансплантации поверх ЖЭК были наложены первичная и вторичная повязки с дальнейшей их фиксацией атравматичным пластырем на силиконовой основе. Первая перевязка проведена на 5 сутки после трансплантации. После удаления повязок наблюдалась полная эпителизация эрозивного дефекта. Признаки трансплантата на поверхности эпителизировавшегося дефекта отсутствовали.

Для определения экспрессии коллагена VII типа проведена биопсия кожи из очага поражения с иммунофлюоресцентным исследование биоптата кожи. В биоптате выявлено восстановление экспрессии коллагена VII типа.

У пациента, получившего лечение комбинированным методом внутрикожного введения суспензии аллогенных фибробластов и трансплантации ЖЭК, в течение 3 месяце после проведенного лечения не наблюдалось появления пузырей и эрозий/язв в местах инъекций и трансплантации ЖЭК.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что внутрикожное введение аллогенных фибробластов и трансплантация ЖЭК способствует ускорению эпителизации, восстановлению экспрессии структурных белков в области дермо-эпидермального соединения и может быть эффективным методом терапии больных ВБЭ с длительно незаживающими эрозиями и язвами.

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для лечения больных врожденным буллезным эпидермолизом. Способ включает комбинированное применение аллогенных фибробластов человека и живого эквивалента кожи. Донорские клетки применяют путем последовательного применения двух типов трансплантаций донорских клеток. На первом этапе лечения длительно незаживающей эрозии/язвы кожи осуществляют однократное внутрикожное введение 1 мл суспензии аллогенных фибробластов человека в концентрации 20х10⁶ кл/мл на расстоянии не более 0,5 см от края эрозивно-язвенного дефекта по 0,1 мкл с интервалом между местами инъекций не более 1 см. На втором этапе в случае отсутствия полного заживления эрозии/язвы на 14 сутки после применения фибробластов в виде инъекций суспензии трансплантацию дермальных фибробластов и эпидермальных кератиноцитов производят в составе живого эквивалента кожи, содержащего биосовместимую основу-носитель, коллагеновый гель с распределенными в нем фибробластами в концентрации 100 тыс. на 1 мл геля и эпидермальные кератиноциты человека в количестве 100 тыс. на 1 см², трансплантируемого на поверхность длительно незаживающей эрозии/язвы кожи. Использование изобретения позволяет повысить экспрессию структурных белков кожи в области дермоэпидермального соединения и ускорить процесс заживления эрозивно-язвенных дефектов кожи. 1 пр.

Способ лечения больных врожденным буллезным эпидермолизом, включающий комбинированное применение двух типов трансплантаций донорских клеток в виде последовательного использования суспензии аллогенных фибробластов человека и живого эквивалента кожи, отличающийся тем, что на первом этапе лечения длительно незаживающей эрозии/язвы кожи осуществляют однократное внутрикожное папульное введение 1 мл суспензии аллогенных фибробластов человека в концентрации 20×10⁶ кл/мл на расстоянии не более 0,5 см от края эрозивно-язвенного дефекта по 0,1 мкл с интервалом между местами инъекций не более 1 см, а на втором этапе в случае отсутствия полного заживления эрозии/язвы на 14 сутки после применения фибробластов в виде инъекций суспензии трансплантацию дермальных фибробластов и эпидермальных кератиноцитов производят в составе живого эквивалента кожи, содержащего биосовместимую основу-носитель, коллагеновый гель с распределенными в нем фибробластами в концентрации 100 тыс. на 1 мл геля и эпидермальные кератиноциты человека в количестве 100 тыс. на 1 см², трансплантируемого на поверхность длительно незаживающей эрозии/язвы кожи.