Улучшенный способ получения конъюгата физиологически активного полипептида с высоким выходом Российский патент 2019 года по МПК C07K14/62 C07K16/00 C07K19/00 A61K38/28 A61K47/68 

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

1. Область изобретения

Настоящее изобретение относится к способу получения конъюгата путем связывания физиологически активного полипептида, непептидильного полимерного линкера и константной области иммуноглобулина посредством ковалентной связи. Более конкретно, настоящее изобретение относится к способу эффективного получения конъюгата физиологически активного полипептида, при котором в реакции сочетания для преодоления проблемы низкого выхода продукта во время получения конъюгата физиологически активного полипептида используют соль.

2. Предшествующий уровень техники

Физиологически активные полипептиды обычно легко денатурируют благодаря своей низкой стабильности и разрушаются протеингидролазой в крови, быстро удаляясь через почки или печень. Таким образом, для поддержания концентрации в крови и эффективности белковых медикаментов, включающих физиологически активный полипептид в качестве фармакологически активного ингредиента, необходимо частое введение пациентам лекарственного средства на основе белка. Однако, в случае белковых лекарств, вводимых пациентам главным образом в форме инъецируемой композиции, частые инъекции для поддержания концентрации в крови физиологически активных полипептидов могут привести к чрезмерным страданиям пациентов и высокой стоимости лечения. Для решения этих проблем постоянно осуществляли попытки максимального увеличения фармакологической эффективности путем увеличения стабильности белковых лекарственных средств в крови и поддержания концентрации лекарственного средства в крови в течение более длительного периода времени. Такие композиции белковых лекарственных средств длительного действия требуются для увеличения стабильности белковых лекарственных средств и в то же самое время для поддержания эффективности самих лекарственных средств на достаточно высоком уровне, а также для того, чтобы не вызвать иммунную реакцию у пациентов.

В документах предшествующего уровня техники для стабилизации белков и ингибирования контакта с протеингидролазой и выведения через почки использовали способ химического присоединения полимеров, обладающих высокой растворимостью, таких как полиэтиленгликоль (далее называемый "ПЭГ"), к поверхности белковых лекарственных средств. Известно, что ПЭГ эффективны для стабилизации белков и предупреждения гидролиза белков путем неспецифического связывания ПЭГ со специфическим сайтом или различными сайтами белка-мишени для увеличения растворимости белка и не вызывают каких-либо неблагоприятных побочных эффектов (Sada et al., J. Fermentation Bioengineering 71: 137-139, 1991).

Тем не менее, в способе с использованием ПЭГ, несмотря на его способность увеличивать время обращения пептидных лекарственных средств путем увеличения молекулярной массы ПЭГ, эффективность пептидного лекарственного средства значительно уменьшается и реакционная способность ПЭГ с пептидами уменьшается одновременно с увеличением молекулярной массы, тем самым приводя к уменьшению выхода.

Кроме того, проблемы низкого выхода ПЭГилирования и неспецифичности может преодолеть способ получения слитого белка фрагмента иммуноглобулина и физиологически активного полипептида, однако ему присущи проблемы, заключающиеся в том, что увеличение периода полувыведения из крови не является ощутимо высоким в противоположность ожиданию, и в том, что в некоторых случаях он обладает низким титром. Для доведения до максимума эффекта увеличения периода полувыведения из крови также можно использовать различные типы линкеров, однако также может существовать и вероятность вызвать иммунологическую реакцию. Кроме того, существуют проблемы, заключающиеся в том, что в случаях, когда используют пептиды, имеющие дисульфидные связи, такие как BNP, применение осложняется вследствие высокой вероятности ошибочного фолдинга, а в случаях, когда присутствуют ненативные аминокислотные остатки, получение в форме генетического рекомбинанта не является возможным.

Инсулин является пептидом, секретируемым бета-клетками поджелудочной железы человека, представляя собой вещество, которое играет очень важную роль в контролировании уровня глюкозы в крови организма. В случаях, когда инсулин секретируется не надлежащим образом или секретированный инсулин не надлежащим образом действует в организме, уровень глюкозы в крови организма не удается контролировать и он увеличивается, вызывая, тем самым, состояние, называемое диабетом. Изложенный выше случай называется сахарным диабетом 2 типа, а случай, когда инсулин не секретируется из поджелудочной железы с увеличением уровня глюкозы в крови, называется сахарным диабетом 1 типа. Сахарный диабет 2 типа лечат с помощью перорально вводимого гипогликемического агента, включающего в качестве основного компонента химическое вещество, и некоторых пациентов также лечат инсулином. С другой стороны, введение инсулина требуется для лечения сахарного диабета 1 типа.

Инсулиновая терапия, широко применяемая в настоящее время, представляет собой способ введения инсулина посредством инъекции до и после приема пищи. Однако для такой инсулиновой терапии требуется, чтобы инсулин постоянно вводили трижды в сутки, и поэтому она приводит к гораздо большим страданиям пациентам и неудобствам. Для преодоления таких проблем были предприняты различные попытки. Одна из них представляла собой попытку доставить пептидные лекарственные средства в организм путем ингаляции через ротовую или назальную полости посредством увеличения проницаемости биологической мембраны к пептидным лекарственным средствам. Однако такой способ обладает значительно меньшей эффективностью доставки в организм по сравнения с инъекцией, и, таким образом, все еще существует множество трудностей в отношении поддержания активности пептидных лекарственных средств in vivo в требуемых условиях.

Кроме того, предпринимались попытки осуществить способы замедления абсорбции после подкожного введения избыточных количеств лекарственных средств. Согласно этому, сообщали о способах поддержания концентрации лекарственных средств в крови путем только разового суточного введения. Некоторые одобрены в качестве медицинского продукта (например, Lantus, Sanofi-aventis) и их вводят пациентам в настоящее время. Исследования совершенствовались в сторону модификации инсулина жирными кислотами для усиления связывания инсулинового полимера и для увеличения длительности путем связывания с альбумином, присутствующим в области введения и в крови, и лекарственные средства, полученные с использованием такого способа, одобрены в качестве медицинских продуктов (Levemir, NovoNordisk). Однако такие способы обладают побочным эффектом, заключающимся в том, что вызывают боль в области введения и, кроме того, интервал между введениями, представляющими собой разовую ежесуточную инъекцию, все же накладывает значительное бремя на пациентов.

Для решения этих проблем авторы настоящего изобретения получили комплекс, содержащий физиологически активный полипептид и константную область иммуноглобулина, с использованием непептидильного полимера в качестве линкера в качестве стратегии для одновременного доведения до максимума увеличения периода полувыведения из крови и поддержания активности in vivo физиологически активных полипептидов, включающих инсулин. Однако все еще сохраняется потребность в способе получения комплекса с высокими выходом и чистотой, поскольку составляющие конъюгат исходные материалы являются дорогими. При таком предшествующем уровне техники авторы настоящего изобретения обнаружили, что когда в реакционный раствор на стадии реакции сочетания во время получения комплекса добавляют соль подходящего типа и в подходящей концентрации, тогда комплекс физиологически активного полипептида может быть получен с высокими выходом и чистотой, и себестоимость продукции может быть уменьшена, дополняя, тем самым, настоящее изобретение.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Задача настоящего изобретения заключается в обеспечении эффективного способа, способного улучшить низкий выход продукта во время получения комплекса путем связывания физиологически активного полипептида, непептидильного полимерного линкера и константной области иммуноглобулина посредством ковалентной связи.

В одном из аспектов для достижения вышеприведенной задачи в настоящем изобретении предложен способ получения комплекса физиологически активный полипептид - непептидильный полимер - константная область иммуноглобулина, включающий стадии: (1) взаимодействия непептидильного полимера с одним из следующего: физиологически активного полипептида или константной области иммуноглобулина; и (2) взаимодействия реакционной смеси со стадии (1) с другим из следующего: физиологически активного полипептида или константной области иммуноглобулина в присутствии соли.

Предпочтительно, непептидильный полимер может иметь каждый независимо функциональную группу, выбранную из группы, состоящей из альдегидного производного, малеимидного производного и сукцинимидного производного на обоих своих концах.

Более предпочтительно, непептидильный полимер можно связать с физиологически активным полипептидом и константной областью иммуноглобулина посредством функциональных групп на обоих его концах с образованием ковалентной связи.

Предпочтительно, способ может дополнительно включать стадию отделения конъюгата физиологически активный полипептид - непептидильный полимер или конъюгата константная область иммуноглобулина непептидильный полимер от реакционной смеси после стадии (1).

Предпочтительно, соль может быть выбрана из группы, состоящей из хлорида натрия, ацетата натрия, сульфата натрия, фосфата натрия, карбоната натрия, цианида натрия, цитрата натрия, нитрата натрия, хлорида калия, ацетата калия, сульфата калия, фосфата калия, карбоната калия, цианида калия, цитрата калия, нитрата калия, хлорида магния, ацетата магния, сульфата магния, фосфата магния, карбоната магния, цианида магния, цитрата магния, нитрата магния, хлорида аммония, ацетата аммония, сульфата аммония, фосфата аммония, карбоната аммония, цианида аммония, цитрата аммония, нитрата аммония, хлорида кальция, ацетата кальция, сульфата кальция, фосфата кальция, карбоната кальция, цианида кальция, цитрата кальция и нитрата кальция.

Более предпочтительно, соль может быть выбрана из группы, состоящей из хлорида натрия, ацетата натрия, сульфата натрия, фосфата натрия и хлорида калия.

Предпочтительно, соль может быть добавлена до конечной концентрации от 0,1 до 3,0 М.

Более предпочтительно, соль может быть добавлена до конечной концентрации от 0,3 до 2,5 М.

Предпочтительно, если соль представляет собой хлорид натрия, то она может быть добавлена до конечной концентрации меньше чем 3,0 М; если соль представляет собой ацетат натрия, то она может быть добавлена до конечной концентрации меньше чем 2,5 М; если соль представляет собой сульфат натрия, то она может быть добавлена до конечной концентрации меньше чем 0,7 М; если соль представляет собой фосфат натрия, то она может быть добавлена до конечной концентрации меньше чем 0,8 М; или если соль представляет собой хлорид калия, то она может быть добавлена до конечной концентрации 1,0 М или меньше.

Предпочтительно, время реакции на стадии (2) может составлять от 4 до 18 часов.

Предпочтительно, температура реакции на стадии (2) может составлять от 0 до 25°С.

Предпочтительно, если непептидильный полимер имеет одно или более альдегидных производных в качестве функциональных групп, то реакционная смесь дополнительно содержит восстановитель с конечной концентрацией от 1 до 100 мМ.

Предпочтительно, стадия (1) может быть осуществлена при рН от 5,0 до 6,5, и стадия (2) может быть осуществлена при рН от 6,0 до 8,5.

Предпочтительно, на стадии (1) непептидильный полимер может взаимодействовать с физиологически активным полипептидом, а на стадии (2) реакционная смесь со стадии (1) может взаимодействовать с константной областью иммуноглобулина.

Предпочтительно, на стадии (1) физиологически активный полипептид и непептидильный полимер могут взаимодействовать друг с другом при мольном отношении от 1:1 до 1:20, а на стадии (2) продукт со стадии (1) и константная область иммуноглобулина могут взаимодействовать друг с другом при мольном отношении от 1:0,5 до 1:10.

Более предпочтительно, стадия (2) может быть осуществлена в присутствии хлорида натрия, добавленного до конечной концентрации меньше чем 3,0 М; ацетата натрия, добавленного до конечной концентрации меньше чем 2,5 М; сульфата натрия, добавленного до конечной концентрации меньше чем 0,7 М; фосфата натрия, добавленного до конечной концентрации меньше чем 0,8 М; или хлорида калия, добавленного до конечной концентрации 1,0 М или меньше.

Предпочтительно, функциональные группы непептидильного полимера можно связать с аминной группой, присутствующей на N-конце или в боковой цепи Lys остатка физиологически активного полипептида и константной области иммуноглобулина.

Предпочтительно, непептидильный полимер может быть выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликолей, полипропиленгликолей, сополимеров этиленгликоля и пропиленгликоля, полиоксиэтилированных полиолов, поливиниловых спиртов, полисахаридов, декстранов, поливинилэтиловых эфиров, полимолочной кислоты (PLA), сополимера молочной и гликолевой кислот (PLGA), липидных полимеров, хитинов, гиалуроновой кислоты и их комбинации.

Более предпочтительно, непептидильный полимер может представлять собой полиэтиленгликоль.

Предпочтительно, непептидильный полимер может иметь молекулярную массу в диапазоне от 1 до 100 кДа.

Предпочтительно, константная область иммуноглобулина может быть агликозилирована.

Предпочтительно, константная область иммуноглобулина может состоять из от одного до четырех доменов, выбранных из группы, состоящей из доменов СН1, СН2, СН3 и СН4.

Предпочтительно, константная область иммуноглобулина может дополнительно включать шарнирную область.

Предпочтительно, константная область иммуноглобулина может быть выбрана из группы, состоящей из константных областей, происходящих из IgG, IgA, IgD, IgE, IgM, их комбинаций и их гибридов.

Предпочтительно, константная область иммуноглобулина может быть выбрана из группы, состоящей из константных областей IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, их комбинаций и их гибридов.

Более предпочтительно, константная область иммуноглобулина может представлять собой Fc область IgG4.

Еще более предпочтительно, константная область иммуноглобулина может представлять собой агликозилированную Fc область IgG4 человека.

Предпочтительно, физиологически активный полипептид может быть выбран из группы, состоящей из гормона роста человека, высвобождающих гормон роста гормонов, высвобождающих гормон роста пептидов, интерферона, рецепторов интерферона, колониестимулирующих факторов, глюкагоноподобных пептидов (GLP-1 и так далее), оксинтомодулина, рецепторов, связанных с белком G, интерлейкинов, рецепторов интерлейкинов, ферментов, интерлейкин-связывающих белков, цитокин-связывающих белков, факторов активации макрофагов, макрофагальных пептидов, В-клеточных факторов, Т-клеточных факторов, белка А, ингибиторов аллергии, гликопротеинов некроза клеток, иммунотоксинов, лимфотоксинов, фактора некроза опухоли, опухолевых супрессоров, трансформирующего фактора роста, альфа-1 антитрипсина, альбумина, α-лактальбумина, аполипопротеина-Е, эритропоэтина, гликозилированного эритропоэтина, ангиопоэтинов, гемоглобина, тромбина, активирующих рецептор тромбина пептидов, тромбомодулина, фактора крови VII, VIIa, VIII, IX и XIII, активаторов плазминогена, фибрин-связывающих пептидов, урокиназы, стрептокиназы, гирудина, белка С, С-реактивного белка, ингибитора ренина, ингибитора коллагеназы, супероксиддисмутазы, лептина, тромбоцитарного фактора роста, эпителиального фактора роста, эпидермального фактора роста, ангиостатина, ангиотензина, фактора роста костей, белка, стимулирующего рост костей, кальцитонина, инсулина, атриопептина, фактора, индуцирующего образование хряща, элкатонина, фактора активации соединительной ткани, ингибитора пути тканевого фактора, фолликуло-стимулирующего гормона, лютеинизирующего гормона, рилизинг-фактора лютеинизирующего гормона, факторов роста нервной ткани, паратиреоидного гормона, релаксина, секретина, соматомедина, инсулиноподобного фактора роста, гормона коры надпочечников, глюкагона, холецистокинина, панкреатического полипептида, пептида, высвобождающего гастрин, рилизинг-фактора кортикотропина, тиреоидстимулирующего гормона, аутотаксина, лактоферрина, миостатина, антигенов клеточной поверхности, вирусных вакцинных антигенов, моноклональных антител, поликлональных антител и фрагментов антител.

Более предпочтительно, физиологически активный полипептид может представлять собой инсулин.

Предпочтительно, на стадии (1) физиологически активный полипептид и непептидильный полимер могут взаимодействовать друг с другом при мольном отношении от 1:1 до 1:20 в условиях рН от 5,0 до 6,5, а на стадии (2), реакционная смесь со стадии (1) и константная область иммуноглобулина могут взаимодействовать друг с другом при мольном отношении от 1:0,5 до 1:10 в условиях рН от 6,0 до 8,5 в присутствии соли, где, если соль представляет собой хлорид натрия, то она может быть добавлена до конечной концентрации меньше чем 3,0 М, если соль представляет собой ацетат натрия, то она может быть добавлена до конечной концентрации меньше чем 2,5 М, если соль представляет собой сульфат натрия, то она может быть добавлена до конечной концентрации меньше чем 0,7 М, если соль представляет собой фосфат натрия, то она может быть добавлена до конечной концентрации меньше чем 0,8 М, или если соль представляет собой хлорид калия, то она может быть добавлена до конечной концентрации 1,0 М или меньше.

ТЕХНИЧЕСКИЙ РЕЗУЛЬТАТ

Комплекс физиологически активный полипептид - непептидильный полимер - константная область иммуноглобулина может быть получен с высокими чистотой и выходом с помощью способа получения по настоящему изобретению. Благодаря способу, используемому для получения комплекса физиологически активного полипептида, себестоимость продукции может быть снижена, что приводит к улучшениям в отношении промышленной применимости и соблюдения режима приема препарата. Таким образом, этот способ может быть использован для разработки композиций длительного действия физиологически активных полипептидов.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На Фиг. 1 представлен профиль, демонстрирующий результат очистки растворов после реакции сочетания в Примерах 2 и 3 на колонке Source 15Q, в соответствии с которым можно сравнить содержание непрореагировавшего Fc иммуноглобулина, инсулинового комплекса длительного действия (комплекс инсулин-ПЭГ-Fc фрагмент иммуноглобулина) и примесей.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВОПЛОЩЕНИЙ

В одном из аспектов для достижения вышеприведенных задач в настоящем изобретении предложен способ получения комплекса физиологически активный полипептид - непептидильный полимер - константная область иммуноглобулина, включающий стадии: (1) взаимодействия непептидильного полимера с одним из следующего: физиологически активного полипептида или константной области иммуноглобулина; и (2) взаимодействия реакционной смеси со стадии (1) с другим из следующего: физиологически активного полипептида или константной области иммуноглобулина в присутствии соли.

Стадия (1) представляет собой стадию связывания физиологически активного полипептида или константной области иммуноглобулина с непептидильным полимером, и может быть использован известный способ, применяемый для связывания непептидильного полимера с физиологически активным полипептидом или константной областью иммуноглобулина. Например, этого можно достичь путем их взаимодействия при температуре от 0 до 25°С в течение от 1 до 16 часов. Предпочтительно, один непептидильный полимер можно ковалентно связать с физиологически активным полипептидом или константной областью иммуноглобулина через функциональную группу путем реакции с образованием ковалентной связи. В то же самое время, в соответствии с типом функциональной группы, принимающей участие в реакции, восстановитель может быть дополнительно включен в концентрации от 1 до 20 мМ для осуществления реакции.

Непептидильный полимер можно связать с физиологически активным полипептидом и константной областью иммуноглобулина посредством включенных в него функциональных групп, образующих ковалентные связи. Предпочтительно, функциональные группы непептидильного полимера можно связать с аминной группой, присутствующей на N-конце или в боковой цепи Lys остатка физиологически активного полипептида и константной области иммуноглобулина. В этой связи положение Lys остатка в физиологически активном полипептиде и константной области иммуноглобулина не ограничено специфическим сайтом. Остаток Lys не ограничен природным Lys, и без ограничения включены неприродные аминокислоты и Lys производные, при условии, что они содержат аминные группы, способные связаться с функциональными группами непептидильного полимера.

Реакционная смесь может включать продукты реакции, такие как конъюгат непептидильного полимера и физиологически активного полипептида или конъюгат непептидильного полимера и константной области иммуноглобулина, и непрореагировавшую реакционную смесь. Таким образом, после стадии (1) может быть дополнительно включена стадия отделения конъюгата физиологически активный полипептид - непептидильный полимер или конъюгата константная область иммуноглобулина - непептидильный полимер от реакционной смеси.

Используемый в данном описании термин "непептидильный полимер" относится к биологически совместимому полимеру, состоящему из двух или более чем двух повторяющихся звеньев, которые удерживаются вместе посредством произвольной ковалентной связи, отличающейся от пептидной связи. Примеры непептидильного полимера, полезного в настоящем изобретении, включают полиэтиленгликоли, полипропиленгликоли, сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля, полиоксиэтилированные полиолы, поливиниловые спирты, полисахариды, декстраны, поливинилэтиловые эфиры, биоразлагаемые полимеры, такие как полимолочная кислота (PLA) и сополимер молочной и гликолевой кислот (PLGA), липидные полимеры, хитины, гиалуроновую кислоту и их комбинации, причем предпочтительным является полиэтиленгликоль (ПЭГ). Их производные, которые хорошо известны в области техники, и производные, которые могут быть легко получены с использованием способов, известных в области техники, также находятся в объеме настоящего изобретения.

Пептидные линкеры, используемые в слитом белке, полученном в соответствии со способом внутрирамочного слияния из предшествующего уровня техники, имеют недостаток, заключающийся в том, что они легко расщепляются in vivo протеолитическими ферментами, и поэтому какое-либо увеличение периода полувыведения из крови активных лекарственных средств вследствие использования соответствующего носителя не оправдывает ожиданий. Однако в настоящем изобретении обнаружено, что период полувыведения пептида из крови похож на период полувыведения носителя благодаря использованию полимеров, устойчивых к протеолитическим ферментам. Таким образом, согласно настоящему изобретению, любой полимер, обладающий указанной выше функцией, то есть обладающий устойчивостью in vivo к протеолитическому ферменту, может быть использован в качестве непептидного полимера без какого-либо ограничения. Непептидные полимеры имеют молекулярную массу в диапазоне от 1 до 100 кДа, и предпочтительно в диапазоне от 1 до 20 кДа. Дополнительно, непептидный полимер по настоящему изобретению, который следует конъюгировать с физиологически активным полипептидом, может представлять собой не только полимер одного типа, но и комбинацию различных типов полимеров.

Непептидные полимеры, применяемые в настоящем изобретении, обладают функциональными группами, которые могут конъюгироваться с Fc областью иммуноглобулина и белковым лекарственным средством.

Предпочтительно, непептидильный полимер можно связать с аминной группой или тиоловой группой в боковой цепи аминокислотного остатка физиологически активного полипептида с образованием пептида, гемитиоацеталя, имина или тиодиоксопирролидинильной связи.

Неограничивающие примеры концевых функциональных групп непептидных полимеров могут включать альдегидные производные, такие как пропиональдегидная группа и бутиральдегидная группа, малеимидные производные и сукцинимидные производные. Сукцинимидные производные могут включать сукцинимидилкарбоксиметил, сукцинимидилвалерат, сукцинимидилметилбутаноат, сукцинимидилметилпропионат, сукцинимидилбутаноат, сукцинимидилпропионат, N-гидроксисукцинимид или сукцинимидилкарбонат, но не ограничиваются ими. Без ограничения могут быть использованы функциональные группы, которые можно селективно связать с аминной группой или тиоловой группой аминокислотного остатка Fc области иммуноглобулина и физиологически активного полипептида с образованием ковалентной связи.

Функциональные группы на обоих концах непептидильного полимера могут быть одинаковыми или отличающимися друг от друга. Например, непептидный полимер может нести сукцинимидную группу на одном конце и альдегидное производное, такое как пропиональдегидная группа или бутиральдегидная группа, на другом конце. Если в качестве непептидильного полимера применяют полиэтиленгликоль, имеющий на обоих своих концах реакционноспособную гидроксигруппу, то гидроксигруппа может быть активирована до различных функциональных групп при помощи известных химических реакций, или для получения белкового комплекса по настоящему изобретению можно использовать имеющийся в продаже полиэтиленгликоль, имеющий модифицированную функциональную группу.

Предпочтительно, непептидильный полимер может иметь пропиональдегидные группы в качестве функциональных групп на обоих концах.

Конъюгирование с ПЭГ, который обычно используют для приготовления белковых композиций длительного действия, увеличивает стабильность белков, при этом большие молекулярные массы ПЭГ демонстрируют более низкую реакционную способность по отношению к белкам и, таким образом, уменьшают выход продукта. Поскольку выход продукта тесно коррелирует с себестоимостью продукции и соответствующей промышленной применимостью, очень важно увеличить выход продукта. ПЭГ с альдегидными функциональными группами можно связать с аминной группой, которая присутствует на N-конце или на группе R Lys остатка полипептида. Выход ПЭГилирования может варьировать в зависимости от мольного отношения ПЭГ к белкам, концентрации реакционных растворов, времени реакции, рН, температуры и т.д.

Однако если в качестве линкера между двумя различными полипептидами используют непептидильный полимер, содержащий ПЭГ с двумя или более чем двумя функциональными группами, то требуются две или более чем две стадии в реакциях, что, таким образом, приводит к уменьшению суммарного выхода. В частности, обнаружено, что стадия второй реакции (на которой физиологически активный полипептид или константная область иммуноглобулина, конъюгированный(ая) с непептидильным полимером, имеющим две или более чем две функциональные группы, взаимодействует с константной областью иммуноглобулина или физиологически активным полипептидом, соответственно; далее называемой "реакцией сочетания") протекает со значительно меньшим выходом по сравнению со стадией первой реакции, на которой физиологически активный полипептид или константная область иммуноглобулина взаимодействует с непептидильным полимером, имеющим две или более чем две функциональные группы.

Авторы настоящего изобретения обнаружили корреляцию между добавлением соли во время реакции сочетания и выходом реакции и утверждают, что выход реакции сочетания улучшается путем использования соли.

Соль по настоящему изобретению представляет собой ионное соединение, которое имеет нейтральный суммарный заряд вследствие образования электрических связей между равными количествами анионов и катионов (с учетом валентности ионов) и диссоцииирует на катионы и анионы в водном растворе. Что касается задач настоящего изобретения, то в реакционный раствор может быть добавлена соль, так что конъюгат непептидильного полимера и физиологически активного полипептида или конъюгат непептидильного полимера и константной области иммуноглобулина связывается с константной областью иммуноглобулина или физиологически активным полипептидом с образованием ковалентной связи. Общепринятые солеобразующие катионы включают аммоний (NH₄⁺), кальций (Са²⁺), железо (Fe²⁺ или Fe³⁺), магний (Mg²⁺), калий (K⁺), пиридиний (C₅H₅NH⁺), четвертичный аммоний (NR₄⁺) или натрий (Na⁺), а анионы могут включать ацетат (СН₃СОО-), карбонат (CO₃^2-), хлорид (Cl^-), цитрат (НОС(СОО-)(СН₂СОО^-)₂), цианид (CN), нитрат (NO₃^-), нитрит (NO₂^-), фосфат (PO₄^3-) или сульфат (SO₄^2-). Соль может быть образована из комбинаций вышеописанных катионов и анионов. Соль может представлять собой соль, типично применяемую в области техники, предпочтительно хлорид натрия, ацетат натрия, сульфат натрия, фосфат натрия, карбонат натрия, цианид натрия, цитрат натрия, нитрат натрия, хлорид калия, ацетат калия, сульфат калия, фосфат калия, карбонат калия, цианид калия, цитрат калия, нитрат калия, хлорид магния, ацетат магния, сульфат магния, фосфат магния, карбонат магния, цианид магния, цитрат магния, нитрат магния, хлорид аммония, ацетат аммония, сульфат аммония, фосфат аммония, карбонат аммония, цианид аммония, цитрат аммония, нитрат аммония, хлорид кальция, ацетат кальция, сульфат кальция, фосфат кальция, карбонат кальция, цианид кальция, цитрат кальция или нитрат кальция, но не ограничивается ими. Более предпочтительно, соль может представлять собой хлорид натрия, ацетат натрия, сульфат натрия, фосфат натрия или хлорид калия. Соль, которая является подходящей, может быть легко выбрана в зависимости от типа физиологически активного полипептида и растворителя для реакции.

Соль может быть включена в реакционный раствор таким образом, что непептидильный полимер, связанный с физиологически активным полипептидом или константной областью иммуноглобулина посредством одной функциональной группы, эффективно связывается с константной областью иммуноглобулина или физиологически активным полипептидом посредством другой функциональной группы. Для увеличения выхода реакции сочетания непептидильного полимера конечная концентрация соли может быть относительно высокой, например меньше чем 3,0 М. Нижний предел концентрации соли может быть определен в повторных экспериментах, и в качестве подходящего диапазона концентрации соли, например, можно предложить такой, когда соль включена в конечной концентрации от 0,1 до 3 М, и более конкретно в конечной концентрации от 0,3 до 2,5 М, во время реакции сочетания.

Предпочтительно, если соль представляет собой хлорид натрия, то она может быть добавлена до конечной концентрации меньше чем 3,0 М, если соль представляет собой ацетат натрия, то она может быть добавлена до конечной концентрации меньше чем 2,5 М, если соль представляет собой сульфат натрия, то она может быть добавлена до конечной концентрации меньше чем 0,7 М, если соль представляет собой фосфат натрия, то она может быть добавлена до конечной концентрации меньше чем 0,8 М, или, если соль представляет собой хлорид калия, то она может быть добавлена до конечной концентрации 1,0 М или меньше. Если концентрация соли превышает вышеприведенный диапазон в соответствии с типом соли, то выход увеличивается, однако может иметь место нежелательная агломерация. Комплексы можно получить, несмотря на имеющее место агломерацию, однако возникают трудности при реализации способа. Таким образом, с точки зрения удобства способа предпочтительно, когда соль добавляют до концентрации, не вызывающей чрезмерную агломерацию, то есть не приводящей ни к агломерации, ни к следовому количеству агломератов. Например, когда добавление соли во время реакции сочетания увеличивает общий выход по сравнению с состоянием до добавления соли, несмотря на агломерацию, такая агломерация является приемлемой до тех пор, пока она не вызывает серьезных проблем с разделением и/или очисткой.

В конкретном воплощении настоящего изобретения, когда комплекс получали путем связывания инсулина, ПЭГ линкера, содержащего две альдегидные группы в качестве функциональных групп, и константной области иммуноглобулина, тогда реакцию оставляли протекать при использовании соли в различных условиях для увеличения выхода. Обнаружено, что использование соли во время реакции сочетания улучшает выход (Таблица 1). Дополнительно, авторы настоящего изобретения обнаружили, что улучшения выхода реакции сочетания путем добавления соли можно достичь путем предупреждения образования примесей вследствие побочной реакции, например путем предупреждения образования мультимеров, которые могут образовываться при связывании двух различных конъюгатов инсулин-ПЭГ с двумя N-концами одной константной области иммуноглобулина (Фиг. 1).

В настоящем изобретении реакция сочетания, то есть реакция на стадии (2), может быть предпочтительно осуществлена в течение от 4 до 18 часов. Дополнительно, реакция сочетания может быть осуществлена при температуре от 0 до 25°С. Тем не менее, условия реакции не ограничиваются указанными.

В настоящем изобретении, если непептидильный полимер имеет одно или более чем альдегидных производных в качестве функциональных групп, то реакционная смесь может дополнительно содержать восстановитель с конечной концентрацией от 1 до 100 мМ.

В настоящем изобретении восстановитель означает соединение, функция которого заключается в восстановлении обратимой двойной иминной связи, образованной в результате реакции между альдегидной группой непептидильного полимера и аминогруппой полипептидов (физиологически активного полипептида, константной области иммуноглобулина), с образованием, посредством этого, ковалентной связи, и, как предполагается, он охватывает все восстановители, известные в области техники. Что касается задач настоящего изобретения, то восстановитель может быть добавлен к реакционному раствору, в котором непептидильный полимер образует ковалентную связь с физиологически активным полипептидом или константной областью иммуноглобулина. Любой типично используемый в области техники восстановитель может быть использован в настоящем изобретении. Предпочтительно, примеры восстановителя могут включать цианоборгидрид натрия, комплекс боран-пиридин, боргидрид натрия, комплекс боран-диметиламин, комплекс боран-триметиламин или триацетоксиборгидрид натрия, но не ограничиваются ими. Отвечающий требованиям восстановитель может легко быть выбран в зависимости от типов физиологически активного полипептида или константной области иммуноглобулина и растворителя для реакции.

Восстановитель включают в реакционный раствор для конъюгирования физиологически активного полипептида или константной области иммуноглобулина с непептидильным полимером. Восстановитель может быть включен в концентрации от 1 до примерно 20 мМ для реакции физиологически активного полипептида с непептидильным полимером или константной областью иммуноглобулина и непептидильным полимером (реакция стадии (1)), и в концентрации от 1 до примерно 100 мМ для реакции сочетания (реакция стадии (2)).

Предпочтительно, стадия (1) может быть осуществлена при рН от 5,0 до 6,5, и стадия (2) может быть осуществлена при рН от 6,0 до 8,5. Кроме того, реакция может быть осуществлена в условиях, при которых ионная сила контролируется в диапазоне от 20 до 500 мМ путем использования цитрата натрия и фосфата калия или HEPES, но не ограничивается им.

В конкретном воплощении настоящего изобретения ПЭГ, имеющий пропиональдегиды в качестве функциональных групп на обоих своих концах, использовали в качестве непептидильного полимера и подвергали взаимодействию с инсулином в качестве физиологически активного полипептида с получением конъюгата ПЭГ-инсулин, а затем осуществляли реакцию сочетания с константной области иммуноглобулина в присутствии соли с получением комплекса инсулин-ПЭГ-константная область иммуноглобулина.

Как описано выше, связь с непептидильным полимером образуется между функциональными группами непептидильного полимера и аминной группой, присутствующей на N-конце физиологически активного полипептида или константной области иммуноглобулина, либо аминной группой или тиольной группой в боковой цепи аминокислотного остатка, являющего их частью. При этом, поскольку константная область иммуноглобулина имеет два N-конца, одна константная область иммуноглобулина связывается через две функциональные группы на одной и той же молекуле непептидильного полимера или через функциональные группы на двух разных молекулах непептидильного полимера. Тем не менее, комплекс, образованный с помощью способа получения по настоящему изобретению, предпочтительно находится в форме, в которой каждая молекула физиологически активного полипептида, непептидильного полимера и константной области иммуноглобулина связана с каждой другой, то есть, одна молекула физиологически активного полипептида и одна молекула константной области иммуноглобулина связаны с обоими концами одного непептидильного полимера. Наоборот, когда одна константная область иммуноглобулина связана с двумя функциональными группами одной и той же молекулы непептидильного полимера, все функциональные группы на обоих концах непептидильного полимера связаны с константными областями иммуноглобулинов, и, таким образом, они не могут быть связаны с физиологически активным полипептидом посредством реакции сочетания. Когда одна константная область иммуноглобулина связана с каждой из функциональных групп двух разных молекул непептидильного полимера, могут образовываться мультимеры в форме псевдодимера.

Таким образом, в одном воплощении настоящего изобретения на стадии (1) непептидильный полимер взаимодействует с физиологически активным полипептидом, а на стадии (2) реакционная смесь со стадии (1) взаимодействует с константной областью иммуноглобулина. Если непептидильный полимер сначала взаимодействует с физиологически активным полипептидом с образованием конъюгата физиологически активный полипептид - непептидильный полимер, а затем конъюгат взаимодействует с константной областью иммуноглобулина посредством реакции сочетания, то может предотвращаться образование конъюгата путем связывания одной константной области иммуноглобулина с обоими концами одного непептидильного полимера, которое может происходить в том случае, когда сначала взаимодействуют константная область иммуноглобулина и непептидильный полимер.

В конкретном примере вышеприведенного воплощения является предпочтительным, когда на стадии (1) физиологически активный полипептид и непептидильный полимер взаимодействуют при мольном отношении от 1:1 до 1:20, а на стадии (2) конъюгат физиологически активного полипептида и непептидильного полимера в качестве продукта со стадии (1) и константная область иммуноглобулина взаимодействуют при мольном отношении от 1:0,5 до 1:10, но не ограничивается этим.

Более конкретно, стадия (2) может быть осуществлена путем добавления хлорида натрия до конечной концентрации меньше чем 3,0 М, ацетата натрия до конечной концентрации меньше чем 2,5 М, сульфата натрия до конечной концентрации меньше чем 0,7 М, фосфата натрия до конечной концентрации меньше чем 0,8 М или хлорида калия до конечной концентрации 1,0 М или меньше, но она не ограничивается типом и концентрацией соли. До тех пор, пока не возникнет излишняя агломерация, которая будет достаточной для того, чтобы влиять на процесс в реакционной смеси, различные типы соли могут быть добавлены в разных концентрациях. Соль может быть использована в концентрации, которая вызывает агломерацию, соответствующую уровню агломерации, рассматриваемому в качестве приемлемого, когда соль не добавляют.

Более конкретно, стадия (1) представляет собой стадию взаимодействия физиологически активного полипептида с непептидильным полимером при мольном отношении от 1:1 до 1:20 в условиях рН от 5,0 до 6,5, а стадия (2) представляет собой стадию взаимодействия реакционной смеси со стадии (1) с константной областью иммуноглобулина при мольном отношении от 1:0,5 до 1:10 в условиях рН от 6,0 до 8,5 в присутствии соли, и если соль представляет собой хлорид натрия, то она может быть добавлена до конечной концентрации меньше чем 3,0 М, если соль представляет собой ацетат натрия, то она может быть добавлена до конечной концентрации меньше чем 2,5 М, если соль представляет собой сульфат натрия, то она может быть добавлена до конечной концентрации меньше чем 0,7 М, если соль представляет собой фосфат натрия, то она может быть добавлена до конечной концентрации меньше чем 0,8 М, или если соль представляет собой хлорид калия, то она может быть добавлена до конечной концентрации 1,0 М или меньше.

Стадия (1) представляет собой реакцию получения конъюгата физиологически активный полипептид - непептидильный полимер, и затем дополнительно может быть осуществлена стадия очистки продукта. Стадия (2) представляет собой реакцию получения комплекса физиологически активный полипептид - непептидильный полимер - константная область иммуноглобулина путем взаимодействия конъюгата физиологически активный полипептид - непептидильный полимер в качестве продукта со стадии (1) с константной областью иммуноглобулина. Комплекс может быть получен с улучшенным выходом путем контролирования условий реакций и мольного отношения реагентов, описанных выше.

Используемый в данном описании термин "физиологически активный полипептид" относится к полипептиду, обладающему определенной физиологической функцией in vivo в виде общего понятия. В общем, он имеет полипептидильную структуру и демонстрирует различные биологические активности. Когда организм в результате утраты или избыточной секреции материала, вовлеченного в определенную функцию, становится биологически аномальным, тогда физиологически активный полипептид может регулировать генетическую экспрессию или физиологическую функцию, тем самым корректируя аномальное состояние. Могут быть включены типичные белковые лекарства.

Физиологически активный полипептид может быть выбран из группы, состоящей из гормона роста человека, высвобождающих гормон роста гормонов, высвобождающих гормон роста пептидов, интерферона, рецепторов интерферона, колониестимулирующих факторов, глюкагоноподобных пептидов (GLP-1 и так далее), оксинтомодулина, рецепторов, связанных с белком G, интерлейкинов, рецепторов интерлейкинов, ферментов, интерлейкин-связывающих белков, цитокин-связывающих белков, факторов активации макрофагов, макрофагальных пептидов, В-клеточных факторов, Т-клеточных факторов, белка А, ингибиторов аллергии, гликопротеинов некроза клеток, иммунотоксинов, лимфотоксинов, фактора некроза опухоли, опухолевых супрессоров, трансформирующего фактора роста, альфа-1 антитрипсина, альбумина, α-лактальбумина, аполипопротеина-Е, эритропоэтина, гликозилированного эритропоэтина, ангиопоэтинов, гемоглобина, тромбина, активирующих рецептор тромбина пептидов, тромбомодулина, фактора крови VII, VIIa, VIII, IX и XIII, активаторов плазминогена, фибрин-связывающих пептидов, урокиназы, стрептокиназы, гирудина, белка С, С-реактивного белка, ингибитора ренина, ингибитора коллагеназы, супероксиддисмутазы, лептина, тромбоцитарного фактора роста, эпителиального фактора роста, эпидермального фактора роста, ангиостатина, ангиотензина, фактора роста костей, белка, стимулирующего рост костей, кальцитонина, инсулина, атриопептина, фактора, индуцирующего образование хряща, элкатонина, фактора активации соединительной ткани, ингибитора пути тканевого фактора, фолликуло-стимулирующего гормона, лютеинизирующего гормона, рилизинг-фактора лютеинизирующего гормона, факторов роста нервной ткани, паратиреоидного гормона, релаксина, секретина, соматомедина, инсулиноподобного фактора роста, гормона коры надпочечников, глюкагона, холецистокинина, панкреатического полипептида, пептида, высвобождающего гастрин, рилизинг-фактора кортикотропина, тиреоидстимулирующего гормона, аутотаксина, лактоферрина, миостатина, антигенов клеточной поверхности, вирусных вакцинных антигенов, моноклональных антител, поликлональных антител и фрагментов антител. Предпочтительно, физиологически активный полипептид может представлять собой инсулин, но не ограничивается им.

Инсулин, применяемый в воплощении настоящего изобретения, является разновидностью физиологически активных пептидов, секретируемых поджелудочной железой, когда уровень глюкозы в крови становится высоким, и эта разновидность выполняет функцию контролирования уровней глюкозы в крови, заставляя печень, скелетные мышцы и жировую ткань захватывать глюкозу из крови и запасать ее в качестве гликогена, и подавляя липолиз, представляющий собой метаболический процесс использования жира в качестве источника энергии. С точки зрения структуры инсулин содержит цепь альфа и цепь бета. Термины цепь альфа инсулина и цепь бета инсулина могут быть использованы взаимозаменяемо с цепью А инсулина и цепью В инсулина, соответственно. Эти пептиды включают инсулиновые агонисты, предшественники, производные, фрагменты и варианты. Нативный инсулин, быстродействующий инсулин и инсулин длительного действия являются предпочтительными.

Нативный инсулин представляет собой гормон, секретируемый поджелудочной железой и играющий критическую роль в контролировании уровней глюкозы в крови, способствуя захвату глюкозы клетками и ингибируя липолиз. Инсулин, обладающий функцией регулирования уровней глюкозы в крови, получается из проинсулинового предшественника, не обладающего функцией регулирования уровней глюкозы в крови, посредством серии процессов. Аминокислотная последовательность инсулина является следующей:

- Цепь альфа:

Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn (SEQ ID NO. 1)

- Цепь бета:

Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr (SEQ ID NO. 2)

Инсулиновые агонисты означают вещество, которое связывается in vivo с инсулиновым рецептором и демонстрирует такие же биологические активности, как и инсулин, независимо от структуры инсулина.

Инсулиновые производные обозначают пептид, который демонстрирует по меньшей мере 80%-ную гомологию аминокислотной последовательности с нативным инсулином, имеет несколько групп аминокислотных остатков, видоизмененных по типу химического замещения (например, альфа-метилирование, альфа-гидроксилирование), удаления (например, деаминирование) или модификации (например, N-метилирование, гликозилирование, жирная кислота), и обладает функцией контролирования уровня глюкозы в крови организма.

Инсулиновые фрагменты обозначают тип инсулина, у которого одна или более чем одна аминокислота добавлена к амино- или карбокси-концам инсулина или удалена из таких концов, и добавленные аминокислоты также могут представлять собой ненативные аминокислоты (например, аминокислоту D типа). Такие инсулиновые фрагменты сохраняют функцию контролирования уровня глюкозы в крови организма.

Инсулиновые варианты обозначают пептид, который отличается от инсулина одной или более чем одной аминокислотой в аминокислотной последовательности и сохраняет функцию контролирования уровня глюкозы в крови организма.

Соответствующие способы, применяемые для получения инсулиновых агонистов, производных, фрагментов и вариантов, могут быть использованы независимо или в комбинации. Например, инсулиновый пептид может включать пептиды, у которых одна или более чем одна аминокислота в аминокислотной последовательности отличается от аминокислот нативного инсулина, и у которых имеется деаминирование по N-концевому аминокислотному остатку, но обладающих функцией контролирования уровня глюкозы в крови организма.

Используемый в данном описании термин "константная область иммуноглобулина" относится к иммуноглобулиновому фрагменту, лишенному вариабельных областей легкой и тяжелой цепей, константной области 1 тяжелой цепи (СН1) и константной области легкой цепи (CL), то есть Fc область состоит из константных областей 2 и 3 тяжелой цепи (СН2 и СН3) (или включает константную область тяжелой цепи (СН4)). Возможно, что Fc область иммуноглобулина может дополнительно включать шарнирную область. Константная область иммуноглобулина по настоящему изобретению также может представлять собой расширенную Fc область иммуноглобулина, которая содержит часть или всю константную область 1 тяжелой цепи (СН1) и/или константную область легкой цепи (CL), за исключением только вариабельных областей тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина, до тех пор, пока она демонстрирует действия, по существу идентичные действиям или превосходящие действия нативной иммуноглобулиновой константной области. Кроме того, константная область иммуноглобулина по настоящему изобретению может быть лишена значительной части аминокислотной последовательности, которая соответствует СН2 и/или СН3. Следовательно, константная область иммуноглобулина по настоящему изобретению может содержать (1) домен СН1, домен СН2, домен СН3 и домен СН4, (2) домен СН1 и домен СН2, (3) домен СН1 и домен СН3, (4) домен СН2 и домен СН3, (5) комбинацию одного или более чем одного константного домена и шарнирной области иммуноглобулина (или части шарнирной области) или (6) димер каждого константного домена тяжелой цепи и константной области легкой цепи.

Константная область иммуноглобулина, включающая Fc область, представляет собой биоразрушаемый полипептид, который может метаболизироваться in vivo, так, что его можно безопасно использовать в качестве лекарственного носителя. Дополнительно, Fc область иммуноглобулина является более благоприятной с точки зрения продукции, очистки и выхода продукта комплекса по сравнению с полноразмерной молекулой иммуноглобулина вследствие ее относительно низкой молекулярной массы. Кроме того, поскольку Fc область иммуноглобулина лишена Fab, который демонстрирует высокую степень неоднородности вследствие различий в аминокислотной последовательности между антителами, Fc область иммуноглобулина сама обеспечивает комплекс со значительно улучшенной гомогенностью и снижает вероятность индуцирования антигенных свойств крови.

С другой стороны, константная область иммуноглобулина может происходить от человека или животных, таких как коровы, козы, свиньи, мыши, кролики, хомяки, крысы, морские свинки и т.д., и предпочтительно может происходить от человека. Кроме того, константная область иммуноглобулина может быть выбрана из Fc фрагментов, происходящих из IgG, IgA, IgD, IgE, IgM или их комбинаций или их гибридов. Предпочтительно, когда константная область происходит из IgG или IgM, которые присутствуют в наибольшем количестве в крови, и наиболее предпочтительно, когда она происходит из IgG, который, как известно, улучшает время полужизни связывающихся с лигандом белков в сыворотке.

Используемый в данном описании термин "комбинация" означает, что полипептиды, кодирующие одноцепочечные константные области иммуноглобулинов (предпочтительно Fc области) одного и того же происхождения, связаны с одноцепочечным полипептидом другого происхождения с образованием димера или мультимера. То есть, димер или мультимер могут быть получены путем комбинации двух или более фрагментов, выбранных из группы, состоящей из фрагментов IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc и IgE.

Используемый в данном описании термин "гибрид" означает, что последовательности, кодирующие две или более чем две константные области иммуноглобулинов разного происхождения, присутствуют в единичной цепи константной области иммуноглобулина (предпочтительно, Fc области). В настоящем изобретении возможны различные гибридные формы. Например, гибридный домен может состоять из от одного до четырех доменов, выбранных из группы, состоящей из СН1, СН2, СН3 и СН4 в IgG Fc, IgM Fc, IgA Fc, IgE Fc и IgD Fc, и может включать шарнирную область.

IgG делится на подклассы IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, и настоящее изобретение может включать их комбинации или гибриды. Предпочтительными являются подклассы IgG2 и IgG4; наиболее предпочтительной является Fc область lgG4, нечасто обладающая эффекторными функциями, такими как комплемент-зависимая цитотоксичность (CDC).

Константная область иммуноглобулина может находиться в форме, имеющей нативные сахарные цепи, увеличенные сахарные цепи или уменьшенные сахарные цепи по сравнению с нативной формой, или может находиться в дегликозилированной форме. Увеличение, уменьшение или удаление сахарных цепей константной области иммуноглобулина может быть достигнуто с помощью типичных в области техники способов, таких как химический способ, ферментативный способ и способ генетической инженерии с использованием микроорганизма. В данном случае дегликозилированная константная область иммуноглобулина демонстрирует резкое уменьшение аффинности связывания с комплементом (c1q) и уменьшение или утрату антитело-зависимой цитотоксичности или комплемент-зависимой цитотоксичности, не вызывая тем самым ненужные иммунные ответы in vivo. В этой связи константная область иммуноглобулина в дегликозилированной или агликозилированной форме может быть более подходящей для задачи настоящего изобретения в качестве лекарственного носителя. Соответственно, происходящая из lgG4 человека агликозилированная Fc область может быть намного более предпочтительно используемой. Fc область, происходящая от человека, является более предпочтительной, чем происходящая не от человека Fc область, которая может действовать в качестве антигена в организме человека и вызывать нежелательные иммунные ответы, такие как продукция нового антитела против антигена.

Кроме того, не только константная область иммуноглобулина с нативной аминокислотной последовательностью, но и с мутантом по аминокислотной последовательности может быть включена в объем константной области иммуноглобулина по настоящему изобретению. Производное аминокислотной последовательности имеет последовательность, которая отличается от нативной аминокислотной последовательности одним или более чем одним аминокислотным остатком вследствие делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены или их комбинации. Например, в Fc IgG аминокислотные остатки в позициях 214-238, 297-299, 318-322 или 327-331, которые, как известно, являются важными для связывания, могут быть использованы в качестве сайтов, подходящих для модификации. В настоящем изобретении могут быть использованы различные производные, такие как производные, полученные путем удаления сайтов, способных к образованию дисульфидных связей, удаления нескольких N-концевых аминокислот из нативной Fc или путем добавления метионина к N-концу нативной Fc. Кроме того, для удаления эффекторной функции из нативной Fc области может быть осуществлено удаление комплемент-связывающих сайтов, например C1q-связывающих сайтов или сайтов ADCC. Методики получения мутантов аминокислотных последовательностей константной области иммуноглобулина раскрыты в публикациях международных патентных заявок WO 97/34631 и WO 96/32478.

В области техники хорошо известны аминокислотные замены в белках и пептидах, которые, как правило, не изменяют активность молекул (Н. Neurath, R.L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). Наиболее распространенные замены имеют место между аминокислотными остатками Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly. Аминокислоты возможно могут быть модифицированы путем фосфорилирования, сульфатирования, акрилирования, гликозилирования, метилирования, фарнезилирования, ацетилирования и амидирования.

Вышеупомянутые производные константной области иммуноглобулина могут представлять собой производные, демонстрирующие биологическую активность, которая совпадает с биологической активностью константной области иммуноглобулина по настоящему изобретению, обладая при этом улучшенной структурной стабильностью по отношению к нагреванию, рН или тому подобному. Кроме того, эти Fc области могут быть получены из нативных форм, выделенных у людей и других животных, включая коров, коз, свиней, мышей, кроликов, хомяков, крыс и морских свинок, или могут представлять собой их рекомбинатные формы или производные, полученные из трансформированных клеток животных или микроорганизмов. При этом они могут быть получены из нативного иммуноглобулина путем выделения полноразмерных иммуноглобулинов из организмов человека или животного и обработки их протеолитическим ферментом. Иммуноглобулины расщепляются на Fab и Fc области путем обработки папаином, и на pF'c и F(ab)₂ путем обработки пепсином. Эти фрагменты могут быть подвергнуты гель-фильтрационной хроматографии для выделения Fc или pF'c.

Предпочтительно, константная область иммуноглобулина, происходящая от человека, может представлять собой рекомбинантную константную область иммуноглобулина, полученную из микроорганизма.

Далее настоящее изобретение более подробно описано со ссылкой на следующие примеры. Однако эти примеры приведены исключительно для иллюстративных задач, и не предполагается, что изобретение ограничено этими примерами.

Пример 1: Реакция ПЭГилирования инсулина и очистка моно-ПЭГилированного инсулина

Инсулиновый порошок растворяли в 10 мМ HCl и затем подвергали взаимодействию с 3,4K пропион-АЛЬД2-ПЭГ (ПЭГ, имеющий две пропиональдегидные группы на обоих концах, IDB, Korea) при 4°С в течение приблизительно 2 часов при мольном отношении инсулин : ПЭГ 1:4 и концентрации инсулина 5 мг/мл для ПЭГилирования N-конца бета-цепи инсулина. Эту реакцию проводили с 50 мМ цитратом натрия, рН 6,0, в 45%-ном изопропиловом спирте с добавлением 3,0 мМ цианоборгидрида натрия в качестве восстановителя. Реакционный раствор очищали с помощью колонки SP-HP (GE Healthcare) с использованием буфера, содержащего цитрат натрия (рН 3,0) и 45%-ный EtOH, и KCl с градиентом концентрации.

Пример 2: Получение комплекса при помощи реакции сочетания без добавления соли

Для получения комплекса инсулин-ПЭГ-Fc фрагмент иммуноглобулина моно-ПЭГилированный инсулин, полученный способом, описанным в примере 1, и Fc фрагмент иммуноглобулина подвергали взаимодействию при мольном отношении 1:1,2 при общем уровне белка 20 мг/мл при 25°С в течение 13 часов. При этом реакционный раствор содержал 100 мМ HEPES, 22 мМ фосфата калия и 10% этанола при рН 8,2 и дополнительно содержал 20 мМ цианоборгидрида натрия в качестве восстановителя.

После завершения реакции реакционный раствор пропускали через колонку Source 15Q (GE Healthcare) для отделения и очистки непрореагировавшего инсулина, непрореагировавшего Fc фрагмента иммуноглобулина, комплекса инсулин-ПЭГ-Fc фрагмент иммуноглобулина и комплекса Fc фрагмент иммуноглобулина, связанный с двумя или более чем двумя моно-ПЭГилированными инсулинами (инсулин-ПЭГ), с использованием буфера Tris-HCl (рН 7,5) и NaCl с градиентом концентрации. При этом содержание примесей идентифицировали на профиле (Фиг. 1).

Затем Source 15ISO (GE Healthcare) использовали в качестве второй колонки для удаления какого-либо остаточного Fc иммуноглобулина и мульти-связанного инсулинового комплекса, получая, таким образом, комплекс инсулин-ПЭГ-Fc иммуноглобулина. В этом случае элюирование проводили с использованием градиента концентрации сульфата аммония, содержащего Tris-HCl (рН 7,5). Элюированный комплекс инсулин-ПЭГ-Fc иммуноглобулина анализировали с помощью RP-HPLC (обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография) и IE-HPLC (ионообменная высокоэффективная жидкостная хроматография).

Пример 3: Улучшение выхода реакции сочетания путем добавления хлорида натрия

Для изучения влияния хлорида натрия на выход реакции сочетания моно-ПЭГилированный инсулин, полученный способом, описанным в примере 1, и Fc фрагмент иммуноглобулина подвергали взаимодействию при мольном отношении 1:1,2 при общем уровне белка 20 мг/мл при 25°С в течение 13 часов. При этом реакционный раствор содержал 100 мМ HEPES, 22 мМ фосфата калия и 10% этанола при рН 8,2 с добавлением хлорида натрия в конечной концентрации от 0,5 до 3,0 М и дополнительно содержал 20 мМ цианоборгидрида натрия в качестве восстановителя.

Реакционный раствор очищали и анализировали тем же самым образом, как в примере 2. Добавление хлорида натрия в раствор реакции сочетания улучшило выход реакции сочетания по сравнению с отсутствием добавления. Этот эффект максимально увеличился при добавлении хлорида натрия в конечной концентрации 2,0 М (таблица 1). Результаты профиля Source 15Q показали, что обусловленные побочной реакцией примеси уменьшились, тогда как выход улучшился (Фиг. 1). Также было подтверждено, что при проведении реакции сочетания путем добавления 2,0 М хлорида натрия может быть получен обладающий высокой чистотой комплекс инсулин-ПЭГ-Fc иммуноглобулина с чистотой 95% или больше (таблица 2). Наоборот, когда хлорид натрия добавляли в конечной концентрации 3,0 М, тогда наблюдали начало агломерации.

Пример 4: Улучшение выхода реакции сочетания путем добавления ацетата натрия

Для изучения влияния ацетата натрия на выход реакции сочетания моно-ПЭГилированный инсулин, полученный способом, описанным в примере 1, и Fc фрагмент иммуноглобулина подвергали взаимодействию при мольном отношении 1:1,2 при общем уровне белка 20 мг/мл при 25°С в течение 13 часов. При этом реакционный раствор содержал 100 мМ HEPES, 22 мМ фосфата калия и 10% этанола при рН 8,2 с добавлением ацетата натрия в конечной концентрации от 1,5 до 3,0 М и дополнительно содержал 20 мМ цианоборгидрида натрия в качестве восстановителя.

Реакционный раствор очищали и анализировали тем же самым образом, как в примере 2. Добавление ацетата натрия в раствор реакции сочетания улучшило выход реакции сочетания по сравнению с отсутствием добавления. Этот эффект максимально увеличился при добавлении ацетата натрия в конечной концентрации 1,5 М (таблица 1). Также было подтверждено, что при проведении реакции сочетания путем добавления 1,5 М ацетата натрия может быть получен обладающий высокой чистотой комплекс инсулин-ПЭГ-Fc иммуноглобулина с чистотой 95% или больше может (таблица 2). Наоборот, когда ацетат натрия добавляли в конечной концентрации 2,5 М или выше, тогда сложно было рассчитать выход вследствие агломерации.

Пример 5: Улучшение выхода реакции сочетания путем добавления сульфата натрия

Для изучения влияния сульфата натрия на выход реакции сочетания моно-ПЭГилированный инсулин, полученный способом, описанным в примере 1, и Fc фрагмент иммуноглобулина подвергали взаимодействию при мольном отношении 1:1,2 при общем уровне белка 20 мг/мл при 25°С в течение 13 часов. При этом реакционный раствор содержал 100 мМ HEPES, 22 мМ фосфата калия и 10% этанола при рН 8,2 с добавлением сульфата натрия в конечной концентрации от 0,4 до 0,7 М и дополнительно содержал 20 мМ цианоборгидрида натрия в качестве восстановителя.

Реакционный раствор очищали и анализировали тем же самым образом, как в примере 2. Добавление сульфата натрия в раствор реакции сочетания улучшило выход реакции сочетания по сравнению с отсутствием добавления. Этот эффект максимально увеличился при добавлении сульфата натрия в конечной концентрации 0,4 М (таблица 1). Когда сульфат натрия добавляли в конечной концентрации 0,5 М, тогда наблюдали начало агломерации. Когда сульфат натрия добавляли в конечной концентрации 0,7 М или выше, тогда сложно было рассчитать выход вследствие агломерации.

Пример 6: Улучшение выхода реакции сочетания путем добавления фосфата натрия

Для изучения влияния фосфата натрия на выход реакции сочетания моно-ПЭГилированный инсулин, полученный способом, описанным в примере 1, и Fc фрагмент иммуноглобулина подвергали взаимодействию при мольном отношении 1:1,2 при общем уровне белка 20 мг/мл при 25°С в течение 13 часов. При этом реакционный раствор содержал 100 мМ HEPES, 22 мМ фосфата калия и 10% этанола при рН 8,2 с добавлением фосфата натрия в конечной концентрации от 0,4 до 0,8 М и дополнительно содержал 20 мМ цианоборгидрида натрия в качестве восстановителя.

Реакционный раствор очищали и анализировали тем же самым образом, как в примере 2. Добавление фосфата натрия в раствор реакции сочетания улучшило выход реакции сочетания по сравнению с отсутствием добавления. Этот эффект максимально увеличился при добавлении фосфата натрия в конечной концентрации 0,4 М (таблица 1). Наоборот, когда фосфат натрия добавляли в конечной концентрации 0,6 М, тогда наблюдали начало агломерации. Когда сульфат натрия добавляли в конечной концентрации 0,8 М, тогда сложно было рассчитать выход вследствие агломерации.

Пример 7: Улучшение выхода реакции сочетания путем добавления хлорида калия

Для изучения влияния хлорида калия на выход реакции сочетания моно-ПЭГилированный инсулин, полученный способом, описанным в примере 1, и Fc фрагмент иммуноглобулина подвергали взаимодействию при мольном отношении 1:1,2 при общем уровне белка 20 мг/мл при 25°С в течение 13 часов. При этом реакционный раствор содержал 100 мМ HEPES, 22 мМ фосфата калия и 10% этанола при рН 8,2 с добавлением хлорида калия в конечной концентрации от 0,5 до 1,0 М и дополнительно содержал 20 мМ цианоборгидрида натрия в качестве восстановителя.

Реакционный раствор очищали и анализировали тем же самым образом, как в примере 2. Добавление хлорида калия в раствор реакции сочетания улучшило выход реакции сочетания по сравнению с отсутствием добавления. Этот эффект максимально увеличился при добавлении хлорида калия в конечной концентрации 1,0 М (таблица 1).

В следующей таблице 1 указан выход реакции сочетания и общий выход в соответствии с типом и концентрацией соли в реакции сочетания во время получения комплекса, включающего инсулин и Fc фрагмент иммуноглобулина.

Как следует из таблицы 1, группы с добавлением соли показали увеличенные выходы реакции сочетания от 35,2% до 43,5% начиная с 32,3% и увеличенные общие выходы от 17,6% до 21,8% начиная с 16,2% по сравнению с контрольной группой без добавления соли, хотя они и различаются в зависимости от типа и концентрации соли. Скорости их изменения относительно выхода в контрольной группе без добавления соли подвергали преобразованиям, и скорости изменения выхода реакции сочетания и общего выхода составляли до 9-35%.

В следующей таблице 2 указана чистота окончательного комплекса, который готовили путем добавления 2,0 М хлорида натрия или 1,5 М ацетата натрия в раствор реакции сочетания во время получения комплекса, включающего инсулин и Fc фрагмент иммуноглобулина. Чистоту дважды проверяли с помощью анализа посредством HPLC с использованием гель-фильтрационной хроматографии (далее названной SE) и ионообменной хроматографии (далее названной IE).

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способу получения конъюгата физиологически активного полипептида с константной областью иммуноглобулина. Более конкретно, настоящее изобретение относится к способу эффективного получения конъюгата физиологически активного полипептида посредством решения проблемы низкого выхода продукта путем использования соли в реакции сочетания при получении конъюгата физиологически активного полипептида. Конъюгат физиологически активный полипептид - непептидильный полимер - константная область иммуноглобулина может быть получен с высокими выходом и чистотой с помощью способа получения по настоящему изобретению. Кроме того, полученный с использованием указанного способа конъюгат физиологически активного полипептида может найти эффективное применение при разработке композиции длительного действия физиологически активного полипептида. 26 з.п. ф-лы, 2 табл., 1 ил., 7 пр.

1. Способ получения конъюгата физиологически активный полипептид - непептидильный полимер - константная область иммуноглобулина, включающий стадии:

(1) взаимодействия непептидильного полимера с одним из следующего: физиологически активного полипептида или константной области иммуноглобулина с получением конъюгата физиологически активный полипептид - непептидильный полимер или конъюгата константная область иммуноглобулина - непептидильный полимер и

(2) взаимодействия конъюгата физиологически активный полипептид - непептидильный полимер или конъюгата константная область иммуноглобулина - непептидильный полимер, полученного на стадии (1), с другим из следующего: физиологически активного полипептида или константной области иммуноглобулина в присутствии соли с получением конъюгата физиологически активный полипептид - непептидильный полимер - константная область иммуноглобулина,

где непептидильный полимер имеет альдегидные функциональные группы на обоих своих концах;

соль выбрана из группы, состоящей из хлорида натрия, ацетата натрия, сульфата натрия, фосфата натрия, карбоната натрия, цианида натрия, цитрата натрия, нитрата натрия, хлорида калия, ацетата калия, сульфата калия, фосфата калия, карбоната калия, цианида калия, цитрата калия, нитрата калия, хлорида магния, ацетата магния, сульфата магния, фосфата магния, карбоната магния, цианида магния, цитрата магния, нитрата магния, хлорида аммония, ацетата аммония, сульфата аммония, фосфата аммония, карбоната аммония, цианида аммония, цитрата аммония, нитрата аммония, хлорида кальция, ацетата кальция, сульфата кальция, фосфата кальция, карбоната кальция, цианида кальция, цитрата кальция и нитрата кальция; и

соль добавляют до конечной концентрации от 0,3 до 3,0 М.

2. Способ по п. 1, при котором непептидильный полимер связывают с физиологически активным полипептидом и константной областью иммуноглобулина посредством функциональных групп на обоих его концах с образованием ковалентной связи.

3. Способ по п. 1, дополнительно включающий стадию отделения конъюгата физиологически активный полипептид - непептидильный полимер или конъюгата константная область иммуноглобулина - непептидильный полимер от реакционной смеси после стадии (1).

4. Способ по п. 1, где соль выбрана из группы, состоящей из хлорида натрия, ацетата натрия, сульфата натрия, фосфата натрия и хлорида калия.

5. Способ по п. 1, при котором соль добавляют до конечной концентрации от 0,3 до 2,5 М.

6. Способ по п. 4, при котором, если соль представляет собой хлорид натрия, то ее добавляют до конечной концентрации меньше чем 3,0 М; если соль представляет собой ацетат натрия, то ее добавляют до конечной концентрации меньше чем 2,5 М; если соль представляет собой сульфат натрия, то ее добавляют до конечной концентрации меньше чем 0,7 М; если соль представляет собой фосфат натрия, то ее добавляют до конечной концентрации меньше чем 0,8 М; или если соль представляет собой хлорид калия, то ее добавляют до конечной концентрации 1,0 М или меньше.

7. Способ по п. 1, при котором время реакции на стадии (2) составляет от 4 до 18 часов.

8. Способ по п. 1, при котором температура реакции на стадии (2) составляет от 0 до 25°С.

9. Способ по п. 1, где реакционная смесь дополнительно содержит восстановитель с конечной концентрацией от 1 до 100 мМ.

10. Способ по п. 1, при котором стадию (1) осуществляют при рН от 5,0 до 6,5 и стадию (2) осуществляют при рН от 6,0 до 8,5.

11. Способ по п. 1, при котором на стадии (1) непептидильный полимер взаимодействует с физиологически активным полипептидом, а на стадии (2) реакционная смесь со стадии (1) взаимодействует с константной областью иммуноглобулина.

12. Способ по п. 11, при котором на стадии (1) физиологически активный полипептид и непептидильный полимер взаимодействуют друг с другом при мольном отношении от 1:1 до 1:20, а на стадии (2) продукт со стадии (1) и константная область иммуноглобулина взаимодействуют друг с другом при мольном отношении от 1:0,5 до 1:10.

13. Способ по п. 12, при котором стадию (2) осуществляют в присутствии хлорида натрия, добавленного до конечной концентрации меньше чем 3,0 М, ацетата натрия, добавленного до конечной концентрации меньше чем 2,5 М, сульфата натрия, добавленного до конечной концентрации меньше чем 0,7 М, фосфата натрия, добавленного до конечной концентрации меньше чем 0,8 М, или хлорида калия, добавленного до конечной концентрации 1,0 М или меньше.

14. Способ по п. 1, при котором функциональные группы непептидильного полимера связывают с аминной группой, присутствующей на N-конце или в боковой цепи Lys остатка физиологически активного полипептида и константной области иммуноглобулина.

15. Способ по п. 1, где непептидильный полимер выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликолей, полипропиленгликолей, сополимеров этиленгликоля и пропиленгликоля, полиоксиэтилированных полиолов, поливиниловых спиртов, полисахаридов, декстранов, поливинилэтиловых эфиров, полимолочной кислоты (PLA), сополимера молочной и гликолевой кислот (PLGA), липидных полимеров, хитинов, гиалуроновой кислоты и их комбинации.

16. Способ по п. 1, где непептидильный полимер представляет собой полиэтиленгликоль.

17. Способ по п. 1, где непептидильный полимер имеет молекулярную массу в диапазоне от 1 до 100 кДа.

18. Способ по п. 1, где константная область иммуноглобулина агликозилирована.

19. Способ по п. 1, где константная область иммуноглобулина состоит из от одного до четырех доменов, выбранных из группы, состоящей из доменов CH1, СН2, СН3 иСН4.

20. Способ по п. 1, где константная область иммуноглобулина дополнительно содержит шарнирную область.

21. Способ по п. 1, где константная область иммуноглобулина выбрана из группы, состоящей из константных областей, происходящих из IgG, IgA, IgD, IgE, IgM, их комбинаций и их гибридов.

22. Способ по п. 1, где константная область иммуноглобулина выбрана из группы, состоящей из константных областей IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, их комбинаций и их гибридов.

23. Способ по п. 22, где константная область иммуноглобулина представляет собой Fc область IgG4.

24. Способ по п. 23, где константная область иммуноглобулина представляет собой агликозилированную Fc область IgG4 человека.

25. Способ по п. 1, где физиологически активный полипептид выбран из группы, состоящей из гормона роста человека, высвобождающих гормон роста гормонов, высвобождающих гормон роста пептидов, интерферона, рецепторов интерферона, колониестимулирующих факторов, глюкагоноподобных пептидов (GLP-1 и так далее), оксинтомодулина, рецепторов, связанных с белком G, интерлейкинов, рецепторов интерлейкинов, ферментов, интерлейкин-связывающих белков, цитокин-связывающих белков, факторов активации макрофагов, макрофагальных пептидов, В-клеточных факторов, Т-клеточных факторов, белка А, ингибиторов аллергии, гликопротеинов некроза клеток, иммунотоксинов, лимфотоксинов, фактора некроза опухоли, опухолевых супрессоров, трансформирующего фактора роста, альфа-1 антитрипсина, альбумина, α-лактальбумина, аполипопротеина-Е, эритропоэтина, гликозилированного эритропоэтина, ангиопоэтинов, гемоглобина, тромбина, активирующих рецептор тромбина пептидов, тромбомодулина, фактора крови VII, VIIa, VIII, IX и XIII, активаторов плазминогена, фибрин-связывающих пептидов, урокиназы, стрептокиназы, гирудина, белка С, С-реактивного белка, ингибитора ренина, ингибитора коллагеназы, супероксиддисмутазы, лептина, тромбоцитарного фактора роста, эпителиального фактора роста, эпидермального фактора роста, ангиостатина, ангиотензина, фактора роста костей, белка, стимулирующего рост костей, кальцитонина, инсулина, атриопептина, фактора, индуцирующего образование хряща, элкатонина, фактора активации соединительной ткани, ингибитора пути тканевого фактора, фолликуло-стимулирующего гормона, лютеинизирующего гормона, рилизинг-фактора лютеинизирующего гормона, факторов роста нервной ткани, паратиреоидного гормона, релаксина, секретина, соматомедина, инсулиноподобного фактора роста, гормона коры надпочечников, глюкагона, холецистокинина, панкреатического полипептида, пептида, высвобождающего гастрин, рилизинг-фактора кортикотропина, тиреоидстимулирующего гормона, аутотаксина, лактоферрина, миостатина, антигенов клеточной поверхности, вирусных вакцинных антигенов, моноклональных антител, поликлональных антител и фрагментов антител.

26. Способ по п. 25, где физиологически активный полипептид представляет собой инсулин.

27. Способ по п. 1, при котором на стадии (1) физиологически активный полипептид и непептидильный полимер взаимодействуют друг с другом при мольном отношении от 1:1 до 1:20 в условиях рН от 5,0 до 6,5, а на стадии (2) реакционная смесь со стадии (1) и константная область иммуноглобулина взаимодействуют друг с другом при мольном отношении от 1:0,5 до 1:10 в условиях рН от 6,0 до 8,5 в присутствии соли, и если соль представляет собой хлорид натрия, то она может быть добавлена до конечной концентрации меньше чем 3,0 М, если соль представляет собой ацетат натрия, то она может быть добавлена до конечной концентрации меньше чем 2,5 М, если соль представляет собой сульфат натрия, то она может быть добавлена до конечной концентрации меньше чем 0,7 М, если соль представляет собой фосфат натрия, то она может быть добавлена до конечной концентрации меньше чем 0,8 М, или если соль представляет собой хлорид калия, то она может быть добавлена до конечной концентрации 1,0 М или меньше.