ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И/ИЛИ ПРОФИЛАКТИКИ РАКА Российский патент 2019 года по МПК C07K16/18 C07K16/46 C12N15/13 C12N15/63 C12N5/10 A61K39/395 A61P35/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[0001] Настоящее изобретение относится к антителу против CAPRIN-1 или его фрагменту и его новому фармацевтическому применению в качестве терапевтического и/или профилактического средства против рака и т.д.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0002] Онкологические заболевания являются заболеваниями, которые служат основной причиной смерти. Современная терапия онкологических заболеваний состоит преимущественно из хирургической терапии, которую могут комбинировать с лучевой терапией и/или химиотерапией. Несмотря на развитие новых хирургических методик или открытие в последние годы новых противоопухолевых средств, существующее лечение онкологических заболеваний обеспечивает недостаточно благоприятный исход, за исключением некоторых типов рака. С успехами в молекулярной биологии или онкоиммунологии в последние годы были идентифицированы антитела, которые специфично реагируют с раковыми опухолями, раковые антигены, распознаваемые цитотоксическими Т-лимфоцитами, гены, кодирующие такие раковые антигены, и т.п., повышая ожидания от специфичной противоопухолевой терапии, направленной против раковых антигенов.

[0003] Связанный с активацией в цитоплазме и пролиферацией белок 1 (CAPRIN-1) известен как внутриклеточный белок, который экспрессируется при активации или делении нормальных клеток в фазе покоя и формирует цитоплазматические стрессовые гранулы с внутриклеточными РНК, участвующие в регуляции транспорта и трансляции молекул мРНК. Было обнаружено, что этот белок специфично экспрессируется на поверхности раковых клеток и является объектом исследований в качестве мишени лекарственных антител для лечения рака (Патентная литература 1-19).

Список цитируемых источников

Патентная литература

[0004] Патентная литература 1: WO2010/016526

Патентная литература 2: WO2011/096517

Патентная литература 3: WO2011/096528

Патентная литература 4: WO2011/096519

Патентная литература 5: WO2011/096533

Патентная литература 6: WO2011/096534

Патентная литература 7: WO2011/096535

Патентная литература 8: WO2013/018886

Патентная литература 9: WO2013/018894

Патентная литература 10: WO2013/018892

Патентная литература 11: WO2013/018891

Патентная литература 12: WO2013/018889

Патентная литература 13: WO2013/018883

Патентная литература 14: WO2013/125636

Патентная литература 15: WO2013/125654

Патентная литература 16: WO2013/125630

Патентная литература 17: WO2013/125640

Патентная литература 18: WO2013/147169

Патентная литература 19: WO2013/147176

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Техническая задача

[0005] Цель настоящего изобретения состоит в получении антитела, которое направленно против белка CAPRIN-1, специфично экспрессирующегося на поверхности раковых клеток, и обладает превосходной противоопухолевой активностью по сравнению с обычными антителами, и в обеспечении его применения в качестве терапевтического и/или профилактического средства против рака.

Решение задачи

[0006] Признаки настоящего изобретения являются следующими:

[0007] В настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция для лечения и/или профилактики рака, включающая антитело, которое включает вариабельную область тяжелой цепи, включающую SEQ ID NO: 1, 2 и 3, и вариабельную область легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 4, 5 и 6, и обладает иммунологической реактивностью в отношении белка CAPRIN-1, или его фрагмент в качестве действующего вещества.

[0008] В варианте осуществления рак является раком молочной железы, раком почки, раком поджелудочной железы, раком толстой и прямой кишки, раком легкого, опухолью головного мозга, раком желудка, раком матки, раком яичника, раком предстательной железы, раком мочевого пузыря, раком пищевода, лейкозом, лимфомой, раком печени, раком желчного пузыря, саркомой, мастоцитомой, меланомой, раком коры надпочечников, опухолью Юинга, лимфомой Ходжкина, мезотелиомой, множественной миеломой, раком яичка, раком щитовидной железы или злокачественным новообразованием головы и шеи.

[0009] В другом варианте осуществления антитело является человеческим антителом, гуманизированным антителом, химерным антителом, одноцепочечным антителом или мультиспецифическим антителом (например, биспецифическим антителом).

[0010] Настоящее описание охватывает содержание описания и/или чертежей заявки на патент Японии 2013-166164, на которой основывается приоритет настоящей заявки.

Полезные эффекты изобретения

[0011] Антитело против CAPRIN-1 согласно настоящему изобретению повреждает раковые клетки. Таким образом, антитело против CAPRIN-1 согласно настоящему изобретению может применяться при лечении и/или профилактике рака.

Описание вариантов осуществления

[0012] Антитело против полипептида CAPRIN-1, применяемое в настоящем изобретении, может быть оценено по противоопухолевой активности, как указано ниже, при исследовании ex vivo на наличие иммуноцит-опосредованной цитотоксической активности против опухолевых клеток, экспрессирующих указанный полипептид, или при исследовании in vivo ингибирования роста опухоли у животного-носителя раковой опухоли.

[0013] Антитело против CAPRIN-1 согласно настоящему изобретению может быть моноклональным антителом или поликлональным антителом и предпочтительно является моноклональным антителом. Антитело против CAPRIN-1 согласно настоящему изобретению может быть любым типом антитела, которое может проявлять противоопухолевую активность и включает, например, рекомбинантные антитела (например, синтетические антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), гуманизированные антитела, химерные антитела и одноцепочечные антитела (scFv)), человеческие антитела, а также их фрагменты (например, Fab, F(ab')₂ и Fv). Такие антитела и их фрагменты могут быть получены способами, известными специалистам в данной области техники. В случае, когда субъект является человеком, человеческое антитело или гуманизированное антитело предпочтительны для преодоления или подавления развития иммунного ответа.

[0014] Фраза "специфично связывающийся с белком CAPRIN-1" означает, что антитело специфично связывается с белком CAPRIN-1, по существу без связывания с другими белками.

[0015] Субъект согласно настоящему изобретению, у которого требуется лечить и/или предотвратить рак, является млекопитающим, таким как человек, домашнее животное, сельскохозяйственное животное или спортивное животное, при этом предпочтительный субъект является человеком.

[0016] Далее будет описано получение антигена, получение антитела и фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению.

[0017] Получение антигена для получения антитела

Белки или их фрагмент, используемые в качестве сенсибилизирующего антигена для получения антитела против CAPRIN-1 согласно настоящему изобретению, не ограничиваются видами животных, служащих в качестве их источника, включая людей, собак, кошек, рогатый скот, лошадей, мышей, крыс и кур. Впрочем, предпочтительно выбирать сенсибилизирующий антиген с учетом совместимости с родительскими клетками для использования при слиянии клеток. В целом предпочтителен белок млекопитающего. В частности, предпочтителен белок человека. Например, в случае, когда CAPRIN-1 является CAPRIN-1 человека, белком CAPRIN-1 человека, его пептидным фрагментом, могут использоваться клетки, экспрессирующие CAPRIN-1 человека, или подобное.

[0018] Нуклеотидные последовательности и аминокислотные последовательности человеческого CAPRIN-1 и его гомологов могут быть получены, например, при получении доступа к базе GenBank (NCBI, USA) и использовании алгоритма, такого как BLAST или FASTA (Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877, 1993; и Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997).

[0019] В настоящем изобретении, в отношении нуклеотидной последовательности (SEQ ID NO: 16 или 18) или аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 17 или 19) человеческого CAPRIN-1, целевой CAPRIN-1 является нуклеиновой кислотой или белком, состоящими из последовательности, обладающей 70-100%, предпочтительно от 80% до 100%, более предпочтительно от 90% до 100%, более предпочтительно от 95% до 100%, например от 97% до 100%, от 98% до 100%, от 99% до 100% или от 99,5% до 100% идентичности последовательности с нуклеотидной последовательностью или аминокислотной последовательностью ORF или зрелого фрагмента референсной последовательности (аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 19, сравниваемые друг с другом, отличаются аминокислотными остатками в положении 690 и после него). В данном случае термин "% идентичности последовательности" означает процент (%) количества идентичных аминокислот (или оснований) от общего количества (включая количество пропусков) аминокислот (или оснований), при выравнивании двух последовательностей таким образом, чтобы могла быть достигнута максимальная степень подобия или идентичности с или без введенных пропусков.

[0020] Фрагмент белка CAPRIN-1 имеет длину в пределах от длины в аминокислотах эпитопа (антигенной детерминанты), который является наименьшей единицей, распознаваемой антителом, до длины, меньшей, чем длина полноразмерного белка. Эпитоп относится к фрагменту полипептида, обладающему антигенностью или иммуногенностью у млекопитающих, предпочтительно людей. Его наименьшая единица состоит из приблизительно 7-12 аминокислот, например 8-11 аминокислот.

[0021] Полипептидный фрагмент, включающий вышеуказанный человеческий белок CAPRIN-1 или его неполный пептид, может быть синтезирован согласно методу химического синтеза, например, методу Fmoc (флуоренилметоксикарбонил) или tBoc (т-бутоксикарбонил) (Seikagaku Jikken Koza 1 (Biochemical Experimentation Course 1 in English), the Japanese Biochemical Society ed., Protein Chemistry IV, Chemical Modification and Peptide Synthesis, Tokyo Kagaku Dojin Co., Ltd. (Japan), 1981). Кроме того, человеческий белок CAPRIN-1 или полипептидный фрагмент могут быть синтезированы стандартным способом, с использованием различных коммерчески доступных синтезаторов пептидов. В альтернативе полинуклеотид, кодирующий полипептид, получают, используя метод генной инженерии, известный в уровне техники (Sambrook et al., Molecular Cloning, the 2nd edition, Current Protocols in Molecular Biology (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, the 3rd edition, A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons; и т.д.), и этот полинуклеотид включают в векторы экспрессии, которые затем переносят в клетки-хозяева так, чтобы полипептид продуцировался в клетках-хозяевах. Таким способом может быть получен целевой человеческий белок CAPRIN-1 или его полипептидный фрагмент.

[0022] Полинуклеотид, кодирующий полипептид, может быть с легкостью получен с помощью метода генной инженерии, известного в уровне техники, или стандартного метода с использованием коммерчески доступного синтезатора нуклеиновых кислот. Например, ДНК, включающая нуклеотидную последовательность человеческого гена CAPRIN-1, может быть получена с помощью ПЦР при использовании человеческой хромосомной ДНК или кДНК библиотеки в качестве матрицы и пары праймеров, созданных с возможностью амплификации нуклеотидной последовательности. Условия реакции для такой ПЦР могут быть определены соответствующим образом. Примеры условий могут включать, без ограничения перечисленными, 30 циклов, каждый из которых включает стадии реакции, состоящие из 94°C в течение 30 секунд (денатурация), 55°C в течение 30 секунд - 1 минуты (отжиг) и 72°C в течение 2 минут (элонгация), при использовании термостабильной ДНК-полимеразы (например, Taq полимеразы или Pfu полимеразы) и Mg²⁺-седержащего буфера для ПЦР, с последующей реакцией при 72°C в течение 7 минут. Метод ПЦР, условия и т.д. описаны в, например, Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, the 3rd edition, A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons (в особенности, в Главе 15).

[0023] Кроме того, подходящие зонды или праймеры могут быть получены на основе информации о нуклеотидной последовательности гена CAPRIN-1 и аминокислотной последовательности белка CAPRIN-1, и могут использоваться в скрининге, например, библиотеки человеческой кДНК, с целью выделения нужной ДНК. Предпочтительно библиотека кДНК должна быть получена из клеток, органов или тканей, экспрессирующих белок CAPRIN-1. Примеры таких клеток или тканей включают клетки или ткани, полученные из яичка, а также из опухолей или раковых опухолей, таких как лейкоз, рак молочной железы, лимфома, опухоль головного мозга, рак легкого, рак поджелудочной железы, рак толстой и прямой кишки, рак почки, рак желудка, рак матки, рак яичника, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, рак пищевода, саркома, мастоцитома, рак печени, рак желчного пузыря, меланома, рак коры надпочечников, опухоль Юинга, лимфома Ходжкина, мезотелиома, множественная миелома, рак яичка, рак щитовидной железы и злокачественная опухоль головы и шеи. Указанные методики, включая получение зондов или праймеров, создание библиотеки кДНК, скрининг библиотеки кДНК и клонирование целевого гена, известны специалистам в данной области техники и могут быть выполнены согласно методам, описанным, например, в Sambrook et al., Molecular Cloning, the 2nd edition, Current Protocols in Molecular Biology (1989), и Ausubel et al. (там же). ДНК, кодирующая человеческий белок CAPRIN-1 или его неполный пептид, может быть получена из ДНК, полученной таким способом.

[0024] Клетки-хозяева, предназначенные для введения вектора экспрессии, могут быть любой клеткой, способной экспрессировать полипептид. Примеры прокариотических клеток включают, без ограничения перечисленными, E. coli. Примеры эукариотических клеток включают, без ограничения перечисленными: клетки млекопитающих, такие как клетки почки обезьяны COS1 и клетки яичника китайского хомячка CHO; линию эмбриональных клеток почки человека HEK293; линию эмбриональных клеток кожи мыши NIH3T3; клетки дрожжей, такие как клетки почкующихся дрожжей и делящихся дрожжей; клетки гусениц тутового шелкопряда и яйцеклетки Xenopus.

[0025] В случае использования прокариотических клеток в качестве клеток-хозяев, в качестве векторов экспрессии используются векторы экспрессии, имеющие точку начала репликации, которая обеспечивает репликацию в прокариотических клетках, промотор, сайт связывания рибосомы, сайт множественного клонирования, терминатор, ген устойчивости к лекарственному средству, ауксотрофный комплементарный ген и т.д. Примеры векторов экспрессии для E. coli могут включать серию pUC, pBluescript II, системы экспрессии pET и системы экспрессии pGEX. ДНК, кодирующую полипептид, включают в такие вектора экспрессии, и прокариотические клетки-хозяева могут быть трансформированы такими векторами, с последующим получением культуры полученных транформантов, чтобы полипептид, кодируемый ДНК, экспрессировался в прокариотических клетках-хозяевах. В этом отношении, полипептид может экспрессироваться как слитый с другим белком белок.

[0026] В случае использования эукариотических клеток в качестве клеток-хозяев, в качестве векторов экспрессии используются векторы экспрессии для эукариотических клеток, имеющие промотор, область сплайсинга, сайт поли(A) и т.д. Примеры таких векторов экспрессии могут включать векторы pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV, pRS, pcDNA3 и pYES2. Так же, как указано выше, ДНК, кодирующую полипептид, включают в такие векторы экспрессии, и эукариотические клетки-хозяева могут быть трансформированы такими векторами, с последующим получением культуры полученных транформантов, чтобы полипептид, кодируемый ДНК, экспрессировался в эукариотических клетках-хозяевах. В случае использования таких векторов экспрессии, как pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1 или pEGFP-C1, полипептид может быть экспрессироваться в виде различных слитых белков, меченных His-меткой (например, (His)₆-(His)₁₀), FLAG-меткой, myc-меткой, HA-меткой, GFP или подобным.

[0027] При переносе векторов экспрессии в клетки-хозяева может использоваться известный метод, такой как электропорация, метод с фосфатом кальция, липосомный метод, метод с DEAE декстраном, микроинъекция, вирусная инфекция, липофекция или связывание с проникающими в клетку пептидами.

[0028] Обработки с целью выделения, известные в уровне техники, могут быть выполнены в комбинации для выделения и очистки целевого полипептида из клеток-хозяев. Соответствующие примеры включают, без ограничения перечисленными, обработку денатурирующим агентом (например, мочевиной) или поверхностно-активным веществом, обработку ультразвуком, ферментативное расщепление, осаждение солью, фракционирование и осаждение в растворителе, диализ, центрифугирование, ультрафильтрацию, гель-фильтрацию, электрофорез в ДСН-ПААГ, электрофорез с изоэлектрическим фокусированием, ионообменную хроматографию, гидрофобную хроматографию, аффинную хроматографию и обращенно-фазовую хроматографию.

[0029] Антиген, полученный таким образом, может использоваться в качестве сенсибилизирующего антигена, как указано ниже, для получения антитела согласно настоящему изобретению.

[0030] Структура антитела

Антитела (иммуноглобулины) обычно являются гетеромультимерными гликопротеидами, при этом каждый из них включает по меньшей мере две тяжелых цепи и две легких цепи. Иммуноглобулины, за исключением IgM, являются гетеротетрамерными гликопротеидами массой приблизительно 150 кДа, причем каждый состоит из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (H) цепей. Как правило, каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью через одну ковалентную дисульфидную связь, хотя количество дисульфидных связей различается между тяжелыми цепями иммуноглобулинов различных изотипов. Каждая тяжелая цепь и легкая цепь также имеет внутрицепочечную дисульфидную связь. Каждая тяжелая цепь имеет вариабельный домен (VH область) на одном конце, после которого расположено несколько константных областей. Каждая легкая цепь имеет вариабельный домен (VL область) на одном конце и имеет одну константную область на другом конце. Константная область легкой цепи расположена параллельно первой константной области тяжелой цепи, тогда как вариабельный домен легкой цепи расположен параллельно вариабельному домену тяжелой цепи. Определенные области, называемые определяющими комплементарность областями (CDR), в вариабельных доменах антитела демонстрируют специфическую вариабельность и придают антителу специфичность связывания. Участки, относительно косервативные в вариабельных областях, называются каркасными областями (FR). Каждый полноразмерный вариабельный домен тяжелой цепи и легкой цепи имеет структуру, в которой четыре каркасные области связаны через три определяющих комплементарность области, то есть структуру, в которой FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4 связаны в этом порядке от N-конца. Эти три определяющих комплементарность области в тяжелой цепи называются CDRH1, CDRH2 и CDRH3, в этом порядке от ее N-конца. Аналогично, определяющие комплементарность области в легкой цепи называются CDRL1, CDRL2 и CDRL3. CDRH3 является самой важной в отношении специфичности связывания антитела с его антигеном. Кроме того, области CDR в каждой цепи удерживаются близко друг к другу каркасными областями и способствуют формированию антигенсвязывающего участка в антителе, вместе с определяющими комплементарность областями из другой цепи. Константные области не способствуют непосредственно связыванию антигена и антитела, но проявляют различные эффекторные функции, например, участвуют в антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC), фагоцитозе (ADCP), опосредованном связыванием с Fcγ рецептором, влияют на полупериод существования/скорость выведения, опосредуемые неонатальным Fc-рецептором (FcRn), и комплементзависимую цитотоксичность (CDC), опосредуемую C1q компонентом в каскаде комплемента.

[0031] Получение антитела

Антитело против CAPRIN-1 согласно настоящему изобретению означает антитело, обладающее иммунологической реактивностью с полноразмерным белком CAPRIN-1 или его фрагментом.

[0032] В данном случае "иммунологическая реактивность" означает свойство связывания антитела с антигеном CAPRIN-1 (полноразмерным белком CAPRIN-1 или его неполным полипептидом) in vivo. Посредством такого связывания с CAPRIN-1 антитело согласно настоящему изобретению проявляет функцию повреждения (например, вызывает гибель, подавление или регрессию) опухолевых клеток. Антитело согласно настоящему изобретению может повреждать опухоль, например, рак молочной железы, рак почки, рак поджелудочной железы, рак толстой и прямой кишки (например, рак толстой кишки), рак легкого, опухоль головного мозга, рак желудка, рак матки, рак яичника, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, рак пищевода, лейкоз, лимфому, рак печени, рак желчного пузыря, саркому, мастоцитому, меланому, рак коры надпочечников, опухоль Юинга, лимфому Ходжкина, мезотелиому, множественную миелому, рак яичка, рак щитовидной железы или злокачественную опухоль головы и шеи, при связывании с белком CAPRIN-1.

[0033] Антитело согласно настоящему изобретению конкретно не ограничено, предпочтительно при условии, что антитело является моноклональным антителом. Антитело согласно настоящему изобретению включает синтетические антитела, мультиспецифические антитела (например, диатела и триатела), человеческие антитела, гуманизированные антитела, химерные антитела, одноцепочечные антитела, фрагменты антител (например, Fab, F(ab')₂ и Fv) и т.п. Кроме того, антитело является молекулой иммуноглобулина любого класса, например, IgG, IgE, IgM, IgA, IgD или IgY, или любого подкласса, например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 или IgA2.

[0034] Антитело может быть также модифицировано дегликозилированием, ацетилированием, формилированием, амидированием, фосфорилированием, ПЭГилированием или подобным, в дополнение к гликозилированию.

[0035] Далее будут представлены примеры получения различных моноклональных антител.

[0036] Например, линию клеток рака молочной железы SK-BR-3, экспрессирующую CAPRIN-1, вводят мыши для иммунизации. Селезенку этой мыши забирают. После выделения клетки селезенки подвергают слиянию с клетками миеломы мыши. Клоны, продуцирующие антитела, облающие ингибиторным действием в отношении роста раковых клеток, отбирают из полученных слитых клеток (гибридом). Гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела, облающие ингибиторным действием в отношении роста раковых клеток, выделяют, после чего эти гибридомы культивируют. Антитело согласно настоящему изобретению может быть получено при очистке из супернатанта культуры согласно общему способу аффинной очистки.

[0037] Моноклональные антителопродуцирующие гибридомы могут быть получены, например, следующим образом: первым этапом животных иммунизируют сенсибилизирующим антигеном согласно способу, известному в уровне техники. Такой способ иммунизации обычно включает внутрибрюшинное или подкожное введение сенсибилизирующего антигена млекопитающим. В частности, сенсибилизирующий антиген, разведенный или суспендированный в PBS (фосфатно-солевом буфере), физиологическом растворе или подобном, в нужном количестве, смешивают, при необходимости, с требуемым количеством стандартного адъюванта, например, полного адъюванта Фрейнда. После эмульгирования полученную эмульсию вводят каждому млекопитающему несколько раз каждые 4-21 день. В альтернативе подходящий носитель может использоваться для иммунизации сенсибилизирующим антигеном.

[0038] После подтверждения повышения уровня требуемого антитела в сыворотке млекопитающего, иммунизированного таким образом, у млекопитающего забрают иммуноциты и подвергают слиянию клеток. Предпочтительные примеры иммуноцитов, в частности, включают клетки селезенки.

[0039] Клетки миеломы млекопитающего используются в качестве родительских клеток-партнеров, которые подвергают слиянию с иммуноцитами. Различные клеточные линии, известные в уровне техники, например, P3U1 (P3-X63Ag8U1), P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550), P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519), MPC-11 (Margulies. D.H. et al., Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270), FO (deSt. Groth, S.F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194 (Trowbridge, I.S. J.Exp.Med. (1978) 148, 313-323), R210 (Galfre, G. et al., Nature (1979) 277, 131-133), 240E-1, 240E-W и 240E-W2, предпочтительно используют в качестве клеток миеломы.

[0040] Слияние клеток между иммуноцитами и клетками миеломы может быть выполнено по существу согласно способу, известному в уровне техники, например, способу Колера и Милстеина (Kohler, G. and Milstein, C. Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46).

[0041] Более конкретно, слияние клеток проводят, например, в присутствии ускорителя слияния клеток в стандартной питательной среде. Например, в качестве ускорителя слияния используются полиэтиленгликоль (ПЭГ) или японский гемагглютинирующий вирус (HVJ). При необходимости может быть также добавлено вспомогательное вещество, такое как диметилсульфоксид, для использования с целью повышения эффективности слияния.

[0042] Соотношение между используемыми иммуноцитами и клетками миеломы может быть установлено произвольно. Например, среда RPMI1640 или среда MEM, подходящая для роста линий клеток миеломы, или стандартная среда для использования с этим типом клеточной культуры, могут использоваться в качестве среды для использования при слиянии клеток. Кроме того, добавка сыворотки, такой как эмбриональная сыворотка теленка (FCS), может использоваться в комбинации со средой.

[0043] Для слияния клеток иммуноциты и клетки миеломы тщательно смешивают в заданном количестве среды. Затем раствор ПЭГ (средняя молекулярная масса: например, приблизительно 1000-6000), нагретый до приблизительно 37°C, обычно добавляют к смеси в концентрации 30-60% (в/об) и смешивают с ней для получения целевых гибридом. В дальнейшем предпочтительно удалять агенты для слияния клеток или подобные вещества, неблагоприятно влияющие на рост гибридом, путем повтора процедур последовательного добавления подходящей среды и удаления супернатанта с помощью центрифугирования.

[0044] Гибридомы, полученные таким образом, культивируют в стандартной селективной среде, например, среде HAT (среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин), для селекции. Эту культуру в среде HAT выдерживают в течение периода (обычно, от нескольких дней до нескольких недель), достаточного для гибели всех клеток (неслитых клеток), кроме целевых гибридом. Затем гибридомы, продуцирующие целевое антитело, подвергают скринингу и клонируют как отдельные клоны с помощью стандартного метода серийных разведений.

[0045] В дополнение к такому получению гибридом путем иммунизации не относящихся к человеку животных антигеном, гибридомы, продуцирующие человеческие антитела, обладающие требуемой активностью (например, активностью подавления роста клеток), могут быть получены при сенсибилизации человеческих лимфоцитов, например инфицированных вирусом ЭБ человеческих лимфоцитов, белком, экспрессирующими белок клетками или их лизатами in vitro, и слиянии сенсибилизированных лимфоцитов с клетками миеломы, полученными на основе человеческих клеток, способными к постоянному делению, например, U266 (регистрационный номер TIB196).

[0046] Продуцирующие моноклональное антитело гибридомы, полученные таким образом, можно субкультивировать в стандартной среде и можно также хранить в течение продолжительного периода в жидком азоте.

[0047] В частности, требуемый антиген или клетки, экспрессирующие требуемый антиген, используются в качестве сенсибилизирующего антигена при иммунизации согласно стандартному методу иммунизации. Полученные иммуноциты подвергают слиянию с родительскими клетками, известными в уровне техники, согласно стандартному методу слияния клеток. Продуцирующие моноклональное антитело клетки (гибридомы) могут быть подвергнуты скринингу с помощью стандартного метода скрининга с целью получения целевого антитела.

[0048] Антиген может быть получен согласно, например, способу с использованием клеток животных (публикация патента Японии (Kohyo) 2007-530068 (2007)) или способу с использованием бакуловируса (например, международная публикация WO98/46777). В случае, когда антиген обладает низкой иммуногенностью, такой антиген может быть связан к иммуногенной макромолекулой, такой как альбумин, для иммунизации. Антиген может быть введен вместе с адъювантом для иммунизации.

[0049] В альтернативе антитело согласно настоящему изобретению может быть получено как рекомбинантное антитело, полученное с использованием методики рекомбинации генов, которая включает: клонирование гена антитела из гибридомы; включение гена антитела в подходящие векторы; и перенос векторов в организмы-хозяева (см., например, Carl, A.K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990). В частности, молекулы кДНК вариабельной области (V-область) антитела синтезируют из молекул мРНК гибридомы при использовании обратной транскриптазы. После получения ДНК, кодирующих V-области целевого антитела, ДНК лигируют с ДНК, кодирующими требуемые константные области антитела (C-области). Полученные в результате продукты лигирования встраивают в векторы экспрессии. В альтернативе ДНК, кодирующие V-область антитела, могут быть встроены в векторы экспрессии, содержащие ДНК C-областей антитела. Такие ДНК встраивают в векторы экспрессии, чтобы они экспрессировались под контролем областей регуляции экспрессии, например, энхансера и промотора. Затем клетки-хозяева можно трансформировать полученными векторами экспрессии и проводить экспрессию антитела.

[0050] Антитело против CAPRIN-1 согласно настоящему изобретению предпочтительно является моноклональным антителом. Моноклональное антитело включает человеческие моноклональные антитела, нечеловеческие моноклональные антитела животных (например, моноклональные антитела мыши, крысы, кролика и курицы), химерные моноклональные антитела и т.п. Моноклональное антитело может быть получено при культивировании гибридом, полученных в результате слияния клеток селезенки не относящихся к человеку млекопитающих (например, мышей, продуцирующих человеческое антитело мышей, кур или кроликов), иммунизированных белком CAPRIN-1 или его фрагментом, и клеток миеломы. Химерное антитело представляет собой антитело, полученное в результате объединения последовательностей, полученных из различных животных, и является, например, антителом, состоящим из вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи антитела мыши и константных областей тяжелой цепи и легкой цепи антитела человека. Химерное антитело может быть получено при использовании способа, известного в уровне техники, и его получают, например: при лигировании молекул ДНК, кодирующих V-области антитела, с молекулами ДНК, кодирующими C-области человеческого антитела; включении полученных продуктов лигирования в векторы экспрессии; и переносе векторов в организмы-хозяева для получения антитела.

[0051] В Примерах, представленных ниже, было получено множество гуманизированных моноклональных антител и человеческоое-кроличье химерное моноклональное антитело, и при этом было подтверждено, что они обладают сильным противоопухолевым действием. Все указанные моноклональные антитела имеют вариабельную область тяжелой цепи (область VH), включающую CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2, и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3, и вариабельную область легкой цепи (область VL), включающую CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 4, CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 5, и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 6. Указанные моноклональные антитела включают гуманизированное антитело #0, состоящее из области VH, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и области VL, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, гуманизированное антитело #1, состоящее из области VH, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и области VL, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, гуманизированное антитело #2, состоящее из области VH, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и области VL, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, гуманизированное антитело #3, состоящее из области VH, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и области VL, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, гуманизированное антитело #4, состоящее из области VH, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и области VL, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, гуманизированное антитело #5, состоящее из области VH, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и области VL, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, гуманизированное антитело #6, состоящее из области VH, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и области VL, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, гуманизированное антитело #7, состоящее из области VH, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и области VL, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, гуманизированное антитело #8, состоящее из области VH, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, и области VL, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, гуманизированное антитело #9, состоящее из области VH, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, и области VL, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, гуманизированное антитело #10, состоящее из области VH, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, и области VL, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и человеческое-кроличье химерное антитело, состоящее из области VH, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, и области VL, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21.

[0052] Гуманизированное антитело, также называемое реконструированным человеческим антителом, является сконструированным антителом. Гуманизированное антитело конструируют посредством графтинга определяющих комплементарность областей человеческого антитела с определяющими комплементарность областями антитела, полученного от иммунизированного животного. Общий подход рекомбинации генов для этого также известен.

[0053] В частности, последовательности ДНК, предназначенные для связывания определяющих комплементарность областей, например, мышиного, кроличьего или куриного антитела, и каркасных областей человеческого антитела, синтезируют с помощью ПЦР из нескольких полученных олигонуклеотидов, у которых перекрываются друг с другом концевые участки. Полученные ДНК лигируют с ДНК, кодирующими константные области человеческого антитела. После этого полученные в результате продукты лигирования включают в векторы экспрессии, которые затем переносят в организмы-хозяева для продукции антитела с целью получения целевого антитела (см. публикацию европейской заявки на патент EP239400 и международную публикацию WO96/02576). Каркасные области человеческого антитела, связанные через определяющие комплементарность области, подбирают таким образом, чтобы определяющие комплементарность области формировали подходящий антигенсвязывающий участок. В случае необходимости, аминокислоты в каркасных областях вариабельных областей антитела могут быть заменены таким образом, чтобы определяющие комплементарность области получаемого в результате реконструированного человеческого антитела формировали подходящий антигенсвязывающий участок (Sato K. et al., Cancer Research 1993, 53: 851-856). Кроме того, такие каркасные области могут быть заменены каркасными областями, полученными из различных человеческих антител (см. международную публикацию WO99/51743).

[0054] Для получения химерного антитела или гуманизированного антитела, аминокислоты в вариабельных областях (например, FR) или константных областях могут быть заменены, например, другими аминокислотами.

[0055] Аминокислотная замена является заменой одной или больше, например, меньше 15, меньше 10, 8 или меньше, 7 или меньше, 6 или меньше, 5 или меньше, 4 или меньше, 3 или меньше, или 2 или меньше аминокислот, предпочтительно 1-9 аминокислот. Содержащее замены антитело должно быть функционально эквивалентным не содержащему замен антителу.

[0056] В данном случае фраза "функционально эквивалентный" означает, что рассматриваемое антитело обладает биологической или биохимической активностью, подобной активности антитела настоящего изобретения, в частности, рассматриваемое антитело обладает функцией разрушения опухоли и по существу не вызывает направленного против него иммунного ответа, например, при введении людям. Примеры такой активности могут включать активность ингибирования роста клеток и связывающую активность.

[0057] Способ замены аминокислот, который включает введение мутации в полипептид, известен специалистам в данной области техники как способ получения полипептида, функционально эквивалентного определенному полипептиду. Например, специалисты в данной области техники могут надлежащим образом ввести аминокислотную замену в антитело согласно настоящему изобретению при использовании сайт-направленного мутагенеза (Hashimoto-Gotoh, T. et al., (1995) Gene 152, 271-275; Zoller, MJ., and Smith, M. (1983) Methods Enzymol. 100, 468-500; Kramer, W. et al., (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456; Kramer, W. and Fritz, HJ., (1987) Methods Enzymol. 154, 350-367; Kunkel, TA., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 488-492; Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766) или подобного, с получением, таким образом, антитела, функционально эквивалентного антителу настоящего изобретения.

[0058] В случае введения аминокислотной замены замена предпочтительно является консервативной аминокислотной заменой. Консервативная аминокислотная замена является заменой между аминокислотами, которые обладают подобными свойствами, такими как заряд, боковые цепи, полярность и ароматичность. Аминокислоты могут быть классифицированы по сходным свойствам, например: основные аминокислоты (аргинин, лизин и гистидин); кислотные аминокислоты (аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота); незаряженные полярные аминокислоты (глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, цистеин и тирозин); неполярные аминокислоты (лейцин, изолейцин, аланин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин); разветвленные аминокислоты (лейцин, валин и изолейцин); и ароматические аминокислоты (фенилаланин, тирозин, триптофан и гистидин).

[0059] Примеры модифицированных антител могут включать антитела, связанные с различными молекулами, такими как полиэтиленгликоль (ПЭГ). В модифицированном антителе настоящего изобретения связываемое с антителом вещество не ограничено. Для получения такого модифицированного антитела, полученное антитело может быть модифицировано химически. Соответствующий способ для этого уже известен в уровне техники.

[0060] Антитело, которое распознает белок CAPRIN-1 или полипептидный фрагмент CAPRIN-1, может быть получено методом, общеизвестным специалистам в данной области техники. Антитело может быть получено, например, способом, который включает определение эпитопа белка CAPRIN-1, распознаваемого антителом против CAPRIN-1, стандартным методом (например, картирование эпитопа или способ идентификации эпитопа, указанный ниже) и получение антитела при использовании полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, которая содержится в эпитопе, в качестве иммуногена, или способом, который включает определение эпитопа для антитела, полученного стандартным способом, и отбор антитела, которое распознает тот же эпитоп, что и антитело против CAPRIN-1.

[0061] Антитело согласно настоящему изобретению является антителом, обладающим иммунологической реактивностью с CAPRIN-1, антителом, которое специфично распознает CAPRIN-1, или антителом, которое специфично связывается с CAPRIN-1 и демонстрирует цитотоксическую активность против рака или ингибиторное действие в отношении роста опухоли. Предпочтительно антитело должно быть антителом, имеющим структуру, которая вызвает слабый иммунный ответ или не вызвает иммунного ответа у животных-реципиентов. Примеры таких антител включают человеческие антитела, гуманизированные антитела, химерные антитела (например, человеческие-кроличьи химерные антитела), одноцепочечные антитела и биспецифические антитела в том случае, когда животными-реципиентами являются люди. Такие антитела являются рекомбинантными антителами, имеющими вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи, полученные из человеческого антитела, имеющими вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи, включающие определяющие комплементарность области (CDR1, CDR2, и CDR3), полученные из антитела не относящегося к человеку животного, и каркасные области (FR1, FR2, FR3, и FR4), полученные из человеческого антитела, или имеющими вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи, полученные из антитела не относящегося к человеку животного, и константные области тяжелой цепи и легкой цепи, полученные из человеческого антитела. Предпочтительные антитела являются двумя первыми антителами.

[0062] Указанные рекомбинантные антитела могут быть получены следующим образом: ДНК, кодирующую моноклональное антитело (например, моноклональное антитело человека, мыши, крысы, кролика или курицы) против человеческого CAPRIN-1, клонируют из антителопродуцирующих клеток, таких как гибридомы, и используют ее в качестве матрицы в ОТ-ПЦР или подобном для получения ДНК, кодирующих вариабельные области легкой цепи и тяжелой цепи антитела. Соответствующие последовательности вариабельных областей легкой цепи и тяжелой цепи, соответствующие последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 в каждой области, или соответствующие последовательности FR1, FR2, FR3 и FR4 в каждой области могут быть определены на основе, например, системы нумерации EU Кэбата (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)).

[0063] Такую ДНК, кодирующую каждую из этих вариабельных областей, или ДНК, кодирующую каждую определяющую комплементарность область, также получают при использовании методики рекомбинации генов (Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) или синтезатора ДНК. В данном случае гибридомы, продуцирующие человеческие моноклональные антитела, могут быть получены при иммунизации животных, продуцирующих человеческие антитела (например, мышей), человеческим CAPRIN-1 и последующим слиянием клеток селезенки, забранных у иммунизированных животных, с клетками миеломы. Кроме этого, ДНК, кодирующие полученные из человеческого антитела вариабельные и константные области легкой цепи или тяжелой цепи, получают, в случае необходимости, при использовании методики рекомбинации генов или синтезатора ДНК.

[0064] В отношении гуманизированного антитела, последовательности, кодирующие CDR, в ДНК, кодирующей полученную из человеческого антитела вариабельную область легкой цепи или тяжелой цепи, могут быть заменены соответствующими последовательностями, кодирующими CDR, из антитела не относящегося к человеку животного (например, мыши, крысы, кролика или курицы), с полученим, таким образом, ДНК, кодирующей гуманизированное антитело. В случае, например, гуманизированного антитела, в котором кодирующие CDR последовательности, полученные из человеческого антитела, заменены соответствующими кодирующими CDR последовательностями, полученными из антитела мыши, каждая вариабельная область состоит из человеческой FR1, мышиной CDR1, человеческой FR2, мышиной CDR2, человеческой FR3, мышиной CDR4 и человеческой FR4, в указанном порядке с N-конца.

[0065] В отношении химерного антитела, ДНК, кодирующая вариабельную область легкой цепи или тяжелой цепи антитела не относящегося к человеку животного (например, мыши, крысы, кролика или курицы), может быть лигирована с ДНК, кодирующей константную область легкой цепи или тяжелой цепи, полученную из человеческого антитела, с получением ДНК, кодирующей химерное антитело.

[0066] В случае одноцепочечного антитела это антитело относится к антителу, включающему вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, связанные линейно через линкер. ДНК, кодирующая одноцепочечное антитело, может быть получена при лигировании ДНК, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи, ДНК, кодирующей линкер, и ДНК, кодирующей вариабельную область легкой цепи. В данном случае вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи получены из человеческого антитела или получены из человеческого антитела, в котором только определяющие комплементарность области заменены определяющими комплементарность областями из антитела не относящегося к человеку животного (например, мыши, крысы, кролика или курицы). Линкер состоит из 12-19 аминокислот. Соответствующие примеры включают линкер (G₄S)₃, состоящий из 15 аминокислот (G.-B. Kim et al., Protein Engineering Design and Selection 2007, 20 (9): 425-432).

[0067] В случае биспецифического антитела (например, диатела) это антитело относится к антителу, способному специфично связывать два различных эпитопа. ДНК, кодирующая биспецифическое антитело, может быть получена при лигировании, например, ДНК, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи A, ДНК, кодирующей вариабельную область легкой цепи B, ДНК, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи B, и ДНК, кодирующей вариабельную область легкой цепи A, в указанном порядке (при условии, что ДНК, кодирующая вариабельную область легкой цепи B, и ДНК, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи B, лигированы через ДНК, кодирующую линкер, как описано выше). В данном случае все вариабельные области тяжелой цепи и вариабельные области легкой цепи получены из человеческого антитела или получены из человеческого антитела, в котором только определяющие комплементарность области заменены определяющими комплементарность областями из антитела не относящегося к человеку (например, мыши, крысы, кролика или курицы).

[0068] Рекомбинантные ДНК, полученные таким образом, могут быть включены в один или более подходящих векторов, которые затем переносят в клетки-хозяева (например, клетки млекопитающих, клетки дрожжей и клетки насекомых) так, чтобы ДНК (ко)экспрессировались с получением целевого рекомбинантного антитела (P.J. Delves., ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES., 1997 WILEY; P. Shepherd and C. Dean., Monoclonal Antibodies., 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS; J.W. Goding., Monoclonal Antibodies: principles and practice., 1993 ACADEMIC PRESS).

[0069] Примеры антитела настоящего изобретения, полученного любым из способов, описанных выше, включают следующие антитела (a)-(l), включающие вариабельную область тяжелой цепи, включающую SEQ ID NO: 1, 2 и 3, и вариабельную область легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 4, 5 и 6, полученные в Примерах, представленных ниже:

[0070] (a) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 8 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 15,

(b) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 10 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 15,

(c) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 7 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 15,

(d) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 8 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 13,

(e) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 7 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 12,

(f) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 8 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 12,

(g) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 7 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 13,

(h) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 10 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 14,

(i) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 8 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 11,

(j) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 7 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 11,

(k) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 9 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 15, и

(l) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 20 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 21.

В данном случае аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 1, 2 и 3, соответствуют CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, вариабельной области тяжелой цепи антитела кролика, и аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 4, 5 и 6, соответствуют CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, вариабельной области легкой цепи антитела кролика.

[0071] Гуманизированное антитело, химерное антитело, одноцепочечное антитело или биспецифическое антитело согласно настоящему изобретению являются, например, любым из следующих антител (i)-(xiv):

[0072] (i) антитело, включающее вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1, 2 и 3 и аминокислотные последовательности полученных из человеческого антитела каркасных областей, или их формы с аминокислотными заменами, и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 4, 5 и 6 и аминокислотные последовательности полученных из человеческого антитела каркасных областей, или их формы с аминокислотными заменами,

[0073] (ii) антитело, включающее вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1, 2 и 3 и аминокислотные последовательности полученных из человеческого антитела каркасных областей, или их формы с аминокислотными заменами, и константную область тяжелой цепи, включающую полученную из человеческого антитела аминокислотную последовательность, и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 4, 5 и 6 и аминокислотные последовательности полученных из человеческого антитела каркасных областей, или их формы с аминокислотными заменами, и константную область легкой цепи, включающую полученную из человеческого антитела аминокислотную последовательность,

[0074] (iii) антитело, включающее вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и константную область тяжелой цепи, включающую полученную из человеческого антитела аминокислотную последовательность, и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и константную область легкой цепи, включающую полученную из человеческого антитела аминокислотную последовательность,

[0075] (iv) антитело, включающее вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, и константную область тяжелой цепи, включающую полученную из человеческого антитела аминокислотную последовательность, и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и константную область легкой цепи, включающую полученную из человеческого антитела аминокислотную последовательность,

[0076] (v) антитело, включающее вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и константную область тяжелой цепи, включающую полученную из человеческого антитела аминокислотную последовательность, и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и константную область легкой цепи, включающую полученную из человеческого антитела аминокислотную последовательность,

[0077] (vi) антитело, включающее вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и константную область тяжелой цепи, включающую полученную из человеческого антитела аминокислотную последовательность, и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, и константную область легкой цепи, включающую полученную из человеческого антитела аминокислотную последовательность,

[0078] (vii) антитело, включающее вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и константную область тяжелой цепи, включающую полученную из человеческого антитела аминокислотную последовательность, и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и константную область легкой цепи, включающую полученную из человеческого антитела аминокислотную последовательность,

[0079] (viii) антитело, включающее вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, константную область тяжелой цепи, включающую полученную из человеческого антитела аминокислотную последовательность, и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и константную область легкой цепи, включающую полученную из человеческого антитела аминокислотную последовательность,

[0080] (ix) антитело, включающее вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и константную область тяжелой цепи, включающую полученную из человеческого антитела аминокислотную последовательность, и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, и константную область легкой цепи, включающую полученную из человеческого антитела аминокислотную последовательность,

[0081] (x) антитело, включающее вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, и константную область тяжелой цепи, включающую полученную из человеческого антитела аминокислотную последовательность, и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и константную область легкой цепи, включающую полученную из человеческого антитела аминокислотную последовательность,

[0082] (xi) антитело, включающее вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и константную область тяжелой цепи, включающую полученную из человеческого антитела аминокислотную последовательность, и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотну последовательность SEQ ID NO: 11, и константную область легкой цепи, включающую полученную из человеческого антитела аминокислотную последовательность,

[0083] (xii) антитело, включающее вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и константную область тяжелой цепи, включающую полученную из человеческого антитела аминокислотную последовательность, и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и константную область легкой цепи, включающую полученную из человеческого антитела аминокислотную последовательность,

[0084] (xiii) антитело, включающее вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, и константную область тяжелой цепи, включающую полученную из человеческого антитела аминокислотную последовательность, и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и константную область легкой цепи, включающую полученную из человеческого антитела аминокислотную последовательность, и

[0085] (xiv) антитело, включающее вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, и константную область тяжелой цепи, включающую полученную из человеческого антитела аминокислотную последовательность, и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и константную область легкой цепи, включающую полученную из человеческого антитела аминокислотную последовательность.

[0086] Последовательности каркасных областей константных и вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи человеческого антитела доступны, например, в NCBI (США; GenBank, UniGene и т.д.). Например, могут быть указаны следующие последовательности: регистрационный номер J00228 для константной области тяжелой цепи IgG1 человека; регистрационный номер J00230 для константной области тяжелой цепи IgG2 человека; регистрационный номер X03604 для константной области тяжелой цепи IgG3 человека; регистрационный номер K01316 для константной области тяжелой цепи IgG4 человека; регистрационные номера V00557, X64135, X64133 и т.д. для константной области легкой цепи κ человека; и регистрационные номера X64132, X64134 и т.д. для константной области легкой цепи λ человека.

[0087] Предпочтительно указанные антитела обладают цитотоксической активностью и могут, таким образом, проявлять противоопухолевое действие (или противоопухолевую активность).

[0088] Каждое из вышеуказанных антител может содержать замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот в последовательности определяющей комплементарность области, последовательности каркасной области и/или последовательности константной области, при условии, что получаемое в результате антитело обладает такой специфичностью, что оно может специфично распознавать CAPRIN-1. В данном случае термин "несколько" предпочтительно означает 1-9.

[0089] Константа аффинности Ka (k_on/k_off) антитела настоящего изобретения в отношении белка CAPRIN-1 или его фрагмента предпочтительно составляет по меньшей мере 5×10⁸ M^-1, по меньшей мере 10⁹ M^-1, по меньшей мере 5×10⁹ M^-1, по меньшей мере 10¹⁰ M^-1, по меньшей мере 5×10¹⁰ M^-1, по меньшей мере 10¹¹ M^-1, по меньшей мере 5×10¹¹ M^-1, по меньшей мере 10¹² M^-1, по меньшей мере 10¹³ M^-1, или по меньшей мере 10¹⁴ M^-1.

[0090] Один из механизмов, лежащих в основе противоопухолевого действия антитела настоящего изобретения на раковые клетки, экспрессирующие CAPRIN-1, является антителозависимой клеточной цитотоксичностью (ADCC) эффекторных клеток против клеток, экспрессирующих CAPRIN-1. Противоопухолевая активность антитела настоящего изобретения через ADCC может быть увеличена путем замены одной или нескольких аминокислот в константной области тяжелой цепи антитела настоящего изобретения или путем удаления фукозы, присоединенной к N-ацетилглюкозамину в N-гликозид-связанной углеводной цепи, присоединенной к константной области тяжелой цепи. Противоопухолевая активность антитела настоящего изобретения через ADCC может быть также увеличена при объединении аминокислотной замены и удаления фукозы в константной области тяжелой цепи.

[0091] Такое антитело, не имеющее фукозы, присоединенной к N-ацетилглюкозамину в N-гликозид-связанной углеводной цепи, присоединенной к константной области тяжелой цепи согласно настоящему изобретению, может применяться отдельно или может быть в композиции с фукозилированным антителом. Предпочтительно композиция антитела должна состоять главным образом из антитела, не имеющего фукозы.

[0092] Антитело, в котором заменена одна или несколько аминокислот в константной области тяжелой цепи, может быть получено со ссылкой, например, на международную публикацию WO2004/063351, международную публикацию WO2011/120135, патент США 8388955, международную публикацию WO2011/005481, патент США 6737056 и международную публикацию WO2005/063351. Антитело, не имеющее фукозы, присоединенной к N-ацетилглюкозамину в N-гликозид-связанной углеводной цепи в константной области тяжелой цепи, или клетки, продуцирующие такое антитело, могут быть получены со ссылкой, например, на патент США 6602684, европейский патент 1914244 и патент США 7579170. Композиция антитела, не имеющего фукозы, присоединенной к N-ацетилглюкозамину в N-гликозид-связанной углеводной цепи, присоединенной к константной области тяжелой цепи, и фукозилированного антитела, или клетки, продуцирующие такую композицию, могут быть получены со ссылкой, например, на патент США 8642292.

[0093] Антитело согласно настоящему изобретению может быть конъюгировано с противоопухолевым средством. Конъюгирование антитела с противоопухолевым средством может быть выполнено через спейсер, имеющий группу (например, сукцинимидильную группу, формильную группу, 2-пиридилдитиогруппу, малеимидильную группу, алкоксикарбонильную группу или гидроксильную группу), реагирующую с аминогруппой, карбоксильной группой, гидроксильной группой, тиоловой группой или подобным.

[0094] Примеры противоопухолевого средства включают следующие противоопухолевые средства, общеизвестные из литературы, и т.д.: паклитаксел, доксорубицин, даунорубицин, циклофосфамид, метотрексат, 5-фтороурацил, тиотепа, бусульфан, импросульфан, пипосульфан, бензодопа, карбоквон, метуредопа, уредопа, алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид, триметилоломеламин, буллатацин, буллатацинон, камптотецин, бриостатин, каллистатин, криптофицин 1, криптофицин 8, доластатин, дуокармицин, элеутеробин, панкратистатин, саркодиктиин, спонгистатин, хлорамбуцил, хлорнафазин, хлорфосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, гидрохлорид оксида мехлорэтамина, мелфалан, новембихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урамустин, кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин, ранимустин, калихеамицин, динемицин, клодронат, эсперамицин, аклациномицин, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицин, кактиномицин, карабицин, карминомицин, карцинофилин, хромомицин, дактиномицин, деторбицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, адриамицин, эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицин C, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин, деноптерин, птероптерин, триметрексат, флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин, анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин, андрогены (например, калустерон, дромостанолона пропионат, эпитиостанол, мепитиостан и тестолактон), аминоглутетимид, митотан, трилостан, фролиновая кислота, ацеглатон, альдофосфамида гликозид, аминолевулиновая кислота, энилурацил, амсакрин, бестрабуцил, бисантрен, эдатраксат, дефофамин, демеколцин, диазихон, элфорнитин, эллиптиния ацетат, эпотилон, этоглуцид, лентинан, лонидамин, майтанзин, ансамитоцин, митогуазон, митоксантрон, мопиданмол, нитраэрин, пентостатин, фенамет, пирарубицин, лозоксантрон, подофиллиновая кислота, 2-этилгидразид, прокарбазин, разоксан, ризоксин, шизофиллан, спирогерманий, тенуазоновая кислота, триазиквон, роридин A, ангуидин, уретан, виндезин, дакарбазин, манномустин, митобронитол, митолактол, пипоброман, гацитозин, доцетаксел, хлорамбуцил, гемцитабин, 6-тиогуанин, меркаптопурин, цисплатин, оксалиплатин, карбоплатин, винбластин, этопозид, ифосфамид, митоксантрон, винкристин, винорелбин, новантрон, тенипозид, эдатрексат, дауномицин, аминоптерин, Кселода, ибандронат, иринотекан, ингибиторы топоизомеразы, дифторметилорнитин (DMFO), ретиноевая кислота, капецитабин и их фармацевтически приемлемые соли или производные.

[0095] В случае, когда антитело является антителом, конъюгированным с противоопухолевым средством, способ оценки наличия противоопухолевой активности может включать, например, для полученного из мыши антитела против CAPRIN-1, взаимодействие с ним вторичного антитела с присоединенным к нему лекарственным средством, связывающегося с мышиным антителом, для оценки противоопухолевого действия ex vivo на человеческие раковые клетки. Такая оценка может быть проведена при использовании, например, антитела против человеческого IgG (Hum-ZAP (Advanced Targeting Systems, Inc.)), которое является вторым иммунотоксином, связанным с сапорином.

[0096] В альтернативе антитело согласно настоящему изобретению может быть введено в комбинации с противоопухолевым средством, чтобы таким образом получить более сильное терапевтическое воздействие. Данный подход можно адаптировать для пациента с CAPRIN-1-экспрессирующим раком, до или после хирургического лечения. Данный подход может быть применен, в особенности, после хирургии, к CAPRIN-1-экспрессирующему раку, который подвергали стандартному лечению только с применением противоопухолевого средства, чтобы получить более высокую степень предотвращения рецидива рака или продление времени выживания.

[0097] Например, любое из противоопухолевых средств, описанных выше, может применяться в качестве противоопухолевого средства для использования при комбинированном введении с антителом настоящего изобретения. В частности, предпочтительно используется циклофосфамид, паклитаксел, доцетаксел или винорелбин.

[0098] В альтернативе антитело согласно настоящему изобретению может быть связано с радиоизотопом, общеизвестным в литературе, и т.д., таким как ²¹¹At, ¹³¹I, ¹²⁵I, ⁹⁰Y, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁵³Sm, ²¹²Bi, ³²P, ¹⁷⁵Lu, ¹⁷⁶Lu, ⁸⁹Sr, ⁶⁴Cu или ¹¹¹In (Hideo Saji, YAKUGAKU ZASSHI 128 (3) 323-332, 8 (2008), Jpn). Радиоизотоп, эффективный для лечения или диагностики опухоли является предпочтительным. Такой радиоизотоп также включен в противоопухолевое средство согласно настоящему изобретению.

[0099] Противоопухолевое действие

Противоопухолевое действие антитела против CAPRIN-1, применяемого в настоящем изобретении, в отношении CAPRIN-1-экспрессирующих раковых клеток, как предполагают, осуществляется согласно следующему или подобному механизму: антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC) эффекторных клеток против указанных выше CAPRIN-1-экспрессирующих клеток и антителозависимый клеточный фагоцитоз (ADCP) CAPRIN-1-экспрессирующих клеток. Впрочем, объем настоящего изобретения не должен ограничиваться этим механизмом.

[0100] Таким образом, активность антитела против CAPRIN-1, применяемого в настоящем изобретении, может быть оценена, как конкретно показано в Примерах ниже, при измерении ex vivo ADCC активности или ADCP активности против CAPRIN-1-экспрессирующих раковых клеток.

[0101] Антитело против CAPRIN-1, применяемое в настоящем изобретении, связывается с белком CAPRIN-1 на раковых клетках и демонстрирует противоопухолевое действие посредством активности или подобного. Таким образом, антитело против CAPRIN-1 согласно настоящему изобретению предположительно может применяться при лечении или профилактике рака. В частности, в настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция для лечения и/или профилактики рака, включающая антитело против CAPRIN-1 в качестве действующего вещества. Антитело против CAPRIN-1, применяемое с целью введения в организм человека (терапия антителом), предпочтительно является человеческим антителом или гуманизированным антителом в целях снижения иммуногенности.

[0102] Антитело против CAPRIN-1 с более высокой аффинностью связывания с белком CAPRIN-1 на поверхности раковых клеток проявляет более сильную противоопухолевую активность. Таким образом, антитело согласно настоящему изобретению обладает высокой аффинностью связывания с белком CAPRIN-1 и поэтому может, как ожидается, обладать более сильным противоопухолевым действием. Таким образом, антитело согласно настоящему изобретению может быть адаптировано для фармацевтической композиции, предназначенной для лечения и/или профилактики рака. Такая высокая аффинность связывания антитела настоящего изобретения предпочтительно составляет по меньшей мере 5×10⁸ M^-1, по меньшей мере 10⁹ M^-1, по меньшей мере 5×10⁹ M^-1, по меньшей мере 10¹⁰ M^-1, по меньшей мере 5×10¹⁰ M^-1, по меньшей мере 10¹¹ M^-1, по меньшей мере 5×10¹¹ M^-1, по меньшей мере 10¹² M^-1, по меньшей мере 10¹³ M^-1 или по меньшей мере 10¹⁴ M^-1, по показателю константы ассоциации (константы аффинности) Ka (k_on/k_off), как описано выше.

[0103] Связывание с клеткой, экспрессирующей антиген

Способность антитела связываться с CAPRIN-1 может быть определена при помощи анализа связывания с использованием, например, ELISA, Вестерн-блоттинга, иммунофлуоресцентного и проточного цитометрического анализа, как описано в Примерах.

[0104] Иммуногистохимическое окрашивание

Антитело, которое распознает CAPRIN-1, может применяться в иммуногистохимии согласно методу, известному специалистам в данной области техники. Антитело, которое распознает CAPRIN-1, может быть исследовано на реактивность в отношении CAPRIN-1, например, при использовании фиксированного в параформальдегиде или ацетоне замороженного среза или фиксированного в параформальдегиде и залитого в парафине среза ткани, полученного от пациента во время хирургического лечения, или ткани, полученной от животного, несущего ксенотрансплантатную ткань, инокулированную линией клеток, экспрессирующих CAPRIN-1 спонтанно или после трансфекции.

[0105] Для иммуногистохимического окрашивания антитело, реактивное в отношении CAPRIN-1, может быть окрашено различными методами. Например, антитело можно визуализировать посредством реакции с конъюгированным с пероксидазой хрена антителом козы против антител мыши, антителом козы против антител кролика или антителом козы против антител курицы.

[0106] Фармацевтическая композиция и способ лечения и/или профилактики рака

Мишень фармацевтической композиции для лечения и/или профилактики рака согласно настоящему изобретения конкретно не ограничена, при условии, что мишенью является рак (клетки), экспрессирующий ген CAPRIN-1.

[0107] Термины "опухоль" и "рак", используемые в настоящем описании, означают злокачественное новообразование и используются попеременно друг с другом.

[0108] Рак, который является мишенью в настоящем изобретении, может быть любым раком, экспрессирующим белок CAPRIN-1 на поверхности клеточной мембраны. Рак предпочтительно является раком молочной железы, раком почки, раком поджелудочной железы, раком толстой и прямой кишки, раком легкого, опухолью головного мозга, раком желудка, раком матки, раком яичника, раком предстательной железы, раком мочевого пузыря, раком пищевода, лейкозом, лимфомой, раком печени, раком желчного пузыря, саркомой, мастоцитомой, меланомой, раком коры надпочечников, опухолью Юинга, лимфомой Ходжкина, мезотелиомой, множественной миеломой, раком яичка, раком щитовидной железы или злокачественной опухолью головы и шеи, как указано выше.

[0109] Более конкретно, примеры такого рака включают, без ограничения перечисленными, аденокарциному молочной железы, аденокарциному молочной железы сложного типа, злокачественную смешанную опухоль молочной железы, внутрипротоковую папиллярную аденокарциному, аденокарциному легкого, плоскоклеточный рак, мелкоклеточный рак, крупноклеточный рак, глиому, которая является опухолью нейроэпителиальной ткани, глиобластому, нейробластому, эпендимому, нейроцитому, эмбриональную нейроэктодермальную опухоль, неврилеммому, нейрофиброму, менингиому, хронический лимфоцитарный лейкоз, лимфому желудочно-кишечного тракта, алиментарную лимфому, мелкоклеточную-среднеклеточную лимфому, рак слепой кишки, рак восходящей ободочной кишки, рак нисходящей ободочной кишки, рак поперечной ободочной кишки, рак сигмовидной ободочной кишки и рак прямой кишки, эпителиальный рак яичника, герминогенную опухоль, стромально-клеточную опухоль, протоковую карциному поджелудочной железы, инвазивную протоковую карциному поджелудочной железы, аденокарциному поджелудочной железы, ацинарно-клеточную карциному, железисто-плоскоклеточную карциному, гигантоклеточную опухоль, внутрипротоковое папиллярно-муцинозное новообразование, муцинозно-кистозное новообразование, панкреатобластому, аденому из островковых клеток, опухоль Франц, серозную цистаденокарциному, солидную псевдопапиллярную опухоль, гастриному, глюкагоному, инсулиному, множественную эндокринную неоплазию 1-го типа (синдром Вермера), опухоль из нефункциональных островковых клеток, соматостатиному, ВИПому, рак шейки матки, рак тела матки, фибросаркому, саркому костей или суставов, саркому Юинга, опухоль Вильмса, гептобластому, саркому мягкой ткани, острый лейкоз, хронический лейкоз, опухоль спинного мозга, злокачественную опухоль мягкой ткани, опухоль группы тератомы и злокачественные опухоли головы и шеи, включая рак гортаноглотки, ротоглоточный рак, рак языка, рак носоглотки, рак ротовой полости, рак губы, рак пазух и рак горла.

[0110] Реципиентами (пациентами) предпочтительно являются млекопитающие, например млекопитающие, включающие приматов, домашних животных, сельскохозяйственных животных и спортивных животных, и, наиболее предпочтительно, людей, собак и кошек.

[0111] В случае применения антитела настоящего изобретения в качестве фармацевтической композиции фармацевтическая композиция может быть изготовлена способом, общеизвестным специалисту в данной области техники. Например, фармацевтическая композиция может применяться в форме перентеральной инъекции асептического раствора или суспензии с водой или любой другой фармацевтически приемлемой жидкостью. Например, фармацевтическая композиция может быть изготовлена с антителом, смешанным в форме стандартной лекарственной формы, требуемой в общепринятой фармацевтической практике, в подходящей комбинации с фармакологически приемлемыми носителями или средами, в частности, стерилизованной водой, физиологическим раствором, растительным маслом, эмульгатором, суспендирующим веществом, поверхностно-активным веществом, стабилизатором, ароматическим веществом, вспомогательным веществом, разбавителем, консервантом, связующим веществом и т.д. Количество действующего вещества в таком препарате определяют таким образом, чтобы могла быть достигнута требуемая доза в пределах предписанного диапазона.

[0112] Асептическая композиция для инъекций может быть изготовлена согласно стандартной фармацевтической практике с использованием такого разбавителя, как дистиллированная вода для инъекций.

[0113] Примеры водных растворов для инъекций включают физиологический раствор, изотонические растворы, содержащие глюкозу или другие вспомогательные вещества, такие как D-сорбит, D-маннозу, D-маннит и хлорид натрия. Такие растворы могут использоваться в комбинации с подходящим солюбилизатором, например, спиртом (в частности, этанолом) или полиспиртом (например, пропиленгликолем и полиэтиленгликолем), или неионогенным поверхностно-активным веществом, например, полисорбатом 80^(TM) и HCO-60.

[0114] Примеры масляных растворов включают кунжутное масло и соевое масло. Указанные растворы могут использоваться в комбинации с бензилбензоатом или бензиловым спиртом в качестве солюбилизатора. Также такие растворы можно смешивать с буфером (например, фосфатным буферным раствором или натрий-ацетатным буферным раствором), успокаивающим средством (например, прокаина гидрохлоридом), стабилизатором (например, бензиловым спиртом и фенолом) и антиоксидантом. Растворами для инъекций, приготовленными таким образом, обычно заполняют подходящие ампулы.

[0115] Фармацевтическую композицию настоящего изобретения вводят перорально или парентерально, предпочтительно парентерально. Определенные примеры соответствующих лекарственных форм включают растворы для инъекций, интраназальные препараты, транспульмонарные препараты и чрескожные препараты. Примеры инъекций включают внутривенную инъекцию, внутримышечную инъекцию, внутрибрюшинную инъекцию и подкожную инъекцию, посредством которых фармацевтическая композиция может быть введена системно или местно.

[0116] Кроме того, способ введения может быть соответствующим образом выбран в зависимости от возраста, веса, пола, симптомов, и т.д., пациента. Доза фармацевтической композиции, содержащей антитело или полинуклеотид, кодирующий антитело, может быть выбрана в пределах диапазона, например, 0,0001-1000 мг/кг массы тела на дозу. В альтернативе доза может быть выбрана в пределах диапазона, например, 0,001-100000 мг/тело пациента, хотя доза не обязательно ограничивается указанными числовыми значениями. Хотя доза и способ введения изменяются в зависимости от веса, возраста, пола, симптомов, и т.д., пациента, специалисты в данной области могут соответствующим образом выбрать дозу и способ.

[0117] Фармацевтическая композиция, содержащая антитело согласно настоящему изобретению или его фрагмент, может быть введена субъекту для лечения и/или предотвращения рака, предпочтительно рака молочной железы, рака почки, рака поджелудочной железы, рака толстой и прямой кишки, рака легкого, опухоли головного мозга, рака желудка, рака матки, рака яичника, рака предстательной железы, рака мочевого пузыря, рака пищевода, лейкоза, лимфомы, рака печени, рака желчного пузыря, саркомы, мастоцитомы, меланомы, рака коры надпочечников, опухоли Юинга, лимфомы Ходжкина, мезотелиомы, множественной миеломы, рака яичка, рака щитовидной железы или злокачественной опухоли головы и шеи.

[0118] Настоящее изобретение также охватывает способ лечения и/или предотвращения рака, включающий введение субъекту фармацевтической композиции настоящего изобретения в комбинации с противоопухолевым средством, как представлено выше, или фармацевтической композиции, включающей противоопухолевое средство. Антитело согласно настоящему изобретению или его фрагмент могут быть введены субъекту одновременно с противоопухолевым средством или отдельно от него. В случае раздельного введения одна из их фармацевтических композиций может быть введена сначала или позднее. Их интервалы между введением, дозы, пути введения и количество доз могут быть соответствующим образом выбраны специалистом. В случае одновременного введения лекарственная форма также включает, например, фармацевтическую композицию, изготовленную путем смешивания антитела настоящего изобретения или его фрагмента и противоопухолевого средства в фармакологически приемлемом носителе (или среде). Вышеуказанные описания относительно рецептуры, состава, путей введения, доз, типов рака, и т.д., в отношении фармацевтических композиций и лекарственных форм, содержащих антитело согласно настоящему изобретению, также применимы к любой из фармацевтических композиций и лекарственных форм, содержащих противоопухолевое средство.

[0119] Таким образом, в настоящем изобретении также предложен комбинированный лекарственный продукт для лечения и/или профилактики рака, включающий фармацевтическую композицию настоящего изобретения и фармацевтическую композицию, включающую противоопухолевое средство, как представлено выше, а также способ лечения и/или профилактики рака, включающий введение комбинированного лекарственного продукта. В настоящем изобретении также предложена фармацевтическая композиция для лечения и/или профилактики рака, включающая антитело согласно настоящему изобретению или его фрагмент и противоопухолевое средство вместе с фармакологически приемлемым носителем.

[0120] Полипептид и ДНК

В настоящем изобретении также предложена ДНК, кодирующая антитело согласно настоящему изобретению, ДНК, кодирующая тяжелую цепь или легкую цепь антитела, и ДНК, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи или легкой цепи антитела. Такие ДНК включают, в случае антитела (a), например, ДНК, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи, включающую нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1, 2 и 3, и ДНК, кодирующую вариабельную область легкой цепи, включающую нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 4, 5 и 6.

[0121] Поскольку определяющие комплементарность области, кодируемые указанными ДНК, имеющими такие последовательности, являются областями, которые определяют специфичность антитела, последовательности, кодирующие другие области (то есть константные области и каркасные области) антитела, могут быть последовательностями, полученными из другого антитела. В данном случае другое антитело также включает антитело, полученное из не относящегося к человеку организма, но предпочтительно является антителом, полученным из человека, в целях снижения нежелательной реакции. В частности, в отношении ДНК, указанных выше, области, кодирующие соответствующие каркасные области тяжелой цепи и легкой цепи и каждую константную область, предпочтительно должны включать нуклеотидные последовательности, кодирующие соответствующие аминокислотные последовательности, полученные из человеческого антитела.

[0122] Другие примеры ДНК, кодирующей антитело согласно настоящему изобретению, включают ДНК, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи, включающую нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и ДНК, в которой область, кодирующая вариабельную область легкой цепи, включает нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15. В данном случае, примером нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, является нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 23. Кроме того, примером нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, является нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 30. В отношении указанных ДНК также предпочтительно, чтобы области, кодирующие соответствующие константные области тяжелой цепи и легкой цепи, включали нуклеотидные последовательности, кодирующие соответствующие аминокислотные последовательности, полученные из человеческого антитела.

[0123] Указанные ДНК, кодирующие антитело, могут быть получены, например, с помощью указанного выше способа или следующего способа: на первом этапе суммарную РНК получают из гибридомы, которая относится к антителу настоящего изобретения, при использовании коммерчески доступного набора для выделения РНК, и синтезируют кДНК при использовании обратной транскриптазы с использованием случайных праймеров или подобного. Затем кДНК, кодирующую антитело, амплифицируют с помощью ПЦР при использовании в качестве праймеров олигонуклеотидов, имеющих последовательности, соответственно консервативные в соответствующих вариабельных областях гена тяжелой цепи и гена легкой цепи известного антитела мыши. Последовательности, кодирующие константные области, могут быть получены при амплификации известных последовательностей с помощью ПЦР. Нуклеотидая последовательность полученной в результате ДНК может быть определена с помощью стандартного метода, например, путем встраивания в плазмиду или бактериофаг для секвенирования.

[0124] В настоящем изобретении также предложены полипептиды и ДНК, описанные в следующих пунктах (i)-(xv), связанных с антителами (i)-(xiv):

[0125] (i) полипептид CDR тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 1, 2 и 3, и ДНК, кодирующая указанный полипептид,

[0126] (ii) полипептид CDR легкой цепи, выбранный из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 4, 5 и 6, и ДНК, кодирующая указанный полипептид,

[0127] (iii) полипептид, включающий аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 15, и ДНК, кодирующая указанный полипептид, например, ДНК, включающая нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 23 или SEQ ID NO: 30, соответственно,

[0128] (iv) полипептид, включающий аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 15, и ДНК, кодирующая указанный полипептид, например, ДНК, включающая нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 25 или SEQ ID NO: 30, соответственно,

[0129] (v) полипептид, включающий аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 15, и ДНК, кодирующая указанный полипептид, например, ДНК, включающая нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 22 или SEQ ID NO: 30, соответственно,

[0130] (vi) полипептид, включающий аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 13, и ДНК, кодирующая указанный полипептид, например, ДНК, включающая нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 23 или SEQ ID NO: 28, соответственно,

[0131] (vii) полипептид, включающий аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 12, и ДНК, кодирующая указанный полипептид, например, ДНК, включающая нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 22 или SEQ ID NO: 27, соответственно,

[0132] (viii) полипептид, включающий аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 12, и ДНК, кодирующая указанный полипептид, например, ДНК, включающая нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 23 или SEQ ID NO: 27, соответственно,

[0133] (ix) полипептид, включающий аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 13, и ДНК, кодирующая указанный полипептид, например, ДНК, включающая нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 22 или SEQ ID NO: 28, соответственно,

[0134] (x) полипептид, включающий аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 14, и ДНК, кодирующая указанный полипептид, например, ДНК, включающая нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 25 или SEQ ID NO: 29, соответственно,

[0135] (xi) полипептид, включающий аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 11, и ДНК, кодирующая указанный полипептид, например, ДНК, включающая нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 23 или SEQ ID NO: 26, соответственно,

[0136] (xii) полипептид, включающий аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 11, и ДНК, кодирующая указанный полипептид, например, ДНК, включающая нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 22 или SEQ ID NO: 26, соответственно,

[0137] (xiii) полипептид, включающий аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 15, и ДНК, кодирующая указанный полипептид, например, ДНК, включающая нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 24 или SEQ ID NO: 30, соответственно,

[0138] (xiv) полипептид, включающий аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 21, и ДНК, кодирующая указанный полипептид, например, ДНК, включающая нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 31 или SEQ ID NO: 32, соответственно, и

[0139] (xv) полипептид, полученный из любого из полипептидов, описанных в (i)-(xiv), включающий замену одной или более аминокислот в константной области тяжелой цепи, или его фрагмент, и ДНК, кодирующая указанный полипептид или его фрагмент.

[0140] Указанные полипептиды и ДНК могут быть получены, как описано выше, при использовании методики рекомбинации генов.

[0141] Сущность настоящего изобретения

Настоящее изобретение, описанное выше, будет изложено в общем ниже.

[0142] (1) Антитело, которое включает вариабельную область тяжелой цепи, включающую определяющие комплементарность области SEQ ID NO: 1, 2 и 3, и вариабельную область легкой цепи, включающую определяющие комплементарность области SEQ ID NO: 4, 5 и 6, и обладает иммунологической реактивностью с белком CAPRIN-1, или его фрагмент.

[0143] (2) Антитело или его фрагмент согласно (1), где вариабельная область тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и вариабельная область легкой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15.

[0144] (3) Антитело или его фрагмент согласно (1), где вариабельная область тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, и вариабельная область легкой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15.

[0145] (4) Антитело или его фрагмент согласно (1), где вариабельная область тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и вариабельная область легкой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15.

[0146] (5) Антитело или его фрагмент согласно (1), где вариабельная область тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и вариабельная область легкой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13.

[0147] (6) Антитело или его фрагмент согласно (1), где вариабельная область тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и вариабельная область легкой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.

[0148] (7) Антитело или его фрагмент согласно (1), где вариабельная область тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и вариабельная область легкой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.

[0149] (8) Антитело или его фрагмент согласно (1), где вариабельная область тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и вариабельная область легкой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13.

[0150] (9) Антитело или его фрагмент согласно (1), где вариабельная область тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, и вариабельная область легкой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14.

[0151] (10) Антитело или его фрагмент согласно (1), где вариабельная область тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и вариабельная область легкой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11.

[0152] (11) Антитело или его фрагмент согласно (1), где вариабельная область тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и вариабельная область легкой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11.

[0153] (12) Антитело или его фрагмент согласно (1), где вариабельная область тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, и вариабельная область легкой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15.

[0154] (13) Антитело или его фрагмент согласно (1), где вариабельная область тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, и вариабельная область легкой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21.

[0155] (14) Антитело или его фрагмент согласно любому из (1)-(13), где антитело является человеческим антителом, гуманизированным антителом, химерным антителом, одноцепочечным антителом или мультиспецифическим антителом.

[0156] (15) Антитело или его фрагмент согласно любому из (1)-(13), где антитело или его фрагмент конъюгированы с противоопухолевым средством.

[0157] (16) Антитело согласно любому из (1)-(15), где антитело включает замену одной или более аминокислот в константной области тяжелой цепи этого.

[0158] (17) Антитело согласно любому из (1)-(16), где антитело является антителом, не имеющим фукозы, присоедяемой к N-ацетилглюкозамину на восстанавливающем конце N-гликозид-связанной углеводной цепи, присоединенной к константной области тяжелой цепи.

[0159] (18) Композиция антител, включающая антитело согласно (17) и антитело согласно любому из (1)-(16), имеющее фукозу, присоединеную к N-ацетилглюкозамину на восстанавливающем конце N-гликозид-связанной углеводной цепи, присоединенной к константной области тяжелой цепи.

[0160] (19) Клетка, продуцирующая антитело согласно (17) или композицию антител согласно (18).

[0161] (20) Фармацевтическая композиция для лечения и/или профилактики рака, включающая антитело или его фрагмент согласно любому из (1)-(15), антитело согласно (16) или (17), или композицию антител согласно (18) в качестве действующего вещества.

[0162] (21) Фармацевтическая композиция согласно (20), где рак является раком молочной железы, раком почки, раком поджелудочной железы, раком толстой и прямой кишки, раком легкого, опухолью головного мозга, раком желудка, раком матки, раком яичника, раком предстательной железы, раком мочевого пузыря, раком пищевода, лейкозом, лимфомой, раком печени, раком желчного пузыря, саркомой, мастоцитомой, меланомой, раком коры надпочечников, опухолью Юинга, лимфомой Ходжкина, мезотелиомой, множественной миеломой, раком яичка, раком щитовидной железы или злокачественной опухолью головы и шеи.

[0163] (22) Комбинированный лекарственный продукт для лечения и/или профилактики рака, включающий фармацевтическую композицию согласно (20) или (21) и фармацевтическую композицию, включающую противоопухолевое средство.

[0164] (23) ДНК, кодирующая антитело или его фрагмент согласно любому из (1)-(16).

[0165] (24) Способ лечения и/или профилактики рака, включающий введение субъекту антитела или его фрагмента согласно любому из (1)-(16), антитела согласно (17), композиции антител согласно (18), фармацевтической композиции согласно (20) или (21), или комбинированного лекарственного продукта согласно (22).

ПРИМЕРЫ

[0166] Далее настоящее изобретение будет описано более конкретно со ссылкой на Примеры. Впрочем, объем настоящего изобретения не должен ограничиваться этими конкретными примерами.

[0167] Пример 1: Получение моноклонального антитела против CAPRIN-1 с использованием кролика

300 мкг человеческого белка CAPRIN-1, полученного в Примере 3 WO2010/016526, смешивали с равным количеством полного адъюванта Фрейнда и использовали в качестве раствора антигена для кролика. Смесь с неполным адъювантом Фрейнда использовали во второй или последующих иммунизациях. Раствор антигена внутрибрюшинно вводили каждому кролику возрастом 12 недель и затем вводили 8 раз, каждые 2-3 недели, для завершения иммунизации. Лимфоциты получали из селезенки каждого кролика, которую забирали через 4 дня после заключительной иммунизации, и смешивали с клетками миеломы кролика 240E-W2 в соотношении 1:2. Раствор ПЭГ (нагретый до 37°C), полученный путем смешивания 200 мкл среды RPMI, содержащей 10% FBS и 800 мкл PEG1500, добавляли к клеткам и оставляли смесь на 5 минут для слияния клеток. После центрифугирования и удаления супернатанта, клетки суспендировали в 300 мл среды RPMI, содержащей 10% FBS, с добавкой раствора HAT (селективной среды HAT) в концентрации 2%, и инокулировали в 100 мкл/лунка в 80 96-луночных планшетах. Гибридомы, получаемые в результате слияния клеток селезенки и клеток миеломы кролика, были получены после культивирования при 37°C в течение 7 дней в условиях 5% CO₂.

[0168] Гибридомы отбирали по реактивности антител, продуцируемых полученными гибридомами, с белком CAPRIN-1. Раствор 1 мкг/мл белка CAPRIN-1 добавляли в 100 мкл/лунка в 96-луночные планшеты, после чего планшеты оставляли при 4°C на 18 часов. Каждую лунку три раза промывали PBS-T. Затем 0,5% раствор бычьего сывороточного альбумина (BSA) добавляли в количестве 400 мкл/лунка и оставляли планшеты при комнатной температуре на 3 часа. Раствор удаляли и три раза промывали лунки (400 мкл/лунка) PBS-T. Затем каждый супернатант культуры гибридомы, полученной выше, добавляли в количестве 100 мкл/лунка и оставляли планшеты при комнатной температуре на 2 часа. Каждую лунку три раза промывали PBS-T. Затем меченное HRP антитело против антител кролика, разводенное в 5000 раз PBS, добавляли в количестве 100 мкл/лунка и оставляли планшеты при комнатной температуре на 1 час. Каждую лунку три раза промывали PBS-T. Затем добавляли раствор субстрата TMB по 100 мкл/лунка и оставляли планшеты на 15 - 30 минут для протекания хромогенной реакции. После развития цвета реакцию останавливали добавлением 1Н серной кислоты по 100 мкл/лунка и измеряли значения поглощения при 450 нм и 595 нм, используя абсорбционный спектрометр. В результате отобрали множество гибридом, продуцирующих антитела, которые показали высокие значения поглощения.

[0169] Отобранные гибридомы добавляли по 0,5 клеток/лунка в 96-луночные планшеты и культивировали. Через 1 неделю наблюдали гибридомы, которые формировали одиночные колонии в лунках. Клетки в этих лунках культивировали далее и отобирали гибридомы по реактивности антител, продуцируемых клонированными гибридомами, в отношении белка CAPRIN-1. В результате оценки реактивности каждого антитела с белком CAPRIN-1 с помощью той же методики, как выше, получили множество линий гибридом, продуцирующих моноклональные антитела кролика, которые продемонстрировали реактивность в отношении белка CAPRIN-1.

[0170] Затем эти моноклональные антитела кролика, которые продемонстрировали реактивность в отношении белка CAPRIN-1, подвергали скринингу с целью обнаружения антител, демонстрирующих реактивность с поверхностью человеческих раковых клеток, на которых экспрессировался CAPRIN-1. В частности, по 2×10⁵ клеток линии человеческих клеток рака легкого QG56 и линии человеческих клеток рака молочной железы BT-474 (полученных из ATCC) центрифугировали в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл, в которую затем добавляли 100 мкл супернатанта культуры каждой из гибридом. Пробирку оставляли во льду на 1 часа. После промывки PBS добавляли FITC-меченное антитело против IgG кролика (H+L) или Alexa 488-меченное антитело против IgG кролика (H+L), разведенное в 100 раз в PBS(-), содержащее 0,5% FBS (0,5% FBS-PBS(-)),и оставляли пробирку во льду на 1 час. После промывки 0,5% FBS-PBS(-), клетки суспендировали в 0,2 мкг/мл иодида пропидия и 0,5% FBS-PBS(-) и измеряли интенсивность флуоресценции при использовании FACSCalibur^(ТМ) или FACSVerse^(ТМ) (Becton, Dickinson and Company). В то же время, такую же методику, как выше, выполняли с использованием среды для культуры гибридомы и использовали полученный продукт в качестве образца для отрицательного контроля. В результате было отобрано одно моноклональное антитело кролика против CAPRIN-1, которое показало более высокую интенсивность флуоресценции, чем антитело из отрицательного контроля, то есть сильно реагировало с клеточной поверхностью раковых клеток QG56 и BT-474 при экспрессии CAPRIN-1.

[0171] Затем амплифицированные фрагменты генов, кодирующих вариабельную область, в отношении моноклонального антитела кролика против CAPRIN-1, полученного выше, получали согласно способу, описанному в Примере 5 WO2010/016526, и анализировали их генные последовательности и аминокислотные последовательности, кодируемые таким образом. В частности, мРНК выделяли из гибридомы, продуцирующей моноклональное антитело кролика против CAPRIN-1, а гены вариабельной (VH) области тяжелой цепи и вариабельной (VL) области легкой цепи этого антитела получали с помощью ОТ-ПЦР при использовании праймеров, специфичных к последовательностям вариабельной области кролика. Указанные гены встраивали в клонирующие векторы, а их соответствующие нуклеотидные последовательности определяли согласно стандартному методу.

[0172] Полученное в результате моноклональное антитело кролика против CAPRIN-1, как был подтверждено, имело вариабельную область тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 20, при этом вариабельная область тяжелой цепи содержала CDR1, CDR2 и CDR3, состоящие из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3, соответственно, и имело вариабельную область легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 21, при этом вариабельная область легкой цепи содержала CDR1, CDR2 и CDR3, состоящие из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6, соответственно.

[0173] Затем была подтверждена реактивность полученного моноклонального антитела кролика против CAPRIN-1 с различными человеческими раковыми клетками. Полученное антитело подвергали реакции с человеческими раковыми клетками, которые, как было подтверждено, экспрессировали ген CAPRIN-1, а именно клетками рака молочной железы (BT-474 и MDA-MB-361), клетками рака толстой и прямой кишки (HT-29), клетками рака легкого (QG56), клетками рака желудка (NCI-N87), клетками рака матки (HEC-1-A), клетками рака предстательной железы (22Rv1), клетками рака поджелудочной железы (Panc10.5), клетками рака печени (Hep3B), клетками рака яичника (SKOV3), клетками рака почки (Caki-2), клетками опухоли мозга (U-87MG), клетками рака мочевого пузыря (T24 и HT-1376), клетками рака пищевода (OE33), лейкозными клетками (OCI-AML5), лимфомными клетками (Ramos), клетками рака желчного пузыря (TGBC14TKB), клетками фибросаркомы (HT-1080), клетками меланомы (G-361), клетками рака коры надпочечников (A-673), клетками опухоли Юинга (RD-ES), клетками лимфомы Ходжкина (RPMI1666), клетками мезотелиомы (NCI-H2452), клетками множественной миеломы (IM-9), клетками рака яичка (NT/D1), клетками рака щитовидной железы (TT) или клетками рака головы и шеи (FaDu), и оценивали интенсивность флуоресценции с помощью проточной цитометрии. По 10⁶ клеток каждой линии раковых клеток собирали в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и добавляли в каждую пробирку супернатант культуры (100 мкл) гибридомы, продуцирующей моноклональное антитело кролика против CAPRIN-1, полученное выше, и проводили реакцию при 4°C в течение 1 часа. После промывки 0,5% FBS-PBS(-), добавляли FITC-меченное антитело козы против IgG кролика (H+L) (производства Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), разведенное в 50 раз в 0,5% FBS-PBS(-), и оставляли пробирку при 4°C на 60 минут. После промывки в 0,5% FBS-PBS(-), клетки суспендировали в 0,5% FBS-PBS(-), содержащем 0,2 мкг/мл (конечная концентрация) иодида пропидия, и измеряли интенсивность флуоресценции при использовании FACSCalibur^(ТМ) или FACSVerse^(ТМ) (Becton, Dickinson and Company). В то же время, такую же методику, как выше, проводили для отрицательного контроля, используя среду для культуры гибридомы, и полученный продукт использовали в качестве образца для отрицательного контроля. В результате во всех раковых клетках, используемых в оценке, интенсивность флуоресценции с использованием супернатанта культуры гибридомы, продуцирующей моноклональное антитело кролика против CAPRIN-1, была более сильной, чем в случае использования отрицательного контроля. На основании этих результатов был подтверждено, что моноклональное антитело кролика против CAPRIN-1 реагирует с CAPRIN-1 на поверхности клеточных мембран человеческих раковых клеток.

[0174] Пример 2: Получение человеческого-кроличьего химерного моноклонального антитела против CAPRIN-1

Ген для экспрессии аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, представленной в SEQ ID NO: 20, моноклонального антитела кролика против CAPRIN-1, подтвержденного в Примере 1, и ген для экспрессии его же вариабельной области легкой цепи, представленной в SEQ ID NO: 21, соответственно встраивали в вектор для экспрессии в клетках млекопитающих, несущий ген константной области тяжелой цепи IgG1 человека, и вектор для экспрессии в клетках млекопитающих, несущий ген легкой цепи константной области IgG1 человека. Два полученных рекомбинантных вектора экспрессии переносили в клетки млекопитающих согласно стандартному методу и получали супернатант культуры, содержащий человеческое-кроличье химерное антитело против CAPRIN-1 (человеческое-кроличье химерное антитело). Полученный супернатант культуры, содержащий химерное антитело, очищали согласно стандартному методу, используя Hitrap Protein A Sepharose FF (производства GE Healthcare Japan Corp.). Буфер заменяли PBS(-) и полученный продукт фильтровали через фильтр 0,22 мкм (производства Merck Millipore Corp.) с получением химерного антитела.

[0175] Пример 3: Получение гуманизированных моноклональных антител против CAPRIN-1

Затем на основе информации по аминокислотным последовательностям и нуклеотидным последовательностям CDR1 - CDR3 в вариабельной области тяжелой цепи моноклонального антитела кролика против CAPRIN-1, подтвержденного в Примере 1, и CDR1 - CDR3 в его же вариабельной области легкой цепи была создана нуклеотидная последовательность, обеспечивающая экспрессию аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, представленной в SEQ ID NO: 7, в которой вариабельная область тяжелой цепи CDR1, CDR2 и CDR3 состоит из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3, соответственно. Ее встраивали в вектор для экспрессии в клетках млекопитающих, несущий ген константной области тяжелой цепи человека IgG1. Аналогично была создана нуклеотидная последовательность, обеспечивающая экспрессию аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи, представленной в SEQ ID NO: 11, в которой вариабельная область легкой цепи CDR1, CDR2 и CDR3 состоит из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6, соответственно. Ее встраивали в вектор для экспрессии в клетках млекопитающих, несущий ген константной области легкой цепи IgG1 человека. Эти два рекомбинантных вектора экспрессии переносили в клетки млекопитающих согласно стандартному методу и получали супернатант культуры, содержащий гуманизированное антитело #0, состоящее из полноразмерной аминокислотной последовательности тяжелой цепи, представленной в SEQ ID NO: 7, и полноразмерной аминокислотной последовательности легкой цепи, представленной в SEQ ID NO: 11.

[0176] Аналогичным образом получали супернатант культуры, содержащий гуманизированное антитело #1, состоящее из аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, представленной в SEQ ID NO: 8, в которой вариабельная область тяжелой цепи CDR1, CDR2 и CDR3 состояла из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3, соответственно, и аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи, представленной в SEQ ID NO: 11.

[0177] Аналогичным образом также получали супернатанты культур, содержащие следующие гуманизированные антитела #2-10:

[0178] гуманизированное антитело #2, состоящее из аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, представленной в SEQ ID NO: 8, и полноразмерной аминокислотной последовательности легкой цепи, представленной в SEQ ID NO: 12, в которой вариабельная область легкой цепи CDR1, CDR2 и CDR3 состояла из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6, соответственно;

[0179] гуманизированное антитело #3, состоящее из аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, представленной в SEQ ID NO: 8, и полноразмерной аминокислотной последовательности легкой цепи, представленной в SEQ ID NO: 13, в которой вариабельная область легкой цепи CDR1, CDR2 и CDR3 состояла из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6, соответственно;

[0180] гуманизированное антитело #4, состоящее из аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, представленной в SEQ ID NO: 7, и полноразмерной аминокислотной последовательности легкой цепи, представленной в SEQ ID NO: 12;

[0181] гуманизированное антитело #5, состоящее из аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, представленной в SEQ ID NO: 7, и полноразмерной аминокислотной последовательности легкой цепи, представленной в SEQ ID NO: 13;

[0182] гуманизированное антитело #6, состоящее из аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, представленной в SEQ ID NO: 7, и полноразмерной аминокислотной последовательности легкой цепи, представленной в SEQ ID NO: 15, в которой вариабельная область легкой цепи CDR1, CDR2 и CDR3 состояла из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6, соответственно;

[0183] гуманизированное антитело #7, состоящее из аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, представленной в SEQ ID NO: 8, и полноразмерной аминокислотной последовательности легкой цепи, представленной в SEQ ID NO: 15;

[0184] гуманизированное антитело #8, состоящее из аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, представленной в SEQ ID NO: 9, в которой вариабельная область тяжелой цепи CDR1, CDR2 и CDR3 состояла из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3, соответственно, и полноразмерной аминокислотной последовательности легкой цепи, представленной в SEQ ID NO: 15.

[0185] гуманизированное антитело #9, состоящее из аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, представленной в SEQ ID NO: 10, в которой вариабельная область тяжелой цепи CDR1, CDR2 и CDR3 состояла из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3, соответственно, и полноразмерной аминокислотной последовательности легкой цепи, представленной в SEQ ID NO: 14, в которой вариабельная область легкой цепи CDR1, CDR2 и CDR3 состояла из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6, соответственно; и

[0186] гуманизированное антитело #10, состоящее из аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, представленной в SEQ ID NO: 10, и полноразмерной аминокислотной последовательности легкой цепи, представленной в SEQ ID NO: 15;

[0187] Полученные супернатанты культур, содержащие гуманизированные антитела #0-#10, очищали согласно стандартному методу с использованием сорбента Hitrap Protein A Sepharose FF (производства GE Healthcare Japan Corp.). Буфер заменяли PBS(-) и фильтровали полученный продукт через фильтр 0,22 мкм (производства Merck Millipore Corp.) с получением гуманизированных антител.

[0188] Пример 4: Антигенная специфичность человеческого-кроличьего химерного антитела и гуманизированных антител #0-#10 и их реактивность в отношении раковых клеток

Затем с помощью ELISA, согласно стандартному методу, подтверждали специфичную реактивность человеческого-кроличьего химерного антитела, полученного в Примере 2, и гуманизированных антител #0-#10, полученных в Примере 3, в отношении белка CAPRIN-1. В частности, сначала раствор PBS, содержащий 5 мкг/мл белка CAPRIN-1, добавляли по 100 мкл/лунка в 96-луночные планшеты и оставляли планшеты при 4°C на 18 часов. Каждую лунку промывали PBS-T. Затем добавляли блокирующий раствор, состоящий из раствора PBS, содержащего 5% обезжиренного молока, по 400 мкл/лунка, и оставляли планшеты при комнатной температуре на 3 часа. Раствор удаляли и каждую лунку промывали PBS-T. Затем раствор, содержащий каждое из человеческого-кроличьего химерного антитела и гуманизированных антител #0-#10, доведенных до 1 мкг/мл PBS, содержащим 0,2% обезжиренного молока, добавляли по 50 мкл/лунка в каждую лунку и оставляли планшеты при комнатной температуре на 1 час. Лунка, в которую человеческое антитело IgG, которое, как было подтверждено, не реагировало с белком CAPRIN-1, добавляли в той же концентрации, что и антитело выше, и лунка, в которую не добавляли никакого антитела, служили в качестве отрицательного контроля. Каждую лунку промывали PBS-T три раза. Затем HRP-меченное антитело против человеческого IgG, разведенное в 3000 раз в PBS, содержащем 0,2% обезжиренного молока, добавляли по 50 мкл/лунка и оставляли планшеты при комнатной температуре на 1 час. Каждую лунку промывали PBS-T три раза. Затем добавляли раствор субстрата TMB (производства Thermo Fischer Scientific, Inc.) по 100 мкл/лунка и оставляли планшеты на 1-30 минут для протекания хромогенной реакции. После развития цвета реакцию останавливали добавлением 1Н серной кислоты по 100 мкл/лунка и измеряли значения поглощения при 450 нм и 630 нм с использованием абсорбционного спектрометра. После этого лунки, в которых белок CAPRIN-1 не был иммобилизован (неиммобилизированные лунки) подготавливали вместе с ним, и каждое антитело добавляли и исследовали аналогичным образом. В результате значение поглощения лунки, используемой в качестве отрицательного контроля, в которую добавляли человеческое антитело IgG, которое, как было подтверждено, не реагирует с белком CAPRIN-1, не превышала поглощения лунки, в которую не добавляли никакого антитела, тогда как, соответственно, лунки, в которые добавляли соответствующее человеческое-кроличье химерное антитело и гуманизированные антитела #0-#10, показали эквивалентные высокие значения оптического поглощения. Человеческое-кроличье химерное антитело и гуманизированные антитела #0-#10 в лунках, в которых белок CAPRIN-1 не был иммобилизирован, просто показывали значение поглощения, эквивалентное лункам отрицательного контроля. На основе этих результатов было подтверждено, что человеческое-кроличье химерное антитело и гуманизированные антитела #0-#10 специфично реагируют с белком CAPRIN-1.

[0189] Затем подтверждали реактивность человеческого-кроличьего химерного антитела и гуманизированных антител #0-#10, специфично реагирующих с белком CAPRIN-1, в отношении различных человеческих раковых клеток и мышиных раковых клеток. Каждое из очищенных человеческого-кроличьего химерного антитела и гуманизированных антител #0-#10 реагировало с человеческими раковыми клетками, экспрессирующими, как было подтверждено, ген CAPRIN-1, а именно клетками рака молочной железы (BT-474 и MDA-MB-361), клетками рака толстой и прямой кишки (HT-29), клетками рака легкого (QG56), клетками рака желудка (NCI-N87), клетками рака матки (HEC-1-A), клетками рака предстательной железы (22Rv1), клетками рака поджелудочной железы (Panc10.5), клетками рака печени (Hep3B), клетками рака яичника (SKOV3), клетками рака почки (Caki-2), клетками опухоли мозга (U-87MG), клетками рака мочевого пузыря (T24 и HT-1376), клетками рака пищевода (OE33), лейкозными клетками (OCI-AML5), лимфомными клетками (Ramos), клетками рака желчного пузыря (TGBC14TKB), клетками фибросаркомы (HT-1080), клетками меланомы (G-361), клетками рака коры надпочечников (A-673), клетками опухоли Юинга (RD-ES), клетками лимфомы Ходжкина (RPMI1666), клетками мезотелиомы (NCI-H2452), клетками множественной миеломы (IM-9), клетками рака яичка (NT/D1), клетками рака щитовидной железы (TT) или клетками злокачественной опухоли головы и шеи (FaDu), и оценивали интенсивность флуоресценции с помощью проточной цитометрии. В частности, по 5×10⁵ клеток каждой линии раковых клеток собирали в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл и добавляли по 50 мкг/мл (конечная концентрация) человеческого-кроличьего химерного антитела и гуманизированных антител #0-#10 в каждую пробирку и проводили реакцию при 4°C в течение 1 часа. После промывки 0,5% FBS-PBS(-) два раза, добавляли меченное Alexa 488 антитело козы против IgG человека (H+L) (производства Life Technologies Corp.), разведенное в 100 раз 0,5% FBS-PBS(-), и оставляли пробирку при 4°C на 60 минут. После промывки 0,5% FBS-PBS(-), клетки суспендировали в 0,5% FBS-PBS(-), содержащем 0,2 мкг/мл (конечная концентрация) иодида пропидия и измеряли интенсивность флуоресценции при использовании FACSCalibur^(ТМ) или FACSVerse^(ТМ) (Becton, Dickinson and Company). В то же время, такую же методику, как выше, проводили с использованием среды для культуры гибридомы и полученный продукт использовали в качестве отрицательного контроля. В результате во всех раковых клетках, используемых в оценке, показатели интенсивности флуоресценции с человеческим-кроличьим химерным антителом и гуманизированными антителами #0-#10 были более высокими, чем в случае использования отрицательного контроля. На основе из этих результатов было подтверждено, что человеческое-кроличье химерное антитело и гуманизированные антитела #0-#10 реагируют с белком CAPRIN-1, экспрессирующимся на поверхности мембран человеческих раковых клеток.

[0190] Пример 5: Противоопухолевая активность человеческого-кроличьего химерного антитела и гуманизированных антител #0-#10 против различных человеческих раковых клеток

Следующим этапом человеческое-кроличье химерное антитело, полученное в Примере 2, и гуманизированные антитела #0-#10, полученные в Примере 3, оценивали по их противоопухолевому действию на различные человеческие раковые клетки на основе активности ADCC.

[0191] Следующие антитела против CAPRIN-1 использовали в качестве антител для сравнения с человеческим-кроличьим химерным антителом и гуманизированными антителами #0-#10:

[0192] антитела, описанные в WO2010/016526, а именно сравнительное антитело 1, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 26 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 27 в этом литературном источнике, сравнительное антитело 2, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 28 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 29 там же, сравнительное антитело 3, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 30 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 31 там же, сравнительное антитело 4, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 32 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 33 там же, сравнительное антитело 5, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 34 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 35 там же, сравнительное антитело 6, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 36 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 37 там же, сравнительное антитело 7, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 38 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 39 там же, сравнительное антитело 8, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 40 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 41 там же, сравнительное антитело 9, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 42 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 43 там же, сравнительное антитело 10, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 44 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 45 там же, и сравнительное антитело 11, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 46 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 47 там же;

[0193] антитела, описанные в WO2011/096517, а именно сравнительное антитело 12, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 43 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 47 в этом литературном источнике, и сравнительное антитело 13, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 43 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 53 там же;

[0194] антитела, описанные в WO2011/096528, а именно сравнительное антитело 14, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 43 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 47 в этом литературном источнике, сравнительное антитело 15, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 51 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 55 там же, сравнительное антитело 16, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 59 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 63 там же, сравнительное антитело 17, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 76 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 80 там же, сравнительное антитело 18, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 84 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 88 там же, и сравнительное антитело 19, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 92 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 96 там же;

[0195] антитело, описанное в WO2011/096519, а именно сравнительное антитело 20, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 42 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 46 в этом литературном источнике;

[0196] антитела, описанные в WO2011/096533, а именно сравнительное антитело 21, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 43 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 51 в этом литературном источнике, сравнительное антитело 22, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 47 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 51 там же, и сравнительное антитело 23, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 63 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 67 там же;

[0197] антитела, описанные в WO2011/096534, а именно сравнительное антитело 24, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 43 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 47 в этом литературном источнике, сравнительное антитело 25, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 43 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 51 там же, и сравнительное антитело 26, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 63 и вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 67 там же;

[0198] антитела, описанные в WO2013/018894, а именно сравнительное антитело 27, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 9 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 13 в этом литературном источнике, сравнительное антитело 28, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 19 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 23 там же, сравнительное антитело 29, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 9 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 53 там же, сравнительное антитело 30, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 58 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 62 там же, сравнительное антитело 31, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 63 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 65 там же, сравнительное антитело 32, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 69 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 73 там же, и сравнительное антитело 33, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 77 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 81 там же;

[0199] антитело, описанное в WO2013/018892, а именно сравнительное антитело 34, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 8 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 12 в этом литературном источнике;

[0200] антитело, описанное в WO2013/018891, а именно сравнительное антитело 35, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 8 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 12 в этом литературном источнике;

[0201] антитело, описанное в WO2013/018889, а именно сравнительное антитело 36, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 8 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 12 в этом литературном источнике;

[0202] антитело, описанное в WO2010/018883, а именно сравнительное антитело 37, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 8 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 12 в этом литературном источнике;

[0203] антитело, описанное в WO2013/125636, а именно сравнительное антитело 38, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 6 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 7 в этом литературном источнике;

[0204] антитела, описанные в WO2013/125654, а именно сравнительное антитело 39, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 52 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 54 в этом литературном источнике, сравнительное антитело 40, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 21 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 23 там же, сравнительное антитело 41, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 25 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 23 там же, сравнительное антитело 42, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 16 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 18 там же, сравнительное антитело 43, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 29 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 33 там же, сравнительное антитело 44, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 39 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 43 там же, и сравнительное антитело 45, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 49 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 43 там же;

[0205] антитело, описанное в WO2013/125630, а именно сравнительное антитело 46, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 11 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 15 в этом литературном источнике; и

[0206] антитела, описанные в WO2013/125640, а именно сравнительное антитело 47, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 11 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 15 в этом литературном источнике, и сравнительное антитело 48, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 21 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 25 там же.

[0207] Вышеуказанные сравниваемые антитела (сравнительные антитела 1-48) были получены следующим образом: ген для экспрессии аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи и ген для экспрессии вариабельной области легкой цепи были соответствующим образом встроены в вектор pcDNA4/myc-His для экспрессии в клетках млекопитающих (производства Life Technologies Corp.), несущий ген константной области тяжелой цепи IgG1 человека, и вектор pcDNA3.1/myc-His для экспрессии в клетках млекопитающих (производства Life Technologies Corp.), несущий ген константной области легкой цепи IgG1 человека; два полученных рекомбинантных вектора экспрессии переносили в клетки млекопитающих согласно стандартному методу; полученное человеческое химерное или гуманизированное антитело очищали при использовании сорбента Hitrap Protein A Sepharose FF (производства GE Healthcare Japan Corp.); буфер меняли на PBS(-); и полученный продукт фильтровали через фильтр 0,22 мкм (производства Merck Millipore Corp.).

[0208] Лунка, в которую добавляли антитело контрольного изотипа, лунка, в которую не добавляли никакого антитела, и лунка, в которую добавляли антитело, реагирующее с белком CAPRIN-1, но не проявляющее реактивности в отношении поверхности человеческих раковых клеток, на которых экспрессировался CAPRIN-1, служили в качестве отрицательного контроля. Каждое антитело добавляли в количестве 5 мкг/мл (конечная концентрация) в 96-луночные планшеты с V-образным дном.

[0209] Человеческие NK-клетки, выделенные из мононуклеарных клеток периферической крови человека при использовании стандартного метода, использовали в качестве эффекторных клеток. Мононуклеарные клетки периферической крови человека выделяли при использовании раствора Histopaque для разделения по плотности для выделения мононуклеарных клеток периферической крови (Sigma-Aldrich Corp.) и подвергали реакции с антителами (антитело против CD3 человека, антитело против CD20 человека, антитело против CD19 человека, антитело против CD11c человека, антитело против HLA-DR (BD Pharmingen)), меченными флуоресцентным красителем FITC. Популяцию клеток, содержащих NK-клетки, которые не были окрашены указанными антителами, выделяли при использовании клеточного сортера (FACS Vantage SE (Becton, Dickinson and Company)). В альтернативе использовали популяцию клеток, выделенную при использовании набора для выделения человеческих NK-клеток (производства Miltenyi Biotec K.K.). Подготавливали 96-луночные планшеты с V-образным дном, в которые добавляли каждое из антител и человеческие NK-клетки при плотности 0,4-2,0×10⁵ клеток/лунка.

[0210] В качестве клеток-мишеней использовали клетки рака молочной железы (BT-474 и MDA-MB-361), клетки рака толстой и прямой кишки (HT-29), клетки рака легкого (QG56), клетки рака желудка (NCI-N87), клетки рака матки (HEC-1-A), клетки рака предстательной железы (22Rv1), клетки рака поджелудочной железы (Panc10.5), клетки рака печени (Hep3B), клетки рака яичника (SKOV3), клетки рака почки (Caki-2), клетки опухоли мозга (U-87MG), клетки рака мочевого пузыря (T24 и HT-1376), клетки рака пищевода (OE33), лейкозные клетки (OCI-AML5), лимфомные клетки (Ramos), клетки рака желчного пузыря (TGBC14TKB), клетки фибросаркомы (HT-1080), клетки меланомы (G-361), клетки рака коры надпочечников (A-673), опухоли Юинга (RD-ES), лимфомы Ходжкина (RPMI1666), мезотелиомы (NCI-H2452), множественной миеломы (IM-9), рака яичка (NT/D1), рака щитовидной железы (TT), и злокачественной опухоли головы и шеи (FaDu). По 10⁶ клеток каждой указанной выше линии человеческих раковых клеток собирали в центрифужные пробирки объемом 50 мл. В пробирки добавляли по 100 мкКи хрома 51 (производства PerkinElmer, Inc.) и инкубировали пробирки при 37°C в течение 1 часа. Затем клетки три раза промывали средой RPMI1640, содержащей 10% FBS, добавляли по 2×10³ клеток/лунка в 96-луночные планшеты с V-образным дном, в которые были добавлены эффекторные клетки и каждое антитело, как описано выше, и проводили реакцию при 37°C в течение 4 часов в условиях 5% CO₂. После реакции по 50 мкл супернатанта культуры, содержащего хром 51, высвободившийся в супернатант культуры из поврежденных раковых клеток, отбирали из каждой лунки, добавляли в LumaPlate-96 (производства PerkinElmer, Inc.), дно каждой ячейки которого было покрыто твердым сцинтиллятором, и сушили. Количество хрома 51, высвободившегося в супернатант культуры из поврежденных раковых клеток, измеряли для оценки противоопухолевого действия антител против CAPRIN-1 на раковые клетки.

[0211] В результате в отношении клеток рака молочной железы (BT-474) гуманизированное антитело #7, гуманизированное антитело #10 и гуманизированное антитело #6 продемонстрировали 54% или более высокое противоопухолевое действие, гуманизированное антитело #3, гуманизированное антитело #4, гуманизированное антитело #2 и гуманизированное антитело #5 продемонстрировали 50% или более высокую активность, и гуманизированное антитело #9, гуманизированное антитело #1, гуманизированное антитело #0, человеческое-кроличье химерное антитело и гуманизированное антитело #8 продемонстрировали 46% или более высокую активность. В отличие от этого все сравнительные антитела 1-48 продемонстрировали 25% или более низкую активность, и все отрицательные контроли продемонстрировали 10% или более низкую активность.

[0212] В отношении клеток рака молочной железы (MDA-MB-361) гуманизированное антитело #7, гуманизированное антитело #10 и гуманизированное антитело #6 продемонстрировали 52% или более высокое противоопухолевое действие, гуманизированное антитело #3, гуманизированное антитело #4, гуманизированное антитело #2 и гуманизированное антитело #5 продемонстрировали 45% или более высокую активность, и гуманизированное антитело #9, гуманизированное антитело #1, гуманизированное антитело #0, человеческое-кроличье химерное антитело и гуманизированное антитело #8 продемонстрировали 40% или более высокую активность. В отличие от этого все сравнительные антитела 1-48 продемонстрировали 25% или более низкую активность, и все отрицательные контроли продемонстрировали 6% или более низкую активность.

[0213] В отношении клеток рака толстой и прямой кишки (HT-29) гуманизированное антитело #7, гуманизированное антитело #10 и гуманизированное антитело #6 продемонстрировали 43% или более высокое противоопухолевое действие, гуманизированное антитело #3, гуманизированное антитело #4, гуманизированное антитело #2 и гуманизированное антитело #5 продемонстрировали 40% или более высокую активность, и гуманизированное антитело #9, гуманизированное антитело #1, гуманизированное антитело #0, человеческое-кроличье химерное антитело и гуманизированное антитело #8 продемонстрировали 35% или более высокую активность. В отличие от этого все сравнительные антитела 1-48 продемонстрировали 20% или более низкую активность, и все отрицательные контроли продемонстрировали 3% или более низкую активность.

[0214] В отношении клеток рака легкого (QG56) гуманизированное антитело #7, гуманизированное антитело #10 и гуманизированное антитело #6 продемонстрировали 46% или более высокое противоопухолевое действие, гуманизированное антитело #3, гуманизированное антитело #4, гуманизированное антитело #2 и гуманизированное антитело #5 продемонстрировали 42% или более высокую активность, и гуманизированное антитело #9, гуманизированное антитело #1, гуманизированное антитело #0, человеческое-кроличье химерное антитело и гуманизированное антитело #8 продемонстрировали 38% или более высокую активность. В отличие от этого все сравнительные антитела 1-48 продемонстрировали 22% или более низкую активность, и все отрицательные контроли продемонстрировали 10% или более низкую активность.

[0215] В отношении клеток рака желудка (NCI-N87) гуманизированное антитело #7, гуманизированное антитело #10 и гуманизированное антитело #6 продемонстрировали 45% или более высокое противоопухолевое действие, гуманизированное антитело #3, гуманизированное антитело #4, гуманизированное антитело #2 и гуманизированное антитело #5 продемонстрировали 38% или более высокую активность, и антитело #9, гуманизированное антитело #1, гуманизированное антитело #0, человеческое-кроличье химерное антитело и гуманизированное антитело #8 продемонстрировали 34% или более высокую активность. В отличие от этого все сравнительные антитела 1-48 продемонстрировали 15% или более низкую активность, и все отрицательные контроли продемонстрировали 8% или более низкую активность.

[0216] В отношении клеток рака матки (HEC-1-A) гуманизированное антитело #7, гуманизированное антитело #10 и гуманизированное антитело #6 продемонстрировали 52% или более высокое противоопухолевое действие, гуманизированное антитело #3, гуманизированное антитело #4, гуманизированное антитело #2 и гуманизированное антитело #5 продемонстрировали 45% или более высокую активность, и гуманизированное антитело #9, гуманизированное антитело #1, гуманизированное антитело #0, человеческое-кроличье химерное антитело и гуманизированное антитело #8 продемонстрировали 40% или более высокую активность. В отличие от этого все сравнительные антитела 1-48 продемонстрировали 20% или более низкую активность, и все отрицательные контроли продемонстрировали 5% или более низкую активность.

[0217] В отношении клеток рака предстательной железы (22Rv1) гуманизированное антитело #7, гуманизированное антитело #10 и гуманизированное антитело #6 продемонстрировали 49% или более высокое противоопухолевое действие, гуманизированное антитело #3, антитело #4, гуманизированное антитело #2 и гуманизированное антитело #5 продемонстрировали 45% или более высокую активность, и гуманизированное антитело #9, гуманизированное антитело #1, гуманизированное антитело #0, человеческое-кроличье химерное антитело и гуманизированное антитело #8 продемонстрировали 38% или более высокую активность. В отличие от этого все сравнительные антитела 1-48 продемонстрировали 20% или более низкую активность, и все отрицательные контроли продемонстрировали 12% или более низкую активность.

[0218] В отношении клеток рака поджелудочной железы (Panc10.5) гуманизированное антитело #7, гуманизированное антитело #10 и гуманизированное антитело #6 продемонстрировали 35% или более высокое противоопухолевое действие, гуманизированное антитело #3, гуманизированное антитело #4, гуманизированное антитело #2 и гуманизированное антитело #5 продемонстрировали 30% или более высокую активность, и гуманизированное антитело #9, гуманизированное антитело #1, гуманизированное антитело #0, человеческое-кроличье химерное антитело и гуманизированное антитело #8 продемонстрировали 24% или более высокую активность. В отличие от этого все сравнительные антитела 1-48 продемонстрировали 10% или более низкую активность, и все отрицательные контроли продемонстрировали 2% или более низкую активность.

[0219] В отношении клеток рака печени (Hep3B) гуманизированное антитело #7, гуманизированное антитело #10 и гуманизированное антитело #6 продемонстрировали 28% или более высокое противоопухолевое действие, гуманизированное антитело #3, гуманизированное антитело #4, гуманизированное антитело #2 и гуманизированное антитело #5 продемонстрировали 25% или более высокую активность, и гуманизированное антитело #9, гуманизированное антитело #1, гуманизированное антитело #0, человеческое-кроличье химерное антитело и гуманизированное антитело #8 продемонстрировали 21% или более высокую активность. В отличие от этого все сравнительные антитела 1-48 продемонстрировали 12% или более низкую активность, и все отрицательные контроли продемонстрировали 5% или более низкую активность.

[0220] В отношении клеток рака яичника (SKOV3) гуманизированное антитело #7, гуманизированное антитело #10 и гуманизированное антитело #6 продемонстрировали 35% или более высокое противоопухолевое действие, гуманизированное антитело #3, гуманизированное антитело #4, гуманизированное антитело #2 и гуманизированное антитело #5 продемонстрировали 31% или более высокую активность, и гуманизированное антитело #9, гуманизированное антитело #1, гуманизированное антитело #0, человеческое-кроличье химерное антитело и гуманизированное антитело #8 продемонстрировали 27% или более высокую активность. В отличие от этого все сравнительные антитела 1-48 продемонстрировали 15% или более низкую активность, и все отрицательные контроли продемонстрировали 5% или более низкую активность.

[0221] В отношении клеток рака почки (Caki-2) гуманизированное антитело #7, гуманизированное антитело #10 и гуманизированное антитело #6 продемонстрировали 37% или более высокое противоопухолевое действие, гуманизированное антитело #3, гуманизированное антитело #4, гуманизированное антитело #2 и гуманизированное антитело #5 продемонстрировали 33% или более высокую активность, и гуманизированное антитело #9, гуманизированное антитело #1, гуманизированное антитело #0, человеческое-кроличье химерное антитело и гуманизированное антитело #8 продемонстрировали 26% или более высокую активность. В отличие от этого все сравнительные антитела 1-48 продемонстрировали 15% или более низкую активность, и все отрицательные контроли продемонстрировали 5% или более низкую активность.

[0222] В отношении клеток опухоли мозга (U-87MG) гуманизированное антитело #7, гуманизированное антитело #10 и гуманизированное антитело #6 продемонстрировали 36% или более высокое противоопухолевое действие, гуманизированное антитело #3, гуманизированное антитело #4, гуманизированное антитело #2 и гуманизированное антитело #5 продемонстрировали 29% или более высокую активность, и гуманизированное антитело #9, гуманизированное антитело #1, гуманизированное антитело #0, человеческое-кроличье химерное антитело и гуманизированное антитело #8 продемонстрировали 24% или более высокую активность. В отличие от этого все сравнительные антитела 1-48 продемонстрировали 10% или более низкую активность, и все отрицательные контроли продемонстрировали 6% или более низкую активность.

[0223] В отношении клеток рака мочевого пузыря (T24) гуманизированное антитело #7, гуманизированное антитело #10 и гуманизированное антитело #6 продемонстрировали 36% или более высокое противоопухолевое действие, гуманизированное антитело #3, гуманизированное антитело #4, гуманизированное антитело #2 и гуманизированное антитело #5 продемонстрировали 33% или более высокую активность, и гуманизированное антитело #9, гуманизированное антитело #1, гуманизированное антитело #0, человеческое-кроличье химерное антитело и гуманизированное антитело #8 продемонстрировали 30% или более высокую активность. В отличие от этого все сравнительные антитела 1-48 продемонстрировали 15% или более низкую активность, и все отрицательные контроли продемонстрировали 6% или более низкую активность.

[0224] В отношении клеток рака мочевого пузыря (HT-1376) гуманизированное антитело #7, гуманизированное антитело #10 и гуманизированное антитело #6 продемонстрировали 45% или более высокое противоопухолевое действие, гуманизированное антитело #3, гуманизированное антитело #4, гуманизированное антитело #2 и гуманизированное антитело #5 продемонстрировали 40% или более высокую активность, и гуманизированное антитело #9, гуманизированное антитело #1, гуманизированное антитело #0, человеческое-кроличье химерное антитело и гуманизированное антитело #8 продемонстрировали 28% или более высокую активность. В отличие от этого все сравнительные антитела 1-48 продемонстрировали 20% или более низкую активность, и все отрицательные контроли продемонстрировали 7% или более низкую активность.

[0225] В отношении клеток рака пищевода (OE33) гуманизированное антитело #7, гуманизированное антитело #10 и гуманизированное антитело #6 продемонстрировали 35% или более высокое противоопухолевое действие, гуманизированное антитело #3, гуманизированное антитело #4, гуманизированное антитело #2 и гуманизированное антитело #5 продемонстрировали 33% или более высокую активность, и гуманизированное антитело #9, гуманизированное антитело #1, гуманизированное антитело #0, человеческое-кроличье химерное антитело и гуманизированное антитело #8 продемонстрировали 30% или более высокую активность. В отличие от этого все сравнительные антитела 1-48 продемонстрировали 15% или более низкую активность, и все отрицательные контроли продемонстрировали 6% или более низкую активность.

[0226] В отношении лейкозных клеток (OCI-AML5) гуманизированное антитело #7, гуманизированное антитело #10 и гуманизированное антитело #6 продемонстрировали 20% или более высокое противоопухолевое действие, гуманизированное антитело #3, гуманизированное антитело #4, гуманизированное антитело #2 и гуманизированное антитело #5 продемонстрировали 18% или более высокую активность, и гуманизированное антитело #9, гуманизированное антитело #1, гуманизированное антитело #0, человеческое-кроличье химерное антитело и гуманизированное антитело #8 продемонстрировали 15% или более высокую активность. В отличие от этого все сравнительные антитела 1-48 продемонстрировали 10% или более низкую активность, и все отрицательные контроли продемонстрировали 6% или более низкую активность.

[0227] В отношении лимфомных клеток (Ramos) гуманизированное антитело #7, гуманизированное антитело #10 и гуманизированное антитело #6 продемонстрировали 20% или более высокое противоопухолевое действие, гуманизированное антитело #3, гуманизированное антитело #4, гуманизированное антитело #2 и гуманизированное антитело #5 продемонстрировали 18% или более высокую активность, и антитело #9, антитело #1, гуманизированное антитело #0, человеческое-кроличье химерное антитело и гуманизированное антитело #8 продемонстрировали 15% или более высокую активность. В отличие от этого все сравнительные антитела 1-48 продемонстрировали 10% или более низкую активность, и все отрицательные контроли продемонстрировали 6% или более низкую активность.

[0228] В отношении клеток рака желчного пузыря (TGBC14TKB) гуманизированное антитело #7, гуманизированное антитело #10 и гуманизированное антитело #6 продемонстрировали 35% или более высокое противоопухолевое действие, гуманизированное антитело #3, гуманизированное антитело #4, гуманизированное антитело #2 и гуманизированное антитело #5 продемонстрировали 30% или более высокую активность, и гуманизированное антитело #9, гуманизированное антитело #1, гуманизированное антитело #0, человеческое-кроличье химерное антитело и гуманизированное антитело #8 продемонстрировали 25% или более высокую активность. В отличие от этого все сравнительные антитела 1-48 продемонстрировали 15% или более низкую активность, и все отрицательные контроли продемонстрировали 6% или более низкую активность.

[0229] В отношении клеток фибросаркомы (HT-1080) гуманизированное антитело #7, гуманизированное антитело #10 и гуманизированное антитело #6 продемонстрировали 30% или более высокое противоопухолевое действие, гуманизированное антитело #3, антитело #4, гуманизированное антитело #2 и гуманизированное антитело #5 продемонстрировали 25% или более высокую активность, и гуманизированное антитело #9, гуманизированное антитело #1, гуманизированное антитело #0, человеческое-кроличье химерное антитело и гуманизированное антитело #8 продемонстрировали 20% или более высокую активность. В отличие от этого все сравнительные антитела 1-48 продемонстрировали 10% или более низкую активность, и все отрицательные контроли продемонстрировали 6% или более низкую активность.

[0230] В отношении меланомы (G-361) гуманизированное антитело #7, гуманизированное антитело #10 и гуманизированное антитело #6 продемонстрировали 25% или более высокое противоопухолевое действие, гуманизированное антитело #3, гуманизированное антитело #4, гуманизированное антитело #2 и гуманизированное антитело #5 продемонстрировали 21% или более высокую активность, и гуманизированное антитело #9, гуманизированное антитело #1, гуманизированное антитело #0, человеческое-кроличье химерное антитело и гуманизированное антитело #8 продемонстрировали 15% или более высокую активность. В отличие от этого все сравнительные антитела 1-48 продемонстрировали 8% или более низкую активность, и все отрицательные контроли продемонстрировали 6% или более низкую активность.

[0231] В отношении клеток рака коры надпочечников (A-673) гуманизированное антитело #7, гуманизированное антитело #10 и гуманизированное антитело #6 продемонстрировали 50% или более высокое противоопухолевое действие, гуманизированное антитело #3, гуманизированное антитело #4, гуманизированное антитело #2 и гуманизированное антитело #5 продемонстрировали 46% или более высокую активность, и гуманизированное антитело #9, гуманизированное антитело #1, гуманизированное антитело #0, человеческое-кроличье химерное антитело и гуманизированное антитело #8 продемонстрировали 40% или более высокую активность. В отличие от этого все сравнительные антитела 1-48 продемонстрировали 20% или более низкую активность, и все отрицательные контроли продемонстрировали 8% или более низкую активность.

[0232] В отношении клеток опухоли Юинга (RD-ES) гуманизированное антитело #7, гуманизированное антитело #10 и гуманизированное антитело #6 продемонстрировали 48% или более высокое противоопухолевое действие, гуманизированное антитело #3, гуманизированное антитело #4, гуманизированное антитело #2 и гуманизированное антитело #5 продемонстрировали 40% или более высокую активность, и гуманизированное антитело #9, гуманизированное антитело #1, гуманизированное антитело #0, человеческое-кроличье химерное антитело и гуманизированное антитело #8 продемонстрировали 31% или более высокую активность. В отличие от этого все сравнительные антитела 1-48 продемонстрировали 15% или более низкую активность, и все отрицательные контроли продемонстрировали 6% или более низкую активность.

[0233] В отношении клеток лимфомы Ходжкина (RPMI1666) гуманизированное антитело #7, гуманизированное антитело #10 и гуманизированное антитело #6 продемонстрировали 40% или более высокое противоопухолевое действие, гуманизированное антитело #3, гуманизированное антитело #4, гуманизированное антитело #2 и гуманизированное антитело #5 продемонстрировали 36% или более высокую активность, и гуманизированное антитело #9, гуманизированное антитело #1, гуманизированное антитело #0, человеческое-кроличье химерное антитело и гуманизированное антитело #8 продемонстрировали 30% или более высокую активность. В отличие от этого все сравнительные антитела 1-48 продемонстрировали 20% или более низкую активность, и все отрицательные контроли продемонстрировали 5% или более низкую активность.

[0234] В отношении клеток мезотелиомы (NCI-H2452) гуманизированное антитело #7, гуманизированное антитело #10 и гуманизированное антитело #6 продемонстрировали 35% или более высокое противоопухолевое действие, гуманизированное антитело #3, гуманизированное антитело #4, гуманизированное антитело #2 и гуманизированное антитело #5 продемонстрировали 39% или более высокую активность, и гуманизированное антитело #9, гуманизированное антитело #1, гуманизированное антитело #0, человеческое-кроличье химерное антитело и гуманизированное антитело #8 продемонстрировали 31% или более высокую активность. В отличие от этого все сравнительные антитела 1-48 продемонстрировали 10% или более низкую активность, и все отрицательные контроли продемонстрировали 5% или более низкую активность.

[0235] В отношении клеток множественной миеломы (IM-9) гуманизированное антитело #7, гуманизированное антитело #10 и гуманизированное антитело #6 продемонстрировали 35% или более высокое противоопухолевое действие, гуманизированное антитело #3, гуманизированное антитело #4, антитело #2 и гуманизированное антитело #5 продемонстрировали 30% или более высокую активность, и гуманизированное антитело #9, антитело #1, гуманизированное антитело #0, человеческое-кроличье химерное антитело и гуманизированное антитело #8 продемонстрировали 27% или более высокую активность. В отличие от этого все сравнительные антитела 1-48 продемонстрировали 10% или более низкую активность, и все отрицательные контроли продемонстрировали 6% или более низкую активность.

[0236] В отношении клеток рака яичка (NT/D1) гуманизированное антитело #7, гуманизированное антитело #10 и гуманизированное антитело #6 продемонстрировали 37% или более высокое противоопухолевое действие, гуманизированное антитело #3, гуманизированное антитело #4, гуманизированное антитело #2 и гуманизированное антитело #5 продемонстрировали 30% или более высокую активность, и гуманизированное антитело #9, гуманизированное антитело #1, гуманизированное антитело #0, человеческое-кроличье химерное антитело и гуманизированное антитело #8 продемонстрировали 25% или более высокую активность. В отличие от этого все сравнительные антитела 1-48 продемонстрировали 11% или более низкую активность, и все отрицательные контроли продемонстрировали 5% или более низкую активность.

[0237] В отношении клеток рака щитовидной железы (TT) гуманизированное антитело #7, гуманизированное антитело #10 и гуманизированное антитело #6 продемонстрировали 42% или более высокое противоопухолевое действие, гуманизированное антитело #3, гуманизированное антитело #4, гуманизированное антитело #2 и гуманизированное антитело #5 продемонстрировали 35% или более высокую активность, и гуманизированное антитело #9, гуманизированное антитело #1, гуманизированное антитело #0, человеческое-кроличье химерное антитело и гуманизированное антитело #8 продемонстрировали 30% или более высокую активность. В отличие от этого все сравнительные антитела 1-48 продемонстрировали 15% или более низкую активность, и все отрицательные контроли продемонстрировали 5% или более низкую активность.

[0238] В отношении клеток злокачественной опухоли головы и шеи (FaDu) гуманизированное антитело #7, гуманизированное антитело #10 и гуманизированное антитело #6 продемонстрировали 50% или более высокое противоопухолевое действие, гуманизированное антитело #3, гуманизированное антитело #4, гуманизированное антитело #2 и гуманизированное антитело #5 продемонстрировали 40% или более высокую активность, и гуманизированное антитело #9, гуманизированное антитело #1, гуманизированное антитело #0, человеческое-кроличье химерное антитело и антитело #8 продемонстрировали 35% или более высокую активность. В отличие от этого все сравнительные антитела 1-48 продемонстрировали 20% или более низкую активность, и все отрицательные контроли продемонстрировали 8% или более низкую активность.

[0239] Эти результаты показали, что гуманизированные антитела #0-#10 и человеческое-кроличье химерное антитело демонстрируют значительно более сильное противоопухолевое действие в отношении рака молочной железы, рака почки, рака поджелудочной железы, рака толстой и прямой кишки, рака легкого, опухоли головного мозга, рака желудка, рака матки, рака яичника, рака предстательной железы, рака мочевого пузыря, рака пищевода, лейкоза, лимфомы, рака печени, рака желчного пузыря, саркомы, меланомы, рака коры надпочечников, опухоли Юинга, лимфомы Ходжкина, мезотелиомы, множественной миеломы, рака яичка, рака щитовидной железы или злокачественных опухолей головы и шеи, чем сравнительные антитела.

[0240] Кроме того, гуманизированные антитела #0-#10 и человеческое-кроличье химерное антитело продемонстрировали значительно более высокую противоопухолевую активность против рака молочной железы, рака почки, рака поджелудочной железы, рака толстой и прямой кишки, рака легкого, опухоли головного мозга, рака желудка, рака матки, рака яичника, рака предстательной железы, рака мочевого пузыря, рака пищевода, лейкоза, лимфомы, рака печени, рака желчного пузыря, саркомы, меланомы, рака коры надпочечников, опухоли Юинга, лимфомы Ходжкина, мезотелиомы, множественной миеломы, рака яичка, рака щитовидной железы или злокачественных опухолей головы и шеи, как описано выше, чем все антитела против CAPRIN-1, описанные в Примерах WO2010/016526, WO2011/096517, WO2011/096528, WO2011/096519, WO2011/096533, WO2011/096534, WO2011/096535, WO2013/018886, WO2013/018894, WO2013/018892, WO2013/018891, WO2013/018889, WO2013/018883, WO2013/125636, WO2013/125654, WO2013/125630, WO2013/125640, WO2013/147169 и WO2013/147176.

[0241] Противоопухолевое действие было показано как цитотоксическая активность против линий раковых клеток, которую определяли посредством смешивания каждого антитела против CAPRIN-1, эффекторных клеток и хром 51-содержащих клеток-мишеней, культивирования клеток в течение 4 часов и измерения количества хрома 51, высвободившегося в среду после культивирования, с последующим вычислением согласно следующей формуле*:

[0242] *Формула: Цитотоксическая активность (%)=(Количество хрома 51, высвободившегося из клеток-мишеней при добавлении антитела против CAPRIN-1 и эффекторных клеток - Количество хрома 51, высвободившегося из клеток-мишеней в естественных условиях)/(Количество хрома 51, высвободившегося из клеток-мишеней при добавлении 1Н соляной кислоты - Количество хрома 51, высвободившегося из клеток-мишеней в естественных условиях)×100.

[0243] Пример 6-1: Получение гуманизированных моноклональных антител против CAPRIN-1, в которых была заменена аминокислота в константной области тяжелой цепи

Были получены антитела против CAPRIN-1, имеющие константную область тяжелой цепи, описанную в SEQ ID NO: 33, в которой часть аминокислот в константной области тяжелой цепи гуманизированного антитела #0, #2, #3, #4, #5, #6, #7, #8, #9 или #10, полученных в Примере 3, была заменена (в дальнейшем называемые сконструированными антителами I типа против CAPRIN-1). Синтезировали ДНК, кодирующую аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую указанную выше константную область тяжелой цепи и вариабельную область тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 7, и встраивали ее в вектор для экспрессии в клетках млекопитающих согласно стандартному методу. Кроме того, ДНК, кодирующую аминокислоты вариабельной области легкой цепи, представленной в SEQ ID NO: 11, встраивали в вектор для экспрессии в клетках млекопитающих, несущий ген, кодирующий константную область легкой цепи IgG1 человека, с получением рекомбинантного вектора экспрессии. Два полученных рекомбинантных вектора экспрессии переносили в клетки млекопитающих согласно стандартному методу и получали супернатант культуры сконструированного антитела I типа против CAPRIN-1 #0 из гуманизированного антитела #0. Супернатанты культуры, содержащие сконструированные антитела I типа против CAPRIN-1 #1, #2, #3, #4, #5, #6, #7, #8, #9 и #10, описанные в Примере 3, были затем получены таким же образом, как описано выше в отношении гуманизированных антител #1, #2, #3, #4, #5, #6, #7, #8, #9 и #10, соответственно. Полученные супернатанты культуры, содержащие сконструированные антитела I типа против CAPRIN-1 #0-#10, очищали согласно стандартному методу при использовании сорбента Hitrap Protein A Sepharose FF (производства GE Healthcare Japan Corp.). Буфер меняли на PBS(-) и полученный продукт фильтровали через фильтр 0,22 мкм (производства Merck Millipore Corp.) с получением сконструированных антител I типа против CAPRIN-1.

[0244] Затем были получены антитела против CAPRIN-1, имеющие константную область тяжелой цепи, описанную в SEQ ID NO: 34, в котором заменяли часть аминокислот в константной области тяжелой цепи гуманизированного антитела #0, #1, #2, #3, #4, #5, #6, #7, #8, #9 или #10, полученных в Примере 3 (в дальнейшем называемые сконструированными антителами II типа против CAPRIN-1). Синтезировали ДНК, кодирующую аминокислотную последовательность тяжелой цепи, имеющую указанную выше константную область тяжелой цепи и вариабельную область тяжелой цепи, представленную SEQ ID NO: 7, и встраивали ее в вектор для экспрессии в клетках млекопитающих согласно стандартному методу. Далее, как получали выше, ДНК, кодирующую аминокислоты вариабельной области легкой цепи, представленной в SEQ ID NO: 11, встраивали в вектор для экспрессии в клетках млекопитающих, несущий ген, кодирующий константную область легкой цепи IgG1 человека, с получением рекомбинантного вектора экспрессии. Эти два рекомбинантных вектора экспрессии переносили в клетки млекопитающих согласно стандартному методу и получали супернатант культуры сконструированного антитела II типа против CAPRIN-1 #0. Супернатанты культуры, содержащие сконструированные антитела II типа против CAPRIN-1 #1, #2, #3, #4, #5, #6, #7, #8, #9 и #10, описанные в Примере 3, были затем получены таким же образом, как описано выше в отношении гуманизированных антител #1, #2, #3, #4, #5, #6, #7, #8, #9 и #10, соответственно. Полученные супернатанты культуры, содержащие сконструированные антитела II типа против CAPRIN-1 #0-#10, очищали согласно стандартному методу при использовании сорбента Hitrap Protein A Sepharose FF (производства GE Healthcare Japan Corp.). Буфер меняли на PBS(-) и полученный продукт фильтровали через фильтр 0,22 мкм (производства Merck Millipore Corp.) с получением сконструированных антител II типа против CAPRIN-1.

[0245] Пример 6-2: Получение антител против CAPRIN-1, имеющих углеводную цепь без фукозы, присоединенной к N-ацетилглюкозамину на восстанавливающем конце углеводной цепи, помимо прочих N-гликозид-связанных углеводных цепей, присоединенных к константной области тяжелой цепи

Следующим этапом антитела против CAPRIN-1, имеющие углеводную цепь без фукозы, присоединенной к N-ацетилглюкозамину на восстанавливающем конце углеводной цепи, помимо прочих N-гликозид-связанных углеводных цепей, присоединенных к константной области тяжелой цепи гуманизированного антитела #0, #1, #2, #3, #4, #5, #6, #7, #8, #9 или #10, полученных в Примере 3 (в дальнейшем называемые сконструированными антителами III типа против CAPRIN-1), получали следующим способом: содержащий ген устойчивости к неомицину вектор для экспрессии в клетках млекопитающих, несущий ген ГДФ-6-дезокси-D-ликсо-4-гексулоза-редуктазы (RMD), которая является ферментом, который не катализирует реакцию превращения ГДФ-6-дезокси-D-ликсо-4-гексулозы в ГДФ-L-фукозу, переносили в клетки линии клеток млекопитающих CHO согласно стандартному методу, используя реагент для трансфекции FreeStyle(TM) MAX Reagent (Life Technologies Corp.). Трансфицированные клетки CHO культивировали в среде, содержащей G-418, для получения стабильного пула клеток CHO, экспрессирующих RMD. Из этого стабильного пула 7 клеток CHO, конститутивно экспрессирующих RMD, клонировали методом серийных разведений. Уровень экспрессии гена RMD в каждой из 7 клонированных клеток RMD-CHO оценивали три раза, раз в две недели, с помощью количественной ПЦР с целью отбора клетое CHO, конститутивно и стабильно экспрессирующих ген RMD (клетки RMD-CHO). Таким же способом, как и в Примере 3, ген, кодирующий аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, представленной в SEQ ID NO: 7, и ген, кодирующий аминокислоты вариабельной области легкой цепи, представленной в SEQ ID NO: 11, соответствующим образом переносили посредством вектора для экспрессии в клетках млекопитающих, несущего ген константной области тяжелой цепи IgG1 человека, и вектора для экспрессии в клетках млекопитающих, несущего ген константной области легкой цепи IgG1 человека, в клетки RMD-CHO, конститутивно экспрессирующие RMD, согласно стандартному методу и получали супернатант культуры, содержащий сконструированное антитело III типа против CAPRIN-1 #0. Супернатанты культуры, содержащие сконструированные антитела III типа против CAPRIN-1 #1, #2, #3, #4, #5, #6, #7, #8, #9 и #10, описанные в Примере 3, были затем получены таким же образом, как описано выше в отношении гуманизированных антител #1, #2, #3, #4, #5, #6, #7, #8, #9 и #10, соответственно. Полученные супернатанты культуры, содержащие сконструированные антитела III типа против CAPRIN-1 #0-#10, очищали согласно стандартному методу при использовании Hitrap Protein A Sepharose FF (производства GE Healthcare Japan Corp.). Буфер меняли на PBS(-) и полученный продукт фильтровали через фильтр 0,22 мкм (производства Merck Millipore Corp.) с получением композиции антитела, содержащего сконструированное антитело III типа против CAPRIN-1 #0. Аналогично получали очищенные продукты антител, содержащие сконструированные антитела III типа против CAPRIN-1 #1-#10. Соотношение антитела против CAPRIN-1, имеющего углеводную цепь без фукозы, присоединяемой к N-ацетилглюкозамину на восстанавливающем конце углеводном цепи, помимо прочих N-гликозид-связанных углеводных цепей, присоединенных к константной области тяжелой цепи, содержащейся в каждой из этих очищенных композиций антител, оценивали при использовании LabChip(R) GXII (PerkinElmer, Inc.), и, следовательно, во всех случаях оно составило 80% или выше.

[0246] Таким же способом, как и в Примере 3, ген, кодирующий аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, представленной в SEQ ID NO: 7, и ген, кодирующий аминокислоты вариабельной области легкой цепи, представленной в SEQ ID NO: 11, соответствующим образом переносили посредством содержащего ген устойчивости к гигромицину вектора для экспрессии в клетках млекопитающих, несущего ген константной области тяжелой цепи IgG1 человека, и содержащего ген устойчивости к гигромицину вектора для экспрессии в клетках млекопитающих, несущего ген константной области легкой цепи IgG1 человека, в клетки RMD-CHO согласно стандартному методу и культивировали полученные клетки в среде, содержащей гигромицин B, с получением стабильного пула, экспрессирующего сконструированное антитело III типа против CAPRIN-1 #0. Из этого стабильного пула клетки, конститутивно и стабильно экспрессирующие сконструированное антитело III типа против CAPRIN-1 #0, получали методом серийных разведений. Соотношение антитела против CAPRIN-1, имеющего углеводную цепь без фукозы, присоединяемой к N-ацетилглюкозамину на восстанавливающем конце углеводной цепи, помимо прочих N-гликозид-связанных углеводных цепей, присоединенных к константной области тяжелой цепи, содержащейся в каждой из очищенных композиций антитела, включающих сконструированные антитела III типа против CAPRIN-1 #0-#10, продуцируемые соответствующими клетками, оценивали при использовании LabChip(R) GXII (PerkinElmer, Inc.), и, следовательно, во всех случаях оно составило 80% или выше.

[0247] Пример 6-3: Получение антител против CAPRIN-1, имеющих аминокислотную замену в константной области тяжелой цепи и имеющих углеводную цепь без фукозы, присоединяемой к N-ацетилглюкозамину на восстанавливающем конце углеводной цепи, помимо прочих N-гликозид-связанных углеводных цепей, присоединенных к константной области тяжелой цепи

Следующим этапом получали антитела против CAPRIN-1, имеющие константную область тяжелой цепи, описанную в SEQ ID NO: 34, в которой часть аминокислот в константной области тяжелой цепи гуманизированного антитела #0, #1, #2, #3, #4, #5, #6, #7, #8, #9 или #10, описанных в Примере 3, была заменена, и имеющие углеводную цепь без фукозы, присоединяемой к N-ацетилглюкозамину на восстанавливающем конце углеводной цепи, помимо прочих N-гликозид-связанных углеводных цепей, присоединенных к константной области тяжелой цепи антитела (в дальнейшем называемые сконструированными антителами IV типа против CAPRIN-1). Синтезировали ДНК, кодирующую аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую вариант константной области тяжелой цепи, полученной в Примере 6-1, и вариабельную области тяжелой цепи IgG1 человека, представленную в SEQ ID NO: 7, и встраивали в вектор для экспрессии в клетках млекопитающих согласно стандартному методу, и в то же время синтезировали ДНК, кодирующую аминокислоты вариабельной области легкой цепи, представленной в SEQ ID NO: 11, и встраивали в вектор для экспрессии в клетках млекопитающих, несущий ген, кодирующий аминокислоты константной области легкой цепи IgG1 человека, после чего полученные в результате векторы переносили в клетки RMD-CHO, конститутивно экспрессирующие ГДФ-6-дезокси-D-ликсо-4-гексулоза-редуктазу (RMD), полученные в Примере 6-2. Получали супернатант культуры сконструированного антитела IV типа против CAPRIN-1 #0 из гуманизированного антитела #0. Супернатанты культуры, содержащие сконструированные антитела IV типа против CAPRIN-1 #1, #2, #3, #4, #5, #6, #7, #8, #9 и #10 затем получали таким же способом, как описано выше в отношении гуманизированных антител #1, #2, #3, #4, #5, #6, #7, #8, #9 и #10, соответственно, описанных в Примере 3. Полученные супернатанты культуры, содержащие сконструированные антитела IV типа против CAPRIN-1 #0-#10, очищали согласно стандартному методу при использовании Hitrap Protein A Sepharose FF (производства GE Healthcare Japan Corp.). Буфер меняли на PBS(-) и полученный продукт фильтровали через фильтр 0,22 мкм (производства Merck Millipore Corp.) с получением композиции антител, содержащей сконструированное антитело IV типа против CAPRIN-1 #0. Аналогично получали очищенные продукты антител, содержащие сконструированные антитела IV типа против CAPRIN-1 #1-#10. Соотношение антитела против CAPRIN-1, имеющего углеводную цепь без фукозы, присоединяемой к N-ацетилглюкозамину на восстанавливающем конце углеводной цепи, помимо прочих N-гликозид-связанных углеводных цепей, присоединенных к константной области тяжелой цепи, содержащейся в каждой из этих очищенных композиций антител, оценивали при использовании LabChip(R) GXII (PerkinElmer, Inc.), и, следовательно, во всех случаях оно составило 80% или выше.

[0248] ДНК, кодирующую аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую модифицированную константную область тяжелой цепи, полученную в Примере 6-1, и вариабельную область тяжелой цепи IgG1 человека, представленную в SEQ ID NO: 7, синтезировали и встраивали в содержащий ген устойчивости к гигромицину вектор для экспрессии в клетках млекопитающих согласно стандартному методу, и в то же время ДНК, кодирующую аминокислоты вариабельной области легкой цепи, представленной в SEQ ID NO: 11, синтезировали и встраивали в содержащий ген устойчивости к гигромицину вектор для экспрессии в клетках млекопитающих, несущий ген, кодирующий аминокислоты константной области легкой цепи IgG1 человека, и полученные в результате векторы переносили в клетки. Клетки культивировали в среде, содержащей гигромицин B, с получением стабильного пула, экспрессирующего сконструированное антитело IV типа против CAPRIN-1 #0. Из этого стабильного пула клетки, конститутивно и стабильно экспрессирующие сконструированное антитело IV типа против CAPRIN-1 #0, получали методом серийных разведений. Клетки, конститутивно и стабильно экспрессирующие сконструированные антитела IV типа против CAPRIN-1 #1, #2, #3, #4, #5, #6, #7, #8, #9 и #10 затем получали таким же способом, как описано выше в отношении гуманизированных антител #1, #2, #3, #4, #5, #6, #7, #8, #9 и #10, описанных в Примере 3, соответственно. Соотношение антитела против CAPRIN-1, имеющего углеводную цепь без фукозы, присоединяемой к N-ацетилглюкозамину на восстанавливающем конце углеводной цепи, помимо прочих N-гликозид-связанных углеводных цепей, присоединенных к константной области тяжелой цепи, содержащейся в каждой из очищенных композиций антител, содержащих сконструированные антитела IV типа против CAPRIN-1 #0-#10, продуцируемые соответствующими клетками, оценивали при использовании LabChip(R) GXII (PerkinElmer, Inc.), и, следовательно, во всех случаях оно составляло 80% или выше.

[0249] Пример 7: Антигенная специфичность сконструированных антител против CAPRIN-1 и их реактивность в отношении раковых клеток

Специфическую реактивность сконструированных антител I типа против CAPRIN-1 #0-#10, сконструированных антител II типа против CAPRIN-1 #0-#10, соответствующих композиций антител, содержащих сконструированные антитела III типа против CAPRIN-1 #0-#10, и соответствующих композиций антител, содержащих сконструированные антитела IV типа против CAPRIN-1 #0-#10 (в дальнейшем называемых сконструированными антителами против CAPRIN-1), полученных в Примерах 6-1-6-3, в отношении белка CAPRIN-1 подтверждали таким же способом, как в Примере 4. В результате значение оптического поглощения лунки, в которую было добавлено человеческое антитело IgG, которое, как было подтверждено, не реагировало с белком CAPRIN-1, используемое в качестве отрицательного контроля, не превышало значение оптического поглощения лунки, в которую не было добавлено никакого антитела, тогда как все лунки, соответственно, в которые были добавлены сконструированные антитела против CAPRIN-1, продемонстрировали эквивалентные высокие значения оптического поглощения. Все сконструированные антитела против CAPRIN-1 в лунках, в которых белок CAPRIN-1 не был иммобилизован, просто продемонстрировали значение оптического поглощения, эквивалентное значению оптического поглощения отрицательного контроля. На основе этих результатов было подтверждено, что все сконструированные антитела против CAPRIN-1 специфично реагировали с белком CAPRIN-1.

[0250] Следующим этапом подтверждали реактивность каждого сконструированного антитела против CAPRIN-1 с различными человеческими раковыми клетками, таким же способом, как в Примере 4. В этой оценке использовали клетки рака молочной железы (BT-474 и MDA-MB-361), клетки рака толстой и прямой кишки (HT-29), клетки рака легкого (QG56), клетки рака желудка (NCI-N87), клетки рака матки (HEC-1-A), клетки рака предстательной железы (22Rv1), клетки рака поджелудочной железы (Panc10.5), клетки рака печени (Hep3B), клетки рака яичника (SKOV3), клетки рака почки (Caki-2), клетки опухоли мозга (U-87MG), клетки рака мочевого пузыря (T24 и HT-1376), клетки рака пищевода (OE33), лейкозные клетки (OCI-AML5), лимфомные клетки (Ramos), клетки рака желчного пузыря (TGBC14TKB), клетки фибросаркомы (HT-1080), клетки меланомы (G-361), клетки рака коры надпочечников (A-673), клетки опухоли Юинга (RD-ES), клетки лимфомы Ходжкина (RPMI1666), клетки мезотелиомы (NCI-H2452), клетки множественной миеломы (IM-9), клетки рака яичка (NT/D1), клетки рака щитовидной железы (TT) и клетки злокачественной опухоли головы и шеи (FaDu). В результате интенсивность флуоресценции от каждого сконструированного антитела против CAPRIN-1 была более сильной во всех раковых клетках, используемых при оценке, чем интенсивность флуоресценции в случае использования отрицательного контроля. На основе этих результатов было подтверждено, что все сконструированные антитела против CAPRIN-1 специфично реагируют с белком CAPRIN-1, присутствующим на поверхности мембран человеческих раковых клеток.

[0251] Пример 8: Противоопухолевая активность сконструированного антитела против CAPRIN-1 в отношении различных человеческих раковых клеток

Сконструированные антитела против CAPRIN-1 (сконструированные антитела I типа против CAPRIN-1 #0-#10, сконструированные антитела II типа против CAPRIN-1 #0-#10, соответствующие композиции антител, содержащие сконструированные антитела III типа против CAPRIN-1 #0-#10, и соответствующие композиции антител, содержащие сконструированные антитела IV типа против CAPRIN-1 #0-#10), полученные в Примерах 6-1 - 6-3, оценивали по их противоопухолевому действию в отношении различных человеческих раковых клеток на основе активности ADCC, таким же способом, как в Примере 5. Лунка, в которую было добавлено антитело контрольного изотипа, лунка, в которую не было добавлено никакого антитела, и лунка, в которую было добавлено антитело, реагирующее с белком CAPRIN-1, но не проявляющее реактивности с поверхностью человеческих раковых клеток, на которых экспрессировался CAPRIN-1, служили в качестве отрицательного контроля. Гуманизированные антитела #0-#10, которые являлись соответствующими несконструированными антителами против CAPRIN-1, использовали в качестве сравнительных антител. Каждое антитело добавляли в количестве 0,01-1 мкг/мл (конечная концентрация) в 96-луночные планшеты с V-образным дном.

[0252] В качестве клеток-мишеней использовали клетки рака молочной железы (BT-474 и MDA-MB-361), клетки рака толстой и прямой кишки (HT-29), клетки рака легкого (QG56), клетки рака желудка (NCI-N87), клетки рака матки (HEC-1-A), клетки рака предстательной железы (22Rv1), клетки рака поджелудочной железы (Panc10.5), клетки рака печени (Hep3B), клетки рака яичника (SKOV3), клетки рака почки (Caki-2), клетки опухоли мозга (U-87MG), клетки рака мочевого пузыря (T24 и HT-1376), клетки рака пищевода (OE33), лейкозные клетки (OCI-AML5), лимфомные клетки (Ramos), клетки рака желчного пузыря (TGBC14TKB), клетки фибросаркомы (HT-1080), клетки меланомы (G-361), клетки рака коры надпочечников (A-673), клетки опухоли Юинга (RD-ES), клетки лимфомы Ходжкина (RPMI1666), клетки мезотелиомы (NCI-H2452), клетки множественной миеломы (IM-9), клетки рака яичка (NT/D1), клетки рака щитовидной железы (TT) и клетки злокачественной опухоли головы и шеи (FaDu). По 10⁶ клеток каждой указанной выше линии человеческих раковых клеток собирали в центрифужные пробирки объемом 50 мл. В пробирки добавляли по 100 мкКи хрома 51 (производства PerkinElmer, Inc.) и инкубировали пробирки при 37°C в течение 1 часа. Затем клетки три раза промывали средой RPMI1640, содержащей 10% FBS, добавляли по 2×10³ клеток/лунка в 96-луночные планшеты с V-образным дном, в которые было добавлено каждое из антител, и проводили реакцию.

[0253] Человеческие NK-клетки, выделенные из мононуклеарных клеток человеческой периферической крови при использовании стандартного метода, использовали в качестве эффекторных клеток. Человеческие NK-клетки, добавленные в количестве 0,4-2,0×10⁵ клеток/лунка в 96-луночные планшеты с V-образным дном, в которые были добавлены и реагировали каждое из антител и клеток-мишеней, получали и подвергали реакции при 37°C в течение 4 часов в условиях 5% CO². После реакции по 50 мкл супернатанта культуры, содержащего хром 51, высвободившийся из поврежденных раковых клеток, отбирали из каждой лунки. Количество хрома 51, высвободившегося в супернатант культуры из поврежденных раковых клеток, измеряли таким же способом, как в Примере 5, для вычисления противоопухолевого действия антител против CAPRIN-1 в отношении раковых клеток.

[0254] В результате в отношении клеток рака молочной железы (BT-474), все сконструированные антитела против CAPRIN-1, а именно сконструированные антитела I типа против CAPRIN-1 #0-#10, сконструированные антитела II типа против CAPRIN-1 #0-#10, соответствующие композиции антител, содержащие сконструированные антитела III типа против CAPRIN-1 #0-#10, и соответствующие композиции антител, содержащие сконструированные антитела IV типа против CAPRIN-1 #0-#10, продемонстрировали более сильное противоопухолевое действие, чем антитела отрицательного контроля. Сконструированные антитела I типа против CAPRIN-1 #0-#10, сконструированные антитела II типа против CAPRIN-1 #0-#10 и соответствующие композиции антител, содержащие сконструированные антитела III типа против CAPRIN-1 #0-#10, которые демонстрировали такой же уровень противоопухолевого действия, что и соответствующие несконструированные антитела (гуманизированные антитела #0-#10), используемые в качестве сравнительных антител, находились в концентрации приблизительно 1/13-1/20 концентраций несконструированных антител, соответственно. Для того чтобы соответствующие композиции антител, содержащие сконструированные антитела IV типа против CAPRIN-1 #0-#10, достигали того же уровня противоопухолевого действия, что и соответствующие несконструированные антитела, концентрации составляли приблизительно 1/150 концентраций несконструированных антител, соответственно. Эти результаты продемонстрировали, что сконструированные антитела против CAPRIN-1 (сконструированные антитела I типа против CAPRIN-1 #0-#10, сконструированные антитела II типа против CAPRIN-1 #0-#10 и соответствующие композиции антител, содержащие сконструированные антитела III типа против CAPRIN-1 #0-#10 и сконструированные антитела IV типа против CAPRIN-1 #0-#10), проявляют улучшенную противоопухолевую активность по сравнению с соответствующими несконструированными антителами. Эти результаты также продемонстрировали, что соответствующие композиции антител, содержащие сконструированные антитела IV типа против CAPRIN-1 #0-#10, оказывают более сильное противоопухолевое воздействие, чем сконструированные антитела I типа против CAPRIN-1 #0-#10, сконструированные антитела II типа против CAPRIN-1 #0-#10 и соответствующие композиции антител, содержащие сконструированные антитела III типа против CAPRIN-1 #0-#10.

[0255] Кроме того, аналогичное более сильное противоопухолевое действие также было получено в отношении клеток рака молочной железы (MDA-MB-361), клеток рака толстой и прямой кишки (HT-29), клеток рака легкого (QG56), клеток рака желудка (NCI-N87), клеток рака матки (HEC-1-A), клеток рака предстательной железы (22Rv1), клеток рака поджелудочной железы (Panc10.5), клеток рака печени (Hep3B), клеток рака яичника (SKOV3), клеток рака почки (Caki-2), клеток опухоли мозга (U-87MG), клеток рака мочевого пузыря (T24 и HT-1376), клеток рака пищевода (OE33), лейкозных клеток (OCI-AML5), лимфомных клеток (Ramos), клеток рака желчного пузыря (TGBC14TKB), клеток фибросаркомы (HT-1080), клеток меланомы (G-361), клеток рака коры надпочечников (A-673), клеток опухоли Юинга (RD-ES), клеток лимфомы Ходжкина (RPMI1666), клеток мезотелиомы (NCI-H2452), клеток множественной миеломы (IM-9), клеток рака яичка (NT/D1), клеток рака щитовидной железы (TT) и клеток злокачественной опухоли головы и шеи (FaDu), использованных в оценке.

Промышленная применимость

[0256] Антитело согласно настоящему изобретению может применяться для лечения и/или профилактики рака.

[0257] Все публикации, патенты и заявки на патенты, цитируемые в настоящем описании, полностью включены в настоящую заявку посредством отсылки.

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложено антитело, обладающее иммунологической реактивностью в отношении белка CAPRIN-1. Также рассмотрены композиция, клетка, фармацевтическая композиция, комбинированное лекарственное средство, ДНК и способ лечения. Данное изобретение может найти дальнейшее применение в терапии различных видов рака, ассоциированных с CAPRIN-1, например лимфомы Ходжкина и меланомы. 7 н. и 17 з.п. ф-лы, 7 пр.

1. Антитело, которое включает:

вариабельную область тяжелой цепи, включающую определяющие комплементарность области SEQ ID NO: 1, 2 и 3, и

вариабельную область легкой цепи, включающую определяющие комплементарность области SEQ ID NO: 4, 5 и 6, и

обладает иммунологической реактивностью в отношении белка CAPRIN-1.

2. Антитело по п. 1, в котором

вариабельная область тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8 и

вариабельная область легкой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15.

3. Антитело по п. 1, в котором

вариабельная область тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 и

вариабельная область легкой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15.

4. Антитело по п. 1, в котором

вариабельная область тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 и

вариабельная область легкой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15.

5. Антитело по п. 1, в котором

вариабельная область тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8 и

вариабельная область легкой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13.

6. Антитело по п. 1, в котором

вариабельная область тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 и

вариабельная область легкой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.

7. Антитело по п. 1, в котором

вариабельная область тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8 и

вариабельная область легкой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.

8. Антитело по п. 1, в котором

вариабельная область тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 и

вариабельная область легкой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13.

9. Антитело по п. 1, в котором

вариабельная область тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 и

вариабельная область легкой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14.

10. Антитело по п. 1, в котором

вариабельная область тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8 и

вариабельная область легкой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11.

11. Антитело по п. 1, в котором

вариабельная область тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 и

вариабельная область легкой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11.

12. Антитело по п. 1, в котором

вариабельная область тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 и

вариабельная область легкой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15.

13. Антитело по п. 1, в котором

вариабельная область тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20 и

вариабельная область легкой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21.

14. Антитело по любому из пп. 1-13, где антитело является гуманизированным антителом, химерным антителом, одноцепочечным антителом или мультиспецифическим антителом.

15. Антитело по любому из пп. 1-13, где антитело конъюгировано с противоопухолевым средством.

16. Антитело по любому из пп. 1-13, где антитело включает замену одной или более аминокислот в константной области тяжелой цепи.

17. Антитело по любому из пп. 1-13, где антитело является антителом, не имеющим фукозы, присоединяемой к N-ацетилглюкозамину на восстанавливающем конце углеводной цепи N-гликозид-связанной углеводной цепи, присоединенной к константной области тяжелой цепи.

18. Композиция для лечения и/или профилактики рака, ассоциированного с повышенной экспрессией и/или активностью CAPRIN-1, включающая антитело по п. 17 и антитело по любому из пп. 1-16, имеющее фукозу, присоединенную к N-ацетилглюкозамину на восстанавливающем конце углеводной цепи N-гликозид-связанной углеводной цепи, присоединенной к константной области тяжелой цепи.

19. Клетка, продуцирующая антитело по п. 17 или композицию по п. 18, трансфицированная плазмидой, кодирующей аминокислотную последовательность антитела по любому из пп. 1-17.

20. Фармацевтическая композиция для лечения и/или профилактики рака, ассоциированного с повышенной экспрессией и/или активностью CAPRIN-1, включающая антитело по любому из пп. 1-15, антитело по п. 16 или 17 или композицию по п. 18 в качестве действующего вещества.

21. Фармацевтическая композиция по п. 20, где рак является раком молочной железы, раком почки, раком поджелудочной железы, раком толстой и прямой кишки, раком легкого, опухолью головного мозга, раком желудка, раком матки, раком яичника, раком предстательной железы, раком мочевого пузыря, раком пищевода, лейкозом, лимфомой, раком печени, раком желчного пузыря, саркомой, мастоцитомой, меланомой, раком коры надпочечников, опухолью Юинга, лимфомой Ходжкина, мезотелиомой, множественной миеломой, раком яичка, раком щитовидной железы или злокачественной опухолью головы и шеи.

22. Комбинированное лекарственное средство для лечения и/или профилактики рака, ассоциированного с повышенной экспрессией и/или активностью CAPRIN-1, включающее фармацевтическую композицию по п. 20 или 21, и фармацевтическую композицию, включающую противоопухолевое средство.

23. ДНК, кодирующая антитело по любому из пп. 1-16.

24. Способ лечения и/или предотвращения рака, экспрессирующего CAPRIN-1 на поверхности раковой клетки, включающий введение субъекту антитела по любому из пп. 1-16, антитела по п. 17, композиции по п. 18, фармацевтической композиции по п. 20 или 21 или комбинированного лекарственного средства по п. 22.