ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И ПРОФИЛАКТИКИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОЙ ОПУХОЛИ Российский патент 2017 года по МПК C07K16/30 A61K39/395 A61P35/00 

Область техники

Настоящее изобретение относится к новому применению антитела против CAPRIN-1 или его фрагмента в лекарственном средстве, таком как терапевтическое и/или профилактическое средство, против злокачественной опухоли.

Уровень техники

Злокачественная опухоль является основной причиной смерти. Это заболевание в настоящее время лечат в основном путем хирургического вмешательства в комбинации с лучевой терапией и/или химиотерапией. Несмотря на развитие новых хирургических способов или открытие новых средств против злокачественной опухоли в последнее время, исход существующих способов лечения злокачественных опухолей улучшился в недостаточной мере, за исключением некоторых типов злокачественных опухолей. В результате последних достижений в молекулярной биологии или иммунологии злокачественных опухолей были идентифицированы антитела, которые специфически взаимодействуют со злокачественными опухолями, антигены злокачественных опухолей, распознаваемые цитотоксическими Т-клетками, гены, кодирующие такие антигены злокачественных опухолей, и тому подобное, что увеличило ожидания в отношении специфической терапии злокачественной опухоли, нацеленной на антигены злокачественных опухолей (непатентный документ 1).

Для уменьшения неблагоприятных явлений терапии злокачественной опухоли желательно, чтобы пептиды, полипептиды или белки, распознаваемые в качестве антигенов злокачественных опухолей, редко встречались в нормальных клетках, но исключительно существовали в злокачественных клетках. В 1991 году Boon et al (Ludwig Institute for Cancer Research, Belgium) выделили антиген меланомы человека MAGE 1, распознаваемый CD8-положительными Т-клетками, способом клонирования кДНК на основе экспрессии, используя линию аутологичных злокачественных клеток и Т-клетки, реактивные в отношении злокачественных опухолей (непатентный документ 2). В дальнейшем был описан способ SEREX (серологическая идентификация антигенов путем рекомбинантного клонирования на основе экспрессии), который основан на подходе клонирования генов на основе экспрессии, для идентификации опухолевых антигенов, распознаваемых антителами, продуцированными в ответ на аутологичную злокачественную опухоль in vivo у пациента со злокачественной опухолью (непатентный документ 3 и патентный документ 1). С помощью этого способа были выделены некоторые антигены злокачественных опухолей, которые редко экспрессируются в нормальных клетках, но исключительно экспрессируются в злокачественных клетках (непатентные документы 4-9). Кроме того, клеточная терапия с использованием иммуноцитов, которые специфически взаимодействуют с антигенами злокачественных опухолей, или иммунотерапия, специфичная в отношении злокачественных опухолей, с использованием вакцин или т.п., содержащих антигены злокачественных опухолей, являются объектом клинических испытаний, направленных на некоторые выделенные антигены злокачественных опухолей.

В последние годы во всем мире были выпущены различные лекарственные средства на основе антител для лечения злокачественных опухолей, которые нацелены на антигенные белки на злокачественных клетках. Эти лекарственные средства привлекли внимание вследствие их определенной эффективности в качестве терапевтических средств, специфичных к злокачественной опухоли. Однако большинство антигенных белков, на которые нацелены лекарственные средства, также экспрессируется на нормальных клетках. В результате введения антител повреждаются не только злокачественные клетки, но также и нормальные клетки, экспрессирующие антигены, что является отрицательным результатом и приводит к неблагоприятным явлениям. Следовательно, можно ожидать, что если бы можно было идентифицировать антигены злокачественной опухоли, которые специфически экспрессируются на поверхности злокачественных клеток, и использовать антитела, нацеленные на такие антигены, в качестве лекарственных средств, то эти лекарственные средства на основе антител обеспечивали бы лечение, вызывая меньше неблагоприятных явлений.

Цитоплазматический и ассоциированный с пролиферацией белок 1 (CAPRIN-1) известен как внутриклеточный белок, который экспрессируется при активации или клеточном делении покоящихся клеток и образует внутриклеточные стрессовые гранулы с РНК в клетках для участия в регуляции транспорта и трансляции мРНК. Было обнаружено, что этот белок специфически экспрессируется на поверхности злокачественных клеток и, таким образом, его исследуют в качестве мишени для лекарственных средств на основе антител для лечения злокачественных опухолей (патентный документ 2).

Список литературы

Патентная литература

Патентный документ 1: патент США №5698396

Патентный документ 2: WO 2010/016526

Непатентная литература

Непатентный документ 1: Tsuyoshi Akiyoshi, "Japanese Journal of Cancer and Chemotherapy", 1997, Vol. 24, p. 551-519 (Japanese Journal of Cancer and Chemotherapy Publishers Inc., Japan)

Непатентный документ 2: Bruggen P. et al., Science, 254: 1643-1647 (1991)

Непатентный документ 3: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 11810-11813 (1995)

Непатентный документ 4: Int. J. Cancer, 72: 965-971 (1997)

Непатентный документ 5: Cancer Res., 58: 1034-1041 (1998)

Непатентный документ 6: Int. J. Cancer, 29: 652-658 (1998)

Непатентный документ 7: Int. J. Oncol., 14: 703-708 (1999)

Непатентный документ 8: Cancer Res., 56: 4766-4772 (1996)

Непатентный документ 9: Hum. Mol. Genet., 6: 33-39, 1997

Сущность изобретения

Техническая проблема

Задачей настоящего изобретения является получение антитела, которое нацелено на CAPRIN-1, специфически экспрессируемый на поверхности злокачественных клеток, и которое имеет улучшенную противоопухолевую активность по сравнению с общепринятыми антителами, и обеспечение использования антитела в качестве

терапевтического и/или профилактического средства против злокачественной опухоли.

Решение проблемы

Настоящее изобретение имеет следующие аспекты:

Настоящее изобретение относится к антителу или его фрагменту, которые обладают иммунологической реактивностью в отношении белка CAPRIN-1, где антитело или его фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющие комплементарность области SEQ ID NO:5, 6 и 7, и вариабельную область легкой цепи, содержащую определяющие комплементарность области SEQ ID NO:9, 10 и 11, и к фармацевтической композиции для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли, содержащей их в качестве активного ингредиента.

В одном варианте настоящего изобретения злокачественная опухоль представляет собой рак молочной железы, рак почки, рак поджелудочной железы, рак ободочной и прямой кишки, рак легких, опухоль головного мозга, рак желудка, рак шейки матки, рак яичников, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, рак пищевода, лейкоз, лимфому, фибросаркому, мастоцитому или меланому.

В альтернативном варианте осуществления антитело представляет собой антитело человека, гуманизированное антитело, химерное антитело, одноцепочечное антитело или полиспецифическое антитело (например, биспецифическое антитело).

Настоящее описание включает содержание заявки на патент Японии № 2011-171332, на основе которой испрашивается приоритет настоящей заявки.

Преимущественные эффекты изобретения

Антитело против CAPRIN-1, используемое в соответствии с настоящим изобретением, повреждает злокачественные клетки. Таким образом, антитело против CAPRIN-1 применимо при лечении и/или профилактике злокачественной опухоли.

Описание вариантов осуществления

Антитело против CAPRIN-1 в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой моноклональное антитело или поликлональное антитело и предпочтительно представляет собой моноклональное антитело. Антитело против CAPRIN-1 в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой любой тип антитела, который может проявлять противоопухолевую активность и включает, например, рекомбинантные антитела, например, синтетические антитела, полиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), гуманизированные антитела, химерные антитела и одноцепочечные антитела (scFv), антитела человека и фрагменты этих антител, например, Fab, F(ab’)₂ и Fv. Эти антитела и их фрагменты можно получать способами, обычно известными специалистам в данной области. В случае, когда индивидуумом является человек, желательным является антитело человека или гуманизированное антитело для предотвращения или подавления отторжения.

В этом контексте выражение "специфическое связывание с белком CAPRIN-1" означает, что антитело специфически связывается с белком CAPRIN-1, по существу не связываясь с другими белками.

Антитело против полипептида CAPRIN-1 в соответствии с настоящим изобретением можно исследовать в отношении его противоопухолевой активности, как описано ниже, путем исследования in vivo ингибирования роста опухоли у животного, имеющего злокачественную опухоль, или путем исследования ex vivo присутствия или отсутствия опосредуемой иммуноцитами или комплементом цитотоксической активности, которую проявляет антитело против опухолевых клеток, экспрессирующих полипептид.

Индивидуумом, которому проводят лечение и/или профилактику злокачественной опухоли в соответствии с настоящим изобретением, является млекопитающее, такое как человек, домашнее животное, скот или спортивное животное, предпочтительно человек.

Далее настоящее изобретение описано более подробно.

Получение антигена для получения антител

Белки или их фрагменты, используемые в качестве сенсибилизирующих антигенов для получения антитела против CAPRIN-1 в соответствии с настоящим изобретением, не ограничиваются видом животного, служащего их источником, включая, например, людей, собак, крупный рогатый скот, лошадей, мышей, крыс или кур. Однако белки или их фрагменты предпочтительно выбирают, принимая во внимание их совместимость с родительскими клетками, используемыми для слияния клеток. Как правило, предпочтительными являются белки, происходящие от млекопитающих. В частности, предпочтительными являются белки, происходящие от человека. Например, если CAPRIN-1 представляет собой CAPRIN-1 человека, то можно использовать белки CAPRIN-1 человека, их частичные пептиды или клетки, экспрессирующие CAPRIN-1 человека.

Нуклеотидные последовательности и аминокислотные последовательности CAPRIN-1 человека и его гомологов доступны, например, путем доступа в GenBank (NCBI, USA) и с использованием алгоритма BLAST или FASTA (Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5 873-5877,1993; and Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997).

В соответствии с настоящим изобретением, со ссылкой на нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO:1 или 3) или аминокислотную последовательность (SEQ ID NO:2 или 4) CAPRIN-1 человека, мишенью в виде CAPRIN-1 являются нуклеиновые кислоты или белки, состоящие из последовательности, на 70%-100%, предпочтительно на 80%-100%, более предпочтительно на 90%-100%, еще более предпочтительно на 95%-100%, например, на 97%-100%, 98%-100%, 99%-100% или 99,5%-100%, идентичной нуклеотидной последовательности или аминокислотной последовательности ORF или зрелой части эталонной последовательности. В этом контексте термин "% идентичность последовательностей" означает процент (%) числа идентичных аминокислот (или нуклеотидных оснований), от общего числа аминокислот (или нуклеотидных оснований), когда две последовательности выравнивают так, чтобы могла достигаться максимальная степень сходства (или идентичность), с внесением или без внесения пропусков.

В качестве фрагментов каждого белка CAPRIN-1 можно использовать фрагменты, содержащие эпитоп (или антигенную детерминанту), который является наименьшей единицей, распознаваемой антителом, и имеющие длину в диапазоне от длины аминокислотной последовательности эпитопа до менее чем полноразмерного белка. Эпитоп относится к полипептидному фрагменту, имеющему антигенность или иммуногенность у млекопитающих, предпочтительно у человека. Его наименьшая единица состоит приблизительно из 7-12 аминокислот, например, 8-11 аминокислот.

Полипептидные фрагменты, содержащие указанный выше белок CAPRIN-1 человека и его частичные пептиды, могут быть синтезированы в соответствии со способами химического синтеза, Например, способы с использованием Fmoc (флуоренилметилоксикарбонила) и tBoc (трет-бутилоксикарбонила) (Seikagaku Jikken Koza (Biochemical Experimentation Course in English) 1, the Japanese Biochemical Society ed., Protein Chemistry IV, Chemical Modification and Peptide Synthesis, Tokyo Kagaku Dojin Co., Ltd. (Japan), 1981). Также эти полипептиды могут быть синтезированы общепринятыми способами с использованием целого ряда коммерчески доступных устройств для синтеза пептидов. Альтернативно можно получать полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, с использованием генно-инженерных подходов, известных в данной области (Sambrook et al., Molecular Cloning, the 2nd edition, Current Protocols in Molecular Biology (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, the 3rd edition, A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons; и т.д.), и встраивать их в экспрессирующие векторы, которые затем вводят в клетки-хозяева так, чтобы в клетках-хозяевах продуцировались полипептиды. Таким образом, можно получать представляющие интерес белки CAPRIN-1 человека или их полипептидные фрагменты.

Полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, легко могут быть получены с помощью генно-инженерных подходов, известных в данной области, или общепринятых способов с использованием коммерчески доступных устройств для синтеза нуклеиновых кислот. Например, ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность гена CAPRIN-1 человека, можно получать с помощью ПЦР, используя хромосомную ДНК или библиотеку кДНК человека в качестве матрицы и пары праймеров, сконструированных так, чтобы они были способны амплифицировать нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1. Условия реакции для этой ПЦР могут быть определены соответствующим образом. Примеры условий могут включать, но не ограничиваются ими, 30 циклов, каждый из которых включает стадии реакции, состоящие из 94°C в течение 30 секунд (денатурация); 55°C в течение от 30 секунд до 1 минуты (отжиг) и 72°C в течение 2 минут (элонгация) с использованием термостабильной ДНК-полимеразы (например, Taq-полимераза, Pfu-полимераза или т.п.) и Mg²⁺-содержащего буфера для ПЦР, с последующей реакцией при 72°C в течение 7 минут. Подход ПЦР, условия и т.д. описаны, например, в публикации Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, the 3rd edition, A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons (в частности, глава 15).

Также можно получать соответствующие зонды или праймеры на основе информации о нуклеотидных последовательностях гена CAPRIN-1 и аминокислотных последовательностях белков CAPRIN-1 и использовать при скрининге, например, библиотеки кДНК человека, для выделения желаемой ДНК. Предпочтительно такую библиотеку кДНК получают из клеток, органов или тканей, экспрессирующих белки CAPRIN-1. Примеры таких клеток или тканей включают клетки или ткани из семенников или из злокачественных опухолей, или из таких опухолей, как лейкоз, рак молочной железы, лимфома, опухоль головного мозга, рак легких, рак поджелудочной железы и рак ободочной и прямой кишки. Эти действия, включающие получение зондов или праймеров, конструирование библиотеки кДНК, скрининг библиотеки кДНК и клонирование представляющего интерес гена, известны специалистам в данной области, и они могут быть выполнены в соответствии со способами, описанными, например, в публикациях Sambrook et al., Molecular Cloning, the 2nd edition, Current Protocols in Molecular Biology (1989) и Ausubel et al. (ibid.). Из ДНК, полученных таким образом, можно получать ДНК, кодирующие белки CAPRIN-1 человека и их частичные пептиды.

Клетки-хозяева, в которые вводят экспрессирующие векторы, могут представлять собой любую клетку, способную экспрессировать указанные выше полипептиды. Примеры прокариотических клеток включают, но не ограничиваются ими, E. coli. Примеры эукариотических клеток включают, но не ограничиваясь ими: клетки млекопитающих, такие как клетки почки обезьяны COS1 и клетки яичников китайского хомячка CHO; линию клеток эмбриональной почки человека HEK293; линию клеток эмбриональной кожи мыши NIH3T3; клетки дрожжей, такие как почкующиеся дрожжи и клетки делящихся дрожжей; клетки тутового шелкопряда; и яйцеклетки Xenopus.

В случае использования прокариотических клеток в качестве клеток-хозяев, используемые экспрессирующие векторы могут иметь ориджин, который позволяет репликацию в прокариотических клетках, промотор, участок связывания с рибосомой, участок множественного клонирования, терминатор, ген устойчивости к лекарственному средству, ген ауксотрофной комплементарности и т.д. Примеры экспрессирующих векторов для E. coli могут включать серию pUC, pBluescript II, экспрессирующие системы pET и экспрессируюище системы pGEX. ДНК, кодирующую указанные выше полипептиды, можно встраивать в такие экспрессирующие векторы, которыми затем трансформируют прокариотические клетки-хозяева, а затем полученные трансформанты культивируют так, чтобы полипептиды, кодируемые этими ДНК, экспрессировались в прокариотических клетках-хозяевах. При этом, полипептиды могут быть экспрессированы в виде белков, слитых с другими белками.

В случае использования эукариотических клеток в качестве клеток-хозяев, в качестве экспрессирующих векторов могут быть использованы экспрессирующие векторы для эукариотических клеток, имеющие промотор, область сплайсинга, участок добавления поли(А) и т.д. Примеры таких экспрессирующих векторов включают pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV, pRS, pcDNA3 и pYES2. Аналогично тому, как описано выше, ДНК, кодирующие указанные выше полипептиды, можно встраивать в такие экспрессирующие векторы, которыми затем трансформируют эукариотические клетки-хозяева, а затем полученные трансформанты культивируют так, чтобы в эукариотических клетках-хозяевах экспрессировались полипептиды, кодируемые этими ДНК. В случае использования экспрессирующих векторов, таких как pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1 или pEGFP-C1, полипептиды могут быть экспрессированы в виде различных слитых белков, меченных His-меткой (например, (His)₆-(His)₁₀), FLAG-меткой, myc-меткой, HA-меткой, GFP или т.п.

Экспрессирующие векторы можно вводить в клетки-хозяева с использованием хорошо известных способов, таких как электропорация, способ с использованием фосфата кальция, способ с использованием липосом, способ с использованием DEAE декстрана, микроинъекция, инфицирование вирусом, липофекция и связывание с пептидом, проникающим через клеточную мембрану.

Представляющий интерес полипептид может быть выделен из клеток-хозяев и очищен с помощью комбинации способов разделения, известных в данной области. Их примеры включают, но не ограничиваются ими, обработку денатурирующим веществом (например, мочевиной) или поверхностно-активным веществом, обработку ультразвуком, ферментативное расщепление, высаливание, фракционирование растворителем и преципитацию, диализ, центрифугирование, ультрафильтрацию, гель-фильтрацию, SDS-PAGE, изоэлектрофокусирующий электрофорез, ионообменную хроматографию, гидрофобную хроматографию, аффинную хроматографию и обращено-фазовую хроматографию.

Для получения антитела в соответствии с настоящим изобретением антигены, полученные таким образом, можно использовать в качестве сенсибилизирующих антигенов, как описано ниже.

Структура антитела

Антитела (иммуноглобулины) обычно представляют собой гетеромультимерные гликопротеины, каждый из которых содержит по меньшей мере две тяжелые цепи и две легкие цепи. Иммуноглобулины, за исключением IgM, являются гетеротетрамерными гликопротеинами размером приблизительно 150 кДа, каждый из которых содержит две идентичные легкие (L) цепи и две идентичные тяжелые (H) цепи. Обычно, каждая легкая цепь соединена с тяжелой цепью посредством одной ковалентной дисульфидной связи, хотя количество дисульфидных связей между тяжелыми цепями варьирует среди различных изотипов иммуноглобулина. Каждая тяжелая цепь и легкая цепь также имеет внутрицепочечную дисульфидную связь. Каждая тяжелая цепь имеет вариабельный домен (область VH) на одном конце, за которым следует несколько последовательно расположенных константных областей. Каждая легкая цепь имеет вариабельный домен (область VL) на одном конце и имеет одну константную область на другом конце. Константная область легкой цепи соответствует первой константной области тяжелой цепи, в то же время вариабельный домен легкой цепи соответствует вариабельному домену тяжелой цепи. Конкретные области вариабельного домена антитела, которые называются "определяющими комплементарность областями (CDR)", проявляют специфическую вариабельность и придают антителу специфичность связывания. Относительно консервативные участки в вариабельных областях называются "каркасными областями (FR)". Каждый полный вариабельный домен тяжелой цепи и легкой цепи содержит четыре FR, соединенные друг с другом посредством трех CDR. Эти три CDR обозначаются как CDRH1, CDRH2 и CDRH3, соответственно, в указанном порядке от N-конца тяжелой цепи. Аналогично, в легкой цепи CDR обозначаются как CDRL1, CDRL2 и CDRL3. CDRH3 является наиболее важной для специфичности связывания антитела с его антигеном. Кроме того, CDR в каждой цепи удерживаются рядом друг с другом FR областями, и они вносят вклад в образование антигенсвязывающего центра в антителе вместе с CDR на другой цепи. Константные области непосредственно не вносят вклад в связывание антитела с антигеном, однако они проявляют различные эффекторные функции, например, вовлечение в антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC), фагоцитоз, опосредуемый связыванием с Fcγ-рецептором, период полужизни/скорость выведения через неонатальный Fc рецептор (FcRn), и комплементзависимую цитотоксичность (CDC) через компонент C1q в каскаде реакций системы комплемента.

Получение антитела

Антитело против CAPRIN-1 в соответствии с настоящим изобретением означает антитело, обладающее иммунологической реактивностью в отношении полноразмерного белка CAPRIN-1 или его фрагмента.

В этом контексте "иммунологическая реактивность" означает свойство связывания антитела с антигеном CAPRIN-1 (полноразмерный белок CAPRIN-1 или его частичный полипептид) in vivo. Посредством такого связывания антитела по настоящему изобретению с CAPRIN-1 антитело проявляет функцию повреждения (например, гибель, подавление или регрессию) опухолевых клеток. Антитело по настоящему изобретению может повреждать опухоли, такие как рак молочной железы, рак почки, рак поджелудочной железы, рак ободочной и прямой кишки, рак легких, опухоль головного мозга, рак желудка, рак шейки матки, рак яичников, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, рак пищевода, лейкоз, лимфома, фибросаркома, мастоцитома или меланома, в результате связывания с белком CAPRIN-1.

Предпочтительно, антитело по настоящему изобретению конкретно не ограничено, при условии, что антитело представляет собой моноклональное антитело, и его примеры включают синтетические антитела, полиспецифические антитела, антитела человека, гуманизированные антитела, химерные антитела, одноцепочечные антитела и фрагменты антител (например, Fab, F(ab')₂ и Fv). Также антитело представляет собой любой класс молекулы иммуноглобулина, например, IgG, IgE, IgM, IgA, IgD или IgY, или любой подкласс, например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 или IgA2.

Кроме того, антитело может быть модифицировано путем ацетилирования, формилирования, амидирования, фосфорилирования, пегилирования или т.п., а также гликозилирования.

Далее представлены примеры получения различных моноклональных антител.

Например, клеточные линии рака молочной железы SK-BR-3, экспрессирующие CAPRIN-1, вводят каждой мыши для иммунизации. У этих мышей извлекают селезенку. После выделения клеток селезенки клетки подвергают слиянию с клетками миеломы мыши. Из полученных слитых клеток (гибридом) отбирают клоны, продуцирующие антитела, обладающие эффектом ингибирования роста злокачественных клеток. Гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела, обладающие эффектом ингибирования роста злокачественных клеток, выделяют и культивируют. Антитело по настоящему изобретению можно получать путем очистки из культурального супернатанта в соответствии с общим способом аффинной очистки.

Гибридомы, продуцирующие моноклональное антитело, можно получать, например, следующим образом. Сначала животных иммунизируют сенсибилизирующим антигеном способом, известным в данной области. Этот способ иммунизации обычно включает внутрибрюшинную или подкожную инъекцию сенсибилизирующих антигенов млекопитающим. В частности, сенсибилизирующие антигены разбавляют PBS или суспендируют в PBS (фосфатно-буферный солевой раствор), физиологическом растворе или т.п. до получения в результате подходящего количества, а затем смешивают, если желательно, с соответствующим количеством общепринятого адъюванта, например, полного адъюванта Фрейнда. После эмульгирования их вводят каждому млекопитающему несколько раз каждые от 4 до 21 суток. Альтернативно, для иммунизации сенсибилизирующими антигенами можно использовать подходящий носитель.

После подтверждения увеличения уровня желаемого антитела в сыворотке млекопитающего, иммунизированного таким образом, иммуноциты собирают от млекопитающего и подвергают слиянию клеток. Предпочтительные примеры иммуноцитов, в частности, включают клетки селезенки.

В качестве родительских клеток-партнеров, подлежащих слиянию с иммуноцитами, используют клетки миеломы млекопитающих. В качестве клеток миеломы предпочтительно используют различные клеточные линии, известные в данной области, например, P3U1 (P3-X63Ag8U1), P3 (P3×63Ag8.653) (J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550), P3×63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976). 6, 511-519), MPC-11 (Margulies. D.H. et al., Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270), FO (de St. Groth, S.F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194 (Trowbridge, I.S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323), и R210 (Galfre, G. et al., Nature (1979) 277, 131-133).

Слияние клеток между иммуноцитами и клетками миеломы можно проводить в основном в соответствии со способом, известным в данной области, например, способом Kohler и Milstein (Kohler, G. and Milstein, С. Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46).

Более конкретно, слияние клеток проводят, например, в присутствии промотора слияния клеток в общепринятой питательной среде. Например, в качестве промотора слияния используют полиэтиленгликоль (PEG) или японский гемагглютинирующий вирус (HVJ). При желании, для повышения эффективности слияния можно дополнительно добавлять вспомогательное вещество, такое как диметилсульфоксид.

Соотношение между иммуноцитами и используемыми клетками миеломы может быть выбрано произвольно. Например, количество иммуноцитов предпочтительно выбирают так, чтобы оно превышало количество клеток миеломы в 1-10 раз. Примеры среды, которую можно использовать для слияния клеток, включают среду RPMI1640 и среду MEM, которые подходят для роста линий клеток миеломы, а также другие общепринятые среды, используемые для этого типа клеточной культуры. Кроме того, в комбинации с этими средами можно использовать добавку на основе сыворотки, такую как эмбриональная сыворотка теленка (FCS).

Для слияния клеток иммуноциты и клетки миеломы хорошо перемешивают в заранее определенном количестве среды. Обычно к смеси добавляют раствор PEG (средняя молекулярная масса приблизительно от 1000 до 6000), предварительно нагретый приблизительно до 37°C, в концентрации от 30% до 60% (мас./об.), и перемешивают с ним для образования представляющих интерес гибридом. После этого предпочтительно осуществляют повторяющиеся действия, состоящие в последовательном добавлении соответствующей среды и удалении супернатанта центрифугированием для удаления агентов слияния клеток или т.п., которые не являются благоприятными для роста гибридом.

Полученные таким образом гибридомы культивируют в общепринятой селективной среде, например, среде HAT (среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин и тимидин), для селекции. Культивирование в среде HAT продолжают в течение периода времени (как правило, от нескольких суток до нескольких недель), достаточного для гибели клеток (неслитых клеток), отличных от представляющих интерес гибридом. Далее, проводят скрининг гибридом, продуцирующих представляющее интерес антитело, и клонирование в качестве единичных клонов общепринятым способом лимитирующих разведений.

В дополнение к такому получению гибридом путем иммунизации не являющихся человеком животных антигенами, гибридомы, продуцирующие антитела человека, обладающие желаемой активностью (например, активностью ингибирования роста клеток), можно получать путем сенсибилизации лимфоцитов человека, например, инфицированных вирусом EB лимфоцитов человека, белками, экспрессирующими белок клетками или их лизатами in vitro, и слияния сенсибилизированных лимфоцитов с происходящими от человека клетками миеломы, способными постоянно делиться, например, U266 (номер доступа TIB196).

Гибридомы, продуцирующие моноклональное антитело, полученные таким образом, можно субкультивировать в общепринятой среде и также можно хранить в жидком азоте в течение длительного периода времени.

В частности, желаемые антигены или клетки, экспрессирующие желаемые антигены, используют в качестве сенсибилизирующих антигенов при иммунизации в соответствии с общепринятым способом иммунизации. Полученные иммуноциты подвергают слиянию с родительскими клетками, известными в данной области, в соответствии с общепринятым способом слияния клеток. Клетки (гибридомы), продуцирующие моноклональное антитело, можно подвергать скринингу общепринятым способом скрининга с получением гибридом, продуцирующих представляющие интерес моноклональные антитела.

В этом контексте, например, мыши KM (Kirin Pharma Co., Ltd./Medarex) и мыши Xeno (Amgen Inc.) известны в качестве мышей, продуцирующих антитела человека (например, международные публикации №№ WO02/43478 и WO02/092812). Из крови таких мышей, иммунизированных белками CAPRIN-1 или их фрагментами, можно получить полные поликлональные антитела человека. Альтернативно, у мышей, иммунизированных таким образом, можно выделять клетки селезенки и подвергать слиянию с клетками миеломы. Таким образом, можно получать моноклональные антитела человека.

Антигены можно получать, например, способом с использованием клеток животных (публикация патента Японии (Kohyo) № 2007-530068 A (2007)) или способом с использованием бакуловируса (например, международная публикация № WO98/46777). Антигены, обладающие низкой иммуногенностью, могут быть связаны с иммуногенными макромолекулами, такими как альбумин, для иммунизации. Антигены можно вводить с адъювантами для иммунизации.

Альтернативно, антитела по настоящему изобретению можно получать в виде рекомбинантных антител, которые получают с использованием технологии генной инженерии, которая включает: клонирование генов антител из гибридом; встраивание генов антител в соответствующие векторы; и введение векторов в хозяев (см., например, Carl, A.K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990). В частности, кДНК вариабельной области (V-области) антитела синтезируют из мРНК гибридом с использованием обратной транскриптазы. После получения ДНК, кодирующих представляющие интерес V-области, ДНК лигируют с ДНК, кодирующими желаемые константные области антитела (C-области). Полученные в результате продукты лигирования встраивают в экспрессирующие векторы. Альтернативно, ДНК, кодирующие V-область антитела, можно встраивать в экспрессирующие векторы, содержащие ДНК С-области антитела. Эти ДНК встраивают в экспрессирующие векторы таким образом, чтобы они экспрессировались под контролем областей контроля экспрессии, например, энхансера и промотора. Далее, клетки-хозяева можно трансформировать полученными экспрессирующими векторами и давать им возможность экспрессировать антитела.

Антитело против CAPRIN-1 по настоящему изобретению представляет собой моноклональное антитело. Моноклональное антитело включает моноклональные антитела человека, моноклональные антитела не являющихся человеком животных (например, моноклональные антитела мыши, крысы, кролика и курицы), химерные моноклональные антитела и т.п. Моноклональное антитело может быть получено путем культивирования гибридом, полученных слиянием между клетками селезенки от не являющихся человеком животных (например, мышей или мышей, продуцирующих антитела человека, кур и кроликов), иммунизированных белками CAPRIN-1 или их фрагментами, и клетками миеломы. Химерное антитело представляет собой антитело, полученное из комбинации последовательностей, происходящих от различных животных, и представляет собой, например, антитело, состоящее из вариабельных областей тяжелой и легкой цепи антитела мыши и константных областей тяжелой и легкой цепи антитела человека. Химерное антитело можно получать с использованием способа, известного в данной области, который включает, например: лигирование ДНК, кодирующих V-области антитела, с ДНК, кодирующими C-области антитела человека; включение полученных продуктов лигирования в экспрессирующие векторы; и введение векторов в хозяев так, чтобы продуцировались антитела.

Химерные моноклональные антитела человека-мыши, обладающие противоопухолевым эффектом, получают способом, описанным ниже в разделе "Примеры". Эти моноклональные антитела содержат, например, вариабельную область тяжелой цепи (VH), имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, и вариабельную область легкой цепи (VL), имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12. В этих моноклональных антителах VH-область может содержать CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:5, CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:6, и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7, и VL-область может содержать CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:9, CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:10, и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:11.

Гуманизированное антитело, также называемое реконструированным антителом человека, представляет собой антитело, полученное способами инженерии. Гуманизированное антитело конструируют путем пересадки CDR антитела, происходящего от иммунизированного животного, в определяющие комплементарность области антитела человека. Общий подход рекомбинации генов для этого также известен.

В частности, например, последовательность ДНК, сконструированную таким образом, чтобы связать CDR антител мыши и курицы с каркасными областями (FR) антитела человека, синтезируют с помощью ПЦР, используя несколько олигонуклеотидов, полученных таким образом, чтобы они имели концевые части, перекрывающиеся друг с другом. Полученные ДНК лигируют с ДНК, кодирующими константные области антител человека. Затем полученные продукты лигирования встраивают в экспрессирующие векторы, которые затем вводят в хозяев для продукции антител с целью получения представляющего интерес антитела (см. публикацию европейской патентной заявки № EP239400 и международную публикацию № WO96/02576). FR антитела человека, соединенные через CDR, выбирают так, чтобы определяющие комплементарность области образовывали подходящий антигенсвязывающий центр. При необходимости, аминокислоты в каркасных областях вариабельных областей антитела могут быть заменены таким образом, чтобы определяющие комплементарность области полученного реконструированного антитела человека образовывали соответствующий антигенсвязывающий центр (Sato K. et al., Cancer Research 1993, 53: 851-856). Кроме того, эти каркасные области могут быть заменены каркасными областями, происходящими от различных антител человека (см. международную публикацию № WO99/51743).

Каркасные области антитела человека, соединенные через CDR, выбирают так, чтобы определяющие комплементарность области образовывали подходящий антигенсвязывающий центр. При необходимости, аминокислоты в каркасных областях вариабельных областей антитела могут быть заменены таким образом, чтобы определяющие комплементарность области полученного реконструированного антитела человека образовывали соответствующий антигенсвязывающий центр (Sato K. et al., Cancer Research 1993, 53: 851-856).

Аминокислоты в вариабельных областях (например, FR) или константных областях химерного антитела или гуманизированного антитела, полученного таким образом, можно заменять, например, на другие аминокислоты.

Аминокислотная замена представляет собой замену, например, менее 15, менее 10, 8 или менее, 7 или менее, 6 или менее, 5 или менее, 4 или менее, 3 или менее, или 2 или менее аминокислот, предпочтительно от 1 до 5 аминокислот, более предпочтительно 1 или 2 аминокислот. Антитело с заменой должно быть функционально эквивалентным антителу без замены. Замена предпочтительно является консервативной аминокислотной заменой, которая представляет собой замену между аминокислотами, имеющими сходные свойства, такие как заряд, боковые цепи, полярность и ароматичность. С точки зрения сходства свойств аминокислоты могут быть подразделены, например, на: основные аминокислоты (аргинин, лизин и гистидин); кислые аминокислоты (аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота); незаряженные полярные аминокислоты (глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, цистеин и тирозин); неполярные аминокислоты (лейцин, изолейцин, аланин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин); аминокислоты с разветвленной цепью (лейцин, валин и изолейцин); и ароматические аминокислоты (фенилаланин, тирозин, триптофан и гистидин).

Примеры модифицированных антител могут включать антитела, связанные с различными молекулами, такими как полиэтиленгликоль (PEG). В модифицированном антителе по настоящему изобретению вещество, подлежащее связыванию, не ограничено. Для получения такого модифицированного антитела полученное антитело может быть химически модифицированным. Способ для этого уже разработан в

данной области.

В этом контексте выражение "функционально эквивалентный" означает, что рассматриваемое антитело обладает биологической или биохимической активностью, сходной с активностью антитела по настоящему изобретению, в частности, рассматриваемое антитело обладает функцией повреждения опухоли и по существу не вызывает отторжения при применении, например, у человека. Примеры такой активности могут включать активность ингибирования роста клеток и активность связывания.

Способ получения полипептида, функционально эквивалентного определенному полипептиду, который включает внесение мутации в полипептид, хорошо известен специалистам в данной области. Например, специалисты в данной области могут соответствующим образом вносить мутацию в антитело по настоящему изобретению, используя сайт-направленный мутагенез (Hashimoto-Gotoh, T. et al., (1995) Gene 152, 271-275; Zoller, MJ., and Smith, M. (1983) Methods Enzymol. 100, 468-500; Kramer, W. et al., (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456; Kramer, W. and Fritz, HJ., (1987) Methods Enzymol. 154, 350-367; Kunkel, TA., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 488-492; and Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766) или т.п., тем самым получая антитело, функционально эквивалентное антителу по настоящему изобретению.

Антитело, которое распознает эпитоп белка CAPRIN-1, описанный выше, можно получать способом, как правило, известным специалистам в данной области. Например, антитело можно получать способом, который включает определение эпитопа белка CAPRIN-1, распознаваемого антителом против CAPRIN-1, обладающим эффектом ингибирования роста злокачественных клеток, полученным описанным выше общепринятым способом (например, картирование эпитопа), и получение антитела с использованием полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, содержащуюся в эпитопе, в качестве иммуногена, или способом, который включает определение эпитопа антитела, полученного общепринятым способом, и селекцию антитела, которое распознает тот же эпитоп, что и у антитела против CAPRIN-1. В этом контексте "эпитоп" относится к полипептидному фрагменту, обладающему антигенностью или иммуногенностью у млекопитающих, предпочтительно людей. Его наименьшая единица состоит приблизительно из 7-12 аминокислот, предпочтительно 8-11 аминокислот.

Антитело по настоящему изобретению представляет собой антитело, обладающее иммунологической реактивностью в отношении CAPRIN-1, антитело, специфически распознающее CAPRIN-1, или антитело, специфично связывающееся с CAPRIN-1, и оно проявляет цитотоксическую активность или эффект ингибирования роста опухоли в отношении злокачественной опухоли. Антитело предпочтительно имеет структуру, которая дает возможность полностью или почти полностью избежать реакции отторжения у реципиентных животных. Примеры таких антител включают антитела человека, гуманизированные антитела, химерные антитела (например, химерные антитела человека-мыши), одноцепочечные антитела и биспецифические антитела, когда реципиентными животными являются люди. Эти антитела имеют вариабельные области тяжелой и легкой цепей, происходящие от антитела человека, или имеют вариабельные области тяжелой и легкой цепей, состоящие из определяющих комплементарность областей (CDR1, CDR2 и CDR3), происходящих от антитела животного, не являющегося человеком, и каркасных областей, происходящих от антитела человека. Альтернативно, эти антитела представляют собой рекомбинантные антитела, имеющие вариабельные области тяжелой и легкой цепей, происходящие от антитела животного, не являющегося человеком, и константные области тяжелой и легкой цепей, происходящие от антитела человека. Антитело по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой первые два из этих антител.

Такие рекомбинантные антитела могут быть получены следующим образом: ДНК, кодирующие моноклональные антитела (например, моноклональные антитела человека, мыши, крысы, кролика и курицы) против CAPRIN-1 человека, клонируют из антителопродуцирующих клеток, таких как гибридомы, и используют в качестве матриц для получения ДНК, кодирующих вариабельные области легкой и тяжелой цепей антител, способом ОТ-ПЦР или т.п. Соответствующие последовательности вариабельных областей легкой и тяжелой цепей и соответствующие последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 в каждой области определяют с помощью системы нумерации Kabat EU (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)).

ДНК, кодирующую каждую вариабельную область, или ДНК, кодирующую каждую CDR, получают с использованием способов генной инженерии (Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) или устройства для синтеза ДНК. Упомянутые выше гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела человека, можно получать путем иммунизации животных, продуцирующих антитела человека (например, мышей), посредством CAPRIN-1 человека, а затем слияния клеток селезенки, извлеченных у иммунизированных животных, с клетками миеломы. Отдельно, при необходимости, ДНК, кодирующие вариабельные и константные области легкой или тяжелой цепей антитела человека, получают с использованием способов генной инженерии или устройства для синтеза ДНК.

Для гуманизированного антитела, ДНК, кодирующую гуманизированное антитело, можно получать путем получения ДНК, в которых последовательности, кодирующие CDR в ДНК, кодирующих вариабельные области легкой или тяжелой цепей, происходящие от антитела человека, заменены на соответствующие кодирующие последовательности CDR антитела, происходящего от не являющегося человеком животного (например, мыши, крысы, кролика или курицы), и лигирования полученных ДНК с ДНК, кодирующими происходящие от антитела человека константные области легкой или тяжелой цепей, соответственно.

Для химерного антитела, ДНК, кодирующую химерное антитело, можно получать путем лигирования ДНК, кодирующих вариабельные области легкой или тяжелой цепей антитела, происходящего от не являющегося человеком животного (например, мыши, крысы, кролика или курицы), с ДНК, кодирующими константные области, происходящие из легкой или тяжелой цепей антитела человека.

Одноцепочечное антитело означает антитело, в котором вариабельные области тяжелой и легкой цепей линейно связаны друг с другом через линкер. ДНК, кодирующую одноцепочечное антитело, можно получать путем лигирования ДНК, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи, ДНК, кодирующей линкер, и ДНК, кодирующей вариабельную область легкой цепи. В этом контексте вариабельные области как тяжелых, так и легких цепей происходят от антитела человека или происходят от антитела человека, в котором только CDR заменены на CDR антитела, происходящего от не являющегося человеком животного (например, мыши, крысы, кролика или курицы). Линкер состоит из 12-19 аминокислот. Его примеры включают (G₄S)₃ из 15 аминокислот (G.B. Kim et al., Protein Engineering Design and Selection 2007, 20 (9): 425-432).

Биспецифическое антитело (диатело) означает антитело, способное специфически связываться с двумя различными эпитопами. ДНК, кодирующую биспецифическое антитело, можно получать, например, путем лигирования, например, ДНК, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи A, ДНК, кодирующей вариабельную область легкой цепи B, ДНК, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи B, и ДНК, кодирующей вариабельную область легкой цепи A, в указанном порядке, где ДНК, кодирующая вариабельную область легкой цепи B, и ДНК, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи B, лигированы через ДНК, кодирующую линкер, как описано выше. В этом контексте все из вариабельных областей тяжелой и легкой цепей происходят от антитела человека или происходят от антитела человека, в котором только CDR заменены на CDR антитела, происходящего от не являющегося человеком животного (например, мыши, крысы, кролика или курицы).

Полученные таким образом рекомбинантные ДНК можно встраивать в один или несколько подходящих векторов, которые затем вводят в клетки-хозяева (например, клетки млекопитающих, клетки дрожжей и клетки насекомых), и ДНК (ко)экспрессируются, продуцируя рекомбинантные антитела (см. P.J. Delves., ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES., 1997 WILEY, P. Shepherd and C. Dean., Monoclonal Antibodies, 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS; and J.W. Goding., Monoclonal Antibodies: principles and practice., 1993 ACADEMIC PRESS).

Примеры антитела по настоящему изобретению, полученного любым из способов, описанных выше, включают следующее антитело(a), полученное согласно примерам, описанным ниже:

(a) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющие комплементарность области SEQ ID NO:5, 6 и 7, и вариабельную область легкой цепи, содержащую определяющие комплементарность области SEQ ID NO:9, 10 и 11 (например, антитело, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:8 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:12).

В этом контексте аминокислотные последовательности, представленные как SEQ ID NO:5, 6 и 7, соответствуют CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, вариабельной области тяжелой цепи, происходящей от антитела мыши. Аминокислотные последовательности, представленные как SEQ ID NO:9, 10 и 11, соответствуют CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, вариабельной области легкой цепи, происходящей от антитела мыши.

Примеры гуманизированного антитела, химерного антитела, одноцепочечного антитела или биспецифического антитела по настоящему изобретению включают антитела, описанные ниже.

i) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:5, 6 и 7 и аминокислотные последовательности каркасных областей, происходящих от антитела человека, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:9, 10 и 11 и аминокислотные последовательности каркасных областей, происходящих от антитела человека.

(ii) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:5, 6 и 7 и аминокислотные последовательности каркасных областей, происходящих от антитела человека, константную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, происходящую от антитела человека, вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:9, 10 и 11 и аминокислотные последовательности каркасных областей, происходящих от антитела человека, и константную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, происходящую от антитела человека.

(iii) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, константную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, происходящую от антитела человека, вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12, и константную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, происходящую от антитела человека.

Последовательности константных и вариабельных областей тяжелой и легкой цепей антитела человека доступны, например, от NCBI (USA; GenBank, UniGene и т.д.). Например, могут быть приведены следующие последовательности: последовательность с номером доступа № J00228 для константной области тяжелой цепи IgG1 человека; последовательность с номером доступа № J00230 для константной области тяжелой цепи IgG2 человека; последовательность с номером доступа № X03604 для константной области тяжелой цепи IgG3 человека; последовательность с номером доступа № K01316 для константной области тяжелой цепи IgG4 человека; последовательности с номерами доступа №№ V00557, X64135 и X64133 для константной области легкой цепи κ человека; и последовательности с номерами доступа №№ X64132 и X64134 для константной области легкой цепи λ человека.

Предпочтительно, эти антитела обладают цитотоксической активностью и, тем самым, могут проявлять противоопухолевый эффект.

Представленные выше конкретные последовательности вариабельных областей и CDR тяжелой и легкой цепей в упомянутых выше антителах предоставлены только для иллюстративных целей, и очевидно, что антитело по настоящему изобретению не ограничивается конкретными последовательностями. Гибридомы, способные продуцировать антитела человека против CAPRIN-1 человека или антитела не являющегося человеком животного (например, антитела мыши), отличные от антител, конкретно описанных выше, получают, и моноклональные антитела, продуцированные гибридомами, выделяют и определяют, являются ли выделенные антитела представляющими интерес антителами, с использованием иммунологической активности связывания с CAPRIN-1 человека и цитотоксической активности в качестве показателей. Тем самым идентифицируют представляющие интерес гибридомы, продуцирующие моноклональное антитело. Затем из гибридом получают ДНК, кодирующие вариабельные области тяжелой и легкой цепей в представляющих интерес антителах, и секвенируют, как описано выше. ДНК используют для получения различных антител.

Антитело, описанное выше, может представлять собой антитело(a), имеющее замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот, в частности, в последовательности каркасной области и/или последовательности константной области, при условии что антитело обладает такой специфичностью, что оно может специфично распознавать CAPRIN-1. В настоящем описании термин "несколько" предпочтительно означает от 2 до 5, более предпочтительно 2 или 3.

Антитело по настоящему изобретению имеет константу аффинности Ka (k_on/k_off) в отношении белка CAPRIN-1 или его фрагмента предпочтительно по меньшей мере 10⁷ M^-1, по меньшей мере 10⁸ M^-1, по меньшей мере 5×10⁸ M^-1, по меньшей мере 10⁹ M^-1, по меньшей мере 5×10⁹ M^-1, по меньшей мере 10¹⁰ M^-1, по меньшей мере 5×10¹⁰ M^-1, по меньшей мере 10¹¹ M^-1, по меньшей мере 5×10¹¹ M^-1, по меньшей мере 10¹² M^-1 или по меньшей мере 10¹³ M^-1.

Антитело по настоящему изобретению может быть конъюгировано с противоопухолевым средством. Конъюгацию антитела с противоопухолевым средством можно проводить через спейсер, имеющий группу (например, сукцинимидильную группу, формильную группу, 2-пиридилдитиогруппу, малеимидильную группу, алкоксикарбонильную группу или гидроксигруппу), взаимодействующую с аминогруппой, карбоксильной группой, гидроксигруппой, тиольной группой или т.п.

Примеры противоопухолевого средства включают следующие противоопухолевые средства, известные из литературы, и т.д.: паклитаксел, доксорубицин, даунорубицин, циклофосфамид, метотрексат, 5-фторурацил, тиотепа, бусульфан, импросульфан, пипосульфан, бензодопа, карбоквон, метуредопа, уредопа, алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид, триметилоломеламин, буллатацин, буллатацинон, каптотецин, бриостатин, каллистатин, криптофицин 1, криптофицин 8, доластатин, дуокармицин, элеутеробин, панкратистатин, саркодиктин, спонгистатин, хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлоретамин, мехлоретамина оксида гидрохлорид, мелфалан, новэмбихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урацил мустард, кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин, ранимустин, калихеамицин, динемицин, клодронат, эсперамицин, аклациномицин, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицин, кактиномицин, карабицин, карминомицин, карцинофилин, хромомицин, дактиномицин, деторбицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, адриамицин, эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марселломицин, митомицин C, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицин, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин, деноптерин, птероптерин, триметрексат, флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин, анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин, андрогены (например, калустерон, дромостанолона пропионат, эпитиостанол, мепитиостан и тестолактон), аминоглютетимид, митотан, трилостан, фролиновая кислота, ацеглатон, альдофосфамида гликозид, аминолевулиновая кислота, энилурацил, амсакрин, бестрабуцил, бисантрен, эдатраксат, дефофамин, демеколцин, диазиквон, эльфорнитин, эллиптиния ацетат, эпотилон, этоглуцид, лентинан, лонидамин, майтансин, ансамитоцин, митогуазон, митоксантрон, мопиданмол, нитраерин, пентостатин, фенамет, пирарубицин, лозоксантрон, подофиллиновая кислота, 2-этилгидразид, прокарбазин, разоксан, ризоксин, шизофиллан, спирогерманий, тенуазоновая кислота (tenuazonic acid), триазиквон, роридин A, ангуидин, уретан, виндезин, дакарбазин, манномустин, митобронитол, митолактол, пипоброман, гацитозин, доцетаксел, хлорамбуцил, гемцитабин, 6-тиогуанин, меркаптопурин, цисплатин, оксалиплатин, карбоплатин, винбластин, этопозид, ифосфамид, митоксантрон, винкристин, винорелбин, новантрон, тенипозид, эдатрексат, дауномицин, аминоптерин, кселода, ибандронат, иринотекан, ингибитор топоизомеразы, дифторметилорнитин (DMFO), ретиноевая кислота, капецитабин и их фармацевтически приемлемые соли или производные.

Альтернативно, антитело по настоящему изобретению можно вводить в комбинации с противоопухолевым средством для достижения более высокого терапевтического эффекта. Этот подход является адаптируемым для пациента со злокачественной опухолью, экспрессирующей CAPRIN-1, либо до, либо после хирургической операции. Этот подход можно применять, в частности, после хирургической операции для экспрессирующей CAPRIN-1 злокачественной опухоли, которую традиционно лечат противоопухолевым средством отдельно, для обеспечения более высокой профилактики рецидива злокачественной опухоли или продления времени выживания.

Примеры противоопухолевых средств, используемых для комбинированного введения с антителом по настоящему изобретению, включают следующие противоопухолевые средства, известные из литературы, и т.д.: паклитаксел, доксорубицин, даунорубицин, циклофосфамид, метотрексат, 5-фторурацил, тиотепа, бусульфан, импросульфан, пипосульфан, бензодопа, карбоквон, метуредопа, уредопа, алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид, триметилоломеламин, буллатацин, буллатацинон, камптотецин, бриостатин, каллистатин, криптофицин 1, криптофицин 8, доластатин, дуокармицин, элеутеробин, панкратистатин, саркодиктиин, спонгистатин, хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлоретамин, мехлоретамина оксида гидрохлорид, мелфалан, новэмбихин, фенестерин, преднемустин, трофосфамид, урацил мустард, кармустин, хлорзотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин, ранимустин, калихеамицин, динемицин, клодронат, эсперамицин, аклациномицин, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицин, кактиномицин, карабицин, карминомицин, карцинофилин, хромомицин, дактиномицин, деторбицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, адриамицин, эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марселломицин, митомицин C, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицин, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин, деноптерин, птероптерин, триметрексат, флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин, анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин, калустерон, дромостанолона пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон, аминоглутетимид, митотан, трилостан, фролиновая кислота, ацеглатон, альдофосфамида гликозид, аминолевулиновая кислота, энилурацил, амсакрин, бестрабуцил, бисантрен, эдатраксат, дефофамин, демекольцин, диазиквон, эльфорнитин, эллиптиния ацетат, эпотилон, этоглуцид, лентинан, лонидамин, майтансин, ансамитоцин, митогуазон, митоксантрон, мопиданмол, нитраерин, пентостатин, фенамет, пирарубицин, лозоксантрон, подофиллиновая кислота, 2-этилгидразид, прокарбазин, разоксан, ризоксин, шизофиллан, спирогерманий, тенуазоновая кислота, триазиквон, роридин A, ангуидин, уретан, виндезин, дакарбазин, манномустин, митобронитол, митолактол, пипоброман, гацитозин, доцетаксел, хлорамбуцил, гемцитабин, 6-тиогуанин, меркаптопурин, цисплатин, оксалиплатин, карбоплатин, винбластин, этопозид, ифосфамид, митоксантрон, винкристин, винорелбин, новантрон, тенипозид, эдатрексат, дауномицин, аминоптерин, кселода, ибандронат, иринотекан, ингибиторы топоизомеразы, дифторметилорнитин (DMFO), ретиноевая кислота, капецитабин и их фармацевтически приемлемые соли (известные в данной области) и производные (известные в данной области). Среди этих противоопухолевых средств особенно предпочтительно используют циклофосфамид, паклитаксел, доцетаксел или винорелбин.

Антитело по настоящему изобретению может быть связано с радиоактивным изотопом, известным из литературы, и т.д., таким как ²¹¹At, ¹³¹I, ¹²⁵I, ⁹⁰Y, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁵³Sm, ²¹²Bi, ³²P, ¹⁷⁵Lu или ¹⁷⁶Lu. Предпочтительно используют радиоактивный изотоп, эффективный для лечения или диагностики опухоли. Такой радиоактивный изотоп также включен в объем противоопухолевых средств в соответствии с настоящим изобретением.

Противоопухолевый эффект

Считается, что противоопухолевый эффект антитела против CAPRIN-1, подлежащего применению в рамках настоящего изобретения, на экспрессирующих CAPRIN-1 злокачественных клетках, обуславливается следующим механизмом: антителозависимая опосредуемая эффекторными клетками цитотоксичность (ADCC) против злокачественных клеток, экспрессирующих CAPRIN-1, и комплементзависимая цитотоксичность (CDC) против клеток, экспрессирующих CAPRIN-1-. Однако объем настоящего изобретения не ограничивается этим механизмом.

Известно, что противоопухолевый эффект, основанный на этом механизме, коррелирует с количеством антигенсвязывающих молекул-мишеней, экспрессируемых на поверхности злокачественных клеток (Niwa R., Clinical Cancer Research (2005) Mar 15; 11 (6): 2327-2336). Количество молекул-мишеней, экспрессируемых на поверхности злокачественных клеток, можно исследовать с использованием существующего набора для анализа, способного измерять количество молекул на клеточной поверхности. В частности, количество связываемых антителом молекул-мишеней можно определять путем: взаимодействия злокачественных клеток, например, с антителами против молекул-мишеней в качестве первичных антител; взаимодействия с ними флуоресцентно меченных антител против первичных антител, вместе с гранулами для калибровочной кривой с предварительно известным количеством молекул; измерения средней интенсивности флуоресценции в образцах; и определения количества молекул-мишеней на основе полученной калибровочной кривой.

Таким образом, антитело против CAPRIN-1, предназначенное для применения в рамках настоящего изобретения, можно анализировать в отношении его активности путем определения активности ADCC или активности CDC ex vivo против экспрессирующих CAPRIN-1 злокачественных клеток, или путем исследования количества молекул CAPRIN-1, экспрессируемых на поверхности злокачественных клеток, в случае использования антитела против CAPRIN-1 в соответствии с настоящим изобретением в качестве первичного антитела, в частности, как показано ниже в примерах.

Антитело против CAPRIN-1, предназначенное для использования в рамках настоящего изобретения, связывается с белками CAPRIN-1 на злокачественных клетках и проявляет противоопухолевый эффект через свою активность. Таким образом, антитело против CAPRIN-1 по настоящему изобретению считается пригодным для лечения или профилактики злокачественной опухоли. В частности, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли, содержащей антитело против CAPRIN-1 в качестве активного ингредиента. Антитело против CAPRIN-1, предназначенное для использования в целях введения в организм человека (антительная терапия), предпочтительно представляет собой антитело человека или гуманизированное антитело для снижения иммуногенности.

Антитело против CAPRIN-1 с более высокой аффинностью связывания в отношении белка CAPRIN-1 на поверхности злокачественных клеток проявляет более высокую противоопухолевую активность. Таким образом, можно ожидать, что антитело в соответствии с настоящим изобретением будет обладать более высоким противоопухолевым эффектом вследствие высокой аффинности связывания с белком CAPRIN-1, и, таким образом, его можно использовать в виде фармацевтической композиции для применения в целях лечения и/или профилактики злокачественной опухоли. Предпочтительно, антитело в соответствии с настоящим изобретением обладает высокой аффинностью связывания с константой ассоциации (константа аффинности) Ka (k_on/k_off), составляющей предпочтительно по меньшей мере 10⁷ M^-1, по меньшей мере 10⁸ M^-1, по меньшей мере 5×10⁸ M^-1, по меньшей мере 10⁹ M^-1, по меньшей мере 5×10⁹ M^-1, по меньшей мере 10¹⁰ M^-1, по меньшей мере 5×10¹⁰ M^-1, по меньшей мере 10¹¹ M^-1, по меньшей мере 5×10¹¹ M^-1, по меньшей мере 10¹² M^-1 или по меньшей мере 10¹³ M^-1, как описано выше.

Большее количество молекул CAPRIN-1, которые могут связываться с антителами против CAPRIN-1 на поверхности злокачественных клеток, обеспечивает более высокую противоопухолевую активность. Желательно, для обеспечения ожидаемого противоопухолевого эффекта количество молекул CAPRIN-1, с которым связываются антитела, составляет 10⁴ или более, предпочтительно 10⁵ или более молекул CAPRIN-1 на злокачественную клетку при измерении с использованием антитела против CAPRIN-1 по настоящему изобретению. Опухоль (злокачественные клетки), имеющая большое количество молекул CAPRIN-1 на ее клеточной поверхности, является особенно предпочтительной в качестве злокачественной опухоли, предназначенной для введения антитела по настоящему изобретению.

Связывание с экспрессирующими антиген клетками

Способность антитела связываться с CAPRIN-1 можно определять с помощью анализа связывания с использованием, например, ELISA, вестерн-блоттинга, иммунофлуоресценции и проточной цитометрии, как описано в разделе "Примеры".

Иммуногистохимическое окрашивание

Антитело, которое распознает CAPRIN-1, можно исследовать на его реактивность в отношении CAPRIN-1 с помощью иммуногистохимического способа, хорошо известного специалистам в данной области, с использованием замороженного среза ткани, фиксированного параформальдегидом или ацетоном, или заключенного в парафин среза ткани, фиксированного параформальдегидом, полученного от пациента во время хирургической операции или от животного с ксенотрансплантированной тканью, которому была инокулирована клеточная линия, экспрессирующая CAPRIN-1 либо самопроизвольно, либо после трансфекции.

Для иммуногистохимического окрашивания антитело, реактивное в отношении CAPRIN-1, можно окрашивать различными способами. Например, антитело можно визуализировать путем взаимодействия с конъюгированным с пероксидазой хрена антителом козы против антител мыши, антителом козы против антител кролика или антителом козы против антител курицы.

Фармацевтическая композиция и способ лечения и/или профилактики злокачественной опухоли

Мишень фармацевтической композиции для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли по настоящему изобретению конкретно не ограничена, при условии, что этой мишенью является злокачественная опухоль (клетка), экспрессирующая ген CAPRIN-1.

Термины "опухоль" и "злокачественная опухоль", используемые в контексте настоящего изобретения, относятся к злокачественному новообразованию, и их используют взаимозаменяемо.

Злокачественная опухоль, на которую нацелено настоящее изобретение, представляет собой злокачественную опухоль, экспрессирующую ген, кодирующий белок CAPRIN-1, и предпочтительно представляет собой рак молочной железы, рак почки, рак поджелудочной железы, рак ободочной и прямой кишки, рак легких, опухоль головного мозга, рак желудка, рак шейки матки, рак яичников, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, рак пищевода, лейкоз, лимфому, фибросаркому, мастоцитому или меланому.

Конкретные примеры этих злокачественных опухолей включают, но не ограничиваются ими, аденокарциному молочной железы, аденокарциному молочной железы комплексного типа, злокачественную смешанную опухоль молочной железы, внутрипротоковую папиллярную аденокарциному, аденокарциному легких, плоскоклеточный рак, мелкоклеточный рак, крупноклеточный рак, глиому, которая представляет собой опухоль нейроэпителиальной ткани, вентрикулярную эпендимому, нейрональную опухоль, эмбриональную нейроэктодермальную опухоль, неврилеммому, нейрофиброму, менингиому, хронический лимфоцитарный лейкоз, лимфому, желудочно-кишечную лимфому, алиментарную лимфому, лимфому от мелкоклеточного до среднеклеточного типа, рак слепой кишки, рак восходящей толстой кишки, рак нисходящей толстой кишки, рак поперечноободочной толстой кишки, рак сигмовидной толстой кишки, рак прямой кишки, эпителиальный рак яичников, герминогенную опухоль, опухоль стромальных клеток, карциному протоков поджелудочной железы, инвазивную карциному протоков поджелудочной железы, аденокарциному поджелудочной железы, карциному ацинарных клеток, железисто-плоскоклеточную карциному, гигантоклеточную опухоль, внутрипотоковое папиллярно-слизистое новообразование, слизистое кистозное новообразование, панкреатобластому, серозную цистаденокарциному, солидную папиллярную опухоль, гастриному, глюкагоному, инсулиному, множественное эндокринное новообразование типа 1 (синдром Вермера), опухоль нефункциональных островковых клеток, соматостатиному и ВИПому.

Индивидуумом (пациентом) в качестве реципиента предпочтительно являются млекопитающие, например, млекопитающие, включающие приматов, домашних животных, скот и спортивных животных, и особенно предпочтительно люди, собаки и кошки.

При использовании антитела по настоящему изобретению в фармацевтической композиции, фармацевтическая композиция может быть составлена способом, известным специалистам в данной области. Например, фармацевтическую композицию можно использовать в форме парентеральной инъекции асептического раствора или суспензии с водой или любой другой фармацевтически приемлемой жидкостью. Например, фармацевтическую композицию можно составлять с антителом, которое смешивают в единичную дозированную форму, требуемую для общепринятой фармацевтической практики, в комбинации с фармакологически приемлемыми носителями или средами, в частности, стерилизованной водой, физиологическим солевым раствором, растительным маслом, эмульгатором, суспендирующим веществом, поверхностно-активным веществом, стабилизатором, вкусовой добавкой, эксципиентом, носителем, консервантом, связующим веществом и т.д., соответствующим образом. Количество активного ингредиента в таком препарате определяют так, чтобы можно было достигнуть соответствующей дозы в заданном диапазоне.

Асептическую композицию для инъекции можно составлять в соответствии с общей фармацевтической практикой с использованием носителя, такого как дистиллированная вода для инъекций.

Примеры водных растворов для инъекции включают физиологический раствор, изотоничные растворы, содержащие глюкозу и другие адъюванты, такие как D-сорбит, D-манноза, D-маннит и хлорид натрия. Эти растворы можно использовать в комбинации с соответствующим солюбилизатором, например, спиртом (в частности этанолом) или многоатомным спиртом (например, пропиленгликолем и полиэтиленгликолем), или неионным поверхностно-активным веществом, например, полисорбатом 80 (TM) или HCO-60.

Примеры масляных растворов включают растворы, в которых используется кунжутное масло или соевое масло. Растворы можно использовать в комбинации с солюбилизатором, таким как бензилбензоат или бензиловый спирт. Кроме того, в растворы можно добавлять буфер (например, фосфатный буферный раствор или натрий-ацетатный буферный раствор), смягчающее средство (например, прокаина гидрохлорид), стабилизатор (например, бензиловый спирт или фенол) или антиоксидант. Инъецируемыми растворами, полученными таким образом, обычно заполняют подходящие ампулы.

Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению вводят перорально или парентерально, предпочтительно парентерально. Конкретные примеры ее дозированных форм включают инъекции, средства для интраназального введения, средства для транспульмонального введения и средства для чрескожного введения. Примеры инъекций включают внутривенную инъекцию, внутримышечную инъекцию, внутрибрюшинную инъекцию и подкожную инъекцию, посредством которых фармацевтическую композицию можно вводить системно или локально.

Также способ введения можно соответствующим образом выбирать в зависимости от возраста, массы тела, пола, симптомов и т.д. пациента. Дозу фармацевтической композиции, содержащей антитело или полинуклеотид, кодирующий антитело, можно выбирать из диапазона, например, от 0,0001 до 1000 мг/кг массы тела на дозу. Альтернативно, дозу можно выбирать из диапазона, например, от 0,001 до 100000 мг/организм пациента, хотя доза не обязательно ограничивается этими числами. Хотя доза и способ введения варьируют в зависимости от массы тела, возраста, пола, симптомов и т.д. пациента, специалисты в данной области могут соответствующим образом выбирать дозу и способ.

Фармацевтическую композицию, включающую антитело по настоящему изобретению или его фрагменты, можно вводить исследуемому индивидууму для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли, предпочтительно рака молочной железы, рака почки, рака поджелудочной железы, рака ободочной и прямой кишки, рака легких, опухоли головного мозга, рака желудка, рака шейки матки, рака яичников, рака предстательной железы, рака мочевого пузыря, рака пищевода, лейкоза, лимфомы, фибросаркомы, мастоцитомы или меланомы.

Настоящее изобретение дополнительно относится к способу лечения и/или профилактики злокачественной опухоли, включающему введение фармацевтической композиции по настоящему изобретению в комбинации с противоопухолевым средством, как проиллюстрировано выше, или фармацевтической композиции, содержащей противоопухолевое средство, индивидууму. Антитело по настоящему изобретению или его фрагмент можно вводить одновременно с противоопухолевым средством или отдельно от него индивидууму. В случае введения этих фармацевтических композиций по отдельности, любое из них можно вводить первым или последующим. Интервалы между их введением, дозы, пути введения и количество доз могут быть соответствующим образом выбраны специалистом. Другие фармацевтические дозированные формы, подлежащих одновременному введению, также включают, например, фармацевтические композиции, которые составлены путем смешения антитела по настоящему изобретению или его фрагмента, или противоопухолевого средства в фармацевтически приемлемом носителе (или среде). Представленные выше описания о композиции, составе, путях введения, дозах, злокачественной опухоли и т.д. в отношении фармацевтических композиций и дозированных форм, содержащих антитело по настоящему изобретению, также применимы к любой из упомянутых выше фармацевтических композиций и дозированных форм, содержащих противоопухолевое средство.

Таким образом, настоящее изобретение также относится к фармацевтической комбинации для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли, содержащей фармацевтическую композицию по настоящему изобретению и фармацевтическую композицию, содержащую противоопухолевое средство, как проиллюстрировано выше. Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли, содержащей антитело или его фрагмент по настоящему изобретению и противоопухолевое средство вместе с фармакологически приемлемым носителем.

Полипептид и ДНК

Настоящее изобретение дополнительно относится к ДНК, кодирующей антитело по настоящему изобретению, или ее фрагменту (связывающий фрагмент антитела). ДНК может представлять собой ДНК, кодирующую тяжелую и/или легкую цепи антитела, или может представлять собой ДНК, кодирующую вариабельные области тяжелой и/или легкой цепей антитела. ДНК также может представлять собой ДНК, кодирующую каждую из определяющих комплементарность областей антитела или их комбинацию. Такая ДНК включает, например, ДНК, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи, содержащую нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:5, 6 и 7, и ДНК, кодирующую вариабельную область легкой цепи, содержащую нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:9, 10 и 11, в случае упомянутого выше антитела (a).

Определяющие комплементарность области (CDR), кодируемые ДНК, имеющей эти последовательности, служат в качестве областей, которые определяют специфичность антитела. Последовательности, кодирующие другие области (т.е. константные области и каркасные области) антитела, таким образом, могут представлять собой последовательности, происходящие от других антител. В этом контексте "другие антитела" также включают антитела, происходящие от не являющихся человеком организмов, но предпочтительно представляют собой антитела, происходящие от человека, с точки зрения снижения неблагоприятных явлений. В частности, в ДНК по настоящему изобретению области, кодирующие каждую каркасную область и каждую константную область в тяжелой и легкой цепях, предпочтительно содержат нуклеотидные последовательности, кодирующие соответствующие аминокислотные последовательности, происходящие от антител человека.

Следующие примеры ДНК, кодирующей антитело по настоящему изобретению, включают ДНК, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, и ДНК, кодирующую вариабельную область легкой цепи, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12. В этом контексте нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, представляет собой, например, нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:13. Примером нуклеотидных последовательностей, кодирующих аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12, является нуклеотидная последовательность SEQ ID NO:14. Когда такая ДНК содержит области, кодирующие константные области тяжелой и легкой цепей, каждая из областей предпочтительно содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность, происходящую от антитела человека (аминокислотная последовательность каждой константной области тяжелой и легкой цепей).

Эти ДНК антител можно получать, например, способами, описанными выше, или следующим способом. Сначала получают общие РНК из гибридом, продуцирующих антитело по настоящему изобретению, с использованием коммерчески доступного набора для экстракции РНК, и из них синтезируют кДНК с использованием обратной транскриптазы и случайных праймеров или т.п. Затем кДНК, кодирующие антитела, амплифицируют способом ПЦР с использованием олигонуклеотидных праймеров для консервативных последовательностей вариабельных областей в генах тяжелой или легкой цепей известных антител мыши. Последовательности, кодирующие константные области, можно получать путем амплификации способом ПЦР известных последовательностей. Нуклеотидную последовательность ДНК можно встраивать в плазмиду или фаг для секвенирования, например, и определять в соответствии с общепринятым способом.

Настоящее изобретение относится к следующим полипептидам и ДНК, имеющим отношение к упомянутому выше антителу (a):

(i) полипептид, содержащий любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:8 и 12, и ДНК, кодирующая этот полипептид (например, ДНК, содержащая любую из нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO:13 и 14);

(ii) полипептиды CDR тяжелой цепи, выбранные из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, представленных как SEQ ID NO:5, 6 и 7, и ДНК, кодирующая эти полипептиды; и

(iii) полипептиды CDR легкой цепи, выбранные из аминокислотных последовательностей, представленных как SEQ ID NO:9, 10 и 11, и ДНК, кодирующая эти полипептиды.

Эти полипептиды и ДНК можно получать с использованием способов генной инженерии, как описано выше.

Сущность настоящего изобретения

Аспекты настоящего изобретения, описанные выше, обобщенно представлены ниже.

(1) Антитело или его фрагмент, где антитело или его фрагмент обладают иммунологической реактивностью в отношении белка CAPRIN-1 и содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющие комплементарность области SEQ ID NO:5, 6 и 7, и вариабельную область легкой цепи, содержащую определяющие комплементарность области SEQ ID NO:9, 10 и 11.

(2) Антитело или его фрагмент согласно пункту (1), где антитело представляет собой антитело человека, гуманизированное антитело, химерное антитело, одноцепочечное антитело или полиспецифическое антитело.

(3) Антитело или его фрагмент согласно пункту (1) или (2), где антитело или его фрагмент конъюгированы с противоопухолевым средством.

(4) Фармацевтическая композиция для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли, содержащая антитело или его фрагмент согласно любому из пунктов (1)-(3) в качестве активного ингредиента.

(5) Фармацевтическая композиция согласно пункту (4), где злокачественная опухоль представляет собой рак молочной железы, рак почки, рак поджелудочной железы, рак ободочной и прямой кишки, рак легкого, опухоль головного мозга, рак желудка, рак шейки матки, рак яичника, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, рак пищевода, лейкоз, лимфому, фибросаркому, мастоцитому или меланому.

(6) Фармацевтическая комбинация для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли, содержащая фармацевтическую композицию согласно пункту (4) или (5) и фармацевтическую композицию, содержащую противоопухолевое средство.

(7) ДНК, кодирующая антитело или его фрагмент согласно пункту (1) или (2).

(8) Способ лечения и/или профилактики злокачественной опухоли, включающий введение антитела или его фрагмента согласно любому из пунктов (1)-(3), фармацевтической композиции согласно пункту (4) или (5) или фармацевтической комбинации согласно пункту (6) индивидууму.

Примеры

Далее настоящее изобретение описано конкретно с помощью примеров. Однако предполагается, что объем настоящего изобретения не ограничивается этими конкретными примерами.

Пример 1: Анализ экспрессии CAPRIN-1 в каждой ткани

Экспрессию гена CAPRIN-1 в нормальных тканях собаки и человека и различных клеточных линиях исследовали с помощью ОТ-ПЦР в соответствии с примером 1(4) в WO2010/016526. В результате наблюдали высокую экспрессию в семенниках среди здоровых тканей собаки, в то же время экспрессию наблюдали в тканях рака молочной железы и аденокарциномы собаки. Кроме того, в результате исследования экспрессии в тканях человека, экспрессию наблюдали только в яичке среди нормальных тканей, так же как и для гена CAPRIN-1 собаки. Напротив, экспрессия была выявлена во многих типах злокачественных клеточных линий, включая 8 клеточных линий рака молочной железы человека (ZR75-1, MCF7, T47D, SK-BR-3, MDA-MB-157, BT-20, MDA-MB-231V и MRK-nu-1) и 4 клеточных линии рака поджелудочной железы (Capan-2, MIAPaCa-2, Panc-1 и BxPc-3), среди злокачественных клеток. Эти результаты продемонстрировали, что экспрессия CAPRIN-1 не обнаруживается в нормальных тканях, отличных от семенника, в то же время CAPRIN-1 экспрессируется в клеточных линиях рака молочной железы.

Пример 2: Получение моноклонального антитела мыши против CAPRIN-1

100 мкг белка CAPRIN-1 человека (имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2), полученного по примеру 3 WO2010/016526, смешивали с равным количеством адъюванта MPL+TDM (Sigma-Aldrich Corp.). Эту смесь использовали в качестве антигенного раствора для мышей. Антигенный раствор вводили внутрибрюшинно каждой мыши Balb/c в возрасте 6 недель (полученной от Japan SLC Inc.). Затем проводили 7 введений 1 раз в неделю для полного курса иммунизации. Через трое суток после последней иммунизации селезенку каждой мыши извлекали и растирали между двумя стерильными предметными стеклами. Процедуры промывания PBS(-) (производства Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) и центрифугирования при 1500 об/мин. в течение 10 минут для удаления супернатанта повторяли три раза с получением клеток селезенки. Полученные клетки селезенки смешивали с клетками миеломы мыши SP2/0 (приобретенными от ATCC) в соотношении 10:1. Раствор PEG, полученный смешением 200 мкл среды RPMI1640, содержащей 10% FBS, которую нагревали до 37°C, с 800 мкл PEG1500 (производства Boehringer Ingelheim GmbH) добавляли к клеточной смеси, а затем оставляли стоять в течение 5 минут для слияния клеток. После удаления супернатанта путем центрифугирования при 1700 об/мин. в течение 5 минут клетки суспендировали в 150 мл среды RPMI1640, содержащей 15% FBS, дополненной 2% эквивалентом раствора HAT (Gibco) (селективная среда HAT). Эту суспензию высевали в пятнадцать 96-луночных планшетов (Nunc) в количестве 100 мкл/лунку. Клетки селезенки и клетки миеломы подвергали слиянию путем культивирования в течение 7 суток при 37°C, 5% CO₂, с получением гибридом.

Полученные гибридомы подвергали скринингу на аффинность связывания антител, продуцируемых гибридомами, в отношении белка CAPRIN-1, в качестве показателя. 1 мкг/мл раствора белка CAPRIN-1, полученного по примеру 3 WO2010/016526, добавляли в 96-луночный планшет в количестве 100 мкл/лунку и оставляли стоять при 4°C в течение 18 часов. Каждую лунку промывали три раза PBS-T. Затем к нему добавляли 0,5% раствор бычьего сывороточного альбумина (BSA) (производства Sigma-Aldrich Corp.) в количестве 400 мкл/лунку и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 3 часов. Раствор в каждой лунке удаляли и каждую лунку промывали три раза 400 мкл PBS-T. Затем к нему добавляли культуральный супернатант каждой гибридомы, полученной, как описано выше, в количестве 100 мкл/лунку, и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 2 часов. Каждую лунку промывали три раза PBS-T. Затем добавляли меченные HRP антитела против IgG мыши (H+L) (производства Invitrogen Corp.), разбавленные в 5000 раз PBS, в количестве 100 мкл/лунку и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 1 часа. Каждую лукну промывали три раза PBS-T. Затем добавляли раствор субстрата TMB (производства Thermo Fisher Scientific Inc.) в количестве 100 мкл/лунку и оставляли стоять в течение 15-30 минут для обеспечения цветовой реакции. После развития окраски реакцию завершали добавлением 1 н. серной кислоты в количестве 100 мкл/лунку. Поглощение измеряли при 450 нм и 595 нм с использованием абсорбционного спектрометра. В результате было выбрано несколько гибридом, продуцирующих антитела, обладающие высоким поглощением.

Выбранные гибридомы добавляли в 96-луночный планшет в количестве 0,5 клеток/лунку и культивировали в планшете. Через одну неделю наблюдали гибридомы, образующие единичные колонии в лунках. Клетки в этих лунках дополнительно культивировали и клонированные гибридомы подвергали скринингу на аффинность связывания антител, продуцируемых гибридомами, в отношении белка CAPRIN-1, в качестве показателя. 1 мкг/мл раствора белка CAPRIN-1, полученного по примеру 3 WO2010/016526, добавляли в 96-луночный планшет в количестве 100 мкл/лунку и оставляли стоять при 4°C в течение 18 часов. Каждую лунку промывали три раза PBS-T. Затем добавляли 0,5% раствор BSA в количестве 400 мкл/лунку и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 3 часов. Раствор в каждой лунке удаляли и каждую лунку промывали три раза 400 мкл PBS-T. Затем добавляли культуральный супернатант каждой гибридомы, полученной, как описано выше, в количестве 100 мкл/лунку и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 2 часов. Каждую лунку промывали три раза PBS-T. Затем добавляли меченные HRP антитела против IgG мыши (H+L) (производства Invitrogen Corp.), разбавленные в 5000 раз PBS в количестве 100 мкл/лунку и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 1 часа. Каждую лунку промывали три раза PBS-T. Затем добавляли раствор субстрата TMB (производства Thermo Fisher Scientific Inc.) в количестве 100 мкл/лунку и оставляли стоять в течение 15-30 минут для обеспечения цветовой реакции. После развития цвета реакцию завершали добавлением 1 н. серной кислоты в количестве 100 мкл/лунку. Поглощение измеряли при 450 нм и 595 нм с использованием абсорбционного спектрометра. В результате было получено 112 линий гибридом, продуцирующих моноклональные антитела, реактивные в отношении белка CAPRIN-1.

Далее эти моноклональные антитела подвергали скринингу в отношении антител, реактивных в отношении поверхности клеток рака молочной железы, экспрессирующих CAPRIN-1. В частности, 10⁶ клеток клеточной линии рака молочной железы человека MDA-MB-231V центрифугировали в 1,5-мл микроцентрифужной пробирке. Добавляли 100 мкл культурального супернатанта гибридомы, полученной, как описано выше, и оставляли стоять в течение 1 часа на льду. После промывания с помощью PBS добавляли меченные FITC антитела козы против IgG мыши (производства Invitrogen Corp.), разбавленные в 500 раз PBS, содержащего 0,1% FBS, и оставляли стоять в течение 1 часа на льду. После промывания с помощью PBS интенсивность флуоресценции измеряли с использованием FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company). С другой стороны, то же действие, что описано выше, проводили с использованием сыворотки каждой мыши Balb/c в возрасте 6 недель, которой не проводили введение, разбавленной в 500 раз средой для культивирования гибридомы, вместо антител, для получения контроля. В результате было отобрано одно моноклональное антитело (#1), обладающее более высокой интенсивностью флуоресценции, чем у контроля, т.е. реактивное в отношении поверхности клеток рака молочной железы.

Пример 3. Характеризация выбранного моноклонального антитела

Фрагменты амплификации генов, кодирующих вариабельные области моноклональных антител, полученных в примере 2, получали в соответствии со способом, описанным в примере 5 WO2010/016526, и анализировали в отношении их последовательностей генов и аминокислотных последовательностей, кодируемых ими. В результате моноклональное антитело #1 имело вариабельные области, состоящие из вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO:8 и вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO:12. Последовательность гена, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи полученного моноклонального антитела #1, представлена в SEQ ID NO:13, и аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO:8. Последовательность гена, кодирующая вариабельную область легкой цепи полученного моноклонального антитела #1, представлена в SEQ ID NO:14, и аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO:12.

Иными словами, было выявлено, что моноклональное антитело #1 содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:8 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:12, где вариабельная область тяжелой цепи имела CDR1, CDR2 и CDR3, состоящие из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:5, 6 и 7, соответственно, и вариабельная область легкой цепи имела CDR1, CDR2 и CDR3, состоящие из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:9, 10 и 11, соответственно.

Пример 4. Получение химерного моноклонального антитела человека-мыши

Фрагмент амплификации гена, полученный в примере 3, содержащий последовательность (SEQ ID NO:13) вариабельной области тяжелой цепи моноклонального антитела мыши #1, обрабатывали на обоих концах ферментом рестрикции, затем очищали и встраивали в соответствии с общепринятым способом в вектор pcDNA4/myc-His (производства Invitrogen Corp.), уже имеющий генные вставки лидерной последовательности, происходящей от антитела мыши, и константной области H-цепи IgG₁ человека, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:37. Также фрагмент амплификации гена, содержащий последовательность (SEQ ID NO:14) вариабельной области легкой цепи моноклонального антитела мыши #1, обрабатывали на обоих концах ферментом рестрикции, затем очищали и встраивали в соответствии с общепринятым способом в вектор pcDNA3.1/myc-His (производства Invitrogen Corp.), уже имеющий генные вставки лидерной последовательности, происходящей от антитела мыши, и константной области L-цепи IgG₁ человека, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:38.

Далее, рекомбинантный вектор, имеющий вставку вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO:13) моноклонального антитела мыши #1, и рекомбинантный вектор, имеющий вставку вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO:14) моноклонального антитела мыши #1, вводили в клетки CHO-K1 (полученные от Riken Cell Bank). В частности, 2×10⁵ клеток CHO-K1 культивировали в среде Хэма F12 (производства Invitrogen Corp.), содержащей 1 мл 10% FBS на лунку культурального 12-луночного планшета, и промывали PBS(-). Затем добавляли свежую среду Хэма F12, содержащую 1 мл 10% FBS на лунку. 250 нг каждого из векторов в 30 мкл OptiMEM (производства Invitrogen Corp.), смешивали с 30 мкл реагента для трансфекции Polyfect (производства Qiagen N.V.) и эту смесь добавляли в каждую лунку. Клетки CHO-K1, котрансфицированные рекомбинантными векторами, культивировали в среде Хэма F12, содержащей 10% добавку FBS, с 200 мкг/мл зеоцина (производства Invitrogen Corp.) и 200 мкг/мл генетицина (производства Roche Diagnostics K.K.), а затем высевали в 96-луночный планшет в количестве 0,5 клеток/лунку для получения клеточной линии, стабильно продуцирующей химерное моноклональное антитело человека-мыши #1 (#1), имеющее вариабельные области моноклонального антитела мыши #1.

Каждую полученную клеточную линию культивировали в течение 5 суток в 150-см² колбе в количестве 5×10⁵ клеток/мл в 30 мл бессывороточной среды OptiCHO (производства Invitrogen Corp.) с получением культуральных супернатантов, содержащих химерное моноклональное антитело человека-мыши #1.

Также получали клеточные линии, стабильно продуцирующие сравнительные химерные мноклональные антитела человека-мыши 1-11 аналогично тому, как описано выше, соответственно, на основе следующих моноклональных антител мыши против CAPRIN-1, описанных в WO2010/016526, в качестве сравнительных антител: сравнительное антитело 1, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:15 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:16; сравнительное антитело 2, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:17 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:18; сравнительное антитело 3, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:19 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:20; сравнительное антитело 4, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:21 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:22; сравнительное антитело 5, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:23 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:24; сравнительное антитело 6, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:25 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:26; сравнительное антитело 7, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:27 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:28; сравнительное антитело 8, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:29 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:30; сравнительное антитело 9, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:31 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:32; сравнительное антитело 10, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:33 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:34; и сравнительное антитело 11, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:35 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:36. Каждую полученную клеточную линию культивировали в течение 5 суток в 150-см² колбе в количестве 5×10⁵ клеток/мл в 30 мл бессывороточной среды OptiCHO (производства Invitrogen Corp.) с получением культуральных супернатантов, содержащих соответствующие сравнительные химерные антитела человека-мыши 1-11.

Пример 5. Анализ экспрессии CAPRIN-1 на поверхности различных злокачественных клеток с использованием антитела #1 против CAPRIN-1

Далее, клеточные линии рака молочной железы человека (ZR75-1, MCF7, T47D, SK-BR-3, MDA-MB-157, BT-20, MDA-MB-231V и MRK-nu-1), клеточные линии рака почки (Caki-1, Caki-2, A498 и ACHN), клеточную линию рака мочевого пузыря (T24), клеточную линию рака яичников (SKOV3), клеточные линии рака легких (QG56 и A549), клеточные линии рака поджелудочной железы (Capan-2 и MIAPaCa-2), клеточную линию рака предстательной железы (PC3), клеточную линию рака шейки матки (SW756), клеточную линию фибросаркомы (HT1080), клеточные линии опухоли головного мозга (T98G, U87MG, U251, SNB19 и U373), клеточные линии рака желудка (MNK28 и MNK45), клеточные линии рака ободочной и прямой кишки (HT29, Lovo, CaCo2, SW480 и HCT116), клеточную линию лейкоза (AML5) и клеточную линию лимфомы (Ramos), для которых было выявлено, что они обладают экспрессией гена CAPRIN-1, исследовали в отношении их экспрессии белков CAPRIN-1 на клеточной поверхности с использованием культуральных супернатантов, содержащих #1, полученное в примере 2. 5×10⁵ клеток каждой клеточной линии центрифугировали в каждой 1,5-мл микроцентрифужной пробирке. В пробирку добавляли культуральный супернатант (100 мкл), содержащий антитело #1, и оставляли стоять в течение 1 часа на льду. После промывания с помощью PBS добавляли меченные FITC антитела козы против IgG мыши (H+L) (производства Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), разбавленные PBS, содержащим 0,1% FBS, и оставляли стоять при 4°C в течение 30 минут. После промывания с помощью PBS измеряли интенсивность флуоресценции с использованием FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company). Используемый отрицательный контроль представлял собой клетки, реагировавшие только с вторичными антителами. В результате клетки, обработанные антителом #1, обладали интенсивностью флуоресценции, по меньшей мере на 35% превышающей интенсивность флуоресценции отрицательного контроля. Это продемонстрировало, что белки CAPRIN-1 экспрессируются на поверхности клеточной мембраны злокачественных клеточных линий человека. Указанные выше степени усиления интенсивности флуоресценции выражали в виде степеней усиления средней интенсивности флуоресценции (величина MFI) в соответствующих клеточных линиях, которые вычисляли по следующей формуле.

Степень повышения интенсивности флуоресценции (степень усиления интенсивности флуоресценции) (%)=((MFI клеток, прореагировавших с антителами против CAPRIN-1)-(контрольная MFI))/(контрольная MFI)×100.

Пример 6. Противоопухолевый эффект (активность ADCC) антитела против CAPRIN-1 в отношении злокачественных клеток

Химерное моноклональное антитело человека-мыши #1 против CAPRIN-1, полученное в примере 4, исследовали на наличие способности повреждать экспрессирующие CAPRIN-1 злокачественные клетки путем определения активности ADCC. Культуральный супернатант клеточной линии, продуцирующей #1, очищали с использованием Hitrap Protein A Sepharose FF (производства GE Healthcare Bio-Sciences Ltd.). После замены PBS(-) раствор фильтровали через 0,22-мкм фильтр (производства Millipore Corp.). Полученное антитело использовали для анализа активности. 10⁶ клеток каждой из клеточной линии рака молочной железы человека MCF7, клеточной линии рака ободочной и прямой кишки человека HCT-116, клеточной линии рака поджелудочной железы MIAPaCa-2, клеточной линии рака почки человека Caki-2 и клеточной линии рака легких человека QG56, для которых было выявлено, что они обладают активностью в отношении CAPRIN-1, собирали в 50-мл центрифужную пробирку, в которую затем добавляли 100 мкКи хрома 51, а затем инкубировали при 37°C в течение 2 часов. Затем клетки промывали три раза средой RPMI1640, содержащей 10% FBS, и добавляли в количестве 2×10³ клеток/лунку в 96-луночный планшет с V-образным дном для получения клеток-мишеней. Добавляли каждое из очищенного антитела #1 и химерных сравнительных антител человека-мыши 1-11, полученных в примере 4, в количестве 1 мкг/лунку. Клеточную популяцию, содержащую NK-клетки человека, выделенную с использованием общепринятого способа из лимфоцитов периферической крови человека, добавляли в планшет в количестве 2×10⁵ клеток/лунку и культивировали в течение 4 часов при 37°C, 5% CO₂. После культивирования в культуральном супернатанте измеряли количество хрома 51, высвободившегося из поврежденных опухолевых клеток, для вычисления цитотоксической активности каждого антитела против CAPRIN-1 в отношении злокачественных клеток. Используемый отрицательный контроль представлял собой клетки, обработанные изотипическими контрольными антителами. Клеточную популяцию, содержащую NK-клетки человека, которые использовали при этой оценке, получали следующим образом: мононуклеарные клетки периферической крови человека, выделенные из периферической крови в соответствии с общепринятым способом с использованием раствора для разделения по удельной плотности Histopaque для выделения мононуклеарных клеток периферической крови человека (Sigma-Aldrich Corp.), подвергали взаимодействию с меченными флуоресцентным красителем FITC антителами (антитело против CD3 человека, антитело против CD20 человека, антитело против CD19 человека, антитело против CD11c человека и антитело против HLA-DR человека (Becton, and Dickinson and Company)); и клеточную популяцию, содержащую NK-клетки, не окрашенные антителами, выделяли с использованием клеточного сортера (FACS Vantage SE (Becton, and Dickinson and Company)) или клеточную популяцию выделяли с помощью набора для выделения NK-клеток человека (производства Miltenyi Biotec K.K.). В результате оценки цитотоксической активности против злокачественных клеток, использованные изотипические контрольные антитела и сравнительные антитела 1-11 имели цитотоксическую активность менее 5% против всех из клеточной линии рака молочной железы человека MCF7, клеточной линии рака ободочной и прямой кишки HCT-116, клеточной линии рака поджелудочной железы человека MIAPaCa-2, клеточной линии рака почки человека Caki-2 и клеточной линии рака легких человека QG56. Напротив, антитело #1 проявляло цитотоксическую активность, составляющую 26%, 17%, 29%, 23% и 11% в отношении клеточной линии рака молочной железы человека MCF7, клеточной линии рака ободочной и прямой кишки человека HCT-116, клеточной линии рака поджелудочной железы человека MIAPaCa-2, клеточной линии рака почки человека Caki-2 и клеточной линии рака легких человека QG56, соответственно. Аналогично, использованные изотипические контрольные антитела и сравнительные антитела 1-11 обладали цитотоксической активностью менее 4% против всех других злокачественных клеток: клеточных линий рака молочной железы ZR75-1, T47D, Hs578T, BT-20, SK-BR-3, MDA-MB-231V и MRK-nu-1, клеточных линий глиомы T98G и U373, клеточной линии рака легкого A549, клеточных линий рака почки Caki-1 и ACHN, клеточной линии рака шейки матки SW756, клеточной линии рака мочевого пузыря T24, клеточных линий рака желудка MKN28 и MKN45, клеточной линии рака ободочной и прямой кишки SW480, клеточной линии лейкоза AML5 и клеточной линии лимфомы Ramos. Напротив, было выявлено, что антитело #1 обладает 10% или более высокой цитотоксической активностью в отношении этих клеточных линий. Эти результаты показали, что полученное моноклональное антитело #1 против CAPRIN-1 повреждает экспрессирующие CAPRIN-1 злокачественные клетки через его активность ADCC, и было продемонстрировано, что антитело #1 проявляет более высокую цитотоксическую активность в отношении злокачественных клеток человека, чем сравнительные антитела 1-11.

Эти результаты получали путем определения цитотоксической активности посредством, как описано выше, смешения антитела против CAPRIN-1, используемого в настоящем изобретении, лимфоцитов (клеточная популяция, содержащая NK-клетки) и 2×10³ клеток каждой злокачественной клеточной линии с включенным хромом 51; культивирования клеток в течение 4 часов; измерения после культивирования количества хрома 51, высвободившегося в среду; и вычисления цитотоксической активности против каждой злокачественной клеточной линии по следующей формуле*.

*Формула: Цитотоксическая активность (%)=[количество хрома 51, высвободившегося из клеток-мишеней, обработанных антителом против CAPRIN-1 и лимфоцитов (клеточная популяция, содержащая NK-клетки]/[Количество хрома 51, высвободившегося из клеток-мишеней, обработанных 1 н. хлористоводородной кислотой]×100.

Далее, химерное моноклональное антитело человека-мыши #1, полученное в примере 4, оценивали в отношении его противоопухолевого эффекта у мышей, имеющих злокачественную опухоль, in vivo. Используемое антитело #1 очищали на колонке из культурального супернатанта каждой клеточной линии, продуцирующей антитело #1. Аналогично, также оценивали сравнительные химерные моноклональные антитела человека-мыши 1-11 против CAPRIN-1, полученные в примере 4, в отношении их противоопухолевых эффектов на мышей, имеющих злокачественную опухоль, in vivo.

В частности, антитело #1 исследовали в отношении его противоопухолевого эффекта с использованием мышей, имеющих злокачественную опухоль, которым была трансплантирована происходящая от человека экспрессирующая CAPRIN-1 злокачественная клеточная линия. Клетки клеточной линии рака поджелудочной железы человека Capan-2 (приобретенных от ATCC) подкожно трансплантировали в количестве 2×10⁶ клеток на мышь в спину 65 мышей Balb/c nude (производства Japan SLC, Inc.) и выращивали до тех пор, пока размер опухоли не составит приблизительно 5 мм в диаметре. Каждое из антитела #1 и сравнительных химерных антител человека-мыши 1-11 внутрибрюшинно вводили в дозе 200 мкг (200 мкл)/мышь 5 животным (на антитело) из этих мышей, имеющих злокачественную опухоль. Затем каждое антитело внутрибрюшинно вводили мышам, имеющим злокачественную опухоль, в той же дозе, как указано выше, всего три раза в течение 2 суток. Размер опухоли измеряли каждые сутки и оценивали противоопухолевый эффект. С другой стороны, оставшимся 5 мышам, имеющим злокачественную опухоль, которые в свою очередь использовали в качестве контрольной группы, вместо антител вводили PBS(-). Размер опухоли (объем) вычисляли по формуле 0,5×(наибольшая ось × наименьшая ось × наименьшая ось).

В результате оценки противоопухолевого эффекта в исследуемой группе, которой вводили антитело #1 против CAPRIN-1, рост опухоли снижался до 68% на 29 сутки после введения антитела относительно контрольной группы в значениях размера опухоли на ту же дату (определяемого как 100%). Напротив, у мышей, которым вводили сравнительные химерные антитела человека-мыши 1-11, рост опухоли снижался приблизительно до 85%. Эти результаты продемонстрировали, что полученное антитело #1 против CAPRIN-1 проявляет противоопухолевый эффект in vivo на злокачественные клетки, экспрессирующие CAPRIN-1. Эти результаты также продемонстрировали, что антитело #1 проявляет более высокий противоопухолевый эффект in vivo, чем сравнительные антитела 1-11.

Пример 7: Количество молекул CAPRIN-1 на поверхности различных злокачественных клеток, распознаваемых антителом #1 против CAPRIN-1

Клеточные линии рака молочной железы человека (ZR75-1, MCF7, T47D, SK-BR-3, MDA-MB-157, BT-20, MDA-MB-231V и MRK-nu-1), клеточные линии рака почки (Caki-1, Caki-2, A498 и ACHN), клеточную линию рака мочевого пузыря (T24), клеточную линию рака яичников (SKOV3), клеточные линии рака легких (QG56 и A549), клеточные линии рака поджелудочной железы (MIAPaCa-2 и Capan-2), клеточную линию рака предстательной железы (PC3), клеточную линию рака шейки матки (SW756), клеточную линию фибросаркомы (HT1080), клеточные линии опухоли головного мозга (T98G, U87MG, U251, SNB19 и U373), клеточные линии рака желудка (MNK28 и MNK45), клеточные линии рака ободочной и прямой кишки (HT29, Lovo, CaCo2, SW480 и HCT116), клеточную линию лейкоза (AML5) и клеточную линию лимфомы (Ramos) исследовали с использованием набора для анализа количества молекул QIFIKIT (производства Dako Japan Inc.) в отношении количества молекул CAPRIN-1 на их клеточной поверхности, распознаваемых антителом #1 против CAPRIN-1. Аналогично, количество молекул CAPRIN-1 на поверхности этих различных злокачественных клеток также исследовали с использованием сравнительных антител 1-11, которые представляют собой моноклональные антитела против CAPRIN-1, полученные в примере 4.

В соответствии с протоколом, прилагаемым к набору, антитело #1 и сравнительные антитела 1-11) разбавляли PBS до конечной концентрации 5 мкг/мл, и это разведение добавляли к каждой клеточной линии и подвергали реакции в течение 30 минут. После промывания с помощью PBS к каждой клеточной линии добавляли флуоресцентно меченные антитела против IgG мыши, прилагаемые к набору, вместе с калибровочными гранулами, прилагаемыми к набору, и оставляли стоять в течение 45 минут на льду. Каждую клеточную линию и калибровочные гранулы промывали PBS. Затем измеряли интенсивность флуоресценции, используя FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company), с получением средней величины интенсивности флуоресценции (среднее значение). Кроме того, также измеряли интенсивность флуоресценции с использованием сравнительных антител, аналогично тому, как описано выше, для получения среднего значения. Используемый отрицательный контроль представлял собой клетки, подвергнутые взаимодействию с изотипическими контрольными антителами, и также получали среднее значение. Каждую среднюю величину интенсивности флуоресценции (среднее значение) использовали для вычисления количества молекул в соответствии с протоколом, прилагаемым к набору. В результате количество молекул CAPRIN-1 на поверхности различных клеточных линий, распознаваемых антителом #1, составляло 10⁵ или более на клетку для всех исследованных злокачественных клеточных линий человека. С другой стороны, количество молекул, распознаваемых сравнительными моноклональными антителами 1-11, составляло менее 10⁵ на клетку.

Промышленная применимость

Антитело по настоящему изобретению пригодно для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли.

Все публикации, патенты и патентные заявки, цитированные в настоящем описании, включены в настоящее описание путем ссылок в полном объеме.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к антителу или его связывающему фрагменту, где антитело или его связывающий фрагмент специфически связывают белок CAPRIN-1 и обладают иммунологической реактивностью в отношении белка CAPRIN-1, ДНК его кодирующей, а также к фармацевтической композиции для лечения или профилактики злокачественной опухоли, экспрессирующей CAPRIN-1, и к конъюгату, способному специфически связывать белок CAPRIN-1. Также раскрыты способ лечения или профилактики злокачественной опухоли, экспрессирующей CAPRIN-1 с использованием вышеуказанного антитела или его фрагмента, а также к фармацевтическая комбинация для лечения или профилактики злокачественной опухоли, экспрессирующей CAPRIN-1, содержащая вышеуказанную фармацевтическую композицию и фармацевтическую композицию, содержащую противоопухолевое средство. Изобретение позволяет эффективно осуществлять лечение или профилактику злокачественной опухоли, экспрессирующей CAPRIN-1. 6 н. и 2 з.п. ф-лы, 7 пр.

1. Антитело или его связывающий фрагмент, где антитело или его связывающий фрагмент специфически связывают белок CAPRIN-1 и обладают иммунологической реактивностью в отношении белка CAPRIN-1 и содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, CDR2, CDR3, состоящие из SEQ ID NO: 5, 6 и 7 соответственно, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, CDR2, CDR3, состоящие из SEQ ID NO: 9, 10 и 11 соответственно.

2. Антитело или его связывающий фрагмент по п. 1, где антитело представляет собой антитело человека, гуманизированное антитело, химерное антитело, одноцепочечное антитело или полиспецифическое антитело.

3. Конъюгат, способный специфически связывать белок CAPRIN-1, содержащий антитело или его связывающий фрагмент по п. 1 или 2 и противоопухолевое средство.

4. Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики злокачественной опухоли, экспрессирующей CAPRIN-1, содержащая эффективное количество антитела или его связывающего фрагмента по п. 1 или 2, или конъюгата по п. 3 в качестве активного ингредиента для лечения или профилактики указанной злокачественной опухоли.

5. Фармацевтическая композиция по п. 4, где злокачественная опухоль представляет собой рак молочной железы, рак почки, рак поджелудочной железы, рак ободочной и прямой кишки, рак легких, опухоль головного мозга, рак желудка, рак шейки матки, рак яичников, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, рак пищевода, лейкоз, лимфому, фибросаркому, мастоцитому или меланому.

6. Фармацевтическая комбинация для лечения или профилактики злокачественной опухоли, экспрессирующей CAPRIN-1, содержащая фармацевтическую композицию по п. 4 или 5 и фармацевтическую композицию, содержащую противоопухолевое средство.

7. ДНК, кодирующая антитело или его связывающий фрагмент по п. 1 или 2.

8. Способ лечения или профилактики злокачественной опухоли, экспрессирующей CAPRIN-1, включающий введение антитела или связывающего его фрагмента по п. 1 или 2, конъюгата по п. 3, фармацевтической композиции по п. 4 или 5, или фармацевтической комбинации по п. 6 индивидууму.