ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И/ИЛИ ПРОФИЛАКТИКИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОЙ ОПУХОЛИ Российский патент 2017 года по МПК C07K16/30 C07K16/18 C07K16/28 C12N15/13 A61K31/337 A61K39/395 A61P35/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к новому применению антитела против CAPRIN-1 или его фрагмента в лекарственном средстве, таком как терапевтическое и/или профилактическое средство, против злокачественной опухоли.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Злокачественная опухоль является основной причиной смерти. Это заболевание в настоящее время лечат в основном с помощью хирургического вмешательства в комбинации с лучевой терапией или химиотерапией. Несмотря на развитие новых хирургических способов или открытие новых средств против злокачественной опухоли в последнее время, исход существующих способов лечения злокачественных опухолей улучшился в недостаточной мере, за исключением некоторых типов злокачественных опухолей. В результате последних достижений в молекулярной биологии и иммунологии злокачественных опухолей, были идентифицированы антитела, которые специфически взаимодействуют со злокачественными опухолями, антигены злокачественных опухолей, распознаваемые цитотоксическими Т-клетками, гены, кодирующие такие антигены злокачественных опухолей, что увеличило ожидания в отношении специфической терапии злокачественной опухоли, нацеленной на антигены злокачественных опухолей (непатентный документ 1).

Для уменьшения побочных эффектов терапии злокачественной опухоли, желательно, чтобы пептиды, полипептиды или белки, распознаваемые в качестве антигенов злокачественных опухолей, редко встречались в нормальных клетках, но специфически существовали в злокачественных клетках. В 1991 году, Boon et al (Ludwig Institute for Cancer Research, Belgium) выделили антиген меланомы человека MAGE 1, распознаваемый CD8-положительными Т-клетками, способом клонирования кДНК на основе экспрессии, используя линию аутологичных злокачественных клеток и Т-клетки, реактивные в отношении злокачественных опухолей (непатентный документ 2). В дальнейшем был описан способ SEREX (серологическая идентификация антигенов путем рекомбинантного клонирования на основе экспрессии), который основан на подходе клонирования генов на основе экспрессии, для идентификации опухолевых антигенов, распознаваемых антителами, продуцированными в ответ на аутологичную злокачественную опухоль in vivo у пациента со злокачественной опухолью (непатентный документ 3 и патентный документ 1). С помощью этого способа были выделены некоторые антигены злокачественных опухолей, которые редко экспрессируются в нормальных клетках, но специфически экспрессируются в злокачественных клетках (непатентные документы 4-9). Кроме того, проводятся клинические испытания клеточной терапии с использованием иммуноцитов, которые специфически взаимодействуют с антигенами злокачественных опухолей, или иммунотерапии, специфичной в отношении злокачественных опухолей, с использованием вакцин и т.п., содержащих антигены злокачественных опухолей.

В последние годы, во всем мире были выпущены различные лекарственные средства на основе антител для лечения злокачественных опухолей, которые нацелены на антигенные белки на злокачественных клетках. Эти лекарственные средства привлекли внимание вследствие их определенной эффективности в качестве терапевтических средств, специфичных к злокачественной опухоли. Однако большинство антигенных белков, на которые нацелены лекарственные средства, также экспрессируется на нормальных клетках. В результате введения антител повреждаются не только злокачественные клетки, но также и нормальные клетки, экспрессирующие антигены, что является неблагоприятным и приводит к побочным эффектам. Следовательно, можно ожидать, что если бы можно было идентифицировать антигены злокачественной опухоли, которые специфически экспрессируются на поверхности злокачественных клеток, и использовать антитела, нацеленные на такие антигены, в качестве лекарственных средств, тогда эти лекарственные средства на основе антител обеспечивали бы лечение, вызывая меньше побочных эффектов.

Цитоплазматический и ассоциированный с пролиферацией белок 1 (CAPRIN-1) известен в качестве внутриклеточного белка, который экспрессируется при активации или клеточном делении покоящихся клеток и формирует внутриклеточные стрессовые гранулы с внутриклеточными РНК для участия в регуляции транспорта и трансляции мРНК. Было обнаружено, что этот белок специфически экспрессируется на поверхности злокачественных клеток и, таким образом, его исследуют в качестве мишени для лекарственных средств на основе антител для лечения злокачественных опухолей (патентный документ 2).

Список литературы

Патентная литература

Патентный документ 1: Патент США №5698396

Патентный документ 2: WO 2010/016526

Непатентная литература

Непатентный документ 1: Tsuyoshi Akiyoshi, "Japanese Journal of Cancer and Chemotherapy", 1997, Vol. 24, p. 511-519 (Japanese Journal of Cancer and Chemotherapy Publishers Inc., Japan)

Непатентный документ 2: Bruggen P. et al., Science, 254: 1643-1647 (1991)

Непатентный документ 3: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 11810-11813 (1995)

Непатентный документ 4: Int. J. Cancer, 72: 965-971 (1997)

Непатентный документ 5: Cancer Res., 58: 1034-1041 (1998)

Непатентный документ 6: Int. J. Cancer, 29: 652-658 (1998)

Непатентный документ 7: Int. J. Oncol., 14: 703-708 (1999)

Непатентный документ 8: Cancer Res., 56: 4766-4772 (1996)

Непатентный документ 9: Hum. Mol. Genet., 6: 33-39, 1997

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ ТЕХНИЧЕСКАЯ ПРОБЛЕМА

Задачей настоящего изобретения является получение антитела, которое нацелено на CAPRIN-1, специфически экспрессируемый на поверхности злокачественных клеток, и которое имеет улучшенную противоопухолевую активность по сравнению с общепринятыми антителами, и обеспечение применения антитела в качестве терапевтического и/или профилактического средства против злокачественной опухоли.

РЕШЕНИЕ ПРОБЛЕМЫ

Настоящее изобретение имеет следующие аспекты:

Настоящее изобретение относится к антителу или его фрагменту, которое(ый) обладает иммунологической реактивностью в отношении белка CAPRIN-1, причем антитело или его фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотные последовательности, соответствующие SEQ ID NO: 5, 6 и 7, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотные последовательности, соответствующие SEQ ID NO: 9, 10 и 11.

В другом варианте осуществления антитело представляет собой антитело человека, гуманизированное антитело, химерное антитело, одноцепочечное антитело или биспецифическое антитело.

Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли, содержащей антитело или его фрагмент в качестве активного ингредиента.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения злокачественная опухоль представляет собой рак молочной железы, рак почки, рак поджелудочной железы, рак толстого кишечника, рак легких, опухоль головного мозга, рак желудка, рак шейки матки, рак яичников, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, рак пищевода, лейкоз, лимфому, фибросаркому, мастоцитому или меланому.

Настоящее описание охватывает содержание заявки на патент Японии № 2011-171377, на основе которой испрашивается приоритет настоящей заявки.

ПРЕИМУЩЕСТВЕННЫЕ ЭФФЕКТЫ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Антитело против CAPRIN-1, используемое в рамках настоящего изобретения, повреждает злокачественные клетки. Таким образом, антитело против CAPRIN-1 применимо при лечении и/или профилактике злокачественной опухоли.

ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Антитело против полипептида CAPRIN-1, используемое в рамках настоящего изобретения, можно исследовать в отношении его противоопухолевой активности, как описано ниже, путем исследования in vivo ингибирования пролиферации опухоли у животного, имеющего злокачественную опухоль, или путем исследования ex vivo присутствия или отсутствия опосредуемой иммуноцитами или комплементом цитотоксической активности, которую проявляет антитело против опухолевых клеток, экспрессирующих полипептид.

Антитело против CAPRIN-1, используемое в рамках настоящего изобретения, представляет собой моноклональное антитело, специфически связывающееся с белком CAPRIN-1. Такое моноклональные антитело может представлять собой любой тип антитела, которое может проявлять противоопухолевую активность, и включает, например, антитела не являющихся человеком животных (например, моноклональные антитела мыши, крысы, кролика и курицы), рекомбинантные антитела (например, синтетические антитела, полиспецифические антитела, гуманизированные антитела, химерные антитела и одноцепочечные антитела (scFv)), антитела человека и фрагменты этих антител (например, Fab, F(ab')₂ и Fv). Эти антитела и их фрагменты могут быть получены способами, в основном известными специалистам в данной области. Если исследуемым индивидуумом является человек, антитело человека или гуманизированное антитело является предпочтительным для предотвращения или подавления отторжения.

Антитело представляет собой молекулу иммуноглобулина любого класса, например, IgG, IgE, IgM, IgA, IgD или IgY, или любого подкласса, например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 или IgA2.

Кроме того, антитело может быть модифицировано ацетилированием, формилированием, амидированием, фосфорилированием, пегилированием и т.п., в дополнение к гликозилированию.

В этом контексте, выражение "специфически связывающееся с белком CAPRIN-1" означает, что антитело специфически связывается с белком CAPRIN-1 и по существу не связывается с другими белками.

Более того, исследуемым индивидуумом, которому проводят лечение и/или профилактику злокачественной опухоли в соответствии с настоящим изобретением, является млекопитающее, такое как человек, домашнее животное, скот или спортивное животное, предпочтительно человек.

Получение антигенов, получение антител и фармацевтические композиции в соответствии с настоящим изобретением будут рассмотрены ниже.

Получение антигена для получения антител

Белки или их фрагменты, используемые в качестве сенсибилизирующих антигенов для получения антитела против CAPRIN-1, используемого в рамках настоящего изобретения, не ограничиваются типом животного, служащего их источником, включая, например, людей, собак, крупный рогатый скот, лошадей, мышей, крыс или кур. Однако, белки или их фрагменты предпочтительно выбирают, принимая во внимание их совместимость с родительскими клетками, используемыми для слияния клеток. Как правило, предпочтительными являются белки, происходящие из млекопитающих. В частности, предпочтительными являются белки, происходящие из человека. Например, если CAPRIN-1 представляет собой CAPRIN-1 человека, в качестве сенсибилизирующих антигенов можно использовать белки CAPRIN-1 человека, их частичные пептиды или клетки, экспрессирующие CAPRIN-1 человека.

Нуклеотидные последовательности и аминокислотные последовательности CAPRIN-1 человека и его гомологов могут быть получены, например, путем доступа в GenBank (NCBI, USA) и с использованием алгоритма BLAST или FASTA (Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877,1993; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997).

В соответствии с настоящим изобретением, в тех случаях, когда нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 1 или 3) или аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 2 или 4) CAPRIN-1 человека используют в качестве основной последовательности, мишенями являются нуклеиновые кислоты или белки, состоящие из последовательности, на 70%-100%, предпочтительно, на 80%-100%, более предпочтительно, на 90%-100%, и, еще более предпочтительно, на 95%-100%, например, на 97%-100%, 98%-100%, 99%-100% или 99,5%-100%, идентичной нуклеотидной последовательности или аминокислотной последовательности ORF или зрелой части эталонной последовательности. В этом контексте термин "% идентичность последовательностей" означает процент (%) числа идентичных аминокислот (или оснований), от общего числа аминокислот (или оснований), когда две последовательности выравнивают так, чтобы могла достигаться максимальная степень сходства или идентичность, с внесением пропусков или без него.

Фрагменты каждого белка CAPRIN-1 имеют длину в диапазоне от аминокислотной длины эпитопа (или антигенной детерминанты), который является наименьшей единицей, распознаваемой антителом, до менее чем полноразмерной длины этого белка. Эпитоп относится к полипептидному фрагменту, обладающему антигенностью или иммуногенностью у млекопитающих и, предпочтительно, у людей. Его наименьшая единица состоит приблизительно из 7-12 аминокислот, например, 8-11 аминокислот.

Полипептиды, содержащие указанный выше белок CAPRIN-1 человека и его частичные пептиды, могут быть синтезированы в соответствии со способами химического синтеза, такими как способ Fmoc (флуоренилметилоксикарбонил) или способ tBoc (трет-бутилоксикарбонил) (Seikagaku Jikken Koza (Biochemical Experimentation Course in English) 1, the Japanese Biochemical Society ed., Protein Chemistry IV, Chemical Modification and Peptide Synthesis, Tokyo Kagaku Dojin Co., Ltd. (Japan), 1981). Также эти пептиды могут быть синтезированы общепринятыми способами с использованием целого ряда коммерчески доступных устройств для синтеза пептидов. Альтернативно можно получать полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, с использованием подходов генной инженерии, известных в данной области (Sambrook et al., Molecular Cloning, the 2nd edition, Current Protocols in Molecular Biology (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, the 3rd edition, A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons; и т.д.) и встраивать их в экспрессирующие векторы, которые затем вводят в клетки-хозяева, так чтобы клетки-хозяева продуцировали полипептиды. Таким образом, можно получить представляющие интерес полипептиды.

Полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, легко могут быть получены с помощью подходов генной инженерии, известных в данной области, или общих способов с использованием коммерчески доступных устройств для синтеза нуклеиновых кислот. Например, ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность гена CAPRIN-1 человека, можно получать с помощью ПЦР с использованием хромосомной ДНК или библиотеки кДНК человека в качестве матрицы и пары праймеров, сконструированных так, чтобы они были способны амплифицировать нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1. Условия реакции для этой ПЦР могут быть определены соответствующим образом. Примеры условий могут включать, но не ограничиваются ими, 30 циклов, каждый из которых вовлекает стадии реакции, состоящие из: 94°C в течение 30 секунд (денатурация); 55°C в течение от 30 секунд до 1 минуты (отжиг); и 72°C в течение 2 минут (элонгация) с использованием термостабильной ДНК полимеразы (например, Taq-полимераза, Pfu-полимераза) и Mg²⁺-содержащего буфера для ПЦР, с последующей реакцией при 72°C в течение 7 минут. Подход ПЦР, условия и т.д. описаны, например, в Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd edition, A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons (в частности, глава 15).

Также можно получать соответствующие зонды и праймеры на основе информации о нуклеотидных последовательностях гена CAPRIN-1 и аминокислотных последовательностях белка CAPRIN-1 и использовать при скрининге, например, библиотеки кДНК человека, для выделения желаемой ДНК. Предпочтительно такую библиотеку кДНК получают из клеток, органов или тканей, экспрессирующих белок CAPRIN-1. Примеры таких клеток или тканей включают клетки или ткани из семенников или из злокачественных опухолей, или из опухолей, таких как лейкоз, рак молочной железы, лимфома, опухоль головного мозга, рак легких, рак поджелудочной железы и рак толстой кишки. Эти действия, включающие получение зондов или праймеров, конструирование библиотеки кДНК, скрининг библиотеки кДНК и клонирование представляющего интерес гена, известны специалистам в данной области, и они могут быть выполнены в соответствии со способами, описанными, например, в Sambrook et al., Molecular Cloning, 2nd edition, Current Protocols in Molecular Biology (1989) и Ausbel et al. (ibid.). Из ДНК, полученных таким образом, можно получать ДНК, кодирующие белки CAPRIN-1 человека и их частичные пептиды.

Клетки-хозяева могут представлять собой любую клетку, способную экспрессировать указанные выше полипептиды. Примеры прокариотических клеток включают, но не ограничиваются ими, E. coli. Примеры эукариотических клеток включают, но не ограничиваясь ими: клетки млекопитающих, такие как клетки почки обезьяны COS1 и клетки яичников китайского хомячка CHO; линию клеток эмбриональной почки человека HEK293; линию клеток эмбриональной кожи мыши NIH3T3; клетки дрожжей, такие как почкующиеся дрожжи и делящиеся клетки дрожжей; клетки тутового шелкопряда; и яйцеклетки Xenopus.

В тех случаях, когда прокариотические клетки используют в качестве клеток-хозяев, используемый экспрессирующий вектор имеет ориджин, который позволяет репликацию в прокариотических клетках, промотор, участок связывания с рибосомой, участок множественного клонирования, терминатор, ген устойчивости к лекарственному средству, ген ауксотрофной комплементарности и т.п. Примеры экспрессирующих векторов для E. coli могут включать серию pUC, pBluescript II, экспрессирующие системы pET и экспрессирующие системы pGEX. ДНК, кодирующую указанные выше полипептиды, можно встраивать в такие экспрессирующие векторы, которыми затем трансформируют прокариотические клетки-хозяева, а затем полученные трансформанты культивируют так, чтобы полипептиды, кодируемые этими ДНК, экспрессировались в прокариотических клетках-хозяевах. При этом, полипептиды могут быть экспрессированы в качестве белков, слитых с другими белками.

В тех случаях, когда в качестве клеток-хозяев используют эукариотические клетки, в качестве экспрессирующих векторов используют экспрессирующие векторы для эукариотических клеток, имеющие промотор, область сплайсинга, участок добавления поли(А) и т.п. Примеры таких экспрессирующих векторов включают pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV, pRS, pcDNA3 и pYES2. Аналогично тому, как описано выше, ДНК, кодирующую указанные выше полипептиды, можно встраивать в такие экспрессирующие векторы, которыми затем трансформируют эукариотические клетки-хозяева, а затем полученные трансформанты культивируют так, чтобы в эукариотических клетках-хозяевах экспрессировались полипептиды, кодируемые этими ДНК. В тех случаях, когда используют экспрессирующие векторы, такие как pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1 или pEGFP-C1, полипептиды могут быть экспрессированы в качестве различных слитых белков, меченных His-меткой (например, (His)₆-(His)₁₀), FLAG-меткой, myc-меткой, HA-меткой, GFP и т.п.

Экспрессирующие векторы можно вводить в клетки-хозяева с использованием хорошо известных способов, таких как электропорация, способ с использованием фосфата кальция, способ с использованием липосом, способ с использованием DEAE декстрана, микроинъекция, инфицирование вирусом, липофекция и связывание с пептидом, проникающим через клеточную мембрану.

Представляющий интерес полипептид можно выделять и очищать из клеток-хозяев с помощью комбинации способов разделения, известных в данной области. Их примеры включают, но не ограничиваются ими, обработку денатурирующим веществом (например, мочевина) или детергентом, обработку ультразвуком, ферментативное расщепление, высаливание, фракционирование растворителем и преципитацию, диализ, центрифугирование, ультрафильтрацию, гель-фильтрацию, SDS-PAGE, изоэлектрофокусирующий электрофорез, ионообменную хроматографию, гидрофобную хроматографию, аффинную хроматографию и обращено-фазовую хроматографию.

Структура антитела

В основном, антитела представляют собой гетеромультимерные гликопротеины, содержащие по меньшей мере две тяжелые цепи и две легкие цепи. Иммуноглобулины, отличные от IgM, являются гетеротетрамерными гликопротеинами размером приблизительно 150 кДа, каждый из которых содержит две идентичные легкие (L) цепи и две идентичные тяжелые (H) цепи. Обычно, каждая легкая цепь соединена с тяжелой цепью посредством одной ковалентной дисульфидной связи, хотя количество дисульфидных связей между тяжелыми цепями варьирует среди различных изотипов иммуноглобулинов. Каждая тяжелая цепь и легкая цепь также имеет внутрицепочечную дисульфидную связь. Каждая тяжелая цепь имеет вариабельный домен (область VH) на одном конце, за которым следует несколько последовательно расположенных константных областей. Каждая легкая цепь имеет вариабельный домен (область VL) на одном конце и имеет одну константную область на другом конце. Константная область легкой цепи расположена параллельно первой константной области тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи расположен параллельно вариабельному домену тяжелой цепи. Конкретные области вариабельного домена антитела, которые называются "определяющими комплементарность областями (CDR)", демонстрируют специфическую вариабельность и придают антителу специфичность связывания. Относительно консервативные участки в вариабельной области называются "каркасными областями (FR)". Каждый полный вариабельный домен тяжелой цепи и легкой цепи содержит четыре FR, соединенные друг с другом посредством трех CDR. Эти три CDR обозначаются как CDRH1, CDRH2 и CDRH3, соответственно, в указанном порядке от N-конца тяжелой цепи. Аналогично, в легкой цепи CDR обозначаются как CDRL1, CDRL2 и CDRL3. CDRH3 наиболее важна для специфичности связывания антитела с его антигеном. Кроме того, CDR в каждой цепи удерживаются вблизи друг от друга FR областями, и они вносят вклад в формирование антигенсвязывающего центра в антителе вместе с CDR на другой цепи. Константные области непосредственно не вносят вклад в связывание антитела с антигеном, однако они проявляют различные эффекторные функции, например, вовлечение в антителозависимую клеточноопросредованную цитотоксичность (ADCC), фагоцитоз, опосредуемый связыванием с Fcγ-рецептором, период полужизни/скорость выведения через неонатальный Fc рецептор (FcRn), и комплементзависимую цитотоксичность (CDC) через компонент C1q в каскаде реакций системы комплемента.

Получение антитела

Антитело против CAPRIN-1 в соответствии с настоящим изобретением означает антитело, обладающее иммунологической реактивностью в отношении полноразмерного белка CAPRIN-1 или его фрагмента.

В этом контексте "иммунологическая реактивность" означает свойство связывания антитела с антигеном CAPRIN-1 in vivo. Посредством такого связывания антитело проявляет функцию повреждения (например, гибель, подавление или регрессия) опухоли. В частности, тип антитела, используемого в рамках настоящего изобретения, не ограничивается при условии, что антитело может повреждать опухоли, такие как рак молочной железы рак почки, рак поджелудочной железы, рак толстого кишечника, рак легких, опухоль головного мозга, рак желудка, рак шейки матки, рак яичников, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, рак пищевода, лейкоз, лимфома, фибросаркома, мастоцитома или меланома, в результате связывания с белком CAPRIN-1.

Ниже приведены примеры получения различных моноклональных антител.

Например, клеточные линии рака молочной железы SK-BR-3, экспрессирующие CAPRIN-1, вводят каждой мыши для иммунизации. Из такой мыши извлекают селезенку. После выделения клеток селезенки, клетки подвергают слиянию с клетками миеломы мыши. Из полученных слитых клеток (гибридом) выбирают клоны, продуцирующие антитела, обладающие антипролиферативным эффектом на злокачественную опухоль. Гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела, обладающие антипролиферативным эффектом на злокачественные клетки, выделяют и культивируют. Представляющее интерес антитело может быть получено путем очистки из культурального супернатанта обычным способом аффинной очистки.

Гибридомы, продуцирующие моноклональное антитело, можно получать, например, следующим образом: сначала животных иммунизируют сенсибилизирующим антигеном способом, известным в данной области. Этот способ иммунизации обычно вовлекает внутрибрюшинную или подкожную инъекцию сенсибилизирующих антигенов млекопитающим. В частности, сенсибилизирующие антигены разбавляют или суспендируют в PBS (фосфатно-буферный солевой раствор), физиологическом растворе и т.п. до получения в результате подходящего количества, а затем смешивают, если желательно, с соответствующим количеством общепринятого адъюванта, например, полного адъюванта Фрейнда. После эмульгирования полученную эмульсию вводят каждому млекопитающему несколько раз каждые от 4 до 21 суток. Альтернативно для иммунизации сенсибилизирующими антигенами можно использовать подходящий носитель.

После подтверждения увеличения уровня желаемого антитела в сыворотке млекопитающего, иммунизированного таким образом, иммуноциты собирают от млекопитающего и подвергают слиянию клеток. Предпочтительные примеры иммуноцитов, в частности, включают клетки селезенки.

В качестве родительских клеток-партнеров, подлежащих слиянию с иммуноцитами, используют клетки миеломы млекопитающих. В качестве клеток миеломы предпочтительно используют различные клеточные линии, известные в данной области, например, P3U1 (P3-X63Ag8U1), P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550), P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976). 6, 511-519), MPC-11 (Margulies. D. H. et al., Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270), FO (de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194 (Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323), и R210 (Galfre, G. et al., Nature (1979) 277, 131-133).

Слияние клеток между иммуноцитами и клетками миеломы можно проводить в основном в соответствии со способом, известным в данной области, например, способом Kohler и Milstein et al. (Kohler, G. and Milstein, C. Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46).

Более конкретно, слияние клеток проводят, например, в присутствии фактора, стимулирующего слияние клеток, в общепринятой питательной среде. Например, в качестве фактора, стимулирующего слияние клеток, используют полиэтиленгликоль (PEG) и японский гемагглютинирующий вирус (HVJ). При желании, для повышения эффективности слияния можно дополнительно добавлять вспомогательное вещество, такое как диметилсульфоксид.

Соотношение между иммуноцитами и используемыми клетками миеломы может быть выбрано произвольно. Например, количество иммуноцитов предпочтительно выбирают так, чтобы оно превышало количество клеток миеломы в 1-10 раз. Примеры среды, которую можно использовать для слияния клеток, включают среду RPMI1640 и среду МЕМ, пригодные для роста линий клеток миеломы, а также другие общепринятые среды, используемые для этого типа клеточной культуры. Далее, в комбинации с этими средами можно использовать добавку на основе сыворотки, такую как эмбриональная сыворотка теленка (FCS).

Для слияния клеток иммуноциты и клетки миеломы хорошо перемешивают в заранее определенном количестве среды. Обычно к смеси добавляют раствор РЕС (средняя молекулярная масса приблизительно от 1000 до 6000), предварительно нагретый приблизительно до 37°C, в концентрации от 30% до 60% (масс./об.), и перемешивают с ним для формирования представляющих интерес гибридом. После этого осуществляют повторяющиеся действия, состоящие в последовательном добавлении соответствующей среды и удалении супернатанта посредством центрифугирования для удаления агентов слияния клеток и т.п., которые не являются благоприятными для роста гибридом.

Полученные таким образом гибридомы культивируют в общепринятой селективной среде, например, среде HAT (среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин и тимидин) для селекции. Культивирование в среде HAT продолжают в течение периода времени (как правило, от нескольких суток до нескольких недель), достаточного для гибели клеток (неслитых клеток), отличных от представляющих интерес гибридом. Далее, проводят скрининг гибридом, продуцирующих представляющее интерес антитело, и клонирование в качестве единичных клонов общепринятым способом лимитирующих разведений.

В дополнение к такому получению гибридом путем иммунизации не являющихся человеком животных антигенами, гибридомы, продуцирующие антитела человека, обладающие желаемой активностью (например, антипролиферативной активностью в отношении клеток), можно получать путем сенсибилизации лимфоцитов человека, например, инфицированных вирусом EB лимфоцитов человека, белками, экспрессирующими белок клетками или их лизатами in vitro, и слияния сенсибилизированных лимфоцитов с происходящими из человека клетками миеломы, способными постоянно делиться, например, U266 (номер доступа № TIB196).

Гибридомы, продуцирующие моноклональное антитело, полученные таким образом, можно субкультивировать в общепринятой среде и также можно хранить в жидком азоте в течение длительного периода времени.

В частности, желаемые антигены или клетки, экспрессирующие желаемые антигены, используют в качестве сенсибилизирующих антигенов при иммунизации в соответствии с общепринятым способом иммунизации. Полученные иммуноциты подвергают слиянию с родительскими клетками, известными в данной области, в соответствии с общепринятым способом слияния клеток. Клетки (гибридомы), продуцирующие моноклональное антитело, можно подвергать скринингу общепринятым способом скрининга для получения представляющего интерес антитела.

В этом контексте, например, мыши KM (Kirin Pharma Co., Ltd./Medarex) или мыши XenoMouse (Amgen Inc.) известны в качестве мышей, продуцирующих антитела человека (например, международные публикации № WO02/43478 и WO02/092812). Из крови таких мышей, иммунизированных белками CAPRIN-1 или их фрагментами, можно получить полные поликлональные антитела человека. Альтернативно из мышей, иммунизированных таким образом, можно выделять клетки селезенки и подвергать слиянию с клетками миеломы. Таким образом, можно получать моноклональные антитела человека.

Антигены можно получать, например, способом с использованием клеток животных (публикация патента Японии (Kohyo) № 2007-530068) или способом с использованием бакуловируса (например, международная публикация № WO98/46777). Антигены, обладающие низкой иммуногенностью, могут быть связаны с иммуногенными макромолекулами, такими как альбумин, для иммунизации.

Альтернативно можно использовать рекомбинантные антитела, получаемые с использованием способа рекомбинации генов, который вовлекает клонирование генов антител из гибридом; встраивание генов антител в соответствующие векторы; и введение векторов в хозяев (см., например, Carl, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990). В частности, кДНК вариабельной области (V-область) антитела синтезируют из мРНК гибридом с использованием обратной транскриптазы. После получения ДНК, кодирующей представляющие интерес V-области, ДНК лигируют с ДНК, кодирующей желаемые константные области антитела (C-области). Полученные в результате продукты лигирования встраивают в экспрессирующие векторы. Альтернативно, ДНК, кодирующие V-область антитела, можно встраивать в экспрессирующие векторы, содержащие ДНК С-области антитела. Эти ДНК встраивают в экспрессирующие векторы таким образом, чтобы они экспрессировались под контролем областей контроля экспрессии, например, энхансера или промотора. Далее, клетки-хозяева можно трансформировать полученными экспрессирующими векторами и позволять им экспрессировать антитела.

Как описано выше, антитело против CAPRIN-1 по настоящему изобретению представляет собой любое из различных моноклональных антител, включающих моноклональные антитела не являющегося человеком животного, моноклональные антитела человека и рекомбинантные антитела.

Эти моноклональные антитела не являющихся человеком животных или человека можно получать культивированием гибридом, полученных слиянием между клетками селезенки не являющихся человеком животных (например, мышей, мышей, продуцирующих антитела человека, кур или кроликов), иммунизированных белками CAPRIN-1, и клетками миеломы.

Рекомбинантное антитело включает, как описано выше, химерные антитела, гуманизированные антитела, одноцепочечные антитела, полиспецифические антитела и т.п.

Химерное антитело можно получать путем: лигирования ДНК, кодирующих вариабельные области легкой или тяжелой цепи антитела, происходящего из не являющегося человеком животного (например, мыши, крысы, кролика или курицы), с ДНК, кодирующими константные области легкой или тяжелой цепи, происходящие из антитела человека; встраивания полученных слитых генов в экспрессирующие векторы; и введения векторов в хозяев, так чтобы продуцировались антитела.

В частности, химерное антитело представляет собой, например, антитело, состоящее из вариабельных областей тяжелых и легких цепей антител мыши и константных областей тяжелой и легкой цепей антител человека. Химерное антитело можно получать с использованием способа, известного в данной области, который вовлекает, например: лигирование ДНК, кодирующих V-области антитела мыши, с ДНК, кодирующими C-области антитела человека; встраивание полученных продуктов лигирования в экспрессирующие векторы; и введение векторов в хозяев, так чтобы продуцировались антитела. В описанных ниже примерах получали химерные антитела человека-мыши и было подтверждено, что они обладают противоопухолевым эффектом. Эти моноклональные антитела содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH), имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и вариабельную область легкой цепи (VL), имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, где VH-область содержит CDR1, соответствующую аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5, CDR2, соответствующую аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6, и CDR3, соответствующую аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7, и VL-область содержит CDR1, соответствующую аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9, CDR2, соответствующую аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, и CDR3, соответствующую аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11.

Гуманизированное антитело, также называемое реконструированным антителом человека, представляет собой антитело, полученное способами инженерии. Гуманизированное антитело конструируют путем пересадки в CDR антитела человека CDR, соответствующих антителу, происходящему из иммунизированного животного. В частности, получают ДНК, в которых кодирующие последовательности CDR в ДНК, кодирующих происходящую из антитела человека вариабельную область легкой или тяжелой цепи, заменены на соответствующие кодирующие последовательности CDR антитела, происходящего из не являющегося человеком животного (например, мыши, крысы, кролика или курицы), и лигируют их с ДНК, кодирующими константные области легкой или тяжелой цепи, происходящие из антитела человека. Полученные слитые гены можно включать в экспрессирующие векторы, которые затем вводят в хозяев для продукции антител с целью получения представляющего интерес гуманизированного антитела.

В частности, например, последовательность ДНК, сконструированную таким образом, чтобы связать CDR антител мыши и курицы с каркасными областями (FR) антитела человека, синтезируют с помощью ПЦР с использованием нескольких олигонуклеотидов, полученных таким образом, чтобы они имели концевые части, перекрывающиеся друг с другом. Полученные ДНК лигируют с ДНК, кодирующими константные области антител человека. Затем полученные продукты лигирования встраивают в экспрессирующие векторы, которые затем вводят в хозяев для продукции антител с целью получения представляющего интерес антитела (см. публикацию патентной заявки Европы № EP239400 и международную публикацию № WO96/02576). FR антитела человека, соединенные через CDR, выбирают так, чтобы CDR образовывали подходящий антигенсвязывающий центр. При необходимости, аминокислоты в каркасных областях вариабельных областей антитела могут быть заменены таким образом, чтобы CDR в полученном в реконструированном антителе человека образовывали соответствующий антигенсвязывающий центр (Sato K. et al., Cancer Research 1993, 53: 851-856). Кроме того, эти каркасные области могут быть заменены каркасными областями, происходящими из различных антител человека (см. международную публикацию № WO99/51743).

Каркасные области антитела человека, соединенные через CDR, выбирают так, чтобы CDR образовывали подходящий антигенсвязывающий центр. При необходимости, аминокислоты в каркасных областях вариабельных областей антитела могут быть заменены таким образом, чтобы CDR полученного реконструированного антитела человека образовывали соответствующие антигенсвязывающие центры (Sato K. et al., Cancer Research 1993, 53: 851-856).

Одноцепочечное антитело относится к антителу или его фрагменту, содержащим вариабельные области тяжелой и легкой цепей, линейно связанные друг с другом через линкер. ДНК, кодирующую одноцепочечное антитело, можно получать путем лигирования ДНК, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи, ДНК, кодирующей линкер, и ДНК, кодирующей вариабельную область легкой цепи. В этом контексте вариабельные области как тяжелых, так и легких цепей происходят из антитела человека или происходят из антитела человека, в котором только CDR заменены на CDR антитела, происходящего из не являющегося человеком животного (например, мыши, крысы, кролика или курицы). Линкер состоит из 12-19 аминокислот. Его примеры включают (G₄S)₃ из 15 аминокислот (G.-B. Kim et al., Protein Engineering Design and Selection 2007, 20 (9): 425-432).

Полиспецифическое антитело относится к антителу, способному специфически связываться с множеством различных эпитопов. Например, биспецифическое антитело (диантитело) способно специфически связываться с двумя различными эпитопами. ДНК, кодирующую биспецифическое антитело, можно получать путем лигирования, например, ДНК, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи A, ДНК, кодирующей вариабельную область легкой цепи B, ДНК, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи B, и ДНК, кодирующей вариабельную область легкой цепи A, в указанном порядке (при условии, что ДНК, кодирующая вариабельную область легкой цепи B, и ДНК, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи B, лигированы через ДНК, кодирующую линкер, как описано выше). В этом контексте, все из вариабельных областей тяжелой и легкой цепей происходят из антитела человека или происходят из антитела человека, в котором только CDR заменены на CDR антитела, происходящего из не являющегося человеком животного (например, мыши, крысы, кролика или курицы).

Аминокислоты в вариабельных областях (например, FR) или константных областях химерного антитела или гуманизированного антитела, полученного таким образом, можно заменять на другие аминокислоты.

Аминокислотная замена представляет собой замену, например, менее 15, менее 10, 8 или менее, 7 или менее, 6 или менее, 5 или менее, 4 или менее, 3 или менее, или 2 или менее аминокислот, предпочтительно, от 1 до 5 аминокислот, и более предпочтительно, 1 или 2 аминокислот. Антитело с заменой должно быть функционально эквивалентным антителу без замены. Замена предпочтительно представляет собой консервативную аминокислотную замену, которая представляет собой замену между аминокислотами, имеющими сходные свойства, такие как заряд, боковые цепи, полярность и ароматичность. С точки зрения сходства свойств аминокислоты могут быть подразделены, например, на: основные аминокислоты (аргинин, лизин и гистидин); кислые аминокислоты (аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота); незаряженные полярные аминокислоты (глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, цистеин и тирозин); неполярные аминокислоты (лейцин, изолейцин, аланин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин); аминокислоты с разветвленной цепью (лейцин, валин, изолейцин); и ароматические аминокислоты (фенилаланин, тирозин, триптофан и гистидин).

Примеры модифицированных антител могут включать антитела, связанные с различными молекулами, такими как полиэтиленгликоль (PEG). В модифицированном антителе по настоящему изобретению вещество, подлежащее присоединению, не ограничено. Для получения такого модифицированного антитела, полученное антитело может быть химически модифицированным. Способ для этого уже разработан в данной области.

В этом контексте, выражение "функционально эквивалентный" означает, что рассматриваемое антитело обладает биологической или биохимической активностью, сходной с активностью антитела по настоящему изобретению, в частности, рассматриваемое антитело обладает функцией повреждения опухоли и по существу не вызывает отторжения при применении, например, у человека. Примеры такой активности могут включать антипролиферативную активность и активность связывания.

Способ получения полипептида, функционально эквивалентного определенному полипептиду, который вовлекает внесение мутации в полипептид, хорошо известен специалистам в данной области. Например, специалисты в данной области могут соответствующим образом вносить мутацию в антитело по настоящему изобретению с использованием сайт-направленного мутагенеза (Hashimoto-Gotoh, T. et al., (1995) Gene 152, 271-275; Zoller, MJ., и Smith, M. (1983) Methods Enzymol. 100, 468-500; Kramer, W. et al., (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456; Kramer, W. и Fritz, HJ., (1987) Methods Enzymol. 154, 350-367; Kunkel, TA., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 488-492; и Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766) и т.п., тем самым получая антитело, функционально эквивалентное антителу по настоящему изобретению.

Антитело, которое распознает эпитоп белка CAPRIN-1, распознаваемый каждым антителом против CAPRIN-1, описанным выше, можно получать способом, в основном известным специалистам в данной области. Например, антитело можно получать способом, который вовлекает определение эпитопа белка CAPRIN-1, распознаваемого антителом против CAPRIN-1, общепринятым способом (например, картирование эпитопа), и получение антитела с использованием полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, содержащуюся в эпитопе, в качестве иммуногена, или способа, который вовлекает определение эпитопа антитела, полученного общепринятым способом, и селекцию антитела, которое распознает тот же эпитоп, что и у антитела против CAPRIN-1.

Антитело по настоящему изобретению имеет константу аффинности Ka (k_on/k_off) предпочтительно по меньшей мере 10⁷ M^-1, по меньшей мере 10⁸ M^-1, по меньшей мере 5×10⁸ M^-1, по меньшей мере 10⁹ M^-1, по меньшей мере 5×10⁹ M-1, по меньшей мере 10¹⁰ M^-1, по меньшей мере 5×10¹⁰ M^-1, по меньшей мере 10¹¹ M^-1, по меньшей мере 5×10¹¹ M^-1, по меньшей мере 10¹² M-1, или по меньшей мере 10¹³ M^-1.

Антитело по настоящему изобретению может быть конъюгировано с противоопухолевым средством. Конъюгацию антитела с противоопухолевым средством можно проводить через спейсер, имеющий группу (например, сукцинимидильную группу, формильную группу, 2-пиридилдитиогруппу, малеимидильную группу, алкоксикарбонильную группу или гидроксигруппу), взаимодействующую с аминогруппой, карбоксильной группой, гидроксигруппой, тиольной группой и т.п.

Примеры противоопухолевого средства включают следующие противоопухолевые средства, общеизвестные из литературы, и т.д.: паклитаксел, доксорубицин, даунорубицин, циклофосфамид, метотрексат, 5-фторурацил, тиотепа, бусульфан, импросульфан, пипосульфан, бензодопа, карбоквон, метуредопа, уредопа, алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид, триметилолмеламин, буллатацин, буллатицинон, каптотецин, бриостатин, каллистатин, криптофицин 1, криптофицин 8, доластатин, дуокармицин, элеутеробин, панкратистатин, саркодиктин, спонгистатин, хлорамбуцил, хлорнафазин, хлорфосфамид, эстрамустин, ифосфамид, меклоретамин, меклоретамин оксид гидрохлорид, мелфалан, новембицин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урацил мустард, кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин, ранимустин, калихеамицин, динемицин, клодронат, эсперамицин, аклациномицин, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицин, кактиномицин, карабицин, карминомицин, карзинофилин, хромомицин, дактиномицин, деторбицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, адриамицин, эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марселломицин, митомицин C, микофеноловую кислоту, ногаламицин, оливомицин, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин, деноптерин, птероптерин, триметрексат, флударабин, 6-меркаптопурин, триамиприн, тиогуанин, анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидеоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин, андрогены (например калустерон, дромостанолон пропионат, эпитиостанол, мепитиостан и тестолактон), аминоглютетимид, митотан, трилостан, фролиновая кислота, ацеглатон, альдофосфамид гликозид, аминолевулиновая кислота, енилурацил, амсакрин, бестрабуцил, бисантрен, эдатраксат, дефофамин, демеколцин, диазиквон, элфорнитин, эллиптиум ацетат, эпотилон, этоглюцин, лентинан, лонидамин, маитансин, ансамитоцин, митогуазон, митоксантрон, мопиданмол, нитраерин, пентостатин, фенамет, пирарубицин, лозоксантрон, подофиллиновая кислота, 2-этилгидразид, прокарбазин, разоксан, ризоксин, шизофиллан, спирогерманий, тенуазониевую кислоту, триазиквон, роридин A, ангуидин, уретан, виндезин, дакарбазин, манномустин, митобронитол, митолактол, пипоброман, гацитозин, доцетаксел, хлорамбуцил, гемцитабин, 6-тиогуанин, меркаптопурин, цисплатин, оксалиплатин, карбоплатин, винбластин, этопозид, ифосфамид, митоксантрон, винкристин, винорелбин, новантрон, тенипозид, эдатрексат, дауномицин, аминоптерин, кселода, ибандронат, иринотекан, ингибитор топоизомеразы, дифторметилорнитин (DMFO), ретиноевую кислоту, капецитабин и их фармацевтически приемлемые соли или производные.

Альтернативно антитело по настоящему изобретению можно вводить в комбинации с противоопухолевым средством для достижения более высокого терапевтического эффекта. Этот подход является адаптируемым для пациента со злокачественной опухолью, экспрессирующей CAPRIN-1, либо до, либо после хирургической операции. Этот подход можно применять, в частности, после хирургической операции для экспрессирующей CAPRIN-1 злокачественной опухоли, которую традиционно лечат противоопухолевым средством отдельно, для обеспечения более высокой профилактики рецидива злокачественной опухоли и продления времени выживания.

Примеры противоопухолевых средств, используемых для комбинированного введения с антителом по настоящему изобретению, включают следующие противоопухолевые средства, общеизвестные из литературы, и т.д.: паклитаксел, доксорубицин, даунорубицин, циклофосфамид, метотрексат, 5-фторурацил, тиотепа, бусульфан, импросульфан, пипосульфан, бензодопа, карбоквон, метуредопа, уредопа, алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид, триметилолмеламин, буллатацин, буллатацинон, камптотецин, бриостатин, каллистатин, криптофицин 1, криптофицин 8, доластатин, дуокармицин, элеутеробин, панкриастатин, саркодиктиин, спонгистатин, хлорамбуцил, хлолрнафазин, хлорфосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, мехлорэтамин оксид гидрохлорид, мелфалан, новэмбихин, фенестерин, преднемустин, трофосфамид, урацил мустард, кармустин, хлорзотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин, ранимустин, калихеамицин, динемицин, клодронат, эсперамицин, аклациномицин, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицин, сактиномицин, карабицин, карминомицин, карцинофилин, хромомицин, дактиномицин, деторбицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, адриамицин, эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марселломицин, митомицин C, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицин, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин, деноптерин, птероптерин, триметрексат, флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин, анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин, калустерон, дромостанолон пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон, аминоглутетимид, митотан, трилостан, фролиновая кислота, ацеглатон, альдофосфамид гликозид, аминолевулиновая кислота, энилурацил, амсакрин, бестрабуцил, бисантрен, эдатраксат, дефофамин, демекольцин, диазиквон, эльфорнитин, эллиптиний ацетат, эпотилон, этоглуцид, лентинан, лонидамин, майтанзин, ансамитоцин, митогуазон, митоксантрон, мопиданмол, нитраэрин, пентостатин, фенамет, пирарубицин, лозоксантрон, подофиллиновая кислота, 2-этилгидразид, прокарбазин, разоксан, ризоксин, шизофиллан, спирогерманий, тенуазоновая кислота, триазиквон, роридин A, ангвидин, уретан, виндезин, дакарбазин, манномустин, митобронитол, митолактол, пипоброман, гацитозин, доцетаксел, хлорамбуцил, гемцитабин, 6-тиогуанин, меркаптопурин, цисплатин, оксалиплатин, карбоплатин, винбластин, этопозид, ифосфамид, митоксантрон, винкристин, винорелбин, новантрон, тенипозид, эдатрексат, дауномицин, аминоптерин, кселода, ибандронат, иринотекан, ингибиторы топоизомеразы, дифторметилорнитин (DMFO), ретиноевая кислота, капецитабин и их фармацевтически приемлемые соли (известные в данной области) и производные (известные в данной области). Среди этих противоопухолевых средств особенно предпочтительно используют циклофосфамид, паклитаксел, доцетаксел или винорелбин.

Альтернативно, антитело по настоящему изобретению может быть связано с радиоактивным изотопом, общеизвестным из литературы, и т.д., таким как ²¹¹At, ¹³¹I, ¹²⁵I, ⁹⁰Y, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁵³Sm, ²¹²Bi, ³²P, ¹⁷⁵Lu, или ¹⁷⁶Lu. Желательно использовать радиоактивные изотопы, эффективные для лечения или диагностики опухоли.

Антитело по настоящему изобретению представляет собой антитело, обладающее иммунологической реактивностью в отношении CAPRIN-1, антитело, специфически распознающее CAPRIN-1, или антитело, специфично связывающееся с CAPRIN-1, и оно проявляет цитотоксическую активность или антипролиферативный эффект в отношении злокачественной опухоли. Антитело предпочтительно должно иметь структуру, которая дает возможность полностью или почти полностью избежать реакции отторжения у реципиентных животных. Примеры таких антител включают антитела человека, гуманизированные антитела, химерные антитела (например, химерные антитела человека-мыши), одноцепочечные антитела и биспецифические антитела, когда реципиентными животными являются люди. Эти антитела (1) имеют вариабельные области тяжелой и легкой цепей, происходящие из антитела человека, (2) имеют вариабельные области с CDR (CDR1, CDR2 и CDR3) тяжелой и легкой цепей, происходящими из антитела не являющегося человеком животного, и каркасные области, происходящие из антитела человека, или (3) эти антитела представляют собой рекомбинантные антитела, имеющие вариабельные области тяжелой и легкой цепей, происходящие из антитела не являющегося человеком животного, и константные области тяжелой и легкой цепей, происходящие из антитела человека. Антитело по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой антитело (1) или (2).

Такие рекомбинантные антитела можно получать следующим образом: ДНК, кодирующие моноклональные антитела (например, моноклональные антитела человека, мыши, крысы, кролика и курицы) против CAPRIN-1 человека, клонируют из антителопродуцирующих клеток, таких как гибридомы, и используют в качестве матриц в ОТ-ПЦР и т.п. для получения ДНК, кодирующей вариабельные области легкой и тяжелой цепей в антителе. Соответствующие последовательности вариабельных областей легкой и тяжелой цепей и соответствующие последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 в каждой области определяют с помощью системы нумерации Kabat EU (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)).

Такую ДНК, кодирующую каждую вариабельную область, или ДНК, кодирующую каждую CDR, получают с использованием технологии рекомбинации генов (Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) или устройства для синтеза ДНК. В этом контексте гибридому, продуцирующую моноклональные антитела человека, можно получать путем иммунизации животных, продуцирующих антитела человека (например, мышей), посредством CAPRIN-1 человека, а затем слияния клеток селезенки, извлеченных из иммунизированных животных, с клетками миеломы. Дополнительно к указанному выше, при необходимости, ДНК, кодирующие вариабельные и константные области легкой или тяжелой цепей антитела человека, получают с использованием технологии рекомбинации генов или устройства для синтеза ДНК.

Полученные рекомбинантные ДНК можно встраивать в один или несколько подходящих векторов, которые затем вводят в клетки-хозяева (например, клетки млекопитающих, клетки дрожжей и клетки насекомых), так чтобы ДНК коэкспрессиировались, продуцируя рекомбинантный антитела (P.J. Delves., ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES., 1997 WILEY, P. Shepherd and C. Dean., Monoclonal Antibodies, 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS; и J.W. Goding., Monoclonal Antibodies: principles and practice., 1993 ACADEMIC PRESS).

Примеры антитела по настоящему изобретению, полученного любым из способов, описанных выше, включают следующее антитело (a), полученное согласно примерам, описанным ниже:

(a) антитело или его фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотные последовательности, соответствующие SEQ ID NO: 5, 6 и 7, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотные последовательности, соответствующие SEQ ID NO: 9, 10 и 11 (например, антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 8, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 12).

В этом контексте аминокислотные последовательности, соответствующие SEQ ID NO: 5, 6 и 7, соответствуют CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, вариабельной области тяжелой цепи антитела мыши. Аминокислотные последовательности, соответствующие SEQ ID NO: 9, 10 и 11, соответствуют CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, вариабельной области легкой цепи антитела мыши.

Примеры гуманизированного антитела, химерного антитела, одноцепочечного антитела или полиспецифического антитела по настоящему изобретению включают следующие антитела (i), (ii) и (iii):

(i) антитело или его фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотные последовательности, соответствующие SEQ ID NO: 5, 6 и 7, и аминокислотные последовательности каркасных областей, происходящих из антитела человека, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотные последовательности, соответствующие SEQ ID NO: 9, 10 и 11, и аминокислотные последовательности каркасных областей, происходящих из антитела человека;

(ii) антитело или его фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотные последовательности, соответствующие SEQ ID NO: 5, 6 и 7, и аминокислотные последовательности каркасных областей, происходящие из антитела человека, константную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, происходящую из антитела человека, вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотные последовательности, соответствующие SEQ ID NO: 9, 10 и 11, и аминокислотные последовательности каркасных областей, происходящие из антитела человека, и константную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, происходящую из антитела человека; и

(iii) антитело или его фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 8, константную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, происходящую из антитела человека, вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 12, и константную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, происходящую из антитела человека.

Последовательности константных и вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепей антитела человека доступны, например, от NCBI (USA; GenBank, UniGene, и т.д.). Например, могут быть приведены следующие последовательности: последовательность с номером доступа № J00228 для константной области тяжелой цепи IgG1 человека; последовательность с номером доступа № J00230 для константной области тяжелой цепи IgG2 человека; последовательность с номером доступа № X03604 для константной области тяжелой цепи IgG3 человека; последовательность с номером доступа № K01316 для константной области тяжелой цепи IgG4 человека; последовательности с номерами доступа № V00557, X64135 и X64133 для константной области легкой цепи κ человека; и последовательности с номерами доступа № X64132 и X64134 для константной области легкой цепи λ человека.

Предпочтительно, эти антитела обладают цитотоксической активностью и, тем самым, могут проявлять противоопухолевый эффект.

Представленные выше конкретные последовательности вариабельных областей и CDR тяжелой и легкой цепей в каждом антителе предоставлены только для иллюстративных целей. Очевидно, что антитело по настоящему изобретению не ограничивается конкретными последовательностями. Гибридомы, способные продуцировать антитела человека против CAPRIN-1 человека или антитела не являющегося человеком животного (например, антитела мыши), отличные от антител, описанных выше, получают, и моноклональные антитела, продуцируемые гибридомами, выделяют и оценивают как являющиеся (или не являющиеся) представляющими интерес антителами, где в качестве показателей используют иммунологическую активность связывания с CAPRIN-1 человека и цитотоксическую активность. Тем самым идентифицируют представляющие интерес гибридомы, продуцирующие моноклональное антитело. Затем из гибридом получают ДНК, кодирующие вариабельные области тяжелой и легкой цепей в представляющих интерес антителах, и секвенируют, как описано выше. ДНК используют для получения различных антител.

Антитело по настоящему изобретению может представлять собой антитело (a), имеющее замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот, в частности, в последовательности каркасной области и/или константной области при условии, что антитело обладает такой специфичностью, что оно может специфично распознавать CAPRIN-1. В этом контексте термин "несколько" означает предпочтительно от 2 до 5, более предпочтительно 2 или 3.

Кроме того, настоящее изобретение относится к ДНК, кодирующей антитело по настоящему изобретению, ДНК, кодирующей тяжелую или легкую цепь антитела, или ДНК, кодирующей вариабельную область тяжелой или легкой цепи в антителе. Такая ДНК включает, например, ДНК, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотные последовательности, соответствующие SEQ ID NO: 5, 6 и 7, и ДНК, кодирующую вариабельную область легкой цепи, которая содержит нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотные последовательности, соответствующие SEQ ID NO: 9, 10 и 11, в случае антитела (a).

CDR, кодируемые ДНК, имеющими эти последовательности, служат в качестве областей, которые определяют специфичность антитела. Последовательности, кодирующие другие области (т.е. константные области и каркасные области) антитела, таким образом, могут представлять собой последовательности, происходящие из других антител. В этом контексте, "другие антитела" также включают антитела, происходящие из не являющихся человеком организмов, и предпочтительно представляют собой антитела, происходящие из человека, с точки зрения снижения побочных эффектов. В частности, ДНК по настоящему изобретению предпочтительно содержит нуклеотидные последовательности, кодирующие соответствующие происходящие из антитела человека аминокислотные последовательности областей, кодирующие каждую каркасную область и каждую константную область в тяжелой и легкой цепях.

Следующие примеры ДНК, кодирующей антитело по настоящему изобретению, включают ДНК, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 8, и ДНК, кодирующую вариабельную область легкой цепи, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 12. В этом контексте, нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 8, представляет собой, например, нуклеотидную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 13. Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 12, представляет собой, например, нуклеотидную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 14. Для этих ДНК предпочтительно, чтобы область, кодирующая каждую константную область в тяжелой и легкой цепях, содержала нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность, происходящую из антитела человека.

Эти ДНК антител можно получать, например, способами, описанными выше, или следующим способом: сначала получают тотальные РНК из гибридом, соответствующих антителу по настоящему изобретению, с использованием коммерчески доступного набора для экстракции РНК, и кДНК синтезируют с использованием обратной транскриптазы и случайных праймеров и т.п. Затем кДНК, кодирующие антитело, амплифицируют способом ПЦР с использованием олигонуклеотидных праймеров для консервативных последовательностей каждой вариабельной области в генах тяжелой и легкой цепей известных антител мыши. Последовательности, кодирующие константные области, можно получать амплификацией способом ПЦР известных последовательностей. Нуклеотидную последовательность ДНК можно включать в плазмиду или фаг для секвенирования, например, и определять в соответствии с общепринятым способом.

Противоопухолевый эффект антитела против CAPRIN-1, используемого в рамках настоящего изобретения, на экспрессирующие CAPRIN-1 злокачественные клетки, по-видимому, обуславливается опосредуемой эффекторными клетками антителозависимой клеточной цитотоксичностью (ADCC) и комплементзависимой цитотоксичностью (CDC) против экспрессирующих CAPRIN-1 клеток.

Известно, что противоопухолевый эффект, основанный на этом механизме, коррелирует с количеством антигенсвязывающих молекул-мишеней, экспрессируемых на поверхности злокачественных клеток (Niwa R., Clinical Cancer Research 2005 Mar 15; 11 (6): 2327-2336). Количество молекул-мишеней, экспрессируемых на поверхности злокачественных клеток, можно исследовать с использованием существующего набора для анализа, способного измерять количество молекул на клеточной поверхности. В частности, количество связываемых антителом молекул-мишеней можно определять путем: взаимодействия злокачественных клеток, например, с антителами против молекул-мишеней в качестве первичных антител; взаимодействия с ними флуоресцентно меченных антител против первичных антител, вместе с гранулами для калибровочной кривой с предварительно известным количеством молекул; измерения средней интенсивности флуоресценции в образцах; и определения количества молекул-мишеней на основе полученной калибровочной кривой.

Таким образом, антитело против CAPRIN-1, используемое в рамках настоящего изобретения, можно оценивать в отношении его активности путем определения активности ADCC или активности CDC ex vivo против экспрессирующих CAPRIN-1 злокачественных клеток, или путем исследования количества молекул CAPRIN-1, экспрессируемых на поверхности злокачественных клеток, в случае использования антитела против CAPRIN-1 в соответствии с настоящим изобретением в качестве первичного антитела, в частности, как показано ниже в примерах.

Антитело против CAPRIN-1, используемое в рамках настоящего изобретения, связывается с белками CAPRIN-1 на злокачественных клетках и проявляет противоопухолевый эффект через свою активность. Таким образом, антитело против CAPRIN-1 по настоящему изобретению предположительно является пригодным для лечения или профилактики злокачественной опухоли. В частности, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли, содержащей антитело против CAPRIN-1 в качестве активного ингредиента. Антитело против CAPRIN-1, используемое для введения в организм человека (антительная терапия) предпочтительно представляет собой антитело человека или гуманизированное антитело для снижения иммуногенности.

Антитело против CAPRIN-1 с более высокой аффинностью связывания в отношении белка CAPRIN-1 на поверхности злокачественных клеток проявляет более сильную противоопухолевую активность. Таким образом, более сильного противоопухолевого эффекта можно ожидать, если можно было бы получить антитело против CAPRIN-1, обладающее высокой аффинностью связывания с белком CAPRIN-1. Такое антитело можно адаптировать к фармацевтической композиции, предназначенной для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли. Желательно, чтобы такая высокая аффинность связывания предпочтительно составляла по меньшей мере 10⁷ M^-1, по меньшей мере 10⁸ M^-1, по меньшей мере 5×10⁸ M^-1, по меньшей мере 10⁹ M^-1, по меньшей мере 5×10⁹ M^-1, по меньшей мере 10¹⁰ M^-1, по меньшей мере 5×10¹⁰ M^-1, по меньшей мере 10¹¹ M^-1, по меньшей мере 5×10¹¹ M^-1, по меньшей мере 10¹² M^-1, или по меньшей мере 10¹³ M^-1.

Связывание антител против CAPRIN-1 с более высоким количеством молекул CAPRIN-1 на поверхности злокачественных клеток обеспечивает более сильную противоопухолевую активность. Желательно, чтобы количество молекул CAPRIN-1, с которым связываются антитела для ожидаемого противоопухолевого эффекта, составляло 10⁴ или более, предпочтительно 10⁵ или более молекул CAPRIN-1 на злокачественную клетку при измерении с использованием антитела против CAPRIN-1 по настоящему изобретению.

Связывание с экспрессирующими антиген клетками

Способность антитела связываться с CAPRIN-1 можно определять с использованием анализа связывания с использованием, например, ELISA, вестерн-блоттинга, иммунофлуоресценции и проточной цитометрии, как описано в разделе "Примеры".

Иммуногистохимическое окрашивание

Антитело, которое распознает CAPRIN-1, можно исследовать на его реактивность в отношении CAPRIN-1 с помощью иммуногистохимического способа, хорошо известного специалистам в данной области, с использованием замороженного среза ткани, фиксированного параформальдегидом или ацетоном, или заключенного в парафин среза ткани, фиксированного параформальдегидом, полученного от пациента во время хирургической операции или от животного с ксенотрансплантированной тканью, которому была инокулирована клеточная линия, экспрессирующая CAPRIN-1 либо самопроизвольно, либо после трансфекции.

Для иммуногистохимического окрашивания, антитело, реактивное в отношении CAPRIN-1, можно окрашивать различными способами. Например, антитело можно визуализировать путем взаимодействия с конъюгированным с пероксидазой хрена антителом козы против антител мыши или антителом козы против антител курицы.

Фармацевтическая композиция

Мишень для фармацевтической композиции для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли по настоящему изобретению конкретно не ограничена, при условии, что этой мишенью является злокачественная опухоль (клетка), экспрессирующая ген CAPRIN-1.

Термины "опухоль" и "злокачественная опухоль", используемые в контексте настоящего изобретения, относятся к злокачественному новообразованию и их используют взаимозаменяемо.

Злокачественная опухоль, на которую нацелено настоящее изобретение, представляет собой злокачественную опухоль, экспрессирующую ген, кодирующий белок CAPRIN-1, и предпочтительно представляет собой рак молочной железы, рак почки, рак поджелудочной железы, рак толстого кишечника, рак легких, опухоль головного мозга, рак желудка, рак шейки матки, рак яичников, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, рак пищевода, лейкоз, лимфому, фибросаркому, мастоцитому или меланому.

Конкретные примеры этих злокачественных опухолей включают, но не ограничиваются ими, аденокарциному молочной железы, аденокарциному молочной железы комплексного типа, злокачественную смешанную опухоль молочной железы, внутрипротоковую папиллярную аденокарциному, аденокарциному легких, плоскоклеточный рак, мелкоклеточный рак, крупноклеточный рак, глиому, которая представляет собой опухоль нейроэпителиальной ткани, эпендимому, нейрональную опухоль, эмбриональную нейроэктодермальную опухоль, неврилеммому, нейрофиброму, менингиому, хронический лимфоцитарный лейкоз, лимфому, желудочно-кишечную лимфому, алиментарную лимфому, лимфому от мелкоклеточного до среднеклеточного типа, рак слепой кишки, рак восходящей толстой кишки, рак нисходящей толстой кишки, рак поперечноободочной толстой кишки, рак сигмовидной толстой кишки, рак прямой кишки, эпителиальный рак яичников, герминогенную опухоль, опухоль стромальных клеток, карциному протоков поджелудочной железы, инвазивную карциному протоков поджелудочной железы, аденокарциному поджелудочной железы, карциному ацинарных клеток, железисто-плоскоклеточную карциному, гигантоклеточную опухоль, внутрипотоковое папиллярно-слизистое новообразование, слизистое кистозное новообразование, панкреатобластому, серозную цистаденокарциному, солидную псевдопапиллярную опухоль, гастриному, глюкагоному, инсулиному, множественное эндокринное новообразование типа 1 (синдром Вермера), опухоль нефункциональных островковых клеток, соматостатиному и ВИПому.

Исследуемым индивидуумом в качестве реципиента предпочтительно являются млекопитающие, например, млекопитающие, включающие приматов, домашних животных, скот и спортивных животных, и особенно предпочтительными являются люди, собаки и кошки.

В тех случаях, когда антитело по настоящему изобретению используют в качестве фармацевтической композиции, фармацевтическая композиция может быть составлена способом, в основном известным специалистам в данной области. Например, фармацевтическую композицию можно использовать в форме парентеральной инъекции асептического раствора или суспензии с водой или любой другой фармацевтически приемлемой жидкостью. Например, фармацевтическую композицию можно составлять с антителом, которое смешивают в единичную дозированную форму, требуемую для общепринятой фармацевтической практики, в соответствующей комбинации с фармакологически приемлемыми носителями или средами, в частности, стерилизованной водой, физиологическим солевым раствором, растительным маслом, эмульгатором, суспендирующим веществом, детергентом, стабилизатором, вкусовой добавкой, эксципиентом, носителем, консервантом, связующим веществом и т.д. Количество активного ингредиента в таком препарате определяют так, чтобы можно было достигнуть соответствующей дозы в заданном диапазоне.

Асептическую композицию для инъекции можно составлять в соответствии с общей фармацевтической практикой с использованием носителя, такого как дистиллированная вода для инъекций.

Примеры водных растворов для инъекции включают физиологический раствор, изотоничные растворы, содержащие глюкозу и другие адъюванты, такие как D-сорбит, D-манноза, D-маннитол и хлорид натрия. Эти растворы можно использовать в комбинации с соответствующим солюбилизатором, например, спиртом (в частности этанол) или полиспиртом (например, пропиленгликоль и полиэтиленгликоль), или неионным детергентом, например, полисорбатом 80 (TM) или HCO-60.

Примеры масляных растворов включают кунжутное масло и соевое масло. Эти растворы можно использовать в комбинации с солюбилизатором, таким как бензилбензоат или бензиловый спирт. Кроме того, растворы можно смешивать с буфером (например, фосфатный солевой буфер и натрий-ацетатный буферный раствор), смягчающим средством (например, прокаин гидрохлорид), стабилизатором (например, бензиловый спирт и фенол) и антиоксидантом. Инъецируемыми растворами, полученными таким образом, обычно заполняют подходящие ампулы.

Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению вводят перорально или парентерально, предпочтительно парентерально. Конкретные примеры ее дозированных форм включают инъекции, средства для интраназального введения, средства для транспульмонального введения, и средства для чрескожного введения. Примеры инъекций включают внутривенную инъекцию, внутримышечную инъекцию, внутрибрюшинную инъекцию и подкожную инъекцию, посредством которых фармацевтическую композицию можно вводить системно или локально.

Также способ введения можно соответствующим образом выбирать, в зависимости от возраста, массы тела, пола, симптомов и т.д. пациента. Дозу фармацевтической композиции, содержащей антитело или полинуклеотид, кодирующий антитело, можно выбирать из диапазона, например, от 0,0001 до 1000 мг/кг массы тела на дозу. Альтернативно дозу можно выбирать из диапазона, например, от 0,001 до 100000 мг/организм пациента, хотя доза не обязательно ограничивается этими числами. Хотя доза и способ введения варьируют, в зависимости от массы тела, возраста, пола, симптомов и т.д. пациента, специалисты в данной области могут соответствующим образом выбирать дозу и способ.

Фармацевтическую композицию, включающую антитело или его фрагменты по настоящему изобретению, можно вводить исследуемому индивидууму для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли, предпочтительно рака молочной железы, рака почки, рака поджелудочной железы, рака толстого кишечника, рака легких, опухоли головного мозга, рака желудка, рака шейки матки, рака яичников, рака предстательной железы, рака мочевого пузыря, рака пищевода, лейкоза, лимфомы, фибросаркомы, мастоцитомы или меланомы.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу лечения и/или профилактики злокачественной опухоли, включающему введение фармацевтической композиции по настоящему изобретению в комбинации с противоопухолевым средством, как проиллюстрировано выше, или фармацевтической композиции, содержащей противоопухолевое средство, исследуемому индивидууму. Антитело или его фрагмент по настоящему изобретению можно вводить одновременно с противоопухолевым средством или отдельно от него, исследуемому индивидууму. В случае введения этих фармацевтических композиций по отдельности, любое из них можно вводить первым или последующим. Интервалы между их введением, дозы, пути введения и количество доз могут быть соответствующим образом выбраны специалистом. Дозированные формы отдельных лекарственных средств, подлежащих одновременному введению, также включают, например, фармацевтические композиции, каждая из которых составлена путем смешения антитела или его фрагмента по настоящему изобретению и противоопухолевого средства в фармацевтически приемлемом носителе (или среде). Представленное выше описание о назначении, составлении, путях введения, дозах, злокачественной опухоли и т.д. в отношении фармацевтических композиций и дозированных форм, содержащих антитело по настоящему изобретению, также применимы к любой из описанных выше фармацевтических композиций и дозированных форм, содержащих противоопухолевое средство.

Таким образом, настоящее изобретение также относится к фармацевтической комбинации для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли, содержащей фармацевтическую композицию по настоящему изобретению и фармацевтическую композицию, содержащую противоопухолевое средство, как проиллюстрировано выше. Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли, содержащей антитело или его фрагмент по настоящему изобретению и противоопухолевое средство вместе с фармакологически приемлемым носителем.

Полипептид и ДНК

Кроме того, настоящее изобретение относится к следующим полипептидам и ДНК, имеющим отношение к антителу (a):

(i) полипептид, содержащий аминокислотные последовательности, соответствующие SEQ ID NO: 8 и 12, и ДНК, кодирующая полипептид, например, ДНК, содержащая нуклеотидные последовательности, соответствующие SEQ ID NO: 13 и 14;

(ii) полипептид CDR тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, соответствующих SEQ ID NO: 5, 6 и 7, и ДНК, кодирующая полипептид; и

(iii) полипептид CDR легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, соответствующих SEQ ID NO: 9, 10 и 11, и ДНК, кодирующая полипептид.

Эти полипептиды и ДНК можно получать с использованием способов рекомбинации генов, как описано выше.

Сущность настоящего изобретения

Аспекты настоящего изобретения, описанные выше, обобщенно представлены ниже.

(1) Антитело или его фрагмент, которое(ый) имеет иммунологическую реактивность в отношении белка CAPRIN-1, причем антитело или его фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 5, 6 и 7, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 9, 10 и 11.

(2) Антитело или его фрагмент согласно (1), где антитело представляет собой антитело человека, гуманизированное антитело, химерное антитело, одноцепочечное антитело или биспецифическое антитело.

(3) Антитело или его фрагмент согласно (1) или (2), где антитело или его фрагмент конъюгированы с противоопухолевым средством.

(4) Фармацевтическая композиция для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли, содержащая антитело или его фрагмент в качестве активного ингредиента, где антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 5, 6 и 7, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 9, 10 и 11, и обладает иммунологической реактивностью в отношении белка CAPRIN-1.

(5) Фармацевтическая композиция согласно (4), где злокачественная опухоль представляет собой рак молочной железы, рак почки, рак поджелудочной железы, рак толстого кишечника, рак легких, опухоль головного мозга, рак желудка, рак шейки матки, рак яичников, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, рак пищевода, лейкоз, лимфому, фибросаркому, мастоцитому или меланому.

(6) фармацевтическая комбинация для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли, содержащая фармацевтическую композицию согласно (4) или (5), и фармацевтическую композицию, содержащую противоопухолевое средство.

(7) ДНК, кодирующая антитело или его фрагмент, согласно (1) или (2).

(8) Способ лечения и/или профилактики злокачественной опухоли, включающий введение антитела или его фрагмента согласно любому из (1)-(3), фармацевтической композиции согласно (4) или (5), или фармацевтической комбинации согласно (6) исследуемому индивидууму.

Примеры

Далее настоящее изобретение описано конкретно с помощью примеров. Однако предполагается, что объем настоящего изобретения не ограничивается этими конкретными примерами.

Пример 1: Анализ экспрессии гена CAPRIN-1 в каждой ткани

Экспрессию гена CAPRIN-1 в нормальных тканях собаки и человека и различных клеточных линиях исследовали с помощью ОТ-ПЦР в соответствии с примером 1(4), описанным в WO2010/016526. В результате, наблюдали высокую экспрессию в семенниках среди здоровых тканей собаки, и в то же время экспрессию наблюдали в тканях рака молочной железы и аденокарциномы собаки. В результате подтверждения также экспрессии в тканях человека, экспрессия была подтверждена только в яичке среди нормальных тканей, также как и для гена CAPRIN-1 собаки. Напротив, экспрессия была выявлена во многих типах злокачественных клеточных линий, включая 8 клеточных линий рака молочной железы человека (ZR75-1, MCF7, T47D, SK-BR-3, MDA-MB-157, BT-20, MDA-MB-231V и MRK-nu-1) и 4 клеточных линии рака поджелудочной железы (Capan-2, MIAPaCa-2, Panc-1 и BxPc-3), среди злокачественных клеток. Эти результаты продемонстрировали, что CAPRIN-1 экспрессируется в различных злокачественных клетках, хотя его экспрессию не наблюдают в нормальных тканях, отличных от семенника.

Пример 2: Получение моноклонального антитела мыши против CAPRIN-1

100 мкг белков CAPRIN-1 человека, имеющих аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, которые были получены согласно примеру 3, описанному в WO2010/016526, смешивали с равным количеством адъюванта MPL+TDM (Sigma-Aldrich Corp.). Эту смесь использовали в качестве антигенного раствора для мышей. Антигенный раствор вводили внутрибрюшинно каждой мыши Balb/c в возрасте 6 недель (Japan SLC Inc.). Затем проводили 7 вспомогательных введений раз в 1 неделю для завершения иммунизации. Через трое суток после последней инъекции селезенку каждой мыши извлекали и растирали между двумя стерильными предметными стеклами. Процессы промывания PBS(-) (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) и удаления супернатанта центрифугированием при 1500 об./мин. в течение 10 минут повторяли три раза с получением клеток селезенки. Полученные клетки селезенки смешивали с клетками миеломы мыши SP2/0 (приобретенными от ATCC) в соотношении 10:1. 200 мкл среды RPMI1640, содержащей 10% FBS, нагревали до 37°C и смешивали с 800 мкл PEG1500 (Boehringer Ingelheim GmbH), и полученный таким образом раствор PEG добавляли к клеточной смеси, которую затем оставляли стоять в течение 5 минут для слияния клеток. После удаления супернатанта путем центрифугирования при 1700 об./мин. в течение 5 минут клетки суспендировали в 150 мл среды RPMI1640, содержащей 15% FBS, дополненной 2% эквивалентом раствора HAT (Life Technologies, Inc./Gibco) (селективная среда HAT). Эту суспензию инокулировали в пятнадцать 96-луночных планшетов (Thermo Fisher Scientific Inc./Nunc) в концентрации 100 мкл/лунка. Клетки селезенки и клетки миеломы подвергали слиянию путем культивирования при 37°C в течение 7 суток в условиях 5% CO₂ с получением гибридом.

Полученные гибридомы подвергали скринингу, где в качестве показателя использовали аффинность связывания антител, продуцируемых гибридомами, в отношении белка CAPRIN-1. Один мкг/мл раствора белка CAPRIN-1, полученного согласно примеру 3, описанному в WO2010/016526, добавляли в 96-луночный планшет в концентрации 100 мкл/лунка и оставляли стоять при 4°C в течение 18 часов. Каждую лунку промывали три раза PBS-T. Затем к нему добавляли 0,5% раствор бычьего сывороточного альбумина (BSA) (Sigma-Aldrich Corp.) в концентрации 400 мкл/лунка и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 3 часов. Раствор в каждой лунке отбрасывали и каждую лунку промывали три раза 400 мкл PBS-T. Затем к нему добавляли культуральный супернатант каждой гибридомы, полученной как описано выше, в концентрации 100 мкл/лунка, и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 2 часов. Каждую лунку промывали три раза PBS-T. Затем добавляли меченные HRP антитела против IgG мыши (H+L) (Invitrogen Corp.), разбавленные в 5000 раз PBS, в концентрации 100 мкл/лунка и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 1 часа. Каждую лукну промывали три раза PBS-T. Затем добавляли раствор субстрата TMB (Thermo Fisher Scientific Inc.) в концентрации 100 мкл/лунка и оставляли стоять в течение 15-30 минут для обеспечения цветовой реакции. После развития окраски реакцию останавливали добавлением 1 Н серной кислоты в концентрации 100 мкл/лунка. Поглощение измеряли при 450 нм и 595 нм с использованием абсорбционного спектрометра. В результате было выбрано несколько гибридом, продуцирующих антитела, обладающих высоким поглощением.

Выбранные гибридомы добавляли в 96-луночный планшет с плотностью 0,5 клеток/лунка и культивировали в планшете. Через одну неделю наблюдали гибридомы, образующие единичные колонии в лунках. Клетки в этих лунках далее культивировали и клонированные гибридомы подвергали скринингу, где в качестве показателя использовали аффинность связывания антител, продуцируемых гибридомами, в отношении белка CAPRIN-1. Один мкг/мл раствора белка CAPRIN-1, полученных согласно примеру 3, описанному в WO2010/016526, добавляли в 96-луночный планшет в концентрации 100 мкл/лунка и оставляли стоять при 4°C в течение 18 часов. Каждую лунку промывали три раза PBS-T. Затем добавляли 0,5% раствор BSA в концентрации 400 мкл/лунка и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 3 часов. Раствор в каждой лунке отбрасывали и каждую лунку промывали три раза 400 мкл PBS-T. Затем добавляли культуральный супернатант каждой гибридомы, полученной, как описано выше, в концентрации 100 мкл/лунка и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 2 часов. Каждую лунку промывали три раза PBS-T. Затем добавляли меченные HRP антитела против IgG мыши (H+L) (Invitrogen Corp.), разбавленные в 5000 раз PBS в концентрации 100 мкл/лунка и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 1 часа. Каждую лунку промывали три раза PBS-T. Затем добавляли раствор субстрата TMB (Thermo Fisher Scientific Inc.) в концентрации 100 мкл/лунка и оставляли стоять в течение 15-30 минут для обеспечения цветовой реакции. После развития цвета реакцию завершали добавлением 1 Н серной кислоты в концентрации 100 мкл/лунка. Поглощение измеряли при 450 нм и 595 нм с использованием абсорбционного спектрометра. В результате было получено 112 линий гибридом, продуцирующих моноклональные антитела, реактивные в отношении белков CAPRIN-1.

Далее эти моноклональные антитела подвергали скринингу в отношении антител, реактивных в отношении поверхности клеток рака молочной железы, экспрессирующих CAPRIN-1. В частности, 10⁶ клеток клеточной линии рака молочной железы человека MDA-MB-231V центрифугировали в 1,5-мл микроцентрифужной пробирке. Добавляли 100 мкл культурального супернатанта каждой гибридомы, полученной, как описано выше, и оставляли стоять в течение 1 часа на льду. После промывания PBS добавляли меченные FITC антитела козы против IgG мыши (Invitrogen Corp.), разбавленные в 500 раз с помощью PBS, содержащего 0,1%, и оставляли стоять в течение 1 часа на льду. После промывания PBS интенсивность флуоресценции измеряли с использованием FACS Calibur (Becton, Dickinson and Company). С другой стороны, то же действие, что описано выше, проводили с использованием сыворотки каждой мыши Balb/c в возрасте 6 недель, которой не проводили введение, разбавленной в 500 раз средой для культивирования гибридом, вместо антител, для получения контроля. В результате было отобрано одно моноклональное антитело (#1), обладающее более высокой интенсивностью флуоресценции, чем у контроля, т.е. реактивное в отношении поверхности клеток рака молочной железы.

Пример 3: Охарактеризация выбранного моноклонального антитела

Моноклональные антитела, полученные согласно примеру 2, анализировали способом, описанным в примере 5 WO2010/016526, в отношении их нуклеотидных последовательностей и аминокислотных последовательностей, кодируемых ими. Полученное моноклональное антитело #1 содержало вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 8, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 12. Полученная нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи моноклонального антитела #1, представлена в SEQ ID NO: 13, и аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO: 8. Нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи, представлена в SEQ ID NO: 14, и аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO: 12.

В частности, было подтверждено, что моноклональные антитело #1 содержит вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 8, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 12, где вариабельная область тяжелой цепи имела CDR1, CDR2 и CDR3, состоящие из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 5, 6 и 7, соответственно, и вариабельная область легкой цепи имела CDR1, CDR2 и CDR3, состоящие из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 9, 10 и 11, соответственно.

Пример 4: Получение химерного моноклонального антитела человека-мыши

Оба конца фрагмента амплификации гена, содержащего нуклеотиды, кодирующие вариабельную область тяжелой цепи моноклонального антитела мыши #1, полученного согласно примеру 3, которая состоит из нуклеотидной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 13, обрабатывали ферментами рестрикции, а затем очищали и встраивали в соответствии с общепринятым способом в вектор pcDNA4/myc-His (Invitrogen Corp.), уже имеющий генные вставки лидерной последовательности, происходящей из антитела мыши, и константной области H-цепи IgG₁ человека, содержащей SEQ ID NO: 37. Также фрагмент амплификации гена, содержащий ген вариабельной области легкой цепи моноклонального антитела мыши #1, состоящий и нуклеотидной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 14, обрабатывали на обоих концах ферментами рестрикции, а затем очищали и встраивали в соответствии с общепринятым способом в вектор pcDNA3.1/myc-His (Invitrogen Corp.), уже имеющий генные вставки лидерной последовательности, происходящей из антитела мыши, и константной области L-цепи IgG₁ человека, содержащей SEQ ID NO: 38.

Далее, рекомбинантный вектор, имеющий вставку вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO: 13) моноклонального антитела мыши #1, и рекомбинантный вектор, имеющий вставку вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 14) моноклонального антитела мыши #1, вводили в клетки CHO-K1 (полученные от Riken Cell Bank). В частности, 2×10⁵ клеток CHO-K1 культивировали в среде Хэма F12 (Invitrogen Corp.), содержащей 1 мл 10% FBS на ячейку культурального планшета с 12 ячейками, и промывали PBS(-). Затем добавляли свежую среду Хэма F12, содержащую 1 мл 10% FBS на ячейку. 250 нг каждого из векторов, лизированных в 30 мкл OptiMEM (Invitrogen Corp.), смешивали с 30 мкл реагента для трансфекции Polyfect (Qiagen N.V.), и эту смесь добавляли в каждую ячейку. Клетки CHO-K1, котрансфицированные рекомбинантными векторами, культивировали в среде Хэма F12, содержащей 10% добавку FBS с 200 мкг/мл зеоцина (Invitrogen Corp.) и 200 мкг/мл генетицина (Roche Diagnostics K.K.), а затем инокулировали в 96-луночный планшет с плотностью 0,5 клеток/лунка для получения клеточной линии, стабильно продуцирующей химерное моноклональное антитело человека-мыши #1 (#1), имеющее вариабельные области моноклонального антитела мыши #1.

Каждую полученную клеточную линию культивировали в течение 5 суток в 150-см² колбе при плотности 5×10⁵ клеток/мл с использованием 30 мл бессывороточной среды OptiCHO (Invitrogen Corp.) с получением культуральных супернатантов, содержащих химерное моноклональное антитело человека-мыши #1.

Также получали клеточные линии, стабильно продуцирующие сравнительные химерные моноклональные антитела человека-мыши 1-11 аналогично тому, как описано выше, с использованием следующих моноклональных антител мыши против CAPRIN-1, описанных в WO2010/016526, в качестве сравнительных антител: сравнительное антитело 1, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 15 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 16; сравнительное антитело 2, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 17 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 18; сравнительное антитело 3, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 19 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 20; сравнительное антитело 4, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 21 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 22; сравнительное антитело 5, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 23 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 24; сравнительное антитело 6, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 25 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 26; сравнительное антитело 7, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 27 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 28; сравнительное антитело 8, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 29 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 30; сравнительное антитело 9, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 31 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 32; сравнительное антитело 10, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 33 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 34; и сравнительное антитело 11, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 35 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 36. Каждую полученную клеточную линию культивировали в течение 5 суток в 150-см² колбе при плотности 5×10⁵ клеток/мл с использованием 30 мл бессывороточной среды OptiCHO (Invitrogen Corp.) с получением культуральных супернатантов, содержащих любое из сравнительных химерных антител человека-мыши 1-11.

Пример 5: Экспрессия CAPRIN-1 на поверхности различных злокачественных клеток с использованием антитела #1 против CAPRIN-1

Далее, клеточные линии рака молочной железы человека (ZR75-1, MCF7, T47D, SK-BR-3, MDA-MB-157, BT-20, MDA-MB-231V и MRK-nu-1), клеточные линии рака почки (Caki-1, Caki-2, A498 и ACHN), клеточную линию рака мочевого пузыря (T24), клеточную линию рака яичников (SKOV3), клеточную линию рака легких (QG56 и A549), клеточные линии рака поджелудочной железы (Capan-2 и MIAPaCa-2), клеточную линию рака предстательной железы (PC3), клеточную линию рака шейки матки (SW756), клеточную линию фибросаркомы (HT1080), клеточные линии опухоли головного мозга (T98G, U87MG, U251, SNB19 и U373), клеточные линии рака желудка (MNK28 и MNK45), клеточные линии рака толстого кишечника (HT29, Lovo, CaCo2, SW480 и HCT116), клеточную линию лейкоза (AML5) и клеточную линию лимфомы (Ramos), для которых подтверждено, что они обладают экспрессией гена CAPRIN-1, исследовали в отношении их экспрессии белков CAPRIN-1 на клеточной поверхности с использованием культуральных супернатантов, содержащих #1, полученное согласно примеру 4. 5×10⁵ клеток каждой клеточной линии центрифугировали в каждой 1,5-мл микроцентрифужной пробирке. В пробирку добавляли каждый культуральный супернатант (100 мкл), содержащий антитело #1, и оставляли стоять в течение 1 часа на льду. После промывания PBS добавляли меченные FITC антитела козы против IgG мыши (H+L) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), разбавленные PBS, содержащим 0,1% FBS, и оставляли стоять при 4°C в течение 30 минут. После промывания PBS измеряли интенсивность флуоресценции с использованием FACS Calibur (Becton, Dickinson and Company). Используемый отрицательный контроль представлял собой клетки, реагировавшие только с вторичными антителами. В результате клетки, дополненные антителом #1, обладали интенсивностью флуоресценции, по меньшей мере на 35% превышающей интенсивность флуоресценции отрицательного контроля. Это продемонстрировало, что белки CAPRIN-1 экспрессируются на поверхности клеточной мембраны злокачественных клеточных линий человека. Указанную выше степень усиления интенсивности флуоресценции представляли как степень усиления средней интенсивности флуоресценции (величина MFI) в каждой клетке и ее вычисляли по следующей формуле:

Степень повышения интенсивности флуоресценции (степень усиления интенсивности флуоресценции) (%)=((MFI клеток, прореагировавших с антителами против CAPRIN-1)-(контрольная MFI))/(контрольная MFI)×100.

Пример 6: Противоопухолевый эффект (активность ADCC) антитела против CAPRIN-1 на злокачественной клетке

Химерное моноклональное антитело мыши-человека #1 против CAPRIN-1, полученное согласно примеру 4, исследовали в отношении его способности повреждать экспрессирующие CAPRIN-1 злокачественные клетки с помощью анализа активности ADCC. Культуральный супернатант клеток, продуцирующих #1, очищали с использованием Hitrap Protein A Sepharose FF (GE Healthcare Bio-Sciences Ltd.). После замены на PBS(-) раствор фильтровали через 0,22-мкм фильтр (Millipore Corp.). Полученное антитело использовали для анализа активности. 10⁶ клеток каждой из клеточной линии рака молочной железы человека MCF7, клеточной линии рака толстого кишечника человека HCT-116, клеточной линии рака поджелудочной железы MIAPaCa-2, клеточной линии рака почки человека Caki-2, и клеточной линии рака легких человека QG56, для которых было подтверждено, что они обладают экспрессией CAPRIN-1, собирали в 50-мл центрифужную пробирку, в которую затем добавляли 100 мкКи хрома 51, а затем инкубировали при 37°C в течение 2 часов. Затем клетки промывали три раза средой RPMI 1640, содержавшей 10% FBS, и добавляли при плотности 2×10³ клеток/лунка в каждый 96-луночный планшет с V-образным дном для получения клеток-мишеней. Добавляли каждое из очищенного антитела #1 и сравнительных химерных антител человека-мыши 1-11, полученных согласно примеру 4, в концентрации 1 мкг/лунка. В планшет добавляли клеточную популяцию, содержащую NK-клетки человека, выделенную с использованием общепринятого способа из лимфоцитов периферической крови человека, при плотности 2×10⁵ клеток/лунка и культивировали при 37°C в течение 4 часов в условиях 5% CO₂. После культивирования в культуральном супернатанте измеряли количество хрома 51, высвободившегося из поврежденных опухолевых клеток, для вычисления цитотоксической активности каждого антитела против CAPRIN-1 в отношении злокачественных клеток. Использованный отрицательный контроль представлял собой клетки, дополненные изотипическими контрольными антителами. Клеточную популяцию, содержащую NK-клетки, которые использовали при этой оценке, получали следующим образом: мононуклеарные клетки периферической крови человека, отделенные от периферической крови в соответствии с общепринятым способом с использованием раствора для разделения по удельной плотности Histopaque для выделения мононуклеарных клеток периферической крови человека (Sigma-Aldrich Corp.), подвергали взаимодействию с различными меченными FITC антителами (антитело против CD3 человека, антитело против CD20 человека, антитело против CD19 человека, антитело против CD11c человека, и антитело против HLA-DR человека (Becton, and Dickinson and Company)), и клеточную популяцию, не окрашенную антителами, отделяли с использованием клеточного сортера (FACS Vantage SE (Becton, and Dickinson and Company)) или набора для выделения NK-клеток человека (Miltenyi Biotec K.K.). В результате оценки цитотоксической активности против злокачественных клеток, использованные изотипические контрольные антитела и использованные сравнительные антитела 1-11 имели цитотоксическую активность менее 5% против всех из клеточной линии рака молочной железы человека MCF7, клеточной линии рака легких человека QG56, клеточной линии рака толстого кишечника человека HCT-116, клеточной линии рака поджелудочной железы человека MIAPaCa-2 и клеточной линии рака почки человека Caki-2. Напротив, антитело #1 проявляло цитотоксическую активность, составляющую 21%, 11%, 21%, 27% и 23%, против клеточной линии рака молочной железы человека MCF7, клеточной линии рака легких человека QG56, клеточной линии рака толстого кишечника человека HCT-116, клеточной линии рака поджелудочной железы человека MIAPaCa-2 и клеточной линии рака почки человека Caki-2, соответственно. Аналогично, использованные изотипические контрольные антитела и использованные сравнительные антитела 1-11 имели цитотоксическую активность менее 4% против всех других злокачественных клеток: клеточных линий рака молочной железы ZR75-1, T47D, Hs578T, BT-20, SK-BR-3, MDA-MB-231V и MRK-nu-1, клеточных линий глиомы T98G и U373, клеточной линии рака легких A549, клеточных линий рака почки Caki-1 и ACHN, клеточной линии рака шейки матки SW756, клеточной линии рака мочевого пузыря T24, клеточных линий рака желудка MKN28 и MKN45, клеточной линии рака толстого кишечника SW480, клеточной линии лейкоза AML5, и клеточной линии лимфомы Ramos. Напротив, было подтверждено, что антитело #1 имеет 10% или более высокую цитотоксическую активность против этих клеточных линий. Эти результаты показали, что полученное моноклональное антитело #1 против CAPRIN-1 повреждает экспрессирующие CAPRIN-1 злокачественные клетки через его активность ADCC, и продемонстрировали, что антитело #1 проявляет более высокую цитотоксическую активность против злокачественных клеток человека, чем сравнительные антитела 1-11.

Эти результаты, касающиеся цитотоксической активности, были получены путем смешения антитела против CAPRIN-1, используемого в рамках настоящего изобретения, лимфоцитов (популяция, содержащая NK-клетки), и 2×10³ клеток каждой из злокачественных линий с включением хрома 51, как описано выше, с последующим культивированием клеток в течение 4 часов, измерения после культивирования количества хрома 51, высвободившегося в среду, и вычисления цитотоксической активности против каждой из злокачественных клеточных линий по следующей формуле.

Формула: Цитотоксическая активность (%) = количество хрома 51, высвободившегося из клеток-мишеней, дополненных антителом против CAPRIN-1, и лимфоцитов (популяция, содержащая NK-клетки)/Количество хрома 51, высвободившегося из клеток-мишеней, дополненных 1 Н хлористоводородной кислотой × 100.

Пример 7: Противоопухолевый эффект моноклонального антитела против CAPRIN-1 у мыши in vivo

Далее, химерное моноклональное антитело человека-мыши #1, полученное согласно примеру 4, оценивали в отношении его противоопухолевого эффекта у мышей, имеющих злокачественную опухоль, in vivo. Используемое антитело очищали на колонке из культурального супернатанта каждой клеточной линии, продуцирующей антитело #1. Аналогично, также оценивали сравнительные химерные моноклональные антитела человека-мыши против CAPRIN-1 1-11, полученные согласно примеру 4, в отношении их противоопухолевых эффектов на мышей, имеющих злокачественную опухоль, in vivo.

Антитело #1 исследовали в отношении его противоопухолевого эффекта с использованием мышей, имеющих злокачественную опухоль, которым была трансплантирована происходящая из человека экспрессирующая CAPRIN-1 злокачественная клеточная линия. 2×10⁶ клеток клеточной линии рака поджелудочной железы человека Capan-2 (приобретенных от ATCC) на мышь подкожно трансплантировали в спину 65 мышей Balb/c nude (Japan SLC, Inc.) и выращивали до тех пор, пока размер опухоли не составлял приблизительно 5 мм в диаметре. Каждое из антитела #1 и сравнительных химерных антител человека-мыши 1-11 внутрибрюшинно вводили в дозе 200 мкг (200 мкл)/мышь 5 (на антитело) из этих мышей, имеющих злокачественную опухоль. Затем каждое антитело внутрибрюшинно вводили мышам, имеющим злокачественную опухоль, в той же дозе, как указано выше, всего три раза в течение 2 суток. Размер опухоли измеряли каждые сутки и оценивали противоопухолевый эффект. С другой стороны, оставшимся 5 мышам, имеющим злокачественную опухоль, которые, в свою очередь, использовали в качестве контрольной группы, вместо антител вводили PBS(-). Размер опухоли вычисляли в единицах объема по формуле 0,5×(наибольшая ось × наименьшая ось × наименьшая ось).

В результате оценки противоопухолевого эффекта, в исследуемой группе, в которой вводили антитело #1 против CAPRIN-1, пролиферация опухоли снижалась до 65% на 29 сутки после введения антитела (причем размер опухоли в контрольной группе на ту же дату определялся как 100%). Напротив, у мышей, которым вводили сравнительные химерные антитела человека-мыши 1-11, пролиферация опухоли снижалась приблизительно до 85%. Эти результаты продемонстрировали, что полученное антитело #1 против CAPRIN-1 проявляет противоопухолевый эффект in vivo на злокачественные клетки, экспрессирующие CAPRIN-1. Эти результаты также продемонстрировали, что антитело #1 проявляет более высокий противоопухолевый эффект in vivo, чем сравнительные антитела 1-11.

Пример 8: Количество молекул CAPRIN-1 на поверхности различных злокачественных клеток, распознаваемых антителом #1 против CAPRIN-1

Клеточные линии рака молочной железы человека (ZR75-1, MCF7, T47D, SK-BR-3, MDA-MB-157, BT-20, MDA-MB-231V и MRK-nu-1), клеточные линии рака почки (Caki-1, Caki-2, A498 и ACHN), клеточную линию рака мочевого пузыря (T24), клеточную линию рака яичников (SKOV3), клеточные линии рака легких (QG56 и A549), клеточные линии рака поджелудочной железы (MIAPaCa-2 и Capan-2), клеточную линию рака предстательной железы (PC3), клеточную линию рака шейки матки (SW756), клеточную линию фибросаркомы (HT1080), клеточные линии опухоли головного мозга (T98G, U87MG, U251, SNB19 и U373), клеточные линии рака желудка (MNK28 и MNK45), клеточные линии рака толстого кишечника (HT29, Lovo, CaCo2, SW480 и HCT116), клеточную линию лейкоза (AML5) и клеточную линию лимфомы (Ramos) исследовали с использованием набора для анализа количества молекул QIFIKIT (Dako Japan Inc.) в отношении количества молекул CAPRIN-1 на их клеточной поверхности, распознаваемых антителом #1 против CAPRIN-1. Аналогично, количество молекул CAPRIN-1 на поверхности этих различных злокачественных клеток также исследовали с использованием сравнительных антител 1-11, которые представляют собой моноклональные антитела против CAPRIN-1, полученные согласно примеру 4.

В соответствии с протоколом, прилагаемым к набору, антитело #1 и сравнительные антитела 1-11 разбавляли до 5 мкг/мл (в единицах конечной концентрации) PBS, и это разведение добавляли к каждой клеточной линии и подвергали реакции в течение 30 минут. После промывания PBS к каждой клеточной линии добавляли флуоресцентно меченные антитела против IgG мыши, прилагаемые к набору, вместе с калибровочными гранулами, прилагаемыми к набору, и оставляли стоять в течение 45 минут на льду. Каждую клеточную линию и калибровочные гранулы промывали PBS. Затем измеряли интенсивность флуоресценции с использованием FACS Calibur (Becton, Dickinson и Company) с получением средней величины интенсивности флуоресценции (среднее значение). Кроме того, проводили измерения для сравнительных антител аналогично тому, как описано выше, для получения среднего значения. Использованный отрицательный контроль представлял собой клетки, подвергнутые взаимодействию с изотипическими контрольными антителами, и также получали среднее значение. Каждую среднюю величину интенсивности флуоресценции (среднее значение) использовали для вычисления количества молекул в соответствии с протоколом, прилагаемым к набору. В результате количество молекул CAPRIN-1 на поверхности различных клеточных линий, распознаваемых антителом #1, составляло 10⁵ или более на клетку для всех исследованных злокачественных клеточных линий человека. С другой стороны, количество молекул, распознаваемых сравнительными моноклональными антителами 1-11, составляло менее 10⁵ на клетку.

Промышленная применимость

Антитело по настоящему изобретению пригодно для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли.

Все публикации, патенты и патентные заявки, цитированные в настоящем описании, включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к антителу или его фрагменту, которые обладают иммунологической реактивностью в отношении белка CAPRIN-1. Также раскрыты конъюгат антитела, который специфически связывается с CAPRIN-1, фармацевтическая композиция, содержащая указанное антитело или его фрагмент или конъюгат, для лечения или профилактики злокачественной опухоли, ассоциированной с CAPRIN-1, ДНК, кодирующая указанное антитело. Раскрыт способ лечения или профилактики злокачественной опухоли, ассоциированной с CAPRIN-1, с применением заявленного антитела. Изобретение обладает способностью специфически связываться с CAPRIN-1, что позволяет эффективно лечить злокачественную опухоль, ассоциированную с экспрессией CAPRIN-1. 6 н. и 2 з.п. ф-лы, 8 пр.

1. Антитело, специфически связывающееся с CAPRIN-1, или его фрагмент, которое(ый) обладает иммунологической реактивностью в отношении белка CAPRIN-1, причем антитело или его фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющие комплементарность области SEQ ID NO: 5, 6 и 7, и вариабельную область легкой цепи, содержащую определяющие комплементарность области SEQ ID NO: 9, 10 и 11.

2. Антитело или его фрагмент по п. 1, где антитело представляет собой антитело человека, гуманизированное антитело, химерное антитело, одноцепочечное антитело или полиспецифическое антитело.

3. Конъюгат антитела, специфически связывающийся с CAPRIN-1, содержащий антитело или его фрагмент по п. 1 или 2 и противоопухолевое средство.

4. Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики злокачественной опухоли, которая ассоциирована с экспрессией CAPRIN-1, содержащая антитело или его фрагмент по п. 1 или 2 или конъюгат антитела по п. 3 в качестве активного ингредиента.

5. Фармацевтическая композиция по п. 4, где злокачественная опухоль представляет собой рак молочной железы, рак почки, рак поджелудочной железы, рак толстого кишечника, рак легких, опухоль головного мозга, рак желудка, рак шейки матки, рак яичников, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, рак пищевода, лейкоз, лимфому, фибросаркому, мастоцитому или меланому.

6. Фармацевтическая комбинация для лечения или профилактики злокачественной опухоли, которая ассоциирована с экспрессией CAPRIN-1, содержащая фармацевтическую композицию по п. 4 или 5 и фармацевтическую композицию, содержащую противоопухолевое средство.

7. ДНК, кодирующая антитело или его фрагмент по п. 1 или 2.

8. Способ лечения или профилактики злокачественной опухоли, которая ассоциирована с экспрессией CAPRIN-1, включающий введение антитела или его фрагмента по п. 1 или 2, конъюгата антитела по п. 3, фармацевтической композиции по п. 4 или 5 или фармацевтической комбинации по п. 6 исследуемому индивидууму.