Предупреждение и лечение воспалительных состояний Российский патент 2019 года по МПК A61K31/4436 A61P1/16 A61P29/00 A61K31/7024 A61K31/19 A61K31/7032 

Область техники

[0001] Настоящие варианты осуществления относятся к композициям и способам модулирования рецептора ретиноевой кислоты (RAR) при предупреждении и лечении воспалительных состояний печени.

Уровень техники

[0002] Избыточное употребление алкоголя является основной причиной заболеваний печени на Западе. Признаки повреждения печени наблюдают у лиц, которые употребляют четыре или более порции алкогольного напитка в день (четыре по 12 унций пива, четыре стакана вина или четыре унции крепкого напитка для мужчин или половину этого количества для женщин). Несмотря на то, что до конца не понятно, как алкоголь повреждает печень, постоянное употребление алкоголя в результате приводит к секреции провоспалительных цитокинов (TNF-альфа, IL6 и IL8), оксидативному стрессу, перекисному окислению липидов и токсическому действию уксусного альдегида, что приводит к воспалению, апоптозу и, в итоге, к фиброзу клеток печени.

[0003] Алкогольная болезнь печени (ALD) имеет три основные фазы: алкогольная жировая болезнь печени, алкогольный гепатит и цирроз. Алкогольная жировая болезнь печени, которая характеризуется накоплением жирных кислот в печени, является обычно асимптоматичной и обратимой в том случае, если лицо воздержится от алкоголя в течение пары недель. В тяжелых случаях можно испытывать слабость, тошноту, боли в животе, снижение аппетита и беспокойство. Несмотря на то, что у большинства злоупотребляющих спиртными напитками наблюдается некоторая степень жировой болезни печени, в некоторых случаях, когда сильная тяга к употреблению спиртного наблюдается ежедневно в течение периода менее недели, только у одного из пяти злоупотребляющих спиртными напитками развивается алкогольный гепатит и у одного из четырех развивается цирроз. Алкогольный гепатит характеризуется воспалением гепатоцитов и обычно является обратимым при воздержании от спиртного. Цирроз, который характеризуется воспалением, фиброзом (уплотнение клеток) и повреждением мембран, что препятствует детоксикации химических веществ в организме и заканчивается образованием рубцов и некрозом, обычно является необратимым.

[0004] Не до конца понятными являются клеточные и молекулярные механизмы, которые лежат в основе различных фаз повреждения тканей печени при алкогольной болезни печени. Несмотря на прогресс в нескольких областях, все еще отсутствует эффективный терапевтический подход к препятствованию развития этого заболевания. Это отчасти является следствием того, что печень иммунологически, а также анатомически является уникальным органом. Например, в то время как паренхиматозные клетки печени обладают метаболическими функциями, непаренхиматозные клетки выполняют иммунологические функции. В дополнение к паренхиматозным гепатоцитам, печень включает несколько типов непаренхиматозных клеток, таких как LSEC, клетки Купфера, дендритные клетки, NK-клетки и NKT-клетки, все из которых могут принимать участие в иммунитете. Неизвестно, как организован иммунный ответ при получении либо толерантности, либо иммунитета к алкогольному повреждению.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0005] Настоящие варианты осуществления, в целом, относятся к способам и композициям для модуляции врожденной иммунной системы для предупреждения и лечения повреждения ткани, ассоциированного с воспалительными состояниями. Например, несколько вариантов осуществления, описанных в данном документе, относятся к предупреждению и лечению алкогольной болезни печени (ALD) при помощи модуляции врожденной иммунной системы.

[0006] Несколько описанных в данном документе вариантов осуществления относятся к способам и композициям для осуществления влияния на активность NKT-клеток I типа и NKT-клеток II типа, взаимодействия между NKT-клетками I типа и II типа и их взаимодействия с другими клетками печени с целью лечения, смягчения или предупреждения ассоциированного с воспалением поражения печени. В некоторых вариантах осуществления ассоциированное с воспалением поражение является индуцированным алкоголем поражением печени. В некоторых вариантах осуществления индуцированное алкоголем поражение печени представляет собой связанное с алкоголем заболевание печени, жировую болезнь печени, стеатоз печени, алкогольный гепатит или алкогольный цирроз.

[0007] Несколько вариантов осуществления относятся к способу предупреждения, смягчения или лечения индуцированного воспалением повреждения печени после избыточного употребления алкоголя посредством ингибирования активности NKT-клеток I типа. В некоторых вариантах осуществления провоспалительную активность NKT-клеток I типа ингибируют с помощью одного или нескольких агонистов RAR, выбранных из группы, состоящей из ATRA, ретинола, 9-цис-RA или 13-цис-RA, третиноина, АМ580, АС55649, CD1530 и тазаротена. В некоторых вариантах осуществления провоспалительную активность NKT-клеток I типа ингибируют с помощью одного или нескольких полиолефиновых ретиноидов, таких как изоретинонин и ацитретин. В некоторых вариантах осуществления провоспалительную активность NKT-клеток I типа ингибируют с помощью одного или нескольких агонистов RAR, выбранных из группы, состоящей из этретината, ацитретина и изотретиноина. Несколько вариантов осуществления относятся к ингибированию провоспалительной активности NKT-клеток I типа с помощью тазаротена, тазаротеновой кислоты или их смеси. В некоторых вариантах осуществления провоспалительную активность NKT-клеток I типа ингибируют с помощью активации NKT-клеток 2 типа. В некоторых вариантах осуществления воспалительную активность NKT-клеток I типа ингибируют с помощью одного или нескольких сульфатидов.

[0008] Некоторые варианты осуществления по настоящему раскрытию относятся к механизмам врожденного иммунитета, приводящим к поражению печени после употребления алкоголя, связанному с ним или вызванному им. Некоторые варианты осуществления относятся к осуществлению влияния на взаимодействия среди этих клеток, которые обычно обеспечивают толерантность к поступающим из кишечнике или образующимся из метаболитов антигенам и в то же время обеспечивают иммунитет к не идентифицируемых в качестве "своих" патогенам.

[0009] Некоторые варианты осуществления относятся к комбинированному терапевтическому подходу, направленному на NKT-клетки как I типа, так и II типа, для разработки эффективного терапевтического средства для лечения, предупреждения или смягчения повреждения ткани, ассоциированного с воспалительными состояниями. В некоторых вариантах осуществления агонист RAR применяют для прямого ингибирования активности NKT-клеток 1 типа, а сульфатид применяют для активации активности NKT-клеток II типа.

[0010] Некоторые варианты осуществления относятся к предупреждению и лечению повреждения ткани, ассоциированного с ALD, посредством введения всех транс-изомеров ретиноевой кислоты (ATRA). Несколько вариантов осуществления относятся к применению ATRA при предупреждении и лечении индуцированного алкоголем поражения печени, связанного с алкоголем заболевания печени, жировой болезни печени, стеатоза печени, алкогольного гепатита или алкогольного цирроза.

[0011] Некоторые варианты осуществления относятся к предупреждению и лечению повреждения ткани, ассоциированного с ALD, посредством введения тазаротена, тазаротеновой кислоты или их смеси. Несколько вариантов осуществления относятся к применению тазаротена, тазаротеновой кислоты или их смеси при предупреждении и лечении индуцированного алкоголем повреждения печени, связанного с алкоголем заболевания печени, жировой болезни печени, стеатоза печени, алкогольного гепатита или алкогольного цирроза.

[0012] Некоторые варианты осуществления относятся к предупреждению и лечению повреждения ткани, ассоциированного с воспалением, посредством введения одного из нескольких сульфатидов. Несколько вариантов осуществления относятся к применению сульфатида при предупреждении и лечении индуцированного алкоголем поражения печени, связанного с алкоголем заболевания печени, жировой болезни печени, стеатоза печени, алкогольного гепатита или алкогольного цирроза. В некоторых вариантах осуществления сульфатид имеет следующую химическую структуру:

[0013] где R₁ выбран из группы, состоящей из связи, водорода, C₁-С₃₀алкила, замещенного C₁-С₃₀алкила, C₁-С₃₀алкенила, замещенного C₁-С₃₀алкенила и C₅-C₁₂caxapa; R₂ выбран из группы, состоящей из водорода, гидроксигруппы, метоксигруппы и алкоксигруппы; R₃ выбран из группы, состоящей из водорода, гидроксигруппы, метоксигруппы, этоксигруппы и алкоксигруппы; R₄ выбран из группы, состоящей из водорода, гидроксигруппы и алкоксигруппы; R₅ выбран из группы, состоящей из водорода, гидроксила, карбонила, алкокси и связи; R₆ выбран из группы, состоящей из С₁-С₄₀алкила, замещенного С₁-С₄₀алкила, С₁-С₄₀алкенила, замещенного С₁-С₄₀алкенила и С_1-С₄₀алкинила; R₇ выбран из группы, состоящей из С₁-С₄₀алкила, замещенного С_1-С₄₀алкила, С₁-С₄₀алкенила, замещенного С₁-С₄₀алкенила и С₁-С₄₀алкинила; и R₈ выбран из группы, состоящей из водорода, гидроксильной группы, карбонила, алкоксигруппы и связи. В некоторых вариантах осуществления сульфатид имеет следующую химическую структуру:

[0014] Некоторые варианты осуществления относятся к регуляции NKT-клеток I типа посредством активированных сульфатид-реактивных NKT-клеток II типа. Несколько вариантов осуществления относятся к регуляторной роли активированных сульфатид-реактивных NKT-клеток II типа в отношении NKT-клеток I типа при опосредовании защиты от аутоиммунного заболевания и подавлении противоопухолевого иммунитета.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0015] На Фиг. 1а изображена методика, при помощи которой определяют влияние сульфатида на NKT I типа в печени. На Фиг. 1b показаны репрезентативные данные двух независимых экспериментов, в которых измеряли клеточную пролиферацию в ответ на контрольное заражение αGalCer in vitro в присутствии или при отсутствии 10 нг/мл IL-2. На Фиг. 1с показаны результаты внутрицитоплазматического окрашивания сульфатид/CD1d-тетрамер+ и тетрамер- популяций в печени для идентификации IFN-γ+клеток после инъекцирования 20 мкг сульфатида. Числа за скобками указывают % положительных клеток у мышей, которым инъекцировали PBS или сульфатид. На Фиг. 1d показаны микрофотографии (Х200) репрезентативных окрашенных гематоксилином и эозином (Н&Е) срезов печени, взятых у мышей через 12-96 часов после обработки только ConA (верхний ряд) или ConA плюс сульфатид из бычьего головного мозга (нижний ряд). Снизу слева показана иллюстративная микрофоторафия окрашеного Н&Е среза печени от контрольной мыши, которой инъецировали только сульфатид. На Фиг. 1е показаны графики с изображением уровней аланинаминотрансферазы (ALT) и аспартатаминотрансферазы (AST) у мышей IL-12p40+/+ в различные моменты времени после инъекции ConA (закрашенные символы) или ConA плюс сульфатид (незакрашенные символы). Величины представляют собой среднее ± SD у 5 мышей на группу. Р < 0,001.

[0016] На Фиг. 2а показаны точечные диаграммы Gr-1/CD11b экспрессирующих клеток, выделенных из краниальных долей печени мышей дикого типа (WT), Jα18-/- мутантных и обработанных сульфатидом мышей WT, подвергавшихся симуляционному хирургическому вмешательству или ишемическому реперфузионному повреждению (IRI). Прямоугольниками показаны Gr-1^high и Gr-1^int популяции, проанализированные на Фиг. 2b. Числа рядом с прямоугольниками показывают процент положительных клеток среди лейкоцитов печени. На Фиг. 2b показаны столбчатые диаграммы, обобщающие результаты проточного цитометрического анализа. В левой секции показан %, а в правой секции показаны абсолютные числа популяций Gr-1^high и Gr-1^int. Величины представляют собой среднее ± SEM. *р < 0,005. На Фиг. 2с показан график, отображающий % IFN-γ+ αGalCer/CD1d-тетраметр+ клеток в печени IRI, подвергавшихся симуляционному хирургическому вмешательству и обработанных сульфатидом мышей с IRI. Величины представляют собой среднее ± SEM. Р<0,01.

[0017] На Фиг. 3 изображена модель сульфатидного опосредования активности NKT-клеток I типа и II типа. В соответствии с этой моделью сульфатид способствует активации NKT-клеток II типа, которые, в свою очередь, инактивируют NKT-клетки I типа. Ингибирование NKT-клеток I типа проиллюстрировано при помощи ингибирования секреции IFN-γ, приводящей в результате к уменьшению рекрутинга в печени миелоидных клеток, гранулоцитов и, как следствие, к уменьшению поражения гепатоцитов и эндотелиальных клеток.

[0018] На Фиг. 4 показаны иллюстративные микрофотографии окрашенной Н&Е ткани краниальных долей печени мышей, подвергавшихся 90-минутной ишемии печени с последующей 24-часовой реперфузией (IRI) (верхний ряд), и мышей, подвергавшихся симуляционному хирургическому вмешательству (симуляции) (нижний ряд) при 100Х увеличении. Слева направо в секциях показаны ткань от необработанных мышей WT, необработанных мышей Jα18-/-, сульфатид-обработанных мышей WT и сульфатид-обработанных мышей Jα18-/-.

[0019] На Фиг. 5 показаны графики, обобщающие результаты проточного цитометрического анализа печеночных MNC, выделенных от групп (4 в каждой) самцов мышей WT BL/6 или Jα18-/- через 5 недель употребления жидкого корма Либера-Де Карли, содержащего 5% этанол, либо контрольного корма, содержащего такое же число калорий. Значения Р < 0,005. Накопление активированных NKT-клеток I типа и CD11b+Gr-1+ миелоидных клеток наблюдали в печени мышей WT, но не мышей Jα18-/-.

[0020] На Фиг. 6 показана столбчатая диаграмма, отображающая уровни ALT в сыворотке у мышей WT (В6) и Jα18-/-, которым инъецировали (i.p.) 20 микрограмм/мышь сульфатида (d-1 и d10) (столбцы, заштрихованные горизонтальными линиями (сульфатид)), 0,3 миллиграмма/животное ATRA (d6-d10) (столбцы, заштрихованные вертикальными линиями (atRA)) или носителя/DMSO (полностью заштрихованные столбцы (EtOH)), и употреблявших жидкий корм Либера-Де Карли, содержащий алкоголь. Контрольные группы (незаштрихованные столбцы) кормили изокалорийным контрольным кормом. Значения Р < 0,05.

[0021] На Фиг. 7 показаны иллюстративные микрофотографии (Х200) ткани печени, взятые у обработанных носителем/DMSO, сульфатидом и ATRA мышей после постоянного плюс чрезмерного употребления этанола. На ткани печени от обработанных носителем/DMSO мышей видны признаки стеатогепатита печени (жировой болезни печени), в то время как ткань печени, полученная от обработанных сульфатидом и ATRA мышей, выглядит относительно нормальной.

[0022] На Фиг. 8а показана столбчатая диаграмма, отображающая пролиферацию (которая измерена по включению [³Н]-тимидина) свежевыделенных NKT-клеток I типа селезенки, инкубированных в αGalCer отдельно, ATRA отдельно или в αGalCer с повышающимися уровнями ATRA. На Фиг. 8b показан график, отображающий уровень секреции цитокинов IL-2 NKT-клетками I типа (Ну1.2) в ответ на αGalCer отдельно или αGalCer и повышающиеся уровни ATRA. На Фиг. 8с показаны графики, отображающие уровни секреции цитокинов IFN-γ, IL-4, IL-13, IL-6, IL-10 и IL-12 NKT-клетками I типа печени, взятыми от мышей, которым инъецировали DMSO или ATRA, и инкубированными в присутствии αGalCer in vitro. Показанные данные являются репрезентативными для 2 отдельных экспериментов.

[0023] На Фиг. 9а показаны иллюстративные микрофотографии (Х200) окрашенной Н&Е ткани печени, взятой от самцов мышей BL/6 и Jα18-/- после постоянного (10 дней 5% этанола в жидком корме Либера-Де Карли) или постоянного плюс чрезмерного употребления (десять дней постоянного употребления жидкого корма с последующим однократным принудительным кормлением 5 г/кг этанола). На Фиг. 9b показаны графики, отображающие уровни ALT в сыворотке у контрольных или употреблявших этанол самцов мышей BL/6 или Jα18-/- после постоянного или постоянного плюс чрезмерного употребления.

[0024] На Фиг. 10 показана столбчатая диаграмма, отображающая пролиферацию (которую измеряли по включению [³Н]-тимидина) свежевыделенных реактивных в отношении основного белка миелина MBPAc1-9 CD4+ Т-клеток, выделенных от интактных трансгенных мышей B10.PL Vβ8.2 TCR, в ответ на стимуляцию отдельно МВРАс1-9 или МВРАс1-9 и ступенчатые концентрации ATRA (0,15, 1,2, 18,8 мкг/мл).

[0025] На Фиг. 11 показан график, отображающий уровень IL-2, секретируемого NKT-клетками I типа (Ну 1.2), культивированными in vitro в присутствии ступенчатых концентраций липидного антигена, αGalCer и 0, 5 или 10 мкг/мл ATRA в течение 24 часов.

[0026] На Фиг. 12 показан график, отображающий пролиферацию (которую измеряли по включению [³Н]-тимидина) свежевыделенных NKT-клеток I типа селезенки, культивированных в присутствии αGalCer и ступенчатых концентраций ATRA, агониста RARα (АМ580), агониста RAR β 2 (АС55649) или агониста RARγ (CD1530).

[0027] На Фиг. 13 показан график, отображающий пролиферацию (которую измеряли по включению [3Н]-тимидина) свежевыделенных NKT-клеток I типа селезенки, культивированных в присутствии αGalCer и ступенчатых концентраций агониста PPAR-γ (росиглитазон) или антагониста PPAR-γ (GW9662).

[0028] На Фиг. 14 показан график, отображающий пролиферацию (которую измеряли по включению [3Н]-тимидина) свежевыделенных NKT-клеток I типа селезенки, культивированных в присутствии αGalCer и ступенчатых концентраций ATRA, различных аналогов ретиноевой кислоты, ретинола или витамина А.

[0029] На Фиг. 15 показаны столбчатые диаграммы, отображающие пролиферацию (которую измеряли по включению [³Н]-тимидина) свежевыделенных NKT-клеток I типа селезенки (слева) или гибридомы NKT-клетки I типа (1.2 Hyb), культивированных в присутствии оптимальных концентраций αGalCer (10 нг/мл) и оптимальных концентраций ATRA, третиноина, агониста RARα (АМ580), агониста RAR β 2 (АС55649) или агониста RARγ (CD 1530). Данные диаграмм являются репрезентативными для 3 независимых экспериментов.

[0030] На Фиг. 16 показаны графики, отображающие результаты in vitro анализов пролиферации свежевыделенных спленоцитов (верхняя секция) или высвобождения цитокинов у гибридомы NKT-клетки I типа (1.2 Hyb) (нижняя секция), культивированных с оптимальными концентрациями αGalCer (10 нг/мл) в присутствии повышающихся концентраций ATRA или селективного агониста RARγ тазаротена. Тазаротен демонстрирует лучшее ингибирование NKT-клеток I типа, чем ATRA.

[0031] На Фиг. 17 показан график, отображающий результаты ex vivo анализа пролиферации NKT-клеток I типа, выделенных от мышей, обработанных тазаротеном, ATRA или DMSO (контроль) и стимулированных оттитрованными концентрациями αGalCer.

[0032] На Фиг. 18 показаны результаты анализа мононуклеарных клеток, выделенных из печени мышей, которым инъецировали ATRA, тазаротен или DMSO (контроль), и окрашенных αGalCer/CD1d-тетрамерами и общими цепями антител к TCRP, посредством проточной цитометрии. NKT-клетки I типа обведены прямоугольником. Не было значимого отличия в количестве (показанном рядом с прямоугольником) NKT-клеток I типа в контроле по сравнению с животными, которым вводили ATRA или тазаротен.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0033] В печени находится ряд специализированных клеток врожденной иммунной системы, включая клетки Купфера, натуральные клетки-киллеры (NK), натуральные Т-клетки-киллеры (NKT) и дендритные клетки. NKT-клетки являются уникальными в том, что они имеют общие рецепторы клеточной поверхности с NK-клетками (например, NK1.1) и дополнительно экспрессируют Т-клеточные рецепторы (TCR), что дает им возможность распознавать липидные антигены с контексте CD1d молекулами, и образовывать связь между врожденными иммунными ответами и приобретенным иммунитетом. NKT-клетки обладают способностью регулировать активность других клеток, которые вносят вклад в воспаление ткани и связанное с ним клеточное повреждение. При активации NKT-клетки быстро секретируют в больших количествах IFN-γ, IL-4, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, а также множество других цитокинов и хемокинов. Поскольку NKT-клетки способны секретировать как Th1, так и Th2-цитокины, трудно предсказать последствия активации NKT-клеток in vivo. В зависимости от ситуации активация NKT-клеток запускает каскады событий, которые стимулируют и подавляют различные иммунные ответы. В некоторых случаях активация NKT-клеток приводит к активации NK-клеток, дендритных клеток (DC) и В-клеток.

[0034] NKT-клетки распознают липидные антигены, представленные в контексте мономорфной молекулы, подобной МНС класса I, CD1d. CD1d-рестриктированные NKT-клетки подразделяют на I тип и II тип, которые распознают различные липидные антигены, представляемые молекулами CD1d. Несмотря на то, что обе субпопуляции NKT-клеток являются преимущественно NK1.1+ (мыши) или CD161+/CD56+ (человека), их относительное количество различается у мышей и людей: таким образом, в то время, как NKT-клетки I типа преобладают у мышей, субпопуляция NKT-клеток II типа преобладает у людей.

[0035] Тип I, также известный как инвариантные NKT-клетки, экспрессирует полуинвариантный Т-клеточный рецептор (TCR), характеризующийся у мышей Vα14-Jα18 и Vβ8.2, Vβ7 или Vβ2 или у людей Vα24-JαQ и Vβ11, сильно реактивен в отношении полученного из морской губки гликолипида α-галактозилцерамида (αGalCer), и его идентифицируют с помощью αGalCer/CD1d-тетрамеров при проточной цитометрии. NKT-клетки I типа также распознают антигены на основе липидов, такие как липиды, полученные из бактерий, и "свой" гликолипид, изоглоботригексозилцерамид (iGb3). NKT-клетки I типа несут на поверхности маркеры памяти и являются уникальными в том, что хранят предварительно сформированную мРНК для цитокинов. У мышей без гена Jα18 (мыши Jα18) отсутствуют только NKT-клетки I типа.

[0036] NKT-клетки II типа, которые отличаются от NKT-клеток I типа, являются регуляторными клетками, которые могут модулировать активность нескольких других клеточных субпопуляций, включая NKT-клетки I типа. NKT-клетки II типа распознают "свой" гликолипид, сульфатид (3'-сульфогалактозилцерамид) как у мышей, так и у людей. В основной субпопуляции NKT-клеток II типа, которые можно идентифицировать при помощи сульфатид/CD1d-тетрамеров при проточной цитометрии, преимущественно используются генные сегменты Vβ8.1/Vβ3.1-Jβ2.7 и Vα1/Vα3-Jα7, и они реактивны в отношении сульфатидов. Активацию NKT-клеток II типа можно охарактеризовать путем оценки пролиферативного ответа in vitro NKT-клеток II типа на средство-кандидат, а также оценки экспрессии С069 и профиля секреции цитокинов по окрашиванию внутриклеточных цитокинов или с помощью ПЦР в реальном времени на наличие IFN-γ, IL-4 или IL-13. В дополнение, способность активированных NKT-клеток II типа вызывать анергичность NKT-клеток I типа можно охарактеризовать путем оценки пролиферативного ответа NKT-клеток I типа на αGalCer (сильнодействующий активатор NKT-клеток I типа) при помощи анализа разбавлением CF8E и окрашивания внутриклеточных цитокинов клеток, обработанных αGalCer/CO 1 d-тетрамером.

Активность NKT-клеток I типа и II типа в печени при ишемически-реперфузионном повреждении и индуцированном конковалином А гепатите

[0037] Реперфузионное повреждение происходит при восстановлении кровоснабжения органа или ткани после периода ишемии. Реперфузионное повреждение печени обычно происходит в связи с хирургическим вмешательством или травмой и играет основную роль для качества и функционирования пересаженной ткани после трансплантации печени. Развитие ишемически-реперфузионного повреждения (IRI) происходит по меньшей мере в две фазы: начальный период (начиная от приблизительно 1 до приблизительно 6 часов реперфузии), в которой преобладает активация клеток Купфера, высвобождение активных форм кислорода, рекрутинг CD4⁺ клеток и секреция провоспалительных цитокинов, и более поздний период (после начального периода, от приблизительно 6 до приблизительно 48 часов реперфузии), который характеризуется накоплением нейтрофилов и индукцией некроза. Как показано на Фигуре 2а, у мышей дикого типа (WT), происходит рекрутинг субпопуляции миелоидных (CD11b⁺) клеток, CD11b⁺Gr-1^int, которая включает миелоидные клетки-предшественники и моноциты, в ткани, подвергавшиеся реперфузии, на ранней фазе ишемического и реперфузионного повреждения. Рекрутинг миелоидных клеток, отличных от нейрофилов, таких как субпопуляция CD11b⁺Gr-1^int, позволяет предположить, что повреждение усиливается рекрутингом воспалительных моноцитов в подвергавшиеся реперфузии ткани.

[0038] NKT-клетки I типа также становятся активированными и секретируют IFN-γ после ишемической реперфузии. См. Фиг. 2 с. Роль NKT-клеток I типа в IRI оценивали при сравнении печени мышей дикого типа (WT) и Jα18-/-, у которых отсутствуют NKT-клетки I типа, но имеются нормальные уровни NKT-клеток II типа. Как показано на Фигуре 4, после 90-минутной ишемии и 24-часовой реперфузии в краниальных долях печени мышей WT имеются большие области некроза, в то время как области некроза у мышей, у которых отсутствуют NKT-клетки I типа (мыши Jα18-/-), при сравнении были значительно меньшими. Это указывает на патогенную роль NKT-клеток I типа в опосредовании ишемического и реперфузионного повреждения печени.

Влияние сульфатид-активируемых клеток NKT-2 на клетки NKT-1

[0039] Как описано в патенте США №8044029 и заявке на патент США №12/938315, которые включены в данный документ в полном объеме посредством ссылки, введение "своего" гликолипидного лиганда, сульфатида, а также синтетических аналогов сульфатида модулирует активность NKT-клеток I типа и II типа. CD Id-зависимое распознавание сульфатида активирует NKT-клетки II типа и главным образом плазмацитоидные дендритные клетки (pDC), но не популяции обычных дендритных клеток (cDC) (которые в норме активируются NKT-клетками 1 типа), что приводит к быстрому рекрутингу NKT-клеток I типа в печени зависимым от IL-12 и MIP2 образом. Тем не менее, рекрутированные NKT-клетки I типа не являются активированными, не секретируют цитокины и становятся энергичными.

[0040] Клеточные события, вовлеченные в иммунорегуляторные механизмы после введения сульфатида in vivo, показаны на Фиг. 1. Введение сульфатида а) подавляет in vitro пролиферацию NKT-клеток I типа в ответ на стимуляцию αGalCer (Фигура 1b) и b) повышает процентное содержание сульфатид/CD1d-тетрамер+ клеток при внутрицитоплазматическом окрашивании IFN-γ (Фигура 1с).

[0041] Секреция IFN-γ NKT-клетками I типа печени в течение ранней фазы ишемического и реперфузионного повреждения значительно уменьшается у мышей, получающих сульфатид, по сравнению с необработанными животными. См. Фиг. 2 с. Кроме того, как и в случае отсутствия NKT-клеток I типа у мышей Jα18-/-, поражение печени после ишемии/реперфузии значительно уменьшается у мышей, обработанных сульфатидом. См. Фиг. 4. Это указывает на патогенную роль NKT-клеток I типа в опосредовании ишемического и реперфузионного повреждения печени. Роль секреции IFN-γ NKT-клетками I типа может быть общим признаком ишемического повреждения органа, поскольку ишемическое и реперфузионное повреждение почки также уменьшается у Jα18-/- мышей, у которых отсутствуют в NKT 1 типа.

[0042] Аналогично IRI, введение сульфатида защищает от индуцированного конканавалином А (ConA) гепатита, на что указывает уменьшение гепатоцеллюлярного некроза, см. Фиг. 1d, и уменьшение уровней в сыворотке аланинаминотрансферазы (ALT) и аспартатаминотрансферазы (AST), маркеров гепатоцеллюлярного повреждения, см. Фиг. 1е. Это указывает на патогенную роль NKT-клеток I типа при ConA-индуцированном гепатите.

[0043] В совокупности, данные от обеих моделей повреждения печени, IRI и ConA-индуцированного гепатита, согласуются со сведениями об иммунорегуляторном пути, в которых NKT-клетки I типа играют пагубную роль, а сульфатид-реактивные NKT-клетки II типа играют защитную роль при воспалении печени, происходящем по различным причинам. Такая защита связана с ингибированием секреции цитокинов NKT-клетками I типа (ингибированный фенотип) и значительным уменьшением рекрутинга в печени незрелых миелоидных клеток (CD11b+Gr-1+) CD11b+Gr-1- и NK-клеток. Ингибирование NKT-клеток I типа также связано с толеризацией или модификацией обычных дендритных клеток (cDC), и они вместе с ингибированными NKT-клетками I типа ингибируют активацию/размножение адаптивных Th1/Th17 CD4+/CD8+ Т-клеток. Это приводит к модели, где введение сульфатида стимулирует активность NKT-клеток II типа, которые, в свою очередь, ингибируют активность NKT-клеток I типа и повреждение печени, обусловленное воспалением, опосредованным NKT-клетками I типа. См. Фиг. 3.

Роль NKT-клеток при алкогольной болезни печени

[0044] Алкогольная болезнь печени (ALD) развивается в результате повреждения клеток печени, вызванного избыточным употреблением алкоголя. Для того, чтобы наблюдались клинические проявления ALD, необходимы многократные инсульты. Тем не менее, как описано в данном документе, значительное повышение количества NKT-клеток I типа (αGalCer/CD1d-тетраметр+ клеток), CD4+ клеток и CD11b+Gr-1+миелоидных клеток, но не NKT-клеток II типа или CD11b+Gr-1-клеток наблюдается в печени после постоянного употребления алкоголя. См. Пример 6 и Фиг. 5. Усиленная экспрессия маркера CD69 дополнительно указывает на то, что NKT-клетки I типа частично активированы. Таким образом, даже при отсутствии любых клинических признаков заболевания (доклиническая фаза) клетки, опосредующие воспалительную реакцию, накапливаются в печени после избыточного употребления алкоголя. В отсутствии NKT-клеток I типа (мыши Jα18-/-) накопление CD11b+Gr-1+ миелоидных клеток в печени после постоянного употребление алкоголя значительно уменьшено. См. Пример 6 и Фиг. 5. Эти данные позволяют предположить, что NKT-клетки I типа вовлечены в опосредование доклинической фазы ALD.

[0045] В соответствии с данными, позволяющими предположить роль NKT-клеток I типа в доклинической фазе ALD, клинические проявления повреждения печени после избыточного употребления алкоголя значительно уменьшаются, согласно измерениям, например, путем гистологического анализа или анализа ферментов печени у мышей, у которых отсутствуют NKT-клетки I типа (Jα18-/-). См. Пример 6 и Фигуры 6 и 7. Такие данные позволяют предположить, что NKT-клетки I типа играют важную роль при алкогольном повреждении печени.

[0046] NKT-клетки экспрессируют Т-клеточные рецепторы, которые дают им возможность распознавать липидные антигены в контексте молекул CD1d. Не желая ограничиваться отдельной теорией, NKT-клетки I типа активируются в печени после употребления этанола посредством локального представления окисленных "своих" липидов экспрессирующими CD1d антиген-представляющими клетками (АРС). Активированные NKT-клетки I типа затем инициируют многоэтапный процесс, приводящий в результате к активации клеток Купфера, рекрутингу/активации гранулоцитов с последующим воспалительным повреждением гепатоцитов.

[0047] Взаимодействие подтипов NKT-клеток после употребления алкоголя определяет стадию повреждения печени и, в тяжелых случаях, алкогольной болезни печени (ALD). Несколько описанных в данном документе вариантов осуществления относятся к способам и композициям для осуществления влияния на выполнение противоположных ролей NKT-клетками I типа и NKT-клетками II типа и их взаимодействия с другими клетками печени с целью лечения, облегчения или предупреждения поражения печени после употребления алкоголя.

[0048] Несколько описанных в данном документе вариантов осуществления относятся к модулированию активности подтипов NKT-клеток для лечения, смягчения или предупреждения индуцированного алкоголем поражения печени. Как описано в данном документе, введение сульфатида или агонистов рецепторов ретиноевой кислоты (RAR) ингибирует индуцированное алкоголем повреждение печени. Например, инъекции сульфатида или агониста рецепторов ретиноевой кислоты (RAR), полностью трансретиноевой кислоты (ATRA), при постоянном употреблении алкоголя и до чрезмерного употребления этанола имели защитный эффект, который показан по результатам гистологического исследования и анализа уровней печеночных ферментов в сыворотке. См. Пример 7 и Фигуры 6 и 7.

[0049] Несколько вариантов осуществления относятся к защитной роли при индуцированном алкоголем поражении печени основной субпопуляции NKT-клеток II типа, которые реактивны по отношению к сульфатиду. Активация такой субпопуляции NKT-клеток сульфатидом ингибирует опосредованное NKT-клетками I типа поражение после избыточного употребления алкоголя. Сульфатид-опосредованная защита связана с активацией NKT-клеток II типа, и ингибированием секреции IFN-γ NKT-клетками I типа печени, и подавлением опосредованного NKT-клетками I типа рекрутинга миелоидных клеток, например, CD11b⁺Gr-1^int и Gr-1^- субпопуляций и NK-клеток в печени.

[0050] Обработка сульфатидом дает в результате почти полную защиту от повреждения печени после избыточного употребления алкоголя. См. Фигуры 6 и 7. Не желая ограничиваться отдельной теорией, защитное действие сульфатида опосредовано прямой активацией NKT-клеток II типа, которые оказывают ингибирующее влияние на NKT-клетки I типа и cDC.

[0051] Линии Т-клеток из лимфоцитов периферической крови (PBL) двух здоровых доноров получали после стимуляции in vitro посредством либо αGalCer, либо сульфатида и анализировали при помощи проточной цитометрии. Около 2% Т-клеток в этой линии клеток окрашиваются сульфатидом/hCD1d-тетрамерами после двух циклов стимуляции. Аналогично мышиной системе, в таких клетках не используется инвариантный Vα24-Va11 TCR. Такие данные показывают наличие сульфатид-реактивных NKT-клеток II типа у здоровых индивидов и указывают на эффективность применения сульфатида/CD1d-тетрамеров человека при получении характеристик NKT-клеток II типа человека при алкогольной болезни печени.

[0052] В некоторых вариантах осуществления сульфатид может представлять собой, например, полученный из бычьего головного мозга сульфатид, который является смесью из приблизительно 20 различных видов, полученных от Sigma Inc. (Чикаго, Иллинойс, США). В других вариантах осуществления сульфатид является полусинтетическим и представляет собой отдельный вид сульфатида, например, цистетракозеноилсульфатид или лизосульфатид, полученный от Maitreya Inc, (Плезант Гэп, Пенсильвания, США). В других вариантах осуществления сульфатид может быть полностью синтетическим сульфатидом.

[0053] Сульфатид, полученный из миелина бычьего головного мозга, состоит из смеси 2:1 насыщенных/ненасыщенных основных ацильных цепей (С₂₄) с ненасыщенностью при С₁₉. Несколько вариантов осуществления относятся к применению синтетических аналогов сульфатида, таких как аналоги с насыщенной ацильной цепью (С₂₄) и ненасыщенными цепями (С₂₄: 1), а также аналоги, состоящие из ацильных цепей различной длины в жирнокислотных или сфигозиновых фрагментах (более короткие, а также более длинные, например, С₁₈, С₃₂) и позиционные изомеры с 3' к 4'-сульфатной группой на галактозном фрагменте (3'-803 к 4'-803).

[0054] В некоторых вариантах осуществления сульфатид имеет следующую химическую формулу I:

[0055] где R₁ может представлять собой связь, водород, C₁-С₃₀алкил, замещенный С_1-С30алкил, C₁-С₃₀алкенил, замещенный C₁-С₃₀алкенил или C₅-C₁₂caxap; R₂ может представлять собой водород, гидроксигруппу, метоксигруппу или алкоксигруппу; R₃ может представлять собой водород, гидроксигруппу, метоксигруппу, этоксигруппу или алкоксигруппу; R₄ может представлять собой водород, гидроксигруппу или алкоксигруппу; R₅ может представлять собой водород, гидроксигруппу, карбонил, алкоксигруппу или связь; R₆ может представлять собой С₁-С₄₀алкил, замещенный C₁-С₄₀алкил, С₁-С₄₀алкенил, замещенный С₁-С₄₀алкенил или С₁-С₄₀алкинил; R₇ может представлять собой С₁-С₄₀алкил, замещенный С₁-С₄₀алкил, С₁-С₄₀алкенил, замещенный С₁-С₄₀алкенил или С₁-С₄₀алкинил и R₈ может представлять собой водород, гидроксигруппу, карбонил, алкоксигруппу или связь.

[0056] В других вариантах осуществления сульфатид имеет следующую химическую формулу II:

[0057] где R₁ выбран из группы, состоящей из С₁-С₄₀алкила, замещенного С₁-С₄₀алкила, С₁-С₄₀алкенила, замещенного С₁-С₄₀алкенила и С₁-С₄₀алкинила; и R₂ выбран из группы, состоящей из водорода, гидроксильной группы, карбонила, алкоксигруппы и связи.

[0058] В другом варианте осуществления сульфатид имеет следующую химическую структуру:

[0059] Применяемый в данном документе термин "алкил" означает любой неразветвленный или разветвленный насыщенный углеводород. Термин "замещенный алкил" означает любой неразветвленный или разветвленный замещенный насыщенный углеводород. Циклические соединения, как циклические углеводороды, так и циклические соединения с гетероатомами, охватываются значением "алкил".

[0060] Применяемый в данном документе термин "замещенный" означает любое замещение атома водорода на функциональную группу.

[0061] Применяемый в данном документе термин "функциональная группа" имеет свое общепринятое определение и относится к химическим фрагментам, предпочтительно выбранным из группы, состоящей из атома галогена, C₁-С₂₀алкила, замещенного C₁-С₂₀алкила, пергалогенированного алкила, циклоалкила, замещенного циклоалкила, арила, замещенного арила, бензила, гетероарила, замещенного гетероарила, циано и нитро.

[0062] Применяемые в данном документе термины "галоген" и "атом галогена" относятся к любому из радиоактивно стабильных атомов из 17 колонки периодической таблицы элементов, предпочтительно фтору, хлору, брому или йоду, причем фтор и хлор являются особенно предпочтительными.

[0063] Применяемый в данном документе термин "алкенил" означает любой неразветвленный или разветвленный замещенный или незамещенный ненасыщенный углеводород. Термин "замещенный алкенил" означает любой неразветвленный или разветвленный замещенный ненасыщенный углеводород, замещенный одной или несколькими функциональными группами, причем неразветвленные вторичные С₂-С₆алкениламины, замещенные вторичные С₂-С₆алкениламины и неразветвленные третичные С₂-С₆алкениламины охватываются определением "замещенный алкил".

Циклические соединения, как ненасыщенные циклические углеводороды, так и циклические соединения с гетероатомами, охватываются значением "алкенил".

[0064] Применяемый в данном документе термин "алкокси" относится к любому неразветвленному или разветвленному замещенному или незамещенному насыщенному или ненасыщенному простому эфиру.

[0065] Применяемый в данном документе термин "сульфатид" сохраняет свое общепринятое значение и относится к сложному эфиру цереброзида и серной кислоты, содержащему одну или несколько сульфатных групп в части молекулы, относящейся к сахару.

[0066] Применяемый в данном документе термин "цереброзид" относится к любому липидному соединению, содержащему сахар, и обычно относитсящемуся к типу, в норме обнаруживаемому в головном мозге и нервной ткани.

[0067] Соединения формулы (I), (II) и (III) могут находиться в форме своих фармацевтически приемлемых нетоксичных солей. Соли формулы (I), (II) и (III) включают соли присоединения кислоты, такие как соли с неорганическими кислотами (например, соляной кислотой, серной кислотой, азотной кислотой и фосфорной кислотой) или с органическими кислотами (например, уксусной кислотой, пропионовой кислотой, малеиновой кислотой, олеиновой кислотой, пальмитиновой кислотой, лимонной кислотой, янтарной кислотой, винной кислотой, фумаровой кислотой, глутаминовой кислотой, пантотеновой кислотой, лаурилсульфоновой кислотой, метансульфоновой кислотой и фталевой кислотой).

[0068] Соединения формулы (I), (II) и (III) могут находиться в форме их сольватов (например, гидратов).

[0069] Соединения формулы (I), (II) и (III) можно получать при помощи любого способа, предназначенного для синтеза сульфатидов.

[0070] Соединения формул (I), (II) и (III) также можно выделять из природных продуктов (например, биологических организмов) и очистить колоночной хроматографией или подобным способом.

[0071] В одном варианте осуществления сульфатид имеет химическую формулу: (2S, 3R, 4Е)-N-нервон-1-[-D-(3-сульфат)-галактопиранозил]-2-аминооктадецен-3-ол. Эту химическую формулу также называют цис-тетракозеноилсульфатидом.

[0072] В некоторых вариантах осуществления конкретное количество сульфатида, вводимого пациенту, будет варьировать в зависимости от заболевания или состояния, которое лечат, а также возраста, веса и пола пациента, которого лечат. Обычно для достижения такой конечной концентрации, например, в кишечнике или крови, количество молекулы сульфатида в композиции однократной дозировки по настоящим вариантам осуществления обычно будет составлять от приблизительно 0,1 миллиграмма до приблизительно 100 миллиграмм, предпочтительно от приблизительно 2,0 миллиграмм до приблизительно 60 миллиграмм, более предпочтительно от приблизительно 20 миллиграмм до приблизительно 50 миллиграмм. Аналогично этому, количество вторичного терапевтического соединения в композиции однократной пероральной дозировки по настоящим вариантам осуществления обычно будет находиться в диапазоне от приблизительно 0,01 миллиграмма до приблизительно 1000 миллиграмм, более предпочтительно от приблизительно 0,1 миллиграмма до приблизительно 100 миллиграмм. Очевидно, точная дозировка будит варьировать в зависимости от заболевания или нарушения, которое лечат, причем предпочтительные диапазоны можно без труда определить.

[0073] В одном варианте осуществления пациенту вводят сульфатид в количестве 0,1-10 мг/кг веса тела. Более предпочтительно вводят сульфатид в количестве 1-10 мг/кг веса тела. Предпочтительно в случае необходимости эту дозировку повторяют каждый день.

Влияние агонистов рецепторов ретиноевой кислоты (RAR) на активность NKT-клеток

[0074] Как описано в данном документе, введение агониста рецепторов ретиноевой кислоты (RAR), полностью транс-ретиноевой кислоты (ATRA), значительно ингибирует повреждение печени, вызванное употреблением алкоголя. Всасывание этанола уменьшает количество сложных ретиниловых эфиров печени и изменяет физиологические уровни полностью транс-ретиноевой кислоты (ATRA), биологически активной формы витамина А, которая поддерживает множество биологических функций и может улучшать образование, стабильность и функцию дифференцировки наивных CD4+ Т-клеток в FoxP3+ Tregs даже в присутствии IL-6. Несколько описанных в данном документе вариантов осуществления относятся к обнаружению того, что ATRA ингибирует эффекторную функцию NKT-клеток I типа, включая подавление секреции цитокинов этими клетками. См. Примеры 8, 9 и 11 и Фиг. 8, 10 и 11. Кроме того, ATRA оказывает прямое ингибирующее влияние на активность NKT-клеток I типа, проявляя свое ингибирующее влияние в отсутствии антиген-представляющих клеток. См. Пример 11, Фиг. 11. В дополнение, ATRA прямо не ингибирует активность обычных МНС-рестриктированных CD4+ Т-клеток, которые распознают белковые антигены, такие как основной белок миелина или MBPAc1-9. Не желая ограничиваться конкретной теорией, эти данные показывают, что ATRA защищает от повреждения печени, вызванного избыточным употреблением алкоголя, путем ингибирования NKT-клеток I типа.

[0075] Как описано в данном документе, агонисты RAR индуцируют ингибирование NKT-клеток I типа. См. Фиг. 12, 14 и 15-17. Кроме того, повреждение печени, вызванное опосредованным NKT-клетками I типа воспалением, обусловленным избыточным употребления алкоголя, можно предупредить, уменьшить или смягчить путем введения агониста RAR. Печень может воспаляться по множеству различных причин. Например, воспаление печени может быть вызвано бактериальной или вирусной инфекцией, поражением или атакой со стороны собственной иммунной системы. Несмотря на то, что воспаление в норме является защитной реакцией и необходимым этапом процесса заживления, пролонгированное и длительное воспаление может быть причиной поражения. Несколько описанных в данном документе вариантов осуществления относятся к опосредованной агонистом RAR модуляции механизмов врожденного иммунитета, которые приводит к поражению печени после воспаления, связанному с воспалением или обусловленному воспалением. Некоторые варианты осуществления относятся к способам и композициям для опосредованного агонистом RAR ингибирования активности NKT-клеток I типа, которые модулируют взаимодействия между компонентами врожденной иммунной системы для придания толерантности к поступающим из кишечника антигенам или образующимся из метаболитов антигенов без воздействия или минимальным воздействием на врожденный иммунный ответ на не идентифицируемые в качестве "своих" патогены.

[0076] Поскольку агонисты RAR могут напрямую вызывать анергичность NKT-клеток I типа, агонисты RAR можно применять для лечения любого симптома, при котором NKT-клетки I типа играют патогенную роль. Некоторые примеры заболеваний, которые можно лечить с помощью вариантов осуществления по настоящему раскрытию, включают индуцированный алкоголем гепатит, неалкогольный стеатозный гепатит, цирроз, острый цирроз, идиопатический гепатит, вирусный гепатит (А, В, С и другие), воспалительный гепатит, ассоциированный с гепатобилиарной карциномой, рассеянный склероз, сахарный диабет 1 типа, ишемическое реперфузионное повреждение, трансплантацию солидного органа, системную красную волчанку, ревматоидный артрит, амиотрофический латеральный склероз и воспалительное заболевание кишечника (болезнь Крона и колит).

[0077] В некоторых вариантах осуществления различные симптомы аутоиммунных или связанных с иммунитетом заболеваний или нарушений лечат, предупреждают или смягчают с помощью опосредованного агонистом RAR ингибирования активности NKT-клеток I типа. В частности, один аспект по настоящему варианту осуществления относится к способу лечения пациента, страдающего от симптомов аутоиммунного или иммунопатологического заболевания или нарушения, такого как, например, рассеянный склероз, системная красная волчанка, СПИД, болезнь Альцгеймера, ревматоидный артрит, инсулинозависимый сахарный диабет, аутоиммунный гепатит, астма и глютеновая болезнь, эффективным количеством агониста RAR. В некоторых вариантах осуществления опосредованное агонистом RAR ингибирование активности NKT-клеток I типа лечит, предупреждает или смягчает симптомы астмы.

[0078] Некоторые варианты осуществления относятся к способу ингибирования или предупреждения опосредованного NKT-клетками I типа воспаления после ишемической реперфузии путем введения агониста RAR. NKT-клетки I типа играют патогенную роль при таких состояниях, как ишемическое и реперфузионное повреждение. Реперфузионное повреждение может иметь место в различных тканях при восстановлении кровоснабжения после периода ишемии. Примеры включают ткань скелетных мышц после повреждения раздавливанием, сердечную мышцу в связи с инфарктом миокарда, или хирургическим вмешательством на сердце, или ишемической болезнью сердца, нервную ткань в связи с ударом или травмой головного мозга и ткань печени и почек в связи с хирургическим вмешательством или травмой. Ишемическое реперфузионное повреждение также играет главную роль в качестве и функционировании пересаженной ткани в органе-трансплантате. Ишемическое и реперфузионное повреждение является главной причиной продолжительного срока госпитализации и уменьшенной долгосрочной жизнеспособности трансплантата. В некоторых вариантах осуществления опосредованное агонистом RAR ингибирование активности NKT-клеток I типа ингибирует или предупреждает ишемическое реперфузионное повреждение печени в связи с хирургическим вмешательством или травмой.

[0079] Варианты осуществления, описанные в данном документе, относятся к ингибированию активности NKT-клеток I типа с помощью одного или нескольких агонистов рецепторов ретиноевой кислоты (RAR). Рецепторы ретиноевой кислоты включают три основных подтипа: RARα, RARβ и RARγ. Некоторые варианты осуществления относятся к ингибированию активности NKT-клеток I типа с помощью одного или нескольких обладающих общей активностью агонистов RAR, предшественников таких обладающих общей активностью агонистов RAR и их смесей. Применяемый в данном документе термин "обладающий общей активностью агонист RAR" относится к агонисту RAR, который действует, например, активирует, RARα, RARβ и RARγ практически в равной степени или неселективно. Некоторые варианты осуществления относятся к ингибированию активности NKT-клеток I типа с помощью одного или нескольких активных агонистов RAR, которые эффективны в отношении избирательного, или даже специфичного, действия, например, активации, по меньшей мере одного и предпочтительно обоих из RARβ и RARγ по сравнению с RARα, предшественников таких активных агонистов RAR и их смесей. Применяемый в этом контексте термин "селективно" означает, что предшественники агонистов RAR для агониста RAR и их смеси являются более эффективными, предпочтительно по меньшей мере в приблизительно 10 раз или от приблизительно 100 раз до приблизительно 1000 раз или более раз эффективными, в отношении действия по меньшей мере на один и предпочтительно на оба из RARβ и RARγ по сравнению с RARα. Некоторые варианты осуществления относятся к ингибированию активности NKT-клеток I типа с помощью одного или нескольких селективных в отношении подтипа агонистов RAR, предшественников таких селективных в отношении подтипа агонистов RAR и их смесей. Применяемый в данном документе термин " селективный в отношении подтипа агонист RAR" относится к агонисту RAR, который селективно действует, например, активирует один подтип RAR. Ретиноидные соединения, обладающие селективностью в отношении RARα, RARβ и RARγ, известны в уровне техники и раскрыты, например, в патентах США №6534544 и 6025388, которые включены в данный документ во всей полноте посредством ссылки.

[0080] Несколько вариантов осуществления относятся к способу ингибирования провоспалительной активности NKT-клеток I типа путем введения одного или нескольких агонистов рецепторов ретиноевой кислоты (RAR). Примеры агонистов RAR включают, без ограничений, агонисты RAR, перечисленные в Таблице 1.

[0081] В некоторых вариантах осуществления провоспалительную активность NKT-клеток I типа ингибируют с помощью одного или нескольких агонистов RAR, выбранных из группы, состоящей из ATRA, ретинола, 9-цис-RA или 13-цис-RA, третинола, АМ580, АС55649, CD1530 или тазаротена. В некоторых вариантах осуществления провоспалительную активность NKT-клеток I типа ингибируют с помощью одного или нескольких полиолефиновых ретиноидов, таких как изоретинонин и ацитретин. В некоторых вариантах осуществления провоспалительную активность NKT-клеток I типа ингибируют с помощью одного или нескольких агонистов RAR, выбранных из группы, состоящей из этретината, ацитретина и изотретиноина.

[0082] Некоторые варианты осуществления относятся к ингибированию провоспалительной активности NKT-клеток I типа с помощью тазаротена, тазаротеновой кислоты или их смеси. Тазаротен представляет собой пролекарство в виде сложного этилового эфира, который метаболизируется до соответствующей свободной кислоты, тазаротеновой кислоты. Тазаротен имеет прочную замкнутую кольцевую структуру, которая характеризуется ограниченной конформационной гибкостью по сравнению с полностью транс-ретиноевой кислотой, естественным лигандом для рецепторов ретиноевой кислоты (RAR). Это структурное изменение придает тазаротеновой кислоте специфичность в отношении RAR и селективность в отношении RARβ и RARγ.

[0083] Примеры агонистов RAR дополнительно включают сложные эфиры цис- и транс-ретиноевых кислот, например, сложные алкильные эфиры, такие как первичные, вторичные или третичные спирты, включая, без ограничений, метиловый, этиловый, пропиловый, изопропиловый, бутиловый, изобутиловый, гексиловый, гептиловый, этилгексиловый, октиловый, нониловый, лауриловый, олеиловый, стеариловый, гидроксиэтиловый, гидроксипропиловый, бензиловый, альфа-метилбензиловый, альфа-пропилфениловый, амиловый, изоамиловый, анизиловый, цетиловый, ментоловый, циннамиловый, пинаколовый, фуриловый или миристиловый.

[0084] Фармацевтически приемлемые соли агонистов RAR также можно применять для ингибирования активности NKT-клеток I типа. Раскрытые в данном документе соединения, которые содержат функциональные группы с достаточно сильными кислотными, достаточно сильными основными или и теми, и другими свойствами, при этом соответственно могут реагировать с любым из ряда органических и неорганических оснований и органических и неорганических кислот с образованием соли.

[0085] Примеры кислот, которые можно применять для образования солей присоединения кислоты на основе агонистов RAR с основными группами, включают неорганические кислоты, такие как соляная кислота, бромистоводородная кислота, йодистоводородная кислота, серная кислота, фосфорная кислота и т.п., и органические кислоты, такие как р-толуолсульфоновая кислота, метансульфоновая кислота, щавелевая кислота, р-бромфенилсульфоновая кислота, карбоновая кислота, янтарная кислота, лимонная кислота, бензойная кислота, уксусная кислота и т.п. Примеры таких солей включают сульфат, пиросульфат, бисульфат, сульфит, бисульфит, фосфат, моноводородфосфат, биводородфосфат, метафосфат, пирофосфат, хлорид, бромид, йодид, ацетат, пропионат, деканоат, каприлат, акрилат, формат, изобутират, капроат, гептаноат, пропиолат, оксалат, малонат, сукцинат, суберат, себацат, фумарат, малеат, бутан-1,4-диоат, гексин-1,6-диоат, бензоат, хлорбензоат, метилбензоат, динитробензоат, гидроксибензоат, метоксибензоат, фталат, сульфонат, ксиленсульфонат, фенилацетат, фенилпропионат, фенилбутират, цитрат, лактат, гамма-гидроксибутират, гликолят, тартрат, метансульфонат, пропансульфонат, нафталин-1-сульфонат, нафталин-2-сульфонат, манделат и т.п.

[0086] Примеры оснований, которые можно применять для образования солей присоединения оснований на основе агонистов RAR с кислотными группами, включают, без ограничений, гидроксиды щелочных металлов, таких как натрий, калий и литий; гидроксиды щелочно-земельных металлов, таких как кальций и магний; гидроксиды других металлов, таких как алюминий и цинк; аммиак и органические амины, такие как незамещенные или гидроксизамещенные моно-, ди- или триалкиламины; дициклогексиламин; трибутиламин; пиридин; N-метил, N-этиламин; диэтиламин; триэтиламин; моно-, бис- или трис-(2-гидрокси-низшие алкиламины), такие как моно-, бис- или трис-(2-гидроксиэтил)амин, 2-гидрокси-трет-бутиламин или трис-(гидроксиметил)метиламин, N,N-ди-низший алкил-N-(гидрокси-низший алкил)-амины, такие как N,N-диметил-N-(2-гидроксиэтил)амин или три-(2-гидроксиэтил)амин; N-метил-D-глюкамин; и аминокислоты, такие как аргинин, лизин и т.п.

[0087] Применяемый в данном документе термин "пациент" относится к получателю терапевтического лечения и включает все организмы в рамках Царства Животные. В предпочтительных вариантах осуществления животное входит в семейство млекопитающих, например, люди, коровы, овцы, свиньи, кошки, буйволы, собаки, козы, лошади, ослы, олени и приматы. Наиболее предпочтительным животным является человек.

[0088] Применяемые в данном документе термины "лечить" "осуществлять лечение" и "лечение" включают "предупреждать" "осуществлять предупреждение" и "предупреждение", соответственно.

[0089] Применяемый в данном документе термин "эффективное количество" средства представляет собой количество, достаточное для лечения, ингибирования или предупреждения повреждения печени, обусловленного провоспалительной активностью NKT-клеток 1 типа.

[0090] Некоторые варианты осуществления относятся к предварительному лечению пациентов сульфатидом и/или агонистом RAR до клинического проявления ALD. В нескольких вариантах осуществления пациентов лечат эффективным количеством сульфатида и/или агониста RAR до чрезмерного употребления алкоголя. В некоторых других вариантах осуществления пациентов лечат эффективным количеством сульфатида и/или агониста RAR за от приблизительно 0.5 часа до приблизительно 18 часов до чрезмерного употребления алкоголя. В некоторых вариантах осуществления пациентов лечат эффективным количеством сульфатида и/или агониста RAR в течение периода постоянного употребления алкоголя.

[0091] В некоторых вариантах осуществления конкретное количество агониста RAR, вводимого пациенту, будет варьировать в зависимости от заболевания или состояния, которое лечат, а также возраста, веса и пола пациента, которого лечат. Обычно для достижения такой конечной концентрации, например, в кишечнике или крови, количество агониста RAR в композиции однократной дозировки по настоящим вариантам осуществления обычно будет составлять от приблизительно 0,1 миллиграмма до приблизительно 100 миллиграмм, предпочтительно от приблизительно 2,0 миллиграмм до приблизительно 60 миллиграмм, более предпочтительно от приблизительно 20 миллиграмм до приблизительно 50 миллиграмм. Примеры подходящих доз включают: от приблизительно 0,1 до приблизительно 10 мг/сутки; от приблизительно 0,5 до приблизительно 2 мг/сутки; от приблизительно 0,01 до 100 мг/сутки; от приблизительно 1 до приблизительно 50 мг/сутки; от приблизительно 0,1 мг/сутки до приблизительно 1,0 мг/сутки; от приблизительно 1,0 мг/сутки до приблизительно 5,0 мг/сутки; от приблизительно 5,0 мг/сутки до приблизительно 10,0 мг/сутки; от приблизительно 10,0 мг/сутки до приблизительно 15 мг/сутки; от приблизительно 15,0 мг/сутки до приблизительно 20,0 мг/сутки; от приблизительно 20,0 мг/сутки до приблизительно 25,0 мг/сутки; от приблизительно 30,0 мг/сутки до приблизительно 35,0 мг/сутки; от приблизительно 35,0 мг/сутки до приблизительно 40,0 мг/сутки; от приблизительно 40,0 мг/сутки до приблизительно 45,0 мг/сутки; от приблизительно 45,0 мг/сутки до приблизительно 50,0 мг/сутки; от приблизительно 50,0 мг/сутки до приблизительно 55,0 мг/сутки; от приблизительно 55,0 до приблизительно 60,0 мг/сутки; от приблизительно 60,0 мг/сутки до приблизительно 65,0 мг/сутки; от приблизительно 65,0 мг/сутки до приблизительно 70,0 мг/сутки; от приблизительно 70,0 мг/сутки до приблизительно 75,0 мг/сутки; от приблизительно 75,0 мг/сутки до приблизительно 80,0 мг/сутки; от приблизительно 80,0 мг/сутки до приблизительно 85,0 мг/сутки; от приблизительно 85,0 до приблизительно 90,0 мг/сутки; от приблизительно 85,0 мг/сутки до приблизительно 90,0 мг/сутки; от приблизительно 90,0 мг/сутки до приблизительно 95,0 мг/сутки и от приблизительно 95,0 мг/сутки до приблизительно 100,0 мг/сутки.

Очевидно, точная дозировка будет варьировать в зависимо ти от заболевания или нарушения, которое лечат, причем предпочтительные диапазоны можно без труда определить.

[0092] При пероральном введении тазаротена для влияния на уменьшение активности NKT-клеток I типа ежедневная дозировка тазаротена предпочтительно находится в диапазоне от приблизительно 0,3 мг/сутки до приблизительно 7 мг/сутки или приблизительно 8 мг/сутки, более предпочтительно в диапазоне от приблизительно 0,6 мг/сутки до приблизительно 6,5 мг/сутки или приблизительно 7 мг/сутки. В некоторых вариантах осуществления вводимый перорально тазаротен вводят ежедневными дозировками тазаротена, включающими 0,4 мг/сутки, 0,75 мг/сутки, 1,5 мг/сутки, 2,8 мг/сутки, 3 мг/сутки, 4,5 мг/сутки, 6 мг/сутки и 6,3 мг/сутки.

[0093] В соответствии с вариантами осуществления агонист RAR можно вводить для облегчения симптомов пациента или можно вводить для препятствования механизму собственно нарушения. В определенных вариантах осуществления агонист RAR можно вводить в качестве профилактической меры. В некоторых вариантах осуществления вводят многократные дозы агониста RAR. Специалистам в данной области техники будет понятно, что такие цели лечения часто взаимосвязаны и что для конкретных пациентов лечение можно изменять, исходя из различных факторов. Такие факторы могут включать возраст, пол, состояние здоровья пациента и течение аутоиммунного или иммунопатологического заболевания или нарушения. Методику лечения пациента можно изменять, соответственно, в отношении дозировки, периодичности введения, пути введения и посредством одновременного или последующего введения других терапевтических средств.

[0094] В некоторых вариантах осуществления одно или несколько соединений агониста RAR можно вводить отдельно или в комбинации с другим терапевтическим соединением. Например, одно или несколько соединений агониста RAR можно вводить в комбинации с сульфатидом. Можно применять любое известное в настоящее время терапевтическое соединение, используемое для лечения алкогольной болезни печени, воспалительного заболевания, аутоиммунного заболевания или реперфузионного повреждения. В некоторых вариантах осуществления агонист RAR можно вводить в комбинации с сульфидом водорода (H₂S). В некоторых вариантах осуществления агонист RAR можно вводить в комбинации с антиоксидантами. В некоторых вариантах осуществления агонист RAR можно вводить в комбинации, например, с кортикостероидами, биологическими средствами (например, антителами к TNF-альфа и антителами к IL-6), иммуномодуляторами (например, RU-486), модифицирующими заболевание противоревматическими лекарственными средствами (DMARDS, такими как лефлуномид), ингибиторами СОХ-2 (целекоксиб), нестероидными противовоспалительными лекарственными средствами (NSAIDS, такими как напроксен), пероральными противодиабетическими средствами (OAD, такими как метформин или ситаглиптен), агонистами GLP-1, инсулином, агонистами/антагонистами PPAR, медиаторами EGF (противораковыми средствами), другими средствами, эффективными для лечения разновидностей рака печени, клеточными терапевтическими средствами для лечения разновидностей рака печени; интерферонами (IFN) для лечения гепатита С, рассеянного склероза или красной волчанки и антагонистами LFA-1.

[0095] Соединения агониста RAR и соединения сульфатида, описанные в данном документе, можно применять в качестве активного ингредиента, включенного в фармацевтическую композицию. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция может содержать один активный ингредиент. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция может содержать два, три, четыре, пять или более активных ингредиентов. Предусмотрены все способы введения, например, пероральный, ректальный, парентальный, местный или посредством внутривенной, внутримышечной, интрастернальной или подкожной инъекции или в форме, подходящей для ингаляции. Составы, в случае необходимости, для удобства могут быть представлены в дискретных единицах дозирования, и их можно получать любыми способами, известными в области техники, связанной с фармацией. Активные ингредиенты, как правило, будут составлены с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми наполнителями в соответствии с известной и установившейся практикой. Таким образом, фармацевтическую композицию можно составлять в виде жидкости, порошка, крепкого настоя, раствора для инъекции, суспензии, суппозитория и т.д.

[0096] Активные ингредиенты в соответствии с некоторыми вариантами осуществления можно составлять для введения для перорального введения в виде таблеток, плотных желатиновых капсул, мягких желатиновых капсул, содержащих активное средство в форме порошка, смеси с наполнителями, жидкости или раствора, суспензии, твердого раствора. Активные ингредиенты в соответствии с некоторыми вариантами осуществления можно составлять для введения для внутриротового введения (сублингвального или буккального) в виде твердой быстрорастворяющейся лекарственной формы или шипучих таблеток, тонких пленок, буккальных облаток или в виде жидкой или полутвердой формы, такой как гель, раствор, эмульсия, суспензия. Активные ингредиенты в соответствии с некоторыми вариантами осуществления можно составлять для введения для инъекции в виде водного или безводного раствора, суспензии или эмульсии. Растворы и суспензии на основе масел включают смеси натуральных и/или синтетических масел, таких как соевое масло, масло семян льна, минеральное масло, сезамовое масло, касторовое масло, гидрогенизированные растительные масла, пчелиный воск. Активные ингредиенты в соответствии с некоторыми вариантами осуществления можно составлять для введения для трансдермального введения в виде крема, геля, эмульсии, раствора на водной основе, раствора на масляной основе, суспензии, пленки, пластыря, пены. Активные ингредиенты в соответствии с некоторыми вариантами осуществления можно составлять для введения для интраназального введения в виде порошка, суспензии, раствора, эмульсии. Активные ингредиенты в соответствии с некоторыми вариантами осуществления можно составлять для введения для внутрилегочной доставки в виде тонкоизмельченного порошка. Пероральное введение связано с эффектом первого прохождения, а также индукцией участвующих в метаболизме ферментов. Таким образом, для оптимального эффекта содержание активного вещества и режим дозирования при пероральном введении ретиноевых кислот можно изменять. Альтернативные пути доставки, например, сублингвальный, буккальный, инъекционный, внутрилегочной и трансдермальный, могут быть более предпочтительными по сравнению с пероральным введением. Альтернативные пути введения, такие как описанные, исключают эффект первого прохождения и абсорбцию в GI, демонстрируют меньшую индукцию ферментов и обеспечивают стабильную фармакокинетику повторяемой дозы.

[0097] Фармацевтические составы в соответствии с настоящими вариантами осуществления могут быть с мгновенным высвобождением или модифицированным высвобождением (например, с замедленным высвобождением, пульсирующим высвобождением, контролируемым высвобождением, отсроченным высвобождением, медленным высвобождением). По причине немедленной активности фармакологические количества перорально вводимых ретиноидных изомеров могут иметь побочные эффекты. Эти побочные эффекты представляли собой серьезное ограничение для применения пероральных ретиноидов в терапии. Несмотря на то, что местно применяемые ретиноиды характеризуются незначительным тератогенным недостатком, имеют место другие явления токсичности, связанные с этим путем введения, которые ограничивают их применение, включая раздражение кожи. Основной причиной как пероральной, так и местной токсичности является то, что ретиноиды полностью и немедленно доступны при введении. В способе, посредством которого ретиноид можно сделать более медленно или более продолжительно доступным in vivo, не будет пиков и минимумов в доступности ретиноида, таким образом, будет обеспечиваться эффективный уровень in vivo соединения на протяжении более длительного периода времени, а также будут устраняться или значительно уменьшаться явления токсичности, которые часто являются результатом внезапной доступности избыточных количеств вещества. Состав для инъекций на масляной основе с ретинолом, сложным эфиром ретинола и, в частности, сложным эфиром жирной кислоты и ретинола, ретиноевой кислотой или сложным эфиром ретиноевой кислоты, можно вводить внутримышечно еженедельно, и он может обеспечивать системную доставку с медленным высвобождением в соответствии с такими принципами.

[0098] В некоторых вариантах осуществления получение трет-бутилового сложного эфира полностью транс-ретиноевой кислоты происходит следующим образом. К раствору полностью транс-ретиноевой кислоты (100 мг, 0,33 ммоль) в безводном простом эфире добавляют оксалилхлорид (42,3 мг, 0,333 ммоль) при 0 градусов С, и перемешивают при такой температуре в течение 30 минут, и добавляют пиридин (28,7 мг, 0,363 ммоль), 2-метил-2-пропанол (26,8 мг, 0,363 ммоль), и перемшивают при комнатной температуре в темноте, после чего реакция полностью завершается, на что указывают результаты TLC. Реакционную смесь затем охлаждают водой и экстрагируют простым эфиром (3 раза, 10 мл), насыщенным раствором бикарбоната натрия (3 раза, 5 мл) и снова водой (3 раза, 5 мл), высушивают (MgSO₄) и выпаривают.Густой осадок повторно растворяют в гексане и наносят на картридж с силикагелем Sep-Pak (2 г). Элюирование в присутствии гексана/этилацетата (9,7 : 0,3) дает сложный бутиловый эфир ретиноевой кислоты. Окончательную очистку достигают при помощи HPLC (10 мм × 25 см, колонка Zorbax-Sil, 4 мл/мин) с применением системы растворителей гексан/изопропанол (90 : 10). Чистый полностью транс-ретиноилбутират 2 (98 мг, 82,6%) элюируют в виде густого масла.

[0099] Некоторые варианты осуществления относятся к описанному ниже составлению бутил-ретиноевого сложного эфира для инъекции. 10 г раствора бутил-ретиноевого сложного эфира растворяют в смеси из 73 г масла из семян льна, содержащей 0,1 г бутилированного гидроксианизола и 10 г бензилового спирта, при медленно повышающейся температуре и с перемешиванием с высоким сдвигающим усилием в стерильных условиях. Смесь фильтруют в стерильных условиях и заполняют ею шприц для последующего применения. Для введения посредством внутримышечной инъекции. Некоторые варианты осуществления относятся к составлению ретинолпальмитата в масле семян льна, как описано выше для внутримышечной инъекции.

[0100] Некоторые варианты осуществления относятся к описанному ниже составлению пероральной лекарственной формы с одним или несколькими активными ингредиентами по настоящим вариантам осуществления. 10 г ретиноевой кислоты растворяют в смеси пчелиного воска, бутилированного гидроксианизола, динатрия эдетата, хлопьев гидрогенизированного соевого масла, гидрогенизированных растительных масел и спирта соевого масла при медленно повышающейся температуре и с перемешиванием с высоким сдвигающим усилием. Смесь запаивают в мягкие желатиновые капсулы с содержанием активного вещества 2 мг, 5 мг и 10 мг для перорального введения.

[0101] Некоторые варианты осуществления относятся к составлению биоадгезивной буккальной таблетки, содержащей один или нескольких активных ингредиентов по настоящим вариантам осуществления. Получают смесь наполнителей с содержанием 24% активного ингредиента, 21% НРМС, 18% кукурузного крахмала, 24% лактозы, 1% кремния, 2,5% поликарбофила (Noveon), 7,5% карбомера 974Р, 1,2% талька и 0,7% стеарата магния. Смесь спрессовывают в таблетки с диаметром приблизительно 1 см.

[0102] Некоторые варианты осуществления относятся к составлению сублингвальной пленки, содержащей один или нескольких активных ингредиентов по настоящим вариантам осуществления. В 50 г воды смешивают следующее: 3 г метилцеллюлозы Е5, 5 г метилцеллюлозы Е50, 1 г Klucel, 1 г мальтодекстрина, 1 г лимонной кислоты, 3 г сукралозы, 5 г апельсинового ароматизатора, 0,2 г парабена, 0,1 г натрия эдетеата и 5 г сорбита. Добавляют 1 г ретиноевой кислоты и смесь дегазируют помешиванием. Композицию распределяют тонким слоем по подложке в виде пленки из сложного полиэфира и дают ей высохнуть на воздухе при отсутствии какого-либо прямого света, чтобы избежать разложения. Пленку затем разрезают до определенного размера с получением доз 2-10 мг.

[0103] Некоторые варианты осуществления относятся к набору, который может включать один или несколько сульфатидов, агонистов RAR или любую их комбинацию, предпочтительно в виде фармацевтической композиции. В некоторых вариантах осуществления цис-тетракозеноил представлен в фармацевтически приемлемом носителе. В некоторых вариантах осуществления ATRA представлена в фармацевтически приемлемом носителе. В некоторых вариантах осуществления тазаротен представлен в фармацевтически приемлемом носителе. В нескольких вариантах осуществления необязательно может быть представлен сульфид водорода (H₂S). В нескольких вариантах осуществления необязательно могут быть представлены один или несколько антиоксидантов. В нескольких вариантах осуществления наборы могут дополнительно содержать подходящую упаковку и/или инструкции по применению. Наборы также могут содержать средства доставки одного или нескольких сульфатидов, агонистов RAR или любой их комбинации, такие как ингалятор, аэразольный распылитель (например, назальный спрей), шприц для инъекции, иглу, инфузионный мешок или изобарическая упаковка для капсул, таблеток, супозиториев. Один или несколько сульфатидов, агонистов RAR или любая их комбинация могут находиться в сухой или лиофилизированной форме или в растворе, в частности, в стерильном растворе. В сухой форме набор может содержать фармацевтически приемлемый разбавитель для получения жидкого состава. Набор может содержать устройство для введения или для распределения композиций, включая, без ограничений, шприц, пипетку, трансдермальный пластырь или ингалятор. Некоторые варианты осуществления относятся к наборам, которые содержат достаточные дозировки соединений или композиции для обеспечения эффективного лечения индивида в течение продолжительного периода, такого как неделя, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 6 недель, или 8 недель, или более.

[0104] В одном приведенном в качестве примера варианте осуществления 70 кг взрослому пациенту, подверженному риску химического повреждения печени от рецептурных лекарственных средств или вызывающих зависимость лекарственных средств, ежедневно делают i.m. инъекцию 7 мг тазаротена в 1,0 мл фосфатно-солевого буферного раствора для лечения повреждения печени. Эту дозировку можно корректировать на основании результатов лечения и оценки лечащего врача. Лечение предпочтительно продолжают в течение по меньшей мере приблизительно 1 или 2 недель, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 1 или 2 месяцев и его можно продолжать на постоянной основе.

[0105] В другом приведенном в качестве примера варианте осуществления 70 кг взрослому пациенту, подверженному риску химического повреждения печени от рецептурных лекарственных средств или вызывающих зависимость лекарственных средств, ежедневно дают пероральную дозу агониста RAR, достаточную для ингибирования активности NKT-клеток 1 типа. Повреждение печени можно отслеживать по результатам анализа уровней ферментов печени в сыворотке. Дозировку агониста RAR можно корректировать на основании результатов печеночной пробы и оценки лечащего врача. Лечение предпочтительно продолжают в течение по меньшей мере приблизительно 1 или 2 недель, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 1 или 2 месяцев и его можно продолжать на постоянной основе. В некоторых вариантах осуществления продолжительность лечения совпадает с продолжительностью поведенческого состояния пациента, подверженного риску химического повреждения печени. В некоторых вариантах осуществления агонист RAR выбран из группы, состоящей из ATRA и тазаротена. В некоторых вариантах осуществления пациенту дополнительно вводят дозу сульфатида, достаточную для активации NKT-клеток II типа.

[0106] Несмотря на то, что предшествующее письменное описание дает возможность специалисту в данной области техники создать и применять то, что рассматривается в настоящем документе как наилучший вариант, такому специалисту в данной области техники будет понятно и очевидно существование вариаций, комбинаций и эквивалентов конкретного варианта осуществления, способа и примеров, приведенных в данном документе. Настоящие варианты осуществления, таким образом, не следует ограничивать описанным выше вариантом осуществления, способом и примерами, но всеми вариантами осуществления в рамках объема и идеи настоящих вариантов осуществления.

[0107] Следующие примеры предоставлены в целях иллюстрации и не должны рассматриваться в качестве ограничений.

ПРИМЕР 1

Сульфатид опосредует ингибирование NKT-клеток I типа, в то же время активируя сульфатид/CD1d-тетрамер+ клетки

[0108] Дозу 20 мкг сульфатида инъецировали мышам внутрибрюшинно. После инъекции сульфатида выделяли MNC из печени и метили при помощи CFSE. Клетки культивировали с αGalCer (10 нг/мл) в течение 96 часов в присутствии или при отсутствии цитокина IL-2 в концентрации 10 нг/мл. В качестве контроля клетки культивировали только с IL-12 в концентрации 10 нг/мл. После культивирования клетки собирали, красили с помощью mAb к TCRP и αGalCer/CD1d-тетрамеров, подвергали FACs-сортингу и проводили анализ с разведением в CFSE на αGalCer/CD1d-тетрамер⁺ (NKT I типа) клетках. См. Фиг. 1А. Как показано на Фиг. 1 В после введения сульфатида NKT-клетки I типа не могли пролиферировать в ответ на in vitro контрольное заражение αGalCer.

[0109] Клетки печени, выделенные из мышей, которым инъецировали PBS или 20 мкг сульфатида, подвергали сортингу на сульфатид/CD1d-тетрамер+ и тетрамерпопуляции и красили на внутрицитоплазматический IFN-γ+. Как показано на Фиг. 1С, мыши, которым инъецировали сульфатид, обладали наибольшим % IFN-γ-положительных клеток.

[0110] Введение сульфатида приводит как к ингибированию пролиферации NKT-клеток I типа, так и к повышению % IFN-γ-положительных клеток. Не привязываясь к конкретной теории, полагают, что введение сульфатида активирует как pDC, так и NKT-клетки II типа, которые секретируют цитокины и хемокины, и данное взаимодействие приводит к индукции cDC-опосредованого ингибирования NKT-клеток I типа.

ПРИМЕР 2

Введение сульфатида защищает от ConA-индуцированного гепатита

[0111] Самок мышей C57BL/6 внутривенно (i.v.) обрабатывали посредством конкавалина А (ConA) в концентрации 8,5 мг/кг (растворенного в апирогенном фосфатно-буферном растворе, PBS), что индуцировало повреждение печени, сходное с повреждением, вызванным гепатитом. Сразу после инъекции ConA мышам внутрибрюшинно (i.p.) инъецировали 20 мкг (1 мг/кг/м) сульфатида из бычьего головного мозга или PBS.

[0112] Повреждение печени вызывает появление заметных нарушений (предполагающих наличие заболевания печени), которые можно выявить с помощью печеночных проб. Например, вирусный гепатит может служить причиной тому, что ферменты аланинаминотрансфераза (ALT) и аспартатаминотрансфераза (AST) из поврежденных клеток печени выходят в кровоток, и в крови повышается их уровень. Для тестирования на предмет повреждения печени собирали сыворотку крови и измеряли уровни ферментов, ALT и AST, в сыворотке крови через 0, 6, 12, 24, 48 и 72 часа после инъекции Con А или Con А + сульфатид. Уровни в сыворотке крови измеряли с помощью Laboratory Corporation of America, Сан-Диего, Калифорния. Как показано на Фигуре 1е, сопоставимые уровни ферментов в сыворотке крови наблюдали через 6 часов после инъекции Con А или Con А + сульфатид, тем не менее, уровни как ALT, так AST в сыворотке крови были ниже через 12, 24 и 48 часов у мышей, которым инъецировали и ConА, и сульфатид. У мышей, которым инъецировали Con А (•), ALT и AST в сыворотке крове давали пики через около 12 часов (ALT ≈ 15,8×10³ МЕ/л и AST ≈ 22,7×10³ МЕ/л) и возвращались к базовой линии через 48 часов. Напротив, после инъекции комбинации Con А + сульфатид регистрировали значительное снижение уровня ALT и AST в сыворотке крови (ALT ≈ 2,5 × 10³ МЕ/л и AST ≈ 5,4×10³ ME/л) через 12 часов, и они возвращались к базовой линии через 24 часа. Значения приведены как среднее ± SD у 5 мышей на группу. Р < 0,001.

[0113] Мышей умерщвляли через 12, 24, 48, 72 и 96 часов после обработки и собирали их печени. Печеночную ткань фиксировали в 10% растворе формальдегида и хранили при комнатной температуре до применения. Гистологическое исследование с помощью окрашивания гематоксилином и эозином (Н&Е) проводили в Pacific Pathology Inc., Сан-Диего, Калифорния.

[0114] Как показано на фигуре 1d, Н&Е-окрашивание демонстрировало значительно улучшенные показатели гистологического исследования печени у мышей, обработанных Con А + сульфатид из бычьего головного мозга по отношению к мышам, обработанным только Con А. Гистологическое исследование показывало диффузную и массивную инфильтрацию и тяжелый некроз в указанные моменты времени после инъекции мышам Con А, Фигура 1d, верхние секции. Наоборот, инъекция сульфатид + Con А была ассоциирована со слабым повреждением в значении меньшей инфильтрации и меньшего некроза в срезах печени через 12 ч - 48 ч, а показатели гистологического исследования возвращались до нормальных через 72 ч, Фигура 1d, нижние секции.

[0115] Взятые вместе, результаты, полученные в Примере 1 и Примере 2, указывают на то, что (а) сульфатид опосредует ингибирование NKT-клеток I типа в печени и (b) введение сульфатида активирует сульфатид/CD1d-тетрамер+ клетки и защищает от ConA-индуцированного гепатита. Это указывает на то, что cDC с вызванной толерантностью и энергичные NKT-клетки I типа совместно приводят к существенному ингибированию каскада, вызывающего пагубное воспаление.

ПРИМЕР 3

Анализ влияния иммунного ответа на ишемическое и реперфузионное повреждение печени в отношении состава популяции CD11b+Gr-1+ клеток

[0116] Модель ишемическго и реперфузионного повреждения печени создавали, как описано в Shen XD, Ke В, Zhai Y, et al., CD154-CD40 T-cell costimulation pathway is required in the mechanism of hepatic ischemia/reperfusion injury, and its blockade facilitates and depends on heme oxygenase-1 mediated cytoprotection. Transplantation 2002, 74:315-9, включенном в данный документ во всей своей полноте с несколькими модификациями.

[0117] Мышей WT и мышей Jα18^-/-, у которых отсутствовали NKT-клетки I типа, но у которых были нормальные уровни NKT-клеток II типа, (3-5 мышей/группа), или мышей WT (2-3 мыши/группа), обработанных за 3 часа посредством 20 мкг сульфатид/мышь, наркотизировали внутрибрюшинно инъецированием пентобарбитала натрия в концентрации 60 мг/кг. После лапаротомии по срединной линии накладывали атравматичный зажим на печеночную триаду (печеночную артерию, воротную вену, желчный проток) 3 краниальных долей печени. Хвостовые доли сохраняли интактное кровообращение для предупреждения застоя крови в венах кишечника. Брюшную полость закрывали и мышей помещали на грелку-подушку (~ 37°С). Окружающая температура варьировала в диапазоне 25-26°С. Через 90 минут частичной нормотермической ишемии печени зажим удаляли, инициируя реперфузию, и зашивали стенку брюшной полости. Мышей умерщвляли через 6 часов реперфузии и собирали кровь и краниальные доли печени. Симуляционные контроли подвергали такой же процедуре, но без перекрытия кровотока.

[0118] Получение клеток. Лейкоциты выделяли из краниальных долей печени мышей путем механического дробления с последующим разделением в градиенте перколла и лизисом RBC, как описано в Haider RC, Aguilera С, Marie ic I, et al., Type II NKT cell-mediated anergy induction in type I NKT prevents inflammatory liver disease. J Clin Invest 2007, 117:2302-12.

[0119] Проточная цитометрия. Лейкоциты суспендировали в буфере для FACS (PBS, содержащий 0,02% NaN₃ и 2% FCS), блокировали (антитело к FcR-γ мыши, BD Pharmingen, Сан-Диего, Калифорния) и красили нагруженными mCD1d-тетрамер-РЕ или РЕ-, FITC- или РЕ-Су5-меченными антителами к антителам мыши (BD Pharmingen, Сан-Диего, Калифорния, или eBioscience Inc., Сан-Диего, Калифорния) согласно указанному. Окрашивание внутриклеточных цитокинов (ICCS) или мононуклеаров печени (MNC) осуществляли, как описано в Haider RC, Aguilera С, Maricic I, et al., Type II NKT cell-mediated anergy induction in type I NKT prevents inflammatory liver disease. J Clin Invest 2007, 117:2302-12. Анализ осуществляли на приборе FACSCalibur с помощью программного обеспечения CellQuest (версия 4.0.2, BD, Франклин Лейке, Нью-Джерси). Гейтировали популяции Gr-1^high и Gr-1^int. См. Фиг. 2а.

[0120] Статистика. Данные выражали как среднее ± SEM для каждой группы. Р < 0,005. Статистические отличия между группами оценивали при помощи одностороннего критерия Стьюдента для независимых выборок с применением программного обеспечения GraphPad Prism (версия 5.0а, GraphPad Software Inc., Ла-Хойя, Калифорния).

[0121] Результаты. Субпопуляция клеток Gr-1^int преимущественно состоит из моноцитов и миелоидных клеток-предшественников. После ишемического и реперфузионного повреждения (IRI) количество клеток Gr-1^int возрастает в около 3,5 раз (р < 0,005) по сравнению с симуляцией в печени мышей WT, в то же время у мышей Jα18^-/- не наблюдают возрастания после ишемического и реперфузионного повреждения. См. Фиг. 2b, верхние секции. Таким образом, рекрутинг субпопуляций миелоидных клеток в печени во время ишемического и реперфузионного повреждения зависит от присутствия NKT-клеток I типа, которые отсутствуют у мышей Jα18^-/-.

[0122] По сравнению с необработанными мышами у обработанных сульфатидом мышей субпопуляция Gr-1^int клеток уменьшалась на ~ 50% после IRI. Это позволяет предположить, что рекрутинговая активность в отношении миелоидных клеток у NKT-клеток I типа уменьшалась после обработкой сульфатидом.

[0123] Субпопуляция клеток Gr-1^high, которая в основном состояла из гранулоцитов, значительно не отличалась среди образцов печени симуляционных контролей и мышей с индуцированным ишемическим и реперфузионным повреждением. Фиг. 2b, нижние секции.

ПРИМЕР 4

Введение сульфатида перед индукцией ишемического и реперфузионного повреждения значительно ингибирует секрецию IFN-γ NKT-клетками I типа

[0124] Одной группе мышей WT (n = 3) инъецировали сульфатид (20 мкг/мышь i.p.) за 3 часа до индукции ишемии (Sulf. IRI), другие группы (IRI (n = 3), симуляция (n = 2)) не подвергали предварительной обработке. Ишемическое и реперфузионное повреждение печени (90 минут ишемии и 6 часов реперфузии) и симуляционное хирургическое вмешательство осуществляли, как описано в Примере 3.

[0125] Получение клеток. Лейкоциты выделяли из краниальных долей печени мышей путем механического дробления с последующим разделением в градиенте перколла и лизисом RBC, как описано в Halder RC, Aguilera С, Maricic I, et al., Type II NKT cell-mediated anergy induction in type I NKT prevents inflammatory liver disease. J Clin Invest 2007, 117:2302-12.

[0126] Проточная цитометрия. Лейкоциты суспендировали в буфере для FACS (PBS, содержащий 0,02% NaN₃ и 2% FCS), блокировали (антитело к FcR-γ мыши, BD Pharmingen, Сан-Диего, Калифорния) и красили нагруженными αGalCer mCD1d-тетрамер-РЕ антителами к антителам мыши (BD Pharmingen, Сан-Диего, Калифорния, или eBioscience Inc., Сан-Диего, Калифорния). Анализ осуществляли на приборе FACSCalibur с помощью программного обеспечения CellQuest (версия 4.0.2, BD, Франклин Лейке, Нью-Джерси).

[0127] Статистика. Данные выражали как среднее ± SEM для каждой группы. Р < 0,01. Статистические отличия между группами оценивали при помощи одностороннего критерия Стьюдента t для независимых выборок с применением программного обеспечения GraphPad Prism (версия 5.0а, GraphPad Software Inc., Ла-Хойя, Калифорния).

[0128] Результаты. После индукции ишемического и реперфузионного повреждения у NKT-клеток I типа наблюдали повышенную выработку IFN-γ по сравнению с NKT-клетками I типа, полученными после симуляционного хирургического вмешательства, в то время как введение сульфатида за 3 часа до ишемического и реперфузионного повреждения значительно уменьшало секрецию IFN-γ NKT-клетками I типа. См. Фиг. 2 с.

ПРИМЕР 5

Подавление NKT-клеток I типа приводит к уменьшению некроза печени после IRI

[0129] Очищенный полученный из бычьего миелина сульфатид (степень чистоты > 90%), приобретенный у Matreya Inc., Pleasant Gap, Пенсильвания, растворяли в носителе (раствор 0,5% полисорбата-20 (Tween-20) и 0,9% NaCl) и разбавляли в PBS. Группы мышей BL/6 (WT, сульфатид) и мышей Jα18^-/- (Jα18^-/-, сульфатид) обрабатывали сульфатидом (20 мкг/мышь) внутрибрюшинно за 3-48 часов до индукции ишемии или симуляционного хирургического вмешательства. Ишемическое и реперфузионное повреждение печени и симуляционное хирургическое вмешательство осуществляли как описано в Примере 3 на обработанных и необработанных сульфатидом мышах WT и Jαl8^-. После 90 минут ишемии и 24 часов реперфузии ткани печени (краниальные доли) фиксировали в 10% формалине, погружали с фиксацией в парафин и срезы окрашивали гематотоксилином и эозином для гистологического анализа (IDEXX Laboratories Inc., Уестбрук, Мейн).

[0130] У WT мышей, предварительно обработанных сульфатидом (WT, сульфатид), и мышей Jα18^-/- развивался лишь минимальный некроз или не развивался некроз после IRI, в то время как в краниальных долях печени необработанных (WT) мышей обнаруживали большие некротические области. См. Фигуру 4, верхние секции. У симуляционных контролей не наблюдался некроз. См. Фигуру 4, нижние секции. Гистологический анализ показывал, что некроз после IRI уменьшен в печени мышей, у которых отсутствуют NKT-клетки I типа (мышей Jα18^-/-), и мышей, у которых активность NKT-клеток I типа подавляли посредством обработки сульфатидом.

ПРИМЕР 6

Индукция алкогольной болезни печени у мышей WT и мышей с уменьшенным количеством NKT-клеток I типа (Jα18-/-)

[0131] После акклиматизации к адекватному в питательном отношении жидкому корму Либера-Де Карли в течение недели самцам мышей C57BL/6J (В6) и мышей Jα18-/- возрастом 6-8 недель, у которых отсутствовали NKT-клетки 1 типа, но не NKT-клетки 2 типа, давали свободный доступ к жидкому корму, содержащему 5% этанол, или изокалорийному корму, содержащему декстрин и мальтозу (Bio-Serv, Нью-Джерси). Предпринимали меры для ежедневного приготовления свежего корма с помощью автоклавированной воды в стерильных кормушках, ежедневно меняя корм.

[0132] Мышей В6 и Jα18-/-, получавших этанол-содержащий корм, разделяли на две группы: группу, постоянно употреблявшую этанол, и группу, постоянно и чрезмерно употреблявшую этанол. Мышей в группе, постоянно употреблявшей этанол, кормили жидким кормом, содержащим 5% этанол в течение срока до 4-5 недель. Мышей в группе, постоянно и чрезмерно употреблявших этанол, кормили жидким кормом, содержащим 5% этанол в течение 10 дней с последующей (в день 11) однократной высокой принудительной дозой этанола (5 г/кг веса тела). Мышей в контрольной группе принудительно кормили изокалорийными декстрином и мальтозой. После принудительного кормления мышей держали на подушке с контролируемой температурой и осуществляли мониторинг. Хотя изначально двигавшиеся медленно, большинство мышей, получавших высокую дозу принудительно скармливаемого этанола восстанавливали нормальное поведение за несколько часов. Мышей умерщвляли через 8-9 часов после принудительного кормления.

[0133] Н&Е-окрашивание осуществляли на ткани доли печени, полученной от употреблявших этанол самцов мышей В6 и Jα18-/- спустя либо 10 дней, либо 4-5 недель постоянного употребления этанола или постоянного и чрезмерного употребления этанола. Как показано на Фиг. 9а (верхние секции), гистопатологический анализ не показывал повреждение печени у мышей либо В6, либо Jα18-/-, постоянно употреблявших этанол в течение 10 дней. Кроме того, не наблюдали повреждение печени по результатам гистопатологического анализа ткани печени мышей В6 и Jα18-/-, постоянно употреблявших этанол в течение 4-5 недель (данные не показаны). Гистопатологический анализ ткани печени от мышей В6, постоянно и чрезмерно употреблявших этанол, тем не менее, показал значительное повреждение. См. Фиг. 9а, нижняя левая секция. В то время как в ткани печени от мышей Jα18-/-, постоянно и чрезмерно употреблявших этанол, наблюдали относительно небольшое повреждение. См. Фиг. 9а, нижняя правая секция.

[0134] Уровни ALT в сыворотке измеряли у контрольных мышей В6 и Jα18-/- и употреблявших этанол мышей В6 и Jα18-/- после либо 10 дней, либо 4-5 недель постоянного употребления этанола и постоянного и чрезмерного употребления. Как показано на Фиг. 9b, левая секция, постоянное употребление этанола не приводило к значимому повышению уровней ALT в сыворотке. Уровни ALT в сыворотке значительно повышались у мышей В6, постоянно и чрезмерно употреблявших этанол, и возрастали в меньшей степени у мышей Jα18-/-, постоянно и чрезмерно употреблявших этанол, по сравнению с контролем. См. Фиг. 9b, правую секцию.

[0135] Максимальное повреждение печени (по сравнению с безэтанольными контролями), как проиллюстрировано с помощью показателей гистологического исследования или уровней ALT/AST в сыворотке крови, наблюдали у мышей В6 и Jα18-/-через 6-8 часов после принудительного кормления высокой дозой этанола. Среди групп, которых постоянно и чрезмерно кормили этанолом, у мышей Jα18-/-, у которых отсутствовали NKT-клетки 1 типа, наблюдалось меньшее повреждение печени.

[0136] Поскольку постоянное употребление этанола в течение 10 дней или в течение 4-5 недель не приводило к какому-либо значительному повреждению печени, как проиллюстрировано результатами гистопатологического анализа и отсутствием значительного изменения уровней ALT/AST в сыворотке крови, его называли до- или субклинической фазой ALD. Клиническую фазу ALD индуцировали после постоянного-чрезмерного употребления алкоголя на втором этапе.

[0137] Мононуклеарные клетки печени (MNC) выделяли из групп (4 в каждой) самцов мышей В6 и Jα18-/- через 5 недель употребления либо жидкого корма Либера-Де Карли, содержащего 5% этанол (постоянное употребление этанола), либо контрольного корма, содержащего такое же число калорий. Выделенные MNC печени красили различными антителами к поверхности клеток и анализировали с помощью проточной цитометрии. Накопление активированных NKT-клеток I типа и CD11b+Gr-1+ миелоидных клеток наблюдали в печени мышей В6, но не Jα18-/-, в доклинической фазе ALD. См. Фиг. 5.

ПРИМЕР 7

Предупреждение индуцированного алкоголем повреждения печени с помощью сульфатида или полностью транс-ретиноевой кислоты (ATRA)

[0138] Группам 7-недельных самцов мышей В6 (WT) и Jα18-/- инъецировали (i.p.) сульфатид в количестве 20 микрограмм/мышь в дни 1 и 10; ATRA в количестве 0,3 миллиграмм/мышь в дни 6-10 или носитель/DMSO и их кормили либо жидким кормом, содержавшим 5% этанола, в течение 10 дней с последующей (в день 11) однократной высокой принудительно скормленной дозой этанола (5 г/кг веса тела) (группа постоянного и чрезмерного употребления этанола) или изокалорийным кормом, содержащим декстрин и мальтозу, с последующим принудительным кормлением изокалорийными декстрином и мальтозой (контрольная группа). Мышей умерщвляли через 6-8 часов после принудительного кормления и собирали сыворотку крови и ткань печени.

[0139] Для каждой группы мышей определяли уровни ALT в сыворотке. Как показано на Фигуре 6, уровни ALT в сыворотке крови значительно повышались у постоянно и чрезмерно употреблявших этанол мышей В6, которым инъекцировали носитель/DMSO (черный столбец), в то время как уровни ALT в сыворотке крови у постоянно и чрезмерно употреблявших этанол мышей В6, которые получали инъекции либо сульфатида (столбец с горизонтальной штриховкой), либо ATRA (столбец с вертикальной штриховкой) имели схожие показатели с показателями употреблявших контрольный корм мышей В6 (незаштрихованный столбец). Уровни ALT в сыворотке повышались у постоянно и чрезмерно употреблявших этанол мышей Jα18-/-, которым инъецировали носитель/DMSO (черный столбец), по сравнению с употреблявшими контрольный корм мышами Jα18-/- (незаштрихованный столбец), однако, постоянно и чрезмерно употреблявшие этанол мыши Jα18-/-, которым инъекцировали носитель/DMSO. имели сниженные уровни ALT в сыворотке по сравнению с постоянно и чрезмерно употреблявшими этанол мышами В6, которым инъекцировали носитель/DMSO. См. Фиг. 6.

[0140] Гистологическое исследование на предмет стеатогепатита печени (жировой болезни печени) проводили на ткани печени, взятой от мышей В6, которым инъецировали носитель/DMSO, сульфатид или ATRA, после постоянного и чрезмерного употребления этанола. Как показано на Фигуре 7, в ткани печени от мышей В6, которым инъецировали носитель/DMSO, наблюдались выраженные признаки повреждения после постоянного и чрезмерного употребления этанола. В ткани печени, полученной от мышей В6, которым инъецировали сульфатид или ATRA, тем не менее, наблюдались незначительные признаки жировой болезни печени.

[0141] Результаты гистологического анализа и анализа ферментов печени в сыворотке крови позволяют предположить, что введение либо сульфатида, либо агониста рецептора ретиноевой кислоты (RAR), ATRA, могут защищать от повреждения печени, вызванного избыточным потреблением алкоголя.

ПРИМЕР 8

Ингибирование пролиферации NKT-клеток I типа с помощью ATRA

[0142] NKT-клетки I типа выделяли из селезенок интактных мышей В6 и культивировали in vitro с [³Н]-тимидином и оптимальной концентрацией только αGalCer, оптимальной концентрацией αGalCer плюс ATRA в концентрации 0,15 мкг/мл, 1,2 мкг/мл или 18,8 мкг/мл или только ATRA. Пролиферацию NKT-клеток 1 типа измеряли по включению [³Н]-тимидина. Как показано на Фиг. 8а, клеточная пролиферация была похожей у NKT-клеток 1 типа, выращенных в ATRA с концентрацией 0,15 мкг/мл и αGalCer или только αGalCer, в то же время, для сравнения, пролиферация уменьшалась у NKT-клеток 1 типа, выращенных в ATRA с концентрацией 1,2 мкг/мл или 18,8 мкг/мл и αGalCer. Наибольшее ингибирование αGalCer-индуцированной пролиферации NKT-клеток 1 типа наблюдали для ATRA с концентрацией 18,8 мкг/мл. Не наблюдали пролиферацию или наблюдали минимальную пролиферацию NKT-клеток 1 типа, выращенных только в ATRA.

ПРИМЕР 9

Ингибирование активности NKT-клеток I типа с помощью ATRA

[0143] Влияние ATRA на секрецию цитокина IL-2 NKT-клетками I типа в ответ на контрольное заражение in vitro αGalCer тестировали путем совместного культивирования NKT-клеток (Ну 1.2) и облученных антиген-представляющих клеток (АРС) in vitro с оптимальной концентрацией αGalCer в присутствии или при отсутствии ATRA (0,15 мкг/мл, 1,2 мкг/мл или 18,8 мкг/мл) в течение периода 16 часов. Собирали супернатанты и уровни секретированного IL-2 измеряли с помощью ELISA по типу сэндвича для определения IL-2.

[0144] На уровни секреции IL-2 значительно не влияла ATRA в концентрации 0,15 мкг/мл, однако, значительное уменьшение секреции IL-2 наблюдали у NKT-клеток I типа, культивированных в присутствии ATRA в концентрации 1,2 мкг/мл или 18,8 мкг/мл. Наибольшее уменьшение секреции IL-2 достигали с помощью ATRA в концентрации 18,8 мкг/мл. См. Фиг. 8b.

[0145] Дополнительно тестировали функциональные изменения NKT-клеток I типа после введения ATRA. В двух независимых экспериментах группам мышей Black 6 (WT) ежедневно внутрибрюшинно инъецировали ATRA в количестве 0,3 мг/животное (~ 15 мг/кг вес тела) или носитель (DMSO) в течение периода 5 дней. NKT-клетки I типа очищали и культивировали in vitro с повышающимися концентрациями αGalCer. Измеряли клеточную пролиферацию и собирали супернатанты. Цитокиновый ответ выделенных NKT I типа после контрольного заражения in vitro αGalCer определяли с помощью ELISA по типу сэндвича для определения IFN-γ, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12 и IL-13. NKT-клетки I типа, выделенные из мышей, которым инъецировали ATRA, не пролиферировали в ответ на стимуляцию αGalCer (данные не показаны). Как показано на Фиг. 8с, NKT-клетки I типа, выделенные из мышей, которым инъецировали носитель (DMSO), секретировали IFN-γ, IL-4 и IL-13 в ответ на стимуляцию αGalCer, но не IL-6, IL-10 или IL-12. Не наблюдали секрецию IFN-γ, IL-6, IL-10, IL-12 или IL-13 в ответ на стимуляцию αGalCer из NKT-клеток I типа, выделенных из мышей, которым инъецировали ATRA. Наблюдали уменьшение уровней секреции IL-4 из NKT-клеток I типа, выделенных из мышей, которым инъецировали ATRA, в ответ на стимуляцию αGalCer. См. Фиг. 8с.

ПРИМЕР 10

ATRA не ингибирует рестриктированные по МНС II класса обычные CD4 Т-клетки

[0146] Влияние ATRA на рестриктированные по МНС II класса обычные CD4 Т-клетки тестировали путем выделения CD4+ Т-клеток, реактивных по отношению к основному белку миелина MBPAc1-9, из интактных трансгенных мышей B10.PL Vβ8.2 TCR и культивирования клеток in vitro с [³Н]-тимидином и оптимальной концентрацией MBPAc1-9 в присутствии или при отсутствии ступенчатых концентраций ATRA (0,15, 1,2, 18,8 мкг/мл). Пролиферацию CD4+ Т-клеток, реактивных по отношению к MBPAc1-9, измеряли по включению [³Н]-тимидина. Не наблюдали ингибирование стимулируемой МВРАс1-9 пролиферации у обработанных ATRA культур. См. Фиг. 10. Это позволяет предположить, что ATRA прямо не ингибирует активность МНС-рестриктированных CD4+ Т-клеток.

ПРИМЕР 11

Обработка ATRA при отсутствии антиген-представляющих клеток ингибирует функционирование NKT-клеток 1 типа

[0147] Также измеряли влияние обработки ATRA на NKT-клетки I типа при отсутствии антиген-представляющих клеток. Гибридомные NKT-клетки I типа (Ну1.2) культивировали in vitro либо без ATRA, либо с ATRA в концентрации 5 мкг/мл, 10 мкг/мл или 20 мкг/мл в течение 24 часов. Затем клетки трижды промывали и совместно культивировали с облученными спленоцитами (АРС) в присутствии ступенчатых концентраций липидного антигена, αGalCer. Спустя 16 часов собирали супернатанты и уровни IL-2 измеряли с помощью ELISA по типу сэндвича для определения IL-2. Как показано на Фиг. 11, обработка гибридомных NKT-клеток I типа (Ну1.2) с помощью ATRA ингибировала секрецию IL-2. Это позволяет предположить, что обработка ATRA при отсутствии антиген-представляющих клеток ингибирует эффекторную функцию NKT-клеток I типа.

ПРИМЕР 12

Ингибирование активности NKT-клеток I типа посредством специфичных в отношении подтипа агонистов RAR

[0148] Рецепторы ретиноевой кислоты (RAR) включают три основных подтипа: RARα, RAR β и RARγ. Агонист RAR, ATRA, не селективен в отношении конкретного подтипа. Вклад подтипов RAR в ингибирование активности NKT-клеток I типа тестировали с помощью селективных в отношении подтипа агонистов RAR, как приведено далее. Клетки селезенки выделяли из интактных мышей В6 (WT) и культивировали in vitro в присутствии [Н]-тимидина, оптимальной концентрации αGalCer и ступенчатых концентраций общего агониста RAR ATRA, агониста RARα АМ580, агониста RAR β2 АС55649, или агониста RARγ CD1530. Пролиферация NKT-клеток I типа в ответ на стимуляцию αGalCer измеряли по включению [³Н]-тимидина.

[0149] NKT-клетки I типа, культивированные в присутствии ATRA, АМ580 и CD 1530, демонстрировали похожие уровни клеточной пролиферации до концентрации 10¹ мкг/мл. См. Фиг. 12. Клетки, культивированные в присутствии ATRA в концентрации 10¹ мкг/мл или CD 1530, демонстрировали низкую или минимальную пролиферацию, в то же время пролиферация сохранялась для клеток, культивированных в АМ580 в концентрации 10¹ мкг/мл. Уменьшение клеточной пролиферации по сравнению с другими агонистами RAR наблюдали для агониста RAR β 2 АС55649 во всех протестированных концентрациях, за исключением 10¹ мкг/мл, при этой концентрации наблюдали малую или минимальную пролиферацию клеток, культивируемых в АС55649, ATRA или CD1530.

[0150] Эти результаты позволяют предположить, что агонист RAR β 2 АС55649 является эффективным ингибитором активности NKT-клеток I типа и что сигнальный путь рецептора-β2 ретиноевой кислоты (RAR- β 2) вовлечен в ингибирование NKT-клеток I типа.

ПРИМЕР 13

Влияние модуляции PPAR-γ пути на NKT-клетки I типа

[0151] Рецепторы, активируемые пролифератором пероксисом, (PPAR) представляют собой лиганд-индуцируемые транскрипционные факторы, которые принадлежат к надсемейсвту ядерных рецепторов гормонов, которые также включают рецепторы тиреоидного гормона, ретиноидов, стероидных гормонов и витамина D. PPAR регулируют экспрессию генов путем связывания ретиноидного Х-рецептора (RXR) в качестве гетеродимерного участника пары со специфичными элементами ответа пролифератора пероксисом (PPRE) в ДНК. PPAR принимали некоторое участие в липидном и энергетическом метаболизме, воспалении, имплантации эмбриона, диабете и раке.

[0152] Роль PPAR-γ пути в ингибировании NKT-клеток I типа тестировали путем культивирования свежевыделенных NKT-клеток I типа селезенки с [³Н]-тимидином и оптимальной концентрацией αGalCer в присутствии или при отсутствии ступенчатых концентраций агониста PPAR-γ росиглитазона или антагониста PPAR-γ GW9662.

Пролиферацию NKT-клеток I типа селезенки в ответ на стимуляцию αGalCer количественно оценивали по включению [³Н]-тимидина. Похожие уровни пролиферации наблюдали у клеток, культивированных либо в агонисте PPAR-γ росиглитазоне, либо в антагонисте PPAR-γ GW9662, во всех концентрациях. См. Фиг. 13. Эти результаты позволяют предположить, что специфическое ингибирование или активация PPAR-γ пути прямо не ингибирует пролиферацию NKT-клеток I типа.

ПРИМЕР 14

Исследование влияния аналогов ретинола на активность NKT-клеток I типа

[0153] Клетки селезенки выделяли из интактных мышей В6 и культивировали in vitro с [³Н]-тимидином и оптимальной концентрацией αGalCer в присутствии или при отсутствии ступенчатых концентраций ATRA, ретинола, 9-цис-RA или 13-цис-RA. Пролиферацию NKT-клеток I типа селезенки в ответ на стимуляцию αGalCer количественно оценивали по включению [³Н]-тимидина. Как показано на Фиг. 14, не наблюдали пролиферацию или наблюдали минимальную пролиферацию клеток, культивированных в ATRA в концентрации 10¹ мкг/мл, в то же время такой же уровень ингибирования пролиферации NKT-клеток I типа наблюдали только при концентрациях ретинола, 9-цис-RA или 13-цис-RA, которые превышали 10¹ мкг/мл.

ПРИМЕР 15

Исследование влияния агонистов RAR на активность NKT-клеток I типа

[0154] In vitro анализы пролиферации и высвобождения цитокинов проводили на свежевыделенных спленоцитах и гибридомах NKT-клеток I типа (1.2 Hyb). Клетки культивировали в присутствии [³Н]-тимидина и оптимальной концентрации αGalCer (10 нг/мл) с титрующими концентрациями ATRA, третиноина, агониста RARα АМ580, агониста RARβ АС55649 или агониста RARγ CD 1530. Пролиферацию NKT-клеток I типа в ответ на стимуляцию αGalCer количественно оценивали по включению [³Н]-тимидина. Уровни IL-2 измеряли с помощью ELISA по типу сэндвича для определения IL-2. Определяли оптимальные концентрации агонистов RAR. Сравнение влияния агонистов RAR при их оптимальных концентрациях показано на Фиг. 15. Наиболее низкие уровни пролиферации наблюдали у клеток, культивированных в присутствии ATRA, третиноина, агониста RARγ CD 1530. Клетки, культивированные в присутствии агониста RARγ CD 1530, демонстрировали наиболее низкие уровни секреции IL-2. Эти результаты указывают, что агонист RARγ CD 1530 является эффективным ингибитором активности NKT-клеток I типа.

ПРИМЕР 16

Сравнение ингибирования NKT-клеток I типа при помощи тазаротена и ATRA

[0155] Влияние селективного агониста RARγ тазаротена на активность NKT-клеток I типа исследовали при помощи in vitro анализов пролиферации и высвобождения цитокинов.

[0156] In vitro анализы пролиферации и высвобождения цитокинов проводили на свежевыделенных спленоцитах и гибридомах NKT-клеток I типа (1.2 Hyb). Клетки культивировали в присутствии [3Н]-тимидина и оптимальной концентрации αGalCer (10 нг/мл) с возрастающими концентрациями ATRA или тазаротена. Пролиферацию NKT-клеток I типа в ответ на стимуляцию αGalCer количественно оценивали по включению [³Н]-тимидина. Уровни IL-2 измеряли с помощью ELISA по типу сэндвича для определения IL-2. Сравнение ингибирования NKT-клеток I типа посредством ATRA и тазаротена показано на Фиг. 16. Несмотря на то, что агонисты RAR ингибируют пролиферацию NKT-клеток I типа и секрецию IL-2, тазаротен оказывает свое ингибирующие влияние при более низких концентрациях. См. Фиг. 16.

ПРИМЕР 17

Ингибирование NKT-клеток I типа после in vivo введения тазаротена и ATRA

[0157] Тестировали функциональные изменения в NKT-клетках I типа после in vivo введения тазаротена или ATRA. Группам мышей ежедневно внутрибрюшинно инъецировали 300 мкг ATRA (15 мг/кг), 300 мкг тазаротена (15 мг/кг) или носителя (DMSO) в течение периода 5 дней. NKT-клетки I типа селезенки очищали и культивировали in vitro с повышающимися концентрациями αGalCer. Пролиферацию клеток измеряли путем количественной оценки включения [³Н]-тимидина, а результаты показаны на Фиг. 17. Сравнение пролиферативного ответа клеток, выделенных из мышей, которым инъецировали ATRA, инъецировали тазаротен или инъецировали носитель (DMSO), на стимуляцию αGalCer указывает на то, что in vivo введение либо ATRA, либо тазаротена ингибирует активность NKT-клеток I типа. Наиболее низкие уровни пролиферации, тем не менее, наблюдали для NKT-клеток I типа, выделенных из мышей, которым инъецировали тазаротен. См. Фиг. 17.

[0158] Мононуклеарные клетки выделяли из печени мышей, которым инъецировали либо ATRA, либо тазаротен, либо носитель (DMSO), и красили посредством αGalCer/CD1d-тетрамер и общих антител к TCRβ. Проводили проточную цитометрию и популяцию экспрессирующих αGalCer/CD1d-тетрамер/TCRβ клеток (NKT-клеток I типа) количественно оценивали, как показано на Фиг. 18. Не наблюдали значительного отличия в количествах NKT-клеток I типа в печени контрольных животных по сравнению животными, которым вводили ATRA или тазаротен. См. Фиг. 18. Эти результаты указывают на то, что введение ATRA или тазаротена не уменьшает количество NKT-клеток I типа печени.

ПРИМЕР ВОЗМОЖНОГО ПРИМЕНЕНИЯ 18

Предупреждение ALD с помощью введения агониста RAR

[0159] Эффективность агониста RAR при предупреждении или смягчении алкогольной болезни печени тестировали путем ежедневного инъекцирования группам мышей эффективного количества ATRA, тазаротена, третиноина, агониста RARα АМ580, агониста RARβ АС55649, агониста RARγ CD 1530 или носителя/DMSO в течение периода 5 дней, в ходе которого мышей кормили либо жидким кормом, содержавшим 5% этанола, в течение 10 дней с последующей (в день 11) однократной высокой принудительной дозой этанола (5 г/кг веса тела) (группа постоянного и чрезмерного употребления этанола) или изокалорийным кормом, содержащим декстрин и мальтозу, с последующим принудительным кормлением изокалорийными декстрином и мальтозой (контрольная группа). Мышей умерщвляли через 6-8 часов после принудительного кормления и собирали сыворотку и ткань печени.

[0160] Для каждой группы мышей определяли уровни ALT в сыворотке. Ожидали, что уровни ALT в сыворотке значительно повысятся у постоянно и чрезмерно употреблявших этанол мышей, которым инъецировали носитель/DMSO, по сравнению с мышами, употреблявшими контрольный корм. Ожидали, что постоянно и чрезмерно употреблявшие этанол мыши, получавшие инъекции ATRA, тазаротена, третиноина, АМ580, АС55649, CD 1530, будут иметь сниженные уровни ALT в сыворотке по сравнению с постоянно и чрезмерно употреблявшими этанол мышами, которым инъецировали носитель/DMSO. Ожидали, что уровни ALT в сыворотке у постоянно и чрезмерно употреблявших этанол мышей, которым инъецировали ATRA, тазаротен или третиноин, будут аналогичны уровням, наблюдаемым у мышей, употреблявших контрольный корм. Ожидали, что гистологическое исследование стеатогепатита печени (жировой болезни печени) покажет значительное повреждение ткани печени, взятой от мышей, которым инъецировали носитель/DMSO, после постоянного и чрезмерного употребления этанола, в то же время ожидали уменьшенное повреждение или его отсутствие для ткани печени, взятой от мышей, которым инъецировали ATRA, тазаротен, третиноин, АМ580, АС55649 или CD1530, после постоянного и чрезмерного употребления этанола.

ПРИМЕР ВОЗМОЖНОГО ПРИМЕНЕНИЯ 19

[0161] Использовали эксперименты по адаптивному переносу с αGalCer/CD1d-тетрамер-очищенными NKT-клетками I типа из обработанных ATRA или обработанных тазаротеном мышей BL/6 для исследования того, может ли дифференцированное количество этих клеток при переносе интактным реципиентам BL/6 ингибировать повреждение печени после постоянного и чрезмерного употребления этанола.

[0162] Тестировали очищенные (подвергавшиеся сортингу) сульфатид-CD1d-тетрамер+ Т-клетки для определения того, могут ли они предупреждать ALD при адаптивном переносе мышам CD1d+/+ и CD1d-/-. Нокаутированных по генам цитокинов мышей использовали в качестве доноров сульфатид-реактивных Т-клеток для непосредственного определения роли секреции IFN-γ, IL-4 и IL-10 II NK Т-клетками при регуляции ALD. Сульфатид-реактивные Т-клетки выделяли с помощью тетрамеров и дифференцированные количества (0,5-1 миллион) адаптивно переносили реципиентам CD1d+/+ и CD1d-/- C57BL/6. Около 1,5 миллиона сульфатид-CD1d-тетрамер+ клеток выделяли из 18 интактных мышей C57BL/6. Через один день реципиентов подвергали процедуре постоянного и чрезмерного употребления этанола. Для анализа роли секреции цитокинов NKT-клетками II типа изначально использовали IFN-γ, IL-4 -/- или IL-10-/- на основе BL/6 (Jackson Lab). Группам BL/6 дикого типа или нокаут-мышей инъецировали сульфатид (20 мкг/животные), а затем индуцировали ALD. Ожидали, что при отсутствии этих цитокинов 2 типа введение сульфатида будет предупреждать ALD. Эксперименты по адаптивному переносу клеток дополнительно осуществляли с сульфатид-CD1d-тетрамер+ клетками из отдельных нокаутных по гену цитокина мышей, из которых дифференцированные количества (0,5-1 миллион) переносили мышам CD1d-/- C57BL/6. Через один день мышей-реципиентов держали на корме с этанолом. Параллельно, сульфатид-CD1d-тетрамер+ Т-клетки переносили от мышей дикого типа мышам CD1d+/+BL/6 в качестве положительного контроля. Ожидается, что данные эксперименты непосредственно подтвердят роль данных цитокинов, секретируемых сульфатид-реактивными Т-клетками, в контроле ALD.

Эквиваленты

[0163] Полагают, что приведенное выше письменное описание является достаточным для того, чтобы позволить специалисту в данной области осуществить на практике настоящие варианты осуществления. В вышеописанном описании приведены подробности некоторых предпочтительных вариантов осуществления и описан наилучший по мнению авторов вариант. Тем не менее, понятно, что независимо от того, насколько подробно вышеописанное может быть приведено в тексте, настоящие варианты осуществления на практике можно осуществить множеством способов, и их следует интерпретировать согласно пунктам прилагаемой формулы изобретения и любым их эквивалентам.

[0164] Согласно некоторым вариантам осуществления представлен способ лечения или предупреждения по меньшей мере одного воспалительного состояния у пациента. Способ может включать введение пациенту количества ретиноида, достаточного для ингибирования активации NKT-клеток I типа. В некоторых вариантах осуществления воспалительное состояние выбрано из группы, состоящей из жировой болезни печени, индуцированного алкоголем гепатита, неалкогольного стеатозного гепатита, цирроза, острого цирроза, идиопатического гепатита, вирусного гепатита (А, В, С и других), воспалительного гепатита, ассоциированного с гепатобилиарной карциномой, рассеянного склероза, сахарного диабета 1 типа, ишемического реперфузионного повреждения, трансплантации солидного органа, системной красной волчанки, ревматоидного артрита, амиотрофического латерального склероза и воспалительного заболевания кишечника (болезни Крона и колита). В некоторых вариантах осуществления ретиноид представляет собой ATRA или изотретиноин. В некоторых вариантах осуществления ретиноид представляет собой тазаротен. В некоторых вариантах осуществления ретиноид представляет собой ретинол или сложный эфир ретинола. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение количества сульфатида, достаточного для активации NKT-клеток II типа. В некоторых вариантах осуществления сульфатид имеет следующую химическую структуру:

где R1 выбран из группы, состоящей из связи, водорода, C₁-С₃₀алкила, замещенного C₁-С₃₀алкила, C₁-С₃₀алкенила, замещенного C₁-С₃₀алкенила и C₅-C₁₂ сахара; R₂ выбран из группы, состоящей из водорода, гидроксигруппы, метоксигруппы и алкоксигруппы; R₃ выбран из группы, состоящей из водорода, гидроксигруппы, метоксигруппы, этоксигруппы и алкоксигруппы; R₄ выбран из группы, состоящей из водорода, гидроксигруппы и алкоксигруппы; R₅ выбран из группы, состоящей из водорода, гидроксила, карбонила, алкокси и связи; R₆ выбран из группы, состоящей из С₁-С₄₀алкила, замещенного С₁-С₄₀алкила, С₁-С₄₀алкенила, замещенного С₁-С₄₀алкенила и С₁-С₄₀алкинила; R₇ выбран из группы, состоящей из С₁-С₄₀алкила, замещенного С₁-С₄₀алкила, С₁-С₄₀алкенила, замещенного С₁-С₄₀алкенила и С₁-С₄₀алкинила; и R₈ выбран из группы, состоящей из водорода, гидроксильной группы, карбонила, алкоксигруппы и связи. В некоторых вариантах осуществления сульфатид имеет следующую химическую структуру:

[0165] Согласно некоторым вариантам осуществления представлен способ ингибирования повреждения печени у пациента, подверженного риску химического повреждения печени от рецептурных лекарственных средств или вызывающих зависимость лекарственных средств. Способ может включать введение эффективного количества одного или нескольких агонистов RAR, одного или нескольких сульфатидов или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления агонист RAR выбран из группы, состоящей из тазаротена, ATRA или изотретиноина. В некоторых вариантах осуществления один или несколько сульфатидов имеют следующую химическую структуру:

где R1 выбран из группы, состоящей из связи, водорода, C₁-С₃₀алкила, замещенного C₁-С₃₀алкила, C₁-С₃₀алкенила, замещенного C₁-С₃₀алкенила и C₅-C₁₂caxapa; R₂ выбран из группы, состоящей из водорода, гидроксигруппы, метоксигруппы и алкоксигруппы; R₃ выбран из группы, состоящей из водорода, гидроксигруппы, метоксигруппы, этоксигруппы и алкоксигруппы; R₄ выбран из группы, состоящей из водорода, гидроксигруппы и алкоксигруппы; R₅ выбран из группы, состоящей из водорода, гидроксила, карбонила, алкокси и связи; R₆ выбран из группы, состоящей из С₁-С₄₀алкила, замещенногоС₁-С₄₀алкила, С₁-С₄₀алкенила, замещенного С₁-С₄₀алкенила и С₁-С₄₀алкинила; R₇ выбипрают из группы, состоящей из С₁-С₄₀алкила, замещенного С₁-С₄₀алкила, С₁-С₄₀алкенила, замещенного С₁-С₄₀алкенила и С₁-С₄₀алкинила; и R₈ выбран из группы, состоящей из водорода, гидроксильной группы, карбонила, алкоксигруппы и связи.

[0166] Согласно некоторым вариантам осуществления представлен способ ингибирования опосредуемого NKT-клетками I типа повреждения ткани у пациента. Способ может включать введение пациенту эффективного количества агониста RAR, при этом уменьшается активность NKT-клеток I типа. В некоторых вариантах осуществления ткань представляет собой ткань печени. В некоторых вариантах осуществления активность NKT-клеток I типа заключается в секреции IL-4. В некоторых вариантах осуществления агонист RAR выбран из группы, состоящей из тазаротена, ATRA или изотретиноина. В некоторых вариантах осуществления агонист RAR представляет собой агонист RAR-β2.

[0167] Согласно некоторым вариантам осуществления представлен способ ингибирования опосредуемого NKT-клетками I типа повреждения ткани у пациента. Способ может включать введение пациенту количества сульфатида, достаточного для активации NKT-клеток II типа, при этом уменьшается активность NKT-клеток I типа. В некоторых вариантах осуществления сульфатид имеет следующую химическую структуру:

где R1 выбран из группы, состоящей из связи, водорода, C₁-С₃₀алкила, замещенного C₁-С₃₀алкила, C₁-С₃₀алкенила, замещенного C₁-С₃₀алкенила и C₅-C₁₂caxapa; R₂ выбран из группы, состоящей из водорода, гидроксигруппы, метоксигруппы и алкоксигруппы; R₃ выбран из группы, состоящей из водорода, гидроксигруппы, метоксигруппы, этоксигруппы и алкоксигруппы; R₄ выбран из группы, состоящей из водорода, гидроксигруппы и алкоксигруппы; R₅ выбран из группы, состоящей из водорода, гидроксила, карбонила, алкокси и связи; R₆ выбран из группы, состоящей из С₁-С₄₀алкила, замещенного С₁-С₄₀алкила, С₁-С₄₀алкенила, замещенного С₁-С₄₀алкенила и С₁-С₄₀алкинила; R₇ выбран из группы, состоящей из С₁-С₄₀алкила, замещенного С₁-С₄₀алкила, С₁-С₄₀алкенила, замещенного С₁-С₄₀алкенила и С₁-С₄₀алкинила; и R₈ выбран из группы, состоящей из водорода, гидроксильной группы, карбонила, алкоксигруппы и связи. В некоторых вариантах осуществления сульфатид имеет следующую химическую структуру:

[0168] Согласно некоторым вариантам осуществления представлен способ лечения или предупреждения по меньшей мере одного воспалительного состояния у пациента. Способ может включать введение эффективного количества комбинации сульфатида и ретиноида.

[0169] Согласно некоторым вариантам осуществления представлен способ ингибирования активации NKT-клеток I типа. Способ может включать приведение в контакт эффективного количества ретиноида с NKT-клетками I типа.

[0170] Согласно некоторым вариантам осуществления представлен способ ингибирования активации NKT-клеток I типа у пациента с воспалительным заболеванием. Способ может включать введение пациенту эффективного количества комбинации сульфатида и ретиноида.

[0171] Согласно некоторым вариантам осуществления представлен способ ингибирования высвобождения миелоидных клеток в печень пациента. Способ может включать введение пациенту эффективного количества ретиноида.

[0172] Согласно некоторым вариантам осуществления представлен Способ ингибирования высвобождения миелоидных клеток в печень пациента. Способ может включать введение пациенту эффективного количества комбинации сульфатида и ретиноида.

Группа изобретений касается фармакологии и медицины. Предложены: способ лечения или предупреждения по меньшей мере одного воспалительного состояния у пациента, включающий введение пациенту от 0,3 до 8 мг/сутки тазаротена, где указанное количество введенного тазаротена ингибирует активацию NKT-клеток I типа пациента, где воспалительное состояние выбрано из группы, состоящей из жировой болезни печени, индуцированного алкоголем гепатита, неалкогольного стеатозного гепатита, цирроза, острого цирроза, идиопатического гепатита, вирусного гепатита (А, В, С и других), воспалительного гепатита, ассоциированного с гепатобилиарной карциномой, индуцированного алкоголем поражения печени, связанного с алкоголем заболевания печени, стеатоза печени и алкогольного цирроза и способ ингибирования активации NKT-клеток I типа. Способ лечения дополнительно включает введение сульфатида для активации NKT-клеток II типа, который значительно ингибирует секрецию гамма-интерферона NKT-клетками I типа. Технический результат состоит в снижении воспаления, опосредованного NKT-клетками I типа; при алкогольной болезни печени при этом снижалась пролиферации указанных клеток, но их количество не уменьшалось. 2 н. и 30 з.п. ф-лы, 18 ил., 1 табл., 19 пр.

1. Способ лечения или предупреждения по меньшей мере одного воспалительного состояния у пациента, включающий введение пациенту от 0,3 до 8 мг/сутки тазаротена, где указанное количество введенного тазаротена ингибирует активацию NKT-клеток I типа пациента,

где воспалительное состояние выбрано из группы, состоящей из жировой болезни печени, индуцированного алкоголем гепатита, неалкогольного стеатозного гепатита, цирроза, острого цирроза, идиопатического гепатита, вирусного гепатита (А, В, С и других), воспалительного гепатита, ассоциированного с гепатобилиарной карциномой, индуцированного алкоголем поражения печени, связанного с алкоголем заболевания печени, стеатоза печени и алкогольного цирроза.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что воспалительное состояние выбрано из группы, состоящей из индуцированного алкоголем поражения печени, связанного с алкоголем заболевания печени, жировой болезни печени, стеатоза печени, алкогольного гепатита и алкогольного цирроза.

3. Способ по п. 1, дополнительно включающий введение количества сульфатида или синтетического аналога сульфатида, достаточного для активации NKT-клеток II типа.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что вводят сульфатид, имеющий следующую химическую структуру:

,

где R₁ выбран из группы, состоящей из связи, водорода, C₁-С₃₀алкила, замещенного C₁-С₃₀алкила, C₁-С₃₀алкенила, замещенного C₁-С₃₀алкенила и C₅-C₁₂caxapa; R₂ выбран из группы, состоящей из водорода, гидроксигруппы, метоксигруппы и алкоксигруппы; R₃ выбран из группы, состоящей из водорода, гидроксигруппы, метоксигруппы, этоксигруппы и алкоксигруппы; R₄ выбран из группы, состоящей из водорода, гидроксигруппы и алкоксигруппы; R₅ выбран из группы, состоящей из водорода, гидроксила, карбонила, алкокси и связи; R₆ выбран из группы, состоящей из С₁-С₄₀алкила, замещенного С₁-С₄₀алкила, С₁-С₄₀алкенила, замещенного С₁-С₄₀алкенила и C₁-С₄₀алкинила; R₇ выбран из группы, состоящей из С₁-С₄₀алкила, замещенного C₁-С₄₀алкила, С₁-С₄₀алкенила, замещенного С₁-С₄₀алкенила и С₁-С₄₀алкинила и R₈ выбран из группы, состоящей из водорода, гидроксильной группы, карбонила, алкоксигруппы и связи.

5. Способ по п. 3, отличающийся тем, что вводят сульфатид, имеющий следующую химическую структуру:

6. Способ по п. 3, отличающийся тем, что вводят синтетический аналог сульфатида.

7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что у пациента существует риск химического повреждения печени от рецептурных лекарственных средств или вызывающих зависимость лекарственных средств и при этом ингибирование активации NKT-клеток I типа ингибирует повреждение печени у пациента.

8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что введение тазаротена дополнительно включает введение пациенту эффективного количества сульфатида или синтетического аналога сульфатида.

9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что вводят синтетический аналог сульфатида.

10. Способ ингибирования активации по меньшей мере одной NKT-клетки I типа у пациента, имеющего воспалительное состояние, при этом способ включает введение пациенту от 0,3 до 8 мг/сутки тазаротена, таким образом, уменьшая активность NKT-клеток I типа.

11. Способ по п. 10, отличающийся тем, что активность NKT-клетки I типа включает секрецию IL-4.

12. Способ по п. 10, отличающийся тем, что предупреждают повреждение ткани, опосредованное NKT-клетками I типа.

13. Способ по п. 10, отличающийся тем, что ингибируют высвобождение миелоидных клеток в печень пациента.

14. Способ по п. 10, при котором введение тазаротена дополнительно включает введение эффективного количества сульфатида или синтетического аналога сульфатида для активации NKT-клеток II типа.

15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что введением тазаротена и сульфатида или синтетического аналога сульфатида лечат или предупреждают воспалительное состояние у пациента.

16. Способ по п. 10, отличающийся тем, что введение тазаротена дополнительно включает введение эффективного количества сульфатида или синтетического аналога сульфатида для ингибирования высвобождения миелоидных клеток в печень пациента.

17. Способ по любому из пп. 1-9, где количество тазаротена составляет от 0,3 до 7 мг и введение осуществляют ежесуточно.

18. Способ по любому из пп. 1-9, где количество тазаротена составляет от 0,6 до 6,5 мг и введение осуществляют ежесуточно.

19. Способ по любому из пп. 1-9, где воспалительное состояние представляет собой алкогольную болезнь печени (ALD).

20. Способ по любому из пп. 1-9, где воспалительное состояние включает фиброз.

21. Способ по любому из пп. 1-9, где воспалительное состояние включает воспалительное состояние печени.

22. Способ по любому из пп. 1-9, где воспалительное состояние включает аутоиммунный гепатит.

23. Способ по любому из пп. 1-9, где воспалительное состояние включает неалкогольный стеатозный гепатит.

24. Способ по любому из пп. 1-9, где воспалительное состояние включает цирроз.

25. Способ по любому из пп. 1-9, где воспалительное состояние включает фиброз клеток печени.

26. Способ по любому из пп. 10-16, где воспалительное состояние представляет собой алкогольную болезнь печени (ALD).

27. Способ по любому из пп. 10-16, где воспалительное состояние включает фиброз.

28. Способ по любому из пп. 10-16, где воспалительное состояние включает воспалительное состояние печени.

29. Способ по любому из пп. 10-16, где воспалительное состояние включает аутоиммунный гепатит.

30. Способ по любому из пп. 10-16, где воспалительное состояние включает неалкогольный стеатозный гепатит.

31. Способ по любому из пп. 10-16, где воспалительное состояние включает цирроз.

32. Способ по любому из пп. 10-16, где воспалительное состояние включает фиброз клеток печени.