ПРИМЕНЕНИЕ 3-О-СУЛЬФАМОИЛОКСИ-6-ОКСА-7β-МЕТИЛ-D-ГОМО-8α-ЭСТРА-1,3,5(10)-ТРИЕН-17а-ОНА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ, ВКЛЮЧАЯ ТРИЖДЫ-НЕГАТИВНУЮ ФОРМУ, И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2019 года по МПК A61K31/566 C07J73/00 A61P35/00 

Изобретение относится к области медицины и химико-фармацевтической промышленности и касается средств для лечения рака молочной железы.

Рак молочной железы является ведущим онкологическим заболеванием у женщин [Parkin D.M., Bray F., Ferlay J., and Pisani P., CA Cancer J. Clin., 2005, vol. 55, p. 74-108]. По данным ВОЗ, в мире 2.09 миллионов больных, а ежегодно умирают от рака молочной железы 627 тыс. женщин [http://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer].

Значительная часть опухолей этой локализации прогрессирует под действием эстрогенов [Yue W., Yager J.D., Wang J.-P., Jupe E.R., Santen R.J., Steroids, 2013, vol. 78, p. 161-170]. При иммуногистохимическом исследовании рака молочной железы определяются рецепторы эстрогенов (ER), прогестерона (PR) и her2neu («чувствительность к герцептину»). Значительная часть опухолей содержат рецепторы эстрогенов, прогестерона и/или HER2NEU 3+. Если опухоль не имеет рецепторов и не чувствительна к герцептину (ER0, PR0, HER2NEU 0-1) ее рассматривают как трижды негативную (ER-/PR-/HER-2-). Это одна из самых смертоносных форм рака молочной железы по причине отсутствия мишеней для подавления ее роста. На сегодняшний день в мире нет лекарственных препаратов для лечения этой формы рака.

Эстрогены циркулируют в крови и накапливаются в опухоли в виде сульфатов, не способных связываться с рецепторами эстрогенов, однако после превращения в свободные гормоны они активируют рост опухоли. Поэтому перспективной является стратегическая линия лечения, в основе которой лежит применение ингибиторов, блокирующих образование этой группы свободных гормонов в опухоли.

К препаратам из группы селективных модуляторов эстрогеновых рецепторов, которые блокируют эффекты эстрогена на гормонозависимые ткани, в том числе -на ткани молочной железы, относится тамоксифен. Тамоксифен является стандартом гормональной терапии для женщин в пременопаузе и постменопаузе. Наиболее характерными побочными эффектами, возникающими на фоне применения тамоксифена, являются: повышение риска развития тромбоза вен, усугубление течения заболеваний сердечно-сосудистой системы (включая приступы стенокардии), а также появление новообразований эндометрия (полипы, и рак эндометрия), а также фиброма матки. Также тамоксифен обладает гепатотоксичностью. По биофармацевтической классификационной системе (БКС), разработанной Gordon Amidon с соавторами в 1995 году, тамоксифен отнесен ко второму классу - препарат, который имеет низкую растворимость и высокую проницаемость.

Большую эффективность по сравнению с тамоксифеном показали ингибиторы ароматазы. В настоящее время нашли применение в данной области такие ингибиторы ароматазы как летрозол и анастразол, которые по системе БКС отнесены к первому классу - препараты, который имеют высокую растворимость и высокую проницаемость. К побочным эффектам ингибиторов ароматазы является остеопороз, приливы, головные боли.

Кроме того, привлекает внимание стероидная сульфатаза в связи с локальным межтканевым образованием эстрогенов из обильного пула циркулирующего сульфата эстрона. Стероидная сульфатаза катализирует гидролиз сульфата эстрона до эстрона и сульфата DHEA до DHEA (Dibbelt 1., Biol. Chem., Hoppe-Seyler, 1991, 372, 173-185; Stein С, J. Biol. Chem., 1989, 264, 13865-13872).

Самым известным ингибитором стероидной сульфатазы является ЕМАТЕ-сульфамат эстрона (Ahmed S., Curr. Med. Chem., 2002, vol. 9, No. 2, p. 263-273). Однако он обладает существенным недостатком. Под действием ингибиторов сульфатазы эстрона, имеющих в своем составе сульфаматную группу, происходит необратимая дезактивация фермента с высвобождением свободного лиганда [Howarth N.M., Purohit A., Reed M.J. J. Med. Chem., 1994, vol. 37, p. 219-221]. В частности, сульфамат эстрона эффективно ингибирует сульфатазу эстрона, однако высвобождение свободного гормона приводит к появлению сильной утеротропной активности [Shields-Botella Jet al., J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 2003, vol. 84, p. 327-335].

Ряд ингибиторов сульфатазы эстрона защищены в патенте WO 9933858 (А2) - 1999-07-08, где в качестве ингибиторов сульфатазы эстрона для лечения или профилактики эстрогензависимых расстройств, таких как рак молочной железы, могут быть использованы производные общей формулы

Данные производные обладают также утеротропной активностью.

Таким образом, при поиске новых противоонкологических агентов исследователи должны учесть, что носитель сульфаматной группы ингибитора сульфатазы эстрона не должен обладать гормональной (утеротропной) активностью.

Выполнение этих условий привело к расширению области применения сульфаматов на основе эстрогенов ввиду широкого потенциала их действия, в частности, при рецидивирующем раке молочной железы [Shah R. Et al., Sulfatase inhibitors for recidivist breast cancer treatment: A chemical review, Eur. J. Med. Chem., 2016. vol. 114, p. 170-190].

Известно соединение 3,17αβ-дисульфамоилокси-7р-метил-D-гомо-6-окса-эстра-1,3,5(10),8,14-пентаена формулы

в качестве ингибитора роста клеток рака молочной железы MCF-7 (RU 2619457, опубл. 16.05.2017). Данное соединение может быть указано в качестве ближайшего аналога.

Задачей настоящего изобретения является поиск и разработка эффективного синтеза соединений, которые могут быть использованы в качестве противоонкологических агентов при моно- и адъювантной терапии рака молочной железы, в том числе при лечении его самой смертоносной форме- трижды-негативной (ER-/PR-/HER-2-).

Задача решается использованием соединения 3-O-сульфамоилокси-7β-метил-6-окса-D-гомо-8α-эстра-1,3,5(10)-триен-17а-она (1), который ингибирует сульфатазу эстрона,

в качестве противоонкологического агента при моно- и адъювантной терапии начальных и прогрессирующих форм рака молочной железы, включая трижды негативную форму (ER-/PR-/HER-2-) рака молочной железы.

Поставленная задача также решена способом получения противоонкологического агента. Отличительной особенностью предложенной схемы является то, что возможно масштабирование в промышленных масштабах. Способ включает кислотный гидролиз метилового эфира 7β-метил-6-окса-D-гомо-8α-эстрона под действием бромистоводородной кислоты в уксусной кислоте, при этом гидролиз проводят в атмосфере аргона с последующей экстракцией этилацетатом, промыванием водой, насыщенным раствором натрия хлорида, сушкой, полученный рацемический 7β-метил-6-окса-D-гомо-8α-эстрон растворяют в диметилформамиде и добавляют сульфамоилхлорид, продукт реакции экстрагируют этилацетатом, промывают насыщенным раствором хлористого натрия, сушат сульфатом натрия.

Полученный противоонкологический агент относится к 4 классу опасности (LD₅₀>300-2000 мг/кг). Полученные данные позволяют оценить дозы для исследования противоопухолевой активности как безопасные. Терапевтически эффективные дозы препарата предпочтительно составляют от 0.1 до 20 мг.

Технические результаты:

- отсутствие утеротропного действия,

- активность против трижды-негативного рака молочной железы,

- отсутствие токсичности

- гипохолестеринемическое действие и отсутствие влияния на содержание триглицеридов в сыворотке крови.

- отсутствие негативного влияния на эндометрий.

Несмотря на значительный прогресс в клинической онкологии, хирургический метод играет ведущую роль в лечении больных злокачественными новообразованиями молочной железы. Однако, многие пациенты впоследствии погибают. Это означает, что у этих больных наряду с первичной опухолью уже имеются микрометастазы, которые, к сожалению, не всегда можно выявить с помощью самых современных методов исследования. С целью длительного подавления таких микрометастаз, как правило, используется адъювантная терапия -вспомогательное, дополняющее хирургические или лучевые методы, химиотерапевтическое лечение. Адьювантная терапия в основном проводится в течение 5-10 лет, что может привести к различным побочным эффектам на другие ткани и органы. Предложенное соединение обеспечивает проведение такой терапии с большей эффективностью и предотвращает ряд побочных эффектов.

Изобретение может быть проиллюстрировано следующими ниже представленными примерами осуществления изобретения.

Пример 1.

Синтез 3-О-сульфамоилокси-7β-метил-D-гомо-6-окса-8α-эстра-1,3,5(10)-триен-17а-она (1)

К раствору 300 мг метилового эфира рацемического 7β-метил-6-окса-D-гомо-8α-эстрона (2) в 15 мл ледяной уксусной кислоты при комнатной температуре добавляют 2 мл 40% НВr. Реакционную смесь кипятят 7 ч, затем выливают в воду, экстрагируют этилацетатом. Органические слои промывают водой, насыщенным раствором NaCl, сушат над Na₂SO₄. Растворитель удаляют на роторном испарителе. Получают 174 мг (62%) рацемического 7β-метил-6-окса-D-гомо-8α-эстрона (3), т. пл. 231-232°С (по данным лит. т.пл. 230-231°С [WO2009059806]).

Найдено, %:С 76.14; Н 8.17. С₁₉Н₂₄О₃. Вычислено, %: С 75.97; Н 8.05.

К раствору 100 мг соединения (3) в 1 мл диметилформамида добавляют 12 мг сульфамоилхлорида. Через 2 ч реакционную смесь выливают в 6 мл насыщенного раствора NaCl, продукты реакции экстрагируют этилацетатом. Органическую фазу промывают насыщенным раствором NaCl, сушат сульфатом натрия. Получают 93 мг (74%) целевого продукта 1, т. пл. 195-197°С. Спектр ЯМР ¹³С (DMSO-d⁶), δ, м.д.: 214.9, 153.5, 149.8, 125.6, 130.6, 115.0, 111.7, 71.6, 47.4, 44.8, 40.7, 37.9, 34.8, 32.9, 27.4, 26.9, 24.7, 20.0, 19.6. Масс-спектр, m/z (I_отн, %): 379 (100), 331 (18), 316 (6), 305 (11), 278 (62), 270 (72), 251 (48), 225 (32), 211 (43), 199 (55), 185 (22), 171 (30). Найдено, %:С 60.12; Н 6.48; N 3.58. C₁₉H₂₅NO₅S. Вычислено, %: С 60.14; Н 6.64; N 3.69.

Пример 2.

Фармакологическая активность

Оценка пролиферативной активности клеток.

Клетки высаживались на флаконы Карреля по 50 × 10⁴ клеток на флакон. Для изучения пролиферативной активности клеток в условиях подавления сульфатазы через 24 часа после посева культуральную среду заменяли на среду, содержащую ингибиторы сульфатаз до конечной концентрации 50 мкг/мл, после чего инкубировали данные опухолевые клеточные линии в течение различных промежутков времени (от 24 до 72 ч). Ингибитор растворяют в ДМСО. Конечная концентрация ДМСО в культуральной среде не превышала 0.5%. Для исключения цитотоксического действия ДМСО ставили контроль с добавлением ДМСО без ингибитора сульфатаз. Для исключения неспецифического губительного действия веществ использовали нормальные кожные фибробласты человека. Далее, клетки снимали раствором версена-трипсина (Биолот), рассеивали на флаконы Карреля, содержащие новую полную культуральную среду. Подсчет клеток проводили в момент достижения необработанными контрольными клетками максимальной плотности клеток на единицу площади поверхности культурального флакона(монослой), при этом их количество определялось как 100%. Пролиферативную активность всех исследованных клеточных культур при воздействии ингибиторов сульфатаз определяли не менее трех раз.

Исследование влияния полученного сульфамата на рост перевиваемой культуры клеток человека MCF-7 (аденокарцинома молочной железы) показало, что стероид (1) полностью блокирует рост опухолевых клеток при концентрации 20 мкг/мл, при этом он не влияет на рост кожных фибробластов человека, не имеющих рецепторов эстрогенов. Рост опухолевых клеток ингибируется в той же степени, что и под действием тамоксифена, применяемого в медицинской практике более 30 лет. Это весьма важно, поскольку сульфаматы и тамоксифен имеют разные механизмы действия. Результаты исследования представлены в Таблице 1. Экспериментальные данные анализировали с помощью пакета статистических программ "STATISTICA 5.0".

Примечание. ЕЕ - 17α-этинилэстрадиол. *-Р_ОВЭ<0.05;

** - Р_ОВЭ<0.01.

Полученные результаты показывают, что заявленный агент не обладает утеротропной активностью, проявляет гипохолестеринемическое действие и не повышает содержание триглицеридов в сыворотке крови. Последнее важно, поскольку высокий уровень триглицеридов в сыворотке крови связывают с риском возникновения сердечно-сосудистых заболеваний.

В экспериментах на мышах линии FVB, трансгенной по HER-2/neu (ER-/PR-/HER2+), с опухолями молочных желез, агент ингибирует рост опухолей в той же степени, что и применяемый в клинической практике тамоксифен, что допускает их совместное использование для лечения рака молочной железы (это может привести к снижению побочных эффектов).

На клеточной линии трижды негативного рака молочной железы MDA-MB-231 соединение ингибирует рост клеток, IC₅₀=4.8 μМ, что сравнимо с применяющимся в клинической практике химиотерапевтическим препаратом этопозидом.

Показано, что проведение химиотерапии пациентам с метастазами в подмышечные лимфоузлы достоверно увеличивает 5-летнюю безрецидивную выживаемость на 11% по сравнению с группой без химиотерапии и повышает общую выживаемость по сравнению с терапией тамоксифеном.

На животных моделях, с привитой человеческой опухолью трижды-негативного рака молочной железы препарат показал более высокую активность, по сравнению с использующими в клинической практике тамоксифеном и ингибитором ароматазы летрозолом. Указания к применению:

- Моно- и адьювантная терапия раннего гормоноположительного рака молочной железы у женщин в постменопаузе.

- Лечение трижды негативного рака молочной железы.

- Моно- и адьювантная терапия рака молочной железы у женщин в постменопаузе после 2-3 летнего применения тамоксифена.

- Лечение распространенного рака молочной железы на поздних стадиях.

Группа изобретений относится к области медицины и химико-фармацевтической промышленности и касается средств для лечения рака молочной железы. Предложен способ получения 3-O-сульфамоилокси-7β-метил-D-гомо-6-окса-8α-эстра-1,3,5(10)-триен-17а-она и его применение в качестве противоопухолевого агента при моно- и адьювантной терапии трижды негативного рака молочной железы. Технический результат состоит в ингибировании роста опухолей молочной железы ER-/PR-/HER2+ у мышей и в подавлении роста клеток трижды негативного рака молочной железы MDA-MB-231. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 1 табл., 2 пр.

1. Применение 3-О-сульфамоилокси-7β-метил-D-гомо-6-окса-8α-эстра-1,3,5(10)-триен-17а-он формулы

в качестве противоонкологического агента при моно- и адъювантной терапии трижды негативного рака молочной железы.

2. Применение по п. 1, где 3-O-сульфамоилокси-6-окса-7β-метил-D-гомо-8α-эстра-1,3,5(10)-триен-17а-он вводят перорально женщинам с раком молочной железы в начальной стадии и при прогрессирующем раке молочной железы, а также после 2-3 летнего применения тамоксифена.

3. Способ получения противоонкологического агента по п. 1, включающий кислотный гидролиз метилового эфира 7β-метил-6-окса-D-гомо-8α-эстрона под действием бромистоводородной кислоты в уксусной кислоте, характеризующийся тем, что гидролиз проводят в атмосфере аргона с последующей экстракцией этилацетатом, промыванием водой, насыщенным раствором натрия хлорида, сушкой, полученный рацемический 7β-метил-6-окса-D-гомо-8α-эстрон растворяют в диметилформамиде и добавляют сульфамоилхлорид, продукт реакции экстрагируют этилацетатом.