НАПРАВЛЕННЫЕ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ ХИМЕРНЫЕ БЕЛКИ ЛИЗОСОМАЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2019 года по МПК C07K14/65 C07K14/435 C07K19/00 C12N9/24 C12N15/62 C12P21/02 A61K38/47 A61P43/00 

Область техники

[0001] Данная заявка испрашивает приоритет согласно предварительной заявке на Патент Соединенных Штатов Америки № 61/730378, поданной 27 ноября 2012 года, и предварительной заявке на Патент Соединенных Штатов Америки №61/788968, поданной 15 марта 2013 года, полное содержание которых включено в настоящую заявку посредством ссылки.

Область техники

[0002] Настоящее изобретение относится в целом к терапевтическим химерным белкам, подходящим для применения при лечении лизосомальных болезней накопления, и способам лечения таких болезней. Иллюстративные терапевтические химерные белки содержат лизосомальный фермент, компонент для направленной доставки в лизосомы, например, пептид IGF-II, и спейсерный пептид. Подразумевается, что указанным лизосмальным ферментом является альфа-N-ацетилглюкозаминидаза (Naglu), а указанным заболеванием является мукополисахаридоз IIIB типа (Синдром Санфилиппо В).

Уровень техники

[0003] В норме лизосомальные ферменты млекопитающих синтезируются в цитозоле и поступают в ЭР (эндоплазматический ретикулум), где происходит их гликозилирование путем присоединения углевода с высоким содержанием маннозы к N-концу. В аппарате Гольджи углевод с высоким содержанием маннозы ферментов лизосом модифицируется посредством присоединения манноза-6-фосфата (M6P), который обеспечивает направленную доставку указанных белков к лизосоме. Доставка M6P-модифицированных белов к лизосомам осуществляется за счет взаимодействия с одним из двух рецептором M6P. Наиболее предпочтительная форма модификации представляет собой присоединение двух М6Р к углеводу с высоким содержанием маннозы.

[0004] Более сорока лизосомальных болезней накопления (LSD) вызваны, прямо или косвенно, отсутствием одного или более лизосомальных ферментов в лизосоме. Способы ферментозаместительной терапии LSD активно разрабатываются. Как правило, требованием терапии является то, чтобы белки LSD были захвачены и доставлены к лизосомам клеток разных типов M6P-зависимым путем. Один из возможных подходов включает очистку белка LSD и его модификацию с целью включения углеводного компонента с M6P. Такой модифицированный материал может быть захвачен клетками более эффективно, чем немодифицированные белки LSD за счет взаимодействия с рецепторами M6P на поверхности клетки.

[0005] Авторы настоящей заявки ранее разработали технологию направленной доставки на основе пептидов, которая позволяет более эффективно доставлять терапевтические ферменты к лизосомам. Данная запатентованная технология называется «Независимая от гликозилирования направленная доставка в лизосомы (GILT)», поскольку M6P в качестве компонента, обеспечивающего направленную доставку в лизосомы, заменяет пептидная метка. Подробную информацию о технологии GILT можно найти в публикациях заявок на патент США № 2003-0082176, 2004-0006008, 2003-0072761, 2005-0281805, 2005-0244400, и в публикациях международных заявок WO 03/032913, WO 03/032727, WO 02/087510, WO 03/102583, WO 2005/078077, содержание которых включено в настоящую заявку посредством ссылки.

Сущность изобретения

[0006] Согласно настоящему изобретению предложены дополнительно усовершенствованные композиции и способы эффективной доставки в лизосомы на основании технологии GILT. Среди прочего, согласно настоящему изобретению предложены композиции и способы направленной доставки лизосомальных ферментов в лизосомы с применением пептидов направленной доставки в лизосому. Также согласно настоящему изобретению предложены композиции и способы направленной доставки лизосомальных ферментов в лизосомы с применением пептида направленной доставки в лизосому, который обладает сниженным или уменьшенным сродством связывания в отношении рецептора IGF-I и/или сниженным или уменьшенным сродством связывания в отношении рецептора инсулина, и/или устойчив к расщеплению фурином. Также согласно настоящему изобретению предложены химерные белки лизосомальных ферментов, состоящие из лизосомального фермента и IGF-II или пептидных спейсеров, которые обеспечивают увеличенную выработку и захват лизосомами указанного химерного белка лизосомального фермента. Согласно определенным вариантам реализации указанным лизосмальным ферментом является альфа-N-ацетилглюкозаминидаза (Naglu).

[0007] Согласно одному аспекту настоящего изобретения предложен направленный терапевтический химерный белок (белок, обладающий направленным действием), содержащий лизосомальный фермент, пептидную метку, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70% идентичную аминокислотам 8-67 зрелого IGF-II человека, и спейсерный пептидспейсер между лизосомальным ферментом и пептидной меткой IGF-II. Согласно различным вариантам реализации, указанный спейсерный пептид содержит одну или более аминокислотных последовательностей GGGPS (SEQ ID NO:14) или GGGSP (SEQ ID NO:15), и необязательно дополнительно содержит одну или более последовательностей (i) GAP (SEQ ID NO:9), (ii) GGGGS (SEQ ID NO:12), (iii) GGGS (SEQ ID NO:16), (iv) AAAAS (SEQ ID NO:17), (v) AAAS (SEQ ID NO:18), (vi) PAPA (SEQ ID NO:19), (vii) TPAPA (SEQ ID NO:20), (viii) AAAKE (SEQ ID NO:21) или (ix) GGGGA (SEQ ID NO:60).

[0008] Примеры лизосомальных ферментов, рассматриваемых в настоящей заявке, включают ферменты, перечисленные в таблице 1.

[0009] Согласно различным вариантам реализации, указанный направленный терапевтический химерный белок содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 85% идентичную белку альфа-N-ацетилглюкозаминидазе (Naglu) человека (фигура 1, SEQ ID NO:1), пептидную метку, чья аминокислотная последовательность по меньшей мере на 70% идентична аминокислотам 8-67 зрелого IGF-II человека, и спейсерный пептид, расположенный между аминокислотной последовательностью Naglu и пептидной меткой IGF-II. Согласно различным вариантам реализации, указанный спейсер содержит аминокислотную последовательность GAP (SEQ ID NO:9), GPS (SEQ ID NO:10) или GGS (SEQ ID NO:11). Согласно различным вариантам реализации последовательность указанного спейсера содержит аминокислоты Gly-Pro-Ser (GPS) (SEQ ID NO:10) между аминокислотами зрелого IGF-II человека и аминокислотами Naglu человека.

[0010] Согласно различным вариантам реализации, указанный спейсерный пептид содержит одну или более аминокислотных последовательностей GGGGS (SEQ ID NO:12) или GGGS (SEQ ID NO:16). Согласно различным вариантам реализации, указанный спейсерный пептид содержит одну или более аминокислотных последовательностей GGGPS (SEQ ID NO:14) или GGGSP (SEQ ID NO:15). Согласно различным вариантам реализации, указанный спейсерный пептид содержит одну или более аминокислотных последовательностей AAAAS (SEQ ID NO:17) или AAAS (SEQ ID NO:18). Согласно различным вариантам реализации, указанный спейсерный пептид содержит одну или более аминокислотных последовательностей PAPA (SEQ ID NO:19) или TPAPA (SEQ ID NO:20). Согласно различным вариантам реализации, указанный спейсерный пептид содержит одну или более аминокислотных последовательностей AAAKE (SEQ ID NO:21). Согласно различным вариантам реализации, указанный спейсерный пептид содержит одну или более аминокислотных последовательностей GGGGA (SEQ ID NO:60).

[0011] Согласно различным вариантам реализации, указанный спейсерный пептид содержит аминокислотную последовательность, выбираемую из группы, состоящей из: (GGGGS)_n (SEQ ID NO:12, 56, 58, 91-94), (GGGGS)_n-GGGPS (SEQ ID NO:36, 95-100), GAP-(GGGGS)_n-GGGPS (SEQ ID NO:101-107), GAP-(GGGGS)_n-GGGPS-GAP (SEQ ID NO:37, 108-113), GAP-(GGGGS)_n-GGGPS-(GGGGS)_n-GAP (SEQ ID NO:114-162), GAP-GGGPS-(GGGGS)_n-GAP (SEQ ID NO:163-169), GAP-(GGGGS)_n-AAAAS-GGGPS-(GGGGS)_n-AAAA-GAP (SEQ ID NO:170-218), GAP-(GGGGS)_n-PAPAP-(Xaa)_n-GAP (SEQ ID NO:219-267), GAP-(GGGGS)_n-PAPAPT-(Xaa)_n-GAP (SEQ ID NO:268-316), GAP-(GGGGS)_n-(Xaa)_n-PAPAP-(Xaa)_n-(AAAKE)_n-(Xaa)_n-(GGGGS)_n-GAP (SEQ ID NO:544-551), (GGGGA)_n (SEQ ID NO:60, 79, 81, 317-320), (GGGGA)_n-GGGPS (SEQ ID NO:321-326), GAP-(GGGGA)_n-GGGPS (SEQ ID NO:327-333), GAP-(GGGGA)_n-GGGPS-GAP (SEQ ID NO:334-340), GAP-(GGGGA)_n-GGGPS-(GGGGA)_n-GAP (SEQ ID NO:341-389), GAP-GGGPS-(GGGGA)_n-GAP (SEQ ID NO:390-396), GAP-(GGGGA)_n-AAAAS-GGGPS-(GGGGA)_n-AAAA-GAP (SEQ ID NO:397-445), GAP-(GGGGA)_n-PAPAP-(Xaa)_n-GAP (SEQ ID NO:446-494), GAP-(GGGGA)_n-PAPAPT-(Xaa)_n-GAP (SEQ ID NO:495-543), GAP-(GGGGA)_n-(Xaa)_n-PAPAP-(Xaa)_n-(AAAKE)_n-(Xaa)_n-(GGGGA)_n-GAP (SEQ ID NO:552-559); в которых n равно от 1 до 7. Согласно различным вариантам реализации n равно от 1 до 4.

[0012] Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения предложен пептид IGF-II для применения в качестве пептидной метки для направленной доставки пептида или химерного белка, содержащего указанный пептид, в лизосому млекопитающих. Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения предложен мутеин IGF-II. Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения предложен фурин-устойчивый мутеин IGF-II, обладающий аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной последовательности зрелого IGF-II человека (AYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRPASRVSRRSRGIVEECCFRSCDLALLETYCATPAKSE) (SEQ ID NO:5), и содержащий мутацию, которая ведет к устранению по меньшей мере одного сайта расщепления протеазой фурином.

[0013] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен мутеин IGF-II, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70% идентичную последовательности зрелого IGF-II человека. Согласно различным вариантам реализации пептидная метка указанного мутеина IGF-II содержит аминокислоты 8-67 зрелого IGF-II человека. Согласно различным вариантам реализации, указанный мутеин IGF-II содержит мутацию, которая снижает или уменьшает сродство связывания с рецептором инсулина по сравнению с IGF-II человека дикого типа.

[0014] Согласно некоторым вариантам реализации, указанный IGF-II человека обладает сниженным или уменьшенным сродством связывания с рецептором IGF-I по сравнению со сродством существующего в природе IGF-II человека к рецептору IGF-I.

[0015] Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения предложен направленный терапевтический химерный белок, содержащий лизосомальный фермент; и мутеин IGF-II, обладающий аминокислотной последовательностью, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности зрелого IGF-II человека, причем указанный мутеин IGF-II устойчив к расщеплению фурином и связывается с катион-независимым рецептором манноза-6-фосфата независимо от манноза-6-фосфата.

[0016] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен направленный терапевтический химерный белок, содержащий лизосомальный фермент; и мутеин IGF-II, имеющий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности зрелого IGF-II человека, и обладающий сниженным сродством связывания с рецептором инсулина по сравнению со сродством существующего в природе IGF-II человека к рецептору инсулина. Согласно близкому варианту реализации указанный мутеин IGF-II устойчив к расщеплению фурином и связывается с катион-независимым рецептором манноза-6-фосфата независимо от манноза-6-фосфата.

[0017] Согласно различным вариантам реализации мутеин IGF-II, подходящий для реализации настоящего изобретения, содержит мутацию в области, соответствующей аминокислотам 30-40 зрелого IGF-II. Согласно некоторым вариантам реализации мутеин IGF-II, подходящий для реализации настоящего изобретения, содержит мутацию в области, соответствующей аминокислотам 34-40 зрелого IGF-II, так что указанная мутация приводит к устранению по меньшей мере одного сайта расщепления протеазой фурином. Согласно некоторым вариантам реализации подходящей мутацией является замена, делеция и/или вставка аминокислоты. Согласно некоторым вариантам реализации указанной мутацией является аминокислотная замена в положении, соответствующем Arg37 или Arg40 зрелого IGF-II человека. Согласно некоторым вариантам реализации указанной аминокислотной заменой является замена Lys или Ala.

[0018] Согласно некоторым вариантам реализации подходящей мутацией является делеция или замещение аминокислотных остатков, соответствующих положениям, выбираемым из группы, состоящей из 30-40, 31-40, 32-40, 33-40, 34-40, 30-39, 31-39, 32-39, 34-37, 33-39, 34-39, 35-39, 36-39, 37-40 зрелого IGF-II человека, и их сочетаний.

[0019] Согласно различным вариантам реализации мутеин IGF-II согласно настоящему изобретению дополнительно содержит делецию или замену аминокислот, соответствующих положениям 2-7 зрелого IGF-II человека. Согласно различным вариантам реализации мутеин IGF-II согласно настоящему изобретению дополнительно содержит делецию или замену аминокислот, соответствующих положениям 1-7 зрелого IGF-II человека. Согласно различным вариантам реализации мутеин IGF-II согласно настоящему изобретению дополнительно содержит делецию или замену аминокислот, соответствующих положениям 62-67 зрелого IGF-II человека. Согласно различным вариантам реализации мутеин IGF-II согласно настоящему изобретению дополнительно содержит замену аминокислоты в положении, соответствующем Tyr27, Leu43 или Ser26 зрелого IGF-II человека. Согласно различным вариантам реализации мутеин IGF-II согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере одну замену аминокислоты, выбираемую из группы, состоящей из Tyr27Leu, Leu43Val, Ser26Phe и их сочетания. Согласно различным вариантам реализации мутеин IGF-II согласно настоящему изобретению содержит аминокислоты, соответствующие положениям 48-55 зрелого IGF-II человека. Согласно различным вариантам реализации мутеин IGF-II согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере три аминокислоты, выбираемые из группы, состоящей из аминокислот, соответствующих положениям 8, 48, 49, 50, 54 и 55 зрелого IGF-II человека. Согласно различным вариантам реализации мутеин IGF-II согласно настоящему изобретению содержит, в положениях, соответствующих положениям 54 и 55 зрелого IGF-II человека, аминокислоты, каждая из которых не заряжена или отрицательно заряжена при рН 7,4. Согласно различным вариантам реализации, указанный мутеин IGF-II обладает сниженным или уменьшенным сродством связывания с рецептором IGF-I по сравнению со сродством существующего в природе IGF-II человека к рецептору IGF-I. Согласно различным вариантам реализации указанным мутеином IGF-II является IGF2 Δ8-67 R37A (т.е., аминокислоты 8-67 зрелого IGF-II человека с Arg в положении 37 зрелого IGF-II человека заменены на Ala).

[0020] Согласно различным вариантам реализации указанная пептидная метка присоединена к N-концу или C-концу указанного лизосомального фермента, следовательно, является N-концевой или C-концевой меткой, соответственно. Согласно различным вариантам реализации указанная пептидная метка является C-концевой меткой.

[0021] Согласно некоторым вариантам реализации подходящим лизосмальным ферментом является альфа-N-ацетилглюкозаминидаза (Naglu) (фигура 1), или ее функциональный фрагмент или вариант. Согласно некоторым вариантам реализации лизосомальный фермент, подходящий для реализации настоящего изобретения, включает аминокислоты 1-743 альфа-N-ацетилглюкозаминидазы человека или аминокислоты 24-743 альфа-N-ацетилглюкозаминидазы человека, которые не содержат сигнальной последовательности.

[0022] Согласно различным вариантам реализации направленный терапевтический химерный белок согласно настоящему изобретению дополнительно включает спейсер между лизосомальным ферментом и мутеином IGF-II.

[0023] Согласно различным вариантам реализации, указанный спейсер содержит структуру альфа-спирали или жесткую структуру.

[0024] Согласно различным вариантам реализации, указанный спейсер содержит одну или более аминокислотных последовательностей Gly-Ala-Pro (GAP) (SEQ ID NO:9), Gly-Pro-Ser (GPS) (SEQ ID NO:10) или Gly-Gly-Ser (GGS) (SEQ ID NO:11).

[0025] Согласно некоторым вариантам реализации, указанный спейсер выбран из группы, состоящей из EFGGGGSTR (SEQ ID NO:22), GAP (SEQ ID NO:9), GGGGS (SEQ ID NO:12), GPSGSPG (SEQ ID NO:23), GPSGSPGT (SEQ ID NO:24), GPSGSPGH (SEQ ID NO:25), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPST (SEQ ID NO:26), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSH (SEQ ID NO:27), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO:28), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO:29), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO:30), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO:31), GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO:32), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO:33), GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO:34), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO:35), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO:36), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO:37), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPS (SEQ ID NO:38), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO:39), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPS (SEQ ID NO:40), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGAP (SEQ ID NO:41), GGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPS (SEQ ID NO:42), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGAP (SEQ ID NO:43), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS (SEQ ID NO:44), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP (SEQ ID NO:45), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS (SEQ ID NO:46), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP (SEQ ID NO:47), GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS (SEQ ID NO:48), GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP (SEQ ID NO:49), GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS (SEQ ID NO:50), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEQ ID NO:51), GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS (SEQ ID NO:52), GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP (SEQ ID NO:53), GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG (SEQ ID NO:54), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEQ ID NO:55), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:56), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGAP (SEQ ID NO:57), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:58), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGAP (SEQ ID NO:59), GGGGA (SEQ ID NO:60), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPST (SEQ ID NO:61), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH (SEQ ID NO:62), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPS (SEQ ID NO:63), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO:64), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO:65), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO:66), GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO:67), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO:68), GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO:69), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO:70), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO:71), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO:72), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPS (SEQ ID NO:73), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO:74), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPS (SEQ ID NO:75), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGAP (SEQ ID NO:76), GGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPS (SEQ ID NO:77), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGAP (SEQ ID NO:78), GGGGAGGGGAGGGGA (SEQ ID NO:79), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGAP (SEQ ID NO:80), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA (SEQ ID NO:81), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGAP (SEQ ID NO:82), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS [или (GGGGA)₈GGGPS] (SEQ ID NO:83), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH [или (GGGGA)₈GGGPSH] (SEQ ID NO:84), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS [или (GGGGA)₉GGGPS] (SEQ ID NO:85), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH [или (GGGGA)₉GGGPSH] (SEQ ID NO:86), GGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPS (SEQ ID NO:87), GAPGGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPGGAP (SEQ ID NO:88), GGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPS (SEQ ID NO:89) и GAPGGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPGGAP (SEQ ID NO:90).

[0026] Согласно некоторым вариантам реализации, указанный спейсер выбран из группы, состоящей из GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO:36), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS (SEQ ID NO:44), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP (SEQ ID NO:45), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS (SEQ ID NO:46), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP (SEQ ID NO:47), GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS (SEQ ID NO:48), GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP (SEQ ID NO:49), GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS (SEQ ID NO:50), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEQ ID NO:51), GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS (SEQ ID NO:52), GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP (SEQ ID NO:53), GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG (SEQ ID NO:54), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEQ ID NO:55) и GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO:71).

[0027] Согласно некоторым вариантам реализации, указанный спейсер выбран из группы, состоящей из GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO:36), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP (SEQ ID NO:47), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEQ ID NO:51), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEQ ID NO:55) и GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO:71).

[0028] Согласно различным вариантам реализации, указанный химерный белок дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель, растворитель или вспомогательное вещество.

[0029] Также согласно настоящему изобретению предложены нуклеиновые кислоты, кодирующие мутеин IGF-II или направленный терапевтический химерный белок, описанные в разных вариантах реализации выше. Также согласно настоящему изобретению предложены различные клетки, содержащие нуклеиновую кислоту согласно настоящему изобретению.

[0030] Согласно настоящему изобретению предложены фармацевтические композиции, подходящие для лечения лизосомальных болезней накопления, включающие терапевтически эффективное количество направленного терапевтического химерного белка согласно настоящему изобретению. Также согласно настоящему изобретению предложены способы лечения лизосомальных болезней накопления, включающие введение субъекту, нуждающемуся в лечении, направленного терапевтического химерного белка согласно настоящему изобретению. Согласно некоторым вариантам реализации указанной лизосомальной болезнью накопления является мукополисахаридоз IIIB типа (Синдром Санфилиппо В).

[0031] Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен способ получения направленного терапевтического химерного белка, включающий этап культивирования клеток млекопитающих в среде для культивирования клеток, причем указанные клетки млекопитающих содержат нуклеиновую кислоту согласно настоящему изобретению, в частности, как описано в разных вариантах реализации в настоящей заявке; и культивирование проводят при условиях, которые делают возможной экспрессию направленного терапевтического химерного белка.

[0032] Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложен способ получения направленного терапевтического химерного белка, включающий этап культивирования фурин-дефицитных клеток (например, фурин-дефицитных клеток млекопитающих) в среде для культивирования клеток, причем указанные фурин-дефицитные клетки содержат нуклеиновую кислоту, кодирующую химерный белок, содержащий лизосомальный белок и мутеин IGF-II, обладающий аминокислотной последовательностью, идентичной по меньшей мере на 70% последовательности зрелого IGF-II человека, причем указанный мутеин IGF-II связывается с катион-независимым рецептором манноза-6-фосфата человека независимо от манноза-6-фосфата; и причем культивирование проводят при условиях, которые делают возможной экспрессию направленного терапевтического химерного белка.

[0033] Согласно различным вариантам реализации подразумевается, что некоторые из направленных терапевтических белков, содержащих спейсер, описываемый в настоящей заявке, проявляют более высокую экспрессию активного белка, когда он экспрессируется по рекомбинантной технологии, чем направленные терапевтические белки, содержащие другой спейсерный пептид. Согласно различным вариантам реализации также подразумевается, что направленные терапевтические белки, описываемые в настоящей заявке, могут обладать более высокой активностью, чем другие направленные терапевтические белки в настоящей заявке. Подразумевается, что направленные терапевтические белки, проявляющие более высокую экспрессию активного белка и/или обладающие более высокой активностью, чем другие направленные терапевтические белки, содержащие другой спейсерный пептид, применяются в дальнейших экспериментах.

[0034] Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен способ лечения лизосомальной болезни накопления у субъекта, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей химерный белок, содержащий лизосомальный фермент, пептидную метку, обладающую аминокислотной последовательностью, идентичной по меньшей мере на 70% аминокислотам 8-67 зрелого IGF-II человека, и спейсерный пептид, расположенный между аминокислотной последовательностью лизосомального фермента и пептидной меткой IGF-II. Согласно различным вариантам реализации, указанный спейсерный пептид содержит одну или более аминокислотных последовательностей GGGPS (SEQ ID NO:14) или GGGSP (SEQ ID NO:15), и необязательно дополнительно содержит одну или более из последовательностей (i) GAP (SEQ ID NO:9), (ii) GGGGS (SEQ ID NO:12), (iii) GGGS (SEQ ID NO:16), (iv) AAAAS (SEQ ID NO:17), (v) AAAS (SEQ ID NO:18), (vi) PAPA (SEQ ID NO:19), (vii) TPAPA (SEQ ID NO:20), (viii) AAAKE (SEQ ID NO:21) или (ix) GGGGA (SEQ ID NO:60).

[0035] Согласно различным вариантам реализации, указанный спейсерный пептид содержит аминокислотную последовательность, выбираемую из группы, состоящей из: (GGGGS)_n (SEQ ID NO:12, 56, 58, 91-94), (GGGGS)_n-GGGPS (SEQ ID NO:36, 95-100), GAP-(GGGGS)_n-GGGPS (SEQ ID NO:101-107), GAP-(GGGGS)_n-GGGPS-GAP (SEQ ID NO:37, 108-113), GAP-(GGGGS)_n-GGGPS-(GGGGS)_n-GAP (SEQ ID NO:114-162), GAP-GGGPS-(GGGGS)_n-GAP (SEQ ID NO:163-169), GAP-(GGGGS)_n-AAAAS-GGGPS-(GGGGS)_n-AAAA-GAP (SEQ ID NO:170-218), GAP-(GGGGS)_n-PAPAP-(Xaa)_n-GAP (SEQ ID NO:219-267), GAP-(GGGGS)_n-PAPAPT-(Xaa)_n-GAP (SEQ ID NO:268-316), GAP-(GGGGS)_n-(Xaa)_n-PAPAP-(Xaa)_n-(AAAKE)_n-(Xaa)_n-(GGGGS)_n-GAP (SEQ ID NO:544-551), (GGGGA)_n (SEQ ID NO:60, 79, 81, 317-320), (GGGGA)_n-GGGPS (SEQ ID NO:321-326), GAP-(GGGGA)_n-GGGPS (SEQ ID NO:327-333), GAP-(GGGGA)_n-GGGPS-GAP (SEQ ID NO:334-340), GAP-(GGGGA)_n-GGGPS-(GGGGA)_n-GAP (SEQ ID NO:341-389), GAP-GGGPS-(GGGGA)_n-GAP (SEQ ID NO:390-396), GAP-(GGGGA)_n-AAAAS-GGGPS-(GGGGA)_n-AAAA-GAP (SEQ ID NO:397-445), GAP-(GGGGA)_n-PAPAP-(Xaa)_n-GAP (SEQ ID NO:446-494), GAP-(GGGGA)_n-PAPAPT-(Xaa)_n-GAP (SEQ ID NO:495-543), GAP-(GGGGA)_n-(Xaa)_n-PAPAP-(Xaa)_n-(AAAKE)_n-(Xaa)_n-(GGGGA)_n-GAP (SEQ ID NO:552-559); причем n равно 1-7, необязательно n равно 1-4.

[0036] Согласно различным вариантам реализации, указанный спейсерный пептид содержит аминокислотную последовательность, выбираемую из группы, состоящей из: EFGGGGSTR (SEQ ID NO:22), GAP (SEQ ID NO:9), GGGGS (SEQ ID NO:12), GPSGSPG (SEQ ID NO:23), GPSGSPGT (SEQ ID NO:24), GPSGSPGH (SEQ ID NO:25), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPST (SEQ ID NO:26), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSH (SEQ ID NO:27), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO:28), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO:29), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO:30), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO:31), GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO:32), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO:33), GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO:34), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO:35), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO:36), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO:37), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPS (SEQ ID NO:38), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO:39), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPS (SEQ ID NO:40), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGAP (SEQ ID NO:41), GGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPS (SEQ ID NO:42), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGAP (SEQ ID NO:43), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS (SEQ ID NO:44), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP (SEQ ID NO:45), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS (SEQ ID NO:46), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP (SEQ ID NO:47), GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS (SEQ ID NO:48), GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP (SEQ ID NO:49), GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS (SEQ ID NO:50), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEQ ID NO:51), GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS (SEQ ID NO:52), GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP (SEQ ID NO:53), GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG (SEQ ID NO:54), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEQ ID NO:55), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:56), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGAP (SEQ ID NO:57), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:58), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGAP (SEQ ID NO:59), GGGGA (SEQ ID NO:60), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPST (SEQ ID NO:61), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH (SEQ ID NO:62), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPS (SEQ ID NO:63), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO:64), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO:65), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO:66), GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO:67), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO:68), GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO:69), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO:70), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO:71), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO:72), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPS (SEQ ID NO:73), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO:74), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPS (SEQ ID NO:75), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGAP (SEQ ID NO:76), GGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPS (SEQ ID NO:77), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGAP (SEQ ID NO:78), GGGGAGGGGAGGGGA (SEQ ID NO:79), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGAP (SEQ ID NO:80), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA (SEQ ID NO:81), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGAP (SEQ ID NO:82), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS [или (GGGGA)₈GGGPS] (SEQ ID NO:83), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH [или (GGGGA)₈GGGPSH] (SEQ ID NO:84), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS [или (GGGGA)₉GGGPS] (SEQ ID NO:85), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH [или (GGGGA)₉GGGPSH] (SEQ ID NO:86), GGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPS (SEQ ID NO:87), GAPGGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPGGAP (SEQ ID NO:88), GGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPS (SEQ ID NO:89) и GAPGGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPGGAP (SEQ ID NO:90).

[0037] Согласно различным вариантам реализации, указанный спейсерный пептид содержит аминокислотную последовательность, выбираемую из группы, состоящей из: GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO:36), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS (SEQ ID NO:44), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP (SEQ ID NO:45), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS (SEQ ID NO:46), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP (SEQ ID NO:47), GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS (SEQ ID NO:48), GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP (SEQ ID NO:49), GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS (SEQ ID NO:50), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEQ ID NO:51), GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS (SEQ ID NO:52), GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP (SEQ ID NO:53), GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG (SEQ ID NO:54), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEQ ID NO:55) и GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO:71).

[0038] Согласно различным вариантам реализации, указанный спейсерный пептид содержит аминокислотную последовательность, выбираемую из группы, состоящей из: GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO:36), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP (SEQ ID NO:47), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEQ ID NO:51), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEQ ID NO:55) и GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO:71).

[0039] Примеры лизосомальных болезней накопления, рассматриваемых для реализации способов, описанных в настоящей заявке, включают заболевания, перечисленные в таблице 1. Подразумевается, что лизосомальную болезнь накопления лечат с применением направленного терапевтического химерного белка, включающего в себя фермент, недостаточность которого присутствует при конкретной лизосомальной болезни накопления, которые также раскрываются в таблице 1.

[0040] Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ лечения мукополисахаридоза IIIB типа (Синдрома Санфилиппо В) у субъекта, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей химерный белок с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 85% идентичной последовательности белка α-N-ацетилглюкозаминидаза (Naglu) человека (SEQ ID NO:1), пептидную метку, с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотам 8-67 зрелого IGF-II человека, и спейсерный пептид, расположенный между аминокислотной последовательностью Naglu и пептидной меткой IGF-II. Согласно различным вариантам реализации, указанный спейсер содержит аминокислотную последовательность GAP (SEQ ID NO:9), GPS (SEQ ID NO:10) или GGS (SEQ ID NO:11).

[0041] Согласно различным вариантам реализации последовательность спейсера содержит аминокислоты Gly-Pro-Ser (GPS) (SEQ ID NO:10) между аминокислотами зрелого IGF-II человека и аминокислотами Naglu человека.

[0042] Согласно различным вариантам реализации, указанный спейсерный пептид содержит одну или более аминокислотных последовательностей GGGGS (SEQ ID NO:12) или GGGS (SEQ ID NO:16). Согласно различным вариантам реализации, указанный спейсерный пептид содержит одну или более аминокислотных последовательностей GGGPS (SEQ ID NO:14) или GGGSP (SEQ ID NO:15). Согласно различным вариантам реализации, указанный спейсерный пептид содержит одну или более аминокислотных последовательностей AAAAS (SEQ ID NO:17) или AAAS (SEQ ID NO:18). Согласно различным вариантам реализации, указанный спейсерный пептид содержит одну или более аминокислотных последовательностей PAPA (SEQ ID NO:19) или TPAPA (SEQ ID NO:20). Согласно различным вариантам реализации, указанный спейсерный пептид содержит одну или более аминокислотных последовательностей AAAKE (SEQ ID NO:21). Согласно различным вариантам реализации, указанный спейсерный пептид содержит одну или более аминокислотных последовательностей GGGGA (SEQ ID NO:60).

[0043] Согласно различным вариантам реализации, указанный спейсерный пептид содержит аминокислотную последовательность, выбираемую из группы, состоящей из: (GGGGS)_n (SEQ ID NO:12, 56, 58, 91-94), (GGGGS)_n-GGGPS (SEQ ID NO:36, 95-100), GAP-(GGGGS)_n-GGGPS (SEQ ID NO:101-107), GAP-(GGGGS)_n-GGGPS-GAP (SEQ ID NO:37, 108-113), GAP-(GGGGS)_n-GGGPS-(GGGGS)_n-GAP (SEQ ID NO:114-162), GAP-GGGPS-(GGGGS)_n-GAP (SEQ ID NO:163-169), GAP-(GGGGS)_n-AAAAS-GGGPS-(GGGGS)_n-AAAA-GAP (SEQ ID NO:170-218), GAP-(GGGGS)_n-PAPAP-(Xaa)_n-GAP (SEQ ID NO:219-267), GAP-(GGGGS)_n-PAPAPT-(Xaa)_n-GAP (SEQ ID NO:268-316), GAP-(GGGGS)_n-(Xaa)_n-PAPAP-(Xaa)_n-(AAAKE)_n-(Xaa)_n-(GGGGS)_n-GAP (SEQ ID NO:544-551), (GGGGA)_n (SEQ ID NO:60, 79, 81, 317-320), (GGGGA)_n-GGGPS (SEQ ID NO:321-326), GAP-(GGGGA)_n-GGGPS (SEQ ID NO:327-333), GAP-(GGGGA)_n-GGGPS-GAP (SEQ ID NO:334-340), GAP-(GGGGA)_n-GGGPS-(GGGGA)_n-GAP (SEQ ID NO:341-389), GAP-GGGPS-(GGGGA)_n-GAP (SEQ ID NO:390-396), GAP-(GGGGA)_n-AAAAS-GGGPS-(GGGGA)_n-AAAA-GAP (SEQ ID NO:397-445), GAP-(GGGGA)_n-PAPAP-(Xaa)_n-GAP (SEQ ID NO:446-494), GAP-(GGGGA)_n-PAPAPT-(Xaa)_n-GAP (SEQ ID NO:495-543), GAP-(GGGGA)_n-(Xaa)_n-PAPAP-(Xaa)_n-(AAAKE)_n-(Xaa)_n-(GGGGA)_n-GAP (SEQ ID NO:552-559); причем n равно 1-7, и необязательно n равно 1-4.

[0044] Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ уменьшения уровня гликозаминогликанов (GAG) in vivo, включающий введение субъекту, страдающему мукополисахаридозом IIIB типа (Синдромом Санфилиппо В), эффективного количества химерного белка, содержащего i) аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 85% идентичную последовательности белка α-N-ацетилглюкозаминидаза (Naglu) человека (SEQ ID NO:1), ii) пептидную метку, обладающую аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотам 8-67 зрелого IGF-II человека, и iii) спейсерный пептид, расположенный между аминокислотной последовательностью Naglu и пептидной меткой IGF-II.

[0045] Согласно различным вариантам реализации, указанный спейсер содержит одну или более копий из аминокислот Gly-Ala-Pro (GAP) (SEQ ID NO:9) между аминокислотами зрелого IGF-II человека и аминокислотами Naglu человека.

[0046] Согласно различным вариантам реализации, указанный спейсерный пептид выбран из группы, состоящей из EFGGGGSTR (SEQ ID NO:22), GAP (SEQ ID NO:9), GGGGS (SEQ ID NO:12), GPSGSPG (SEQ ID NO:23), GPSGSPGT (SEQ ID NO:24), GPSGSPGH (SEQ ID NO:25), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPST (SEQ ID NO:26), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSH (SEQ ID NO:27), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO:28), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO:29), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO:30), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO:31), GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO:32), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO:33), GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO:34), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO:35), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO:36), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO:37), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPS (SEQ ID NO:38), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO:39), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPS (SEQ ID NO:40), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGAP (SEQ ID NO:41), GGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPS (SEQ ID NO:42), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGAP (SEQ ID NO:43), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS (SEQ ID NO:44), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP (SEQ ID NO:45), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS (SEQ ID NO:46), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP (SEQ ID NO:47), GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS (SEQ ID NO:48), GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP (SEQ ID NO:49), GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS (SEQ ID NO:50), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEQ ID NO:51), GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS (SEQ ID NO:52), GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP (SEQ ID NO:53), GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG (SEQ ID NO:54), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEQ ID NO:55), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:56), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGAP (SEQ ID NO:57), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:58), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGAP (SEQ ID NO:59), GGGGA (SEQ ID NO:60), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPST (SEQ ID NO:61), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH (SEQ ID NO:62), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPS (SEQ ID NO:63), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO:64), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO:65), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO:66), GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO:67), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO:68), GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO:69), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO:70), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO:71), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO:72), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPS (SEQ ID NO:73), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO:74), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPS (SEQ ID NO:75), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGAP (SEQ ID NO:76), GGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPS (SEQ ID NO:77), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGAP (SEQ ID NO:78), GGGGAGGGGAGGGGA (SEQ ID NO:79), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGAP (SEQ ID NO:80), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA (SEQ ID NO:81), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGAP (SEQ ID NO:82), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS [или (GGGGA)₈GGGPS] (SEQ ID NO:83), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH [или (GGGGA)₈GGGPSH] (SEQ ID NO:84), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS [или (GGGGA)₉GGGPS] (SEQ ID NO:85), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH [или (GGGGA)₉GGGPSH] (SEQ ID NO:86), GGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPS (SEQ ID NO:87), GAPGGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPGGAP (SEQ ID NO:88), GGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPS (SEQ ID NO:89) и GAPGGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPGGAP (SEQ ID NO:90).

[0047] Согласно различным вариантам реализации, указанный спейсерный пептид выбран из группы, состоящей из GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO:36), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS (SEQ ID NO:44), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP (SEQ ID NO:45), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS (SEQ ID NO:46), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP (SEQ ID NO:47), GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS (SEQ ID NO:48), GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP (SEQ ID NO:49), GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS (SEQ ID NO:50), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEQ ID NO:51), GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS (SEQ ID NO:52), GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP (SEQ ID NO:53), GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG (SEQ ID NO:54), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEQ ID NO:55) и GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO:71).

[0048] Согласно различным вариантам реализации, указанный спейсерный пептид выбран из группы, состоящей из GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO:36), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP (SEQ ID NO:47), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEQ ID NO:51), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEQ ID NO:55) и GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO:71).

[0049] Согласно различным вариантам реализации домен направленной доставки в лизосомы или пептидная метка IGF-II содержит аминокислоты 8-67 зрелого IGF-II человека (SEQ ID NO:2, 4). Согласно различным вариантам реализации указанная пептидная метка IGF-II содержит мутацию в остатке Arg37. Согласно различным вариантам реализации указанной мутацией является замена аргинина на аланин. Согласно различным вариантам реализации домен направленной доставки в лизосомы или пептидная метка IGF-II содержит IGF2 Δ8-67 R37A.

[0050] Согласно различным вариантам реализации, указанный химерный белок содержит аминокислоты 1-743 Naglu человека (SEQ ID NO:1, 3). Согласно различным вариантам реализации, указанный химерный белок содержит аминокислоты 24-743 Naglu человека.

[0051] Согласно различным вариантам реализации эффективное количество химерного белка варьирует в диапазоне приблизительно 0,1-1 мг/кг, приблизительно 1-5 мг/кг, приблизительно 2,5-20 мг/кг, приблизительно 5-20 мг/кг, приблизительно 10-50 мг/кг, или 20-100 мг/кг массы тела субъекта. Согласно различным вариантам реализации эффективное количество химерного белка составляет приблизительно 2,5-20 мг на килограмм массы тела субъекта.

[0052] Согласно различным вариантам реализации, указанный химерный белок вводят интратекально, внутривенно, парентерально, чрескожно или через слизистые оболочки. Согласно различным вариантам реализации, указанный химерный белок вводят интратекально. Согласно различным вариантам реализации интратекальное введение необязательно также включает внутривенное введение химерного белка.

[0053] Согласно различным вариантам реализации интратекальное введение включает доставку химерного белка в желудочек головного мозга, поясничную область или мозжечково-мозговую цистерну.

[0054] Согласно различным вариантам реализации, указанный химерный белок вводят раз в два месяца, раз в месяц, раз в три недели, раз в две недели, раз в неделю, раз в день или с различными интервалами.

[0055] Согласно различным вариантам реализации указанное лечение приводит к снижению уровня гликозаминогликанов (GAG) в ткани головного мозга. Дополнительно подразумевается, что указанное лечение приводит к уменьшению количества лизосомальных гранул накопления в ткани головного мозга.

[0056] Также рассматриваются композиции, содержащие направленные терапевтические химерные белки, описываемые в настоящей заявке, для применения при лечении лизосомальных болезней накопления. Примеры лизоосомальных болезней накопления включают заболевания, перечисленные в таблице 1.

[0057] Другие характерные свойства, объекты и преимущества настоящего изобретения станут очевидны из подробного описания, которое следует далее. Следует понимать, однако, что подробное описание, хотя и обозначает варианты реализации настоящего изобретения, приведено только в целях иллюстрации, но не ограничения. Разные изменения и модификации в области изобретения станут понятны специалистам в данн6ой области техники из подробного описания.

Краткое описание чертежей

[0058] Чертежи приведены только в целях иллюстрирации, но не ограничения.

[0059] На фигуре 1 изображены аминокислотные последовательности части примерного терапевтического химерного белка, содержащего (A) Naglu и (B) пептид IGF-II, содержащий остатки 8-67 IGF-II, и содержащий замену аминокислоты в остатке 37, R37A (Arg37Ala).

[0060] На фигуре 2 изображены нуклеотидные последовательности части примерного терапевтического химерного белка, содержащего (A) Naglu и (B) пептид IGF-II, содержащий остатки 8-67 IGF-II, и содержащий замену аминокислоты в остатке 37, R37A (Arg37Ala).

[0061] На фигуре 3 раскрываются примеры последовательностей спейсеров, предполагаемых для применения в составе терапевтического химерного белка.

Определения

[0062] Облегчение: В настоящей заявке термин «облегчение» относится к предупреждению, уменьшению или облегчению состояния, или к улучшению состояния субъекта. Облегчение включает, но не обязательно требует, полное восстановление или полное предупреждение патологического состояния. Согласно некоторым вариантам реализации понятие «облегчение» включает сокращение количества накопленного материала внутри лизосом в характерных для конкретного заболевания тканях.

[0063] Фурин-устойчивый мутеин IGF-II: В настоящей заявке термин «фурин-устойчивый мутеин IGF-II» относится к пептиду на основе IGF-II, содержащему измененную аминокислотную последовательность, которая устраняет по меньшей мере один нативный сайт расщепления протеазой фурином или изменяет последовательность вблизи или по соседству с нативным сайтом расщепления протеазой фурином так, что расщепление фурином предотвращено, подавлено, уменьшено или замедлено по сравнению с пептидом IGF-II человека дикого типа. В настоящей заявке под фурин-устойчивым мутеином IGF-II также понимают мутеин IGF-II, который устойчив к фурину.

[0064] Сайт расщепления протеазой фурином: В настоящей заявке термин «сайт расщепления протеазой фурином» (также называемый «сайтом расщепления фурином» или «последовательностью расщепления фурином») относится к аминокислотной последовательности пептида или белка, которая служит последовательностью для распознавания при ферментативном расщеплении протеазой в случае протеазы фурина или фуриноподобных протеаз. Как правило, сайт расщепления протеазой фурином обладает консенсусной последовательностью Arg-X-X-Arg (SEQ ID NO:6), где X является любой аминокислотой. Сайт расщепления располагается после остатка аргинина (Arg) на C-конце последовательности. Согласно некоторым вариантам реализации сайт расщепления фурином может обладать консенсусной последовательностью Lys/Arg-X-X-X-Lys/Arg-Arg (SEQ ID NO:7), где X является любой аминокислотой. Сайт расщепления располагается после остатка аргинина (Arg) на C-конце последовательности.

[0065] Фурин: В настоящей заявке термин «фурин» относится к любой протеазе, которая может распознавать и расщеплять сайт расщепления протеазой фурином, согласно определению выше, включая фурин или фуриноподобную протеазу. Фурин также называют ферментом, расщепляющим парные основные аминокислоты (PACE). Фурин относится к семейству субтилизин-подобных пропротеинконвертаз. Ген, кодирующий фурин, называется FUR (FES-вышележащая область).

[0066] Клетки с дефицитом фурина: В настоящей заявке термин «клетки с дефицитом фурина» относится к клеткам, в которых протеазная активность фурина ингибирована, снижена или устранена. Клетки с дефицитом фурина включают клетки как млекопитающих, так и не млекопитающих, которые не вырабатывают фурин или вырабатывают фурин в уменьшенном количестве, или же вырабатывают дефектный фурин.

[0067] Направленная доставка в лизосомы, независимая от гликозилирования: В настоящей заявке термин «направленная доставка в лизосомы, независимая от гликозилирования» (также называемая «GILT») относится к направленной доставке в лизосомы, которая не зависит от манноза-6-фосфата.

[0068] Альфа-N-ацетилгликозаминидаза человека: В настоящей заявке термин «альфа-N-ацетилглюкозаминидаза человека» (также называемая «Naglu») относится к предшественнику (т.е., содержащему нативную сигнальную последовательность пептида Naglu) или к зрелой (т.е., не содержащему нативной сигнальной последовательности пептида Naglu) форме дикого типа альфа-N-ацетилгликозаминидазы человека дикого типа, или ее функциональному фрагменту или варианту, которые способны снижать уровень гликозаминогликанов (GAG) в лизосомах млекопитающих, или которые могут устранять или облегчать один или более из симптомов MPS III (синдром Санфилиппо B). В настоящей заявке термин «функциональный» применительно к Naglu относится к ферменту Naglu, который способен захватываться лизосомами млекопитающих и обладает достаточной ферментативной активностью для уменьшения количества накопленного материала, т.е. гликозаминогликанов (GAG) в лизосомах млекопитающих.

[0069] Мутеин IGF-II: В настоящей заявке термин «мутеин IGF-II» относится к пептиду на основе IGF-II, содержащему измененную аминокислотную последовательность. В настоящей заявке термин «фурин-устойчивый мутеин IGF-II» относится к пептиду на основе IGF-II, содержащему измененную аминокислотную последовательность, которая устраняет по меньшей мере один нативный сайт расщепления протеазой фурином или изменяет последовательность вблизи или по соседству с нативным сайтом расщепления протеазой фурином так, что расщепление фурином предотвращено, подавлено, уменьшено или замедлено по сравнению с пептидом IGF-II человека дикого типа. В настоящей заявке под фурин-устойчивым мутеином IGF-II также понимают мутеин IGF-II, который устойчив к фурину.

[0070] Улучшать, повышать или снижать: В настоящей заявке термины «улучшать», «повышать» или «снижать» или их грамматические эквиваленты указывают на величины, которые соотнесены с исходным измерением, таким как измерение у того же индивидуума перед началом лечения, описываемого в настоящей заявке, или измерение у контрольного индивидуума (или нескольких контрольных индивидуумов) в отсутствии лечения, описываемого в настоящей заявке. «Контрольным индивидуумом» является индивидуум, страдающий той же формой лизосомальной болезни накопления (например, MPS IIB (Синдром Санфилиппо В)), что и индивидуум, которого лечат, и приблизительно того же возраста, что и индивидуум, которого лечат (чтобы гарантировать, что стадии заболевания у проходящего лечения индивидуума и контрольного индивидуума(ов) сопоставимы).

[0071] Индивдуум, субъект, пациент: В настоящей заявке термины «субъект», «индивидуум» или «пациент» относятся к человеку или млекопитающему, отличному от человека». Индивидуум (также называемый «пациентом» или «субъектом»), которого лечат, - это индивидуум (плод, младенец, ребенок, подросток или взрослый человек), страдающий лизосомальной болезнью накопления, например, MPS IIB (Синдром Санфилиппо В) (т.е., младенческим, ювенильным или взрослым, тяжелым/классическим типом или облегченным типом MPS IIB (Синдром Санфилиппо В)) или у которого возможно развитие лизосомальной болезни накопления (например, MPS IIB (Синдром Санфилиппо В)).

[0072] Лизосомальные болезни накопления: В настоящей заявке термин «лизосомальные болезни накопления» относится к группе генетических расстройств, которые развиваются вследствие недостаточности по меньшей мере одного из ферментов (например, кислых гидролаз), которые необходимы для расщепления макромолекул на пептиды, аминокислоты, моносахариды, нуклеиновые кислоты и жирные кислоты в лизосомах. Как следствие, у индивидуумов, страдающих лизосомальными болезнями накопления, накапливается материал в лизосомах. Примеры лизосомальных болезней накопления перечислены в таблице 1.

[0073] Лизосомальные ферменты: В настоящей заявке термин «лизосомальный фермент» относится к любому ферменту, который способен уменьшать количество накопленного материала в лизосомах млекопитающих, или который может избавлять от одного или более симптомов лизосомальных болезней накопления или облегчать их. Лизосомальные ферменты, подходящие для реализации настоящего изобретения, включают лизосомальные ферменты как дикого типа, так и модифицированные, и их можно получить с применением рекомбинантных способов, синтеза или очистить из природных источников. Примеры лизосомальных ферментов перечислены в таблице 1.

[0074] Спейсер: В настоящей заявке термин «спейсер» (также называемый «линкер») относится к последовательности пептида между двумя функциональными группами белка в химерном белке. Как правило, спейсер конструируют так, чтобы он был гибким или чтобы он был встроен между двумя белковыми фрагментами в структуре, такой как альфа-спираль. Спейсер может быть относительно коротким, как например, последовательности Gly-Ala-Pro (GAP) (SEQ ID NO:9), Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (GGGGS) (SEQ ID NO:12), Gly-Gly-Gly-Gly-Ala (GGGGA) (SEQ ID NO:60) или Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Pro (GGGGGP) (SEQ ID NO:13), или может быть длиннее, например, 10-25 аминокислот в длину, 25-50 аминокислот в длину или 35-55 аминокислот в длину. Примеры последовательностей спейсеров раскрыты более подробно в подробном описании изобретения.

[0075] Терапевтически эффективное количество: В настоящей заявке термин «терапевтически эффективное количество» или «эффективное количество» относится к количеству направленного терапевтического химерного белка, которое оказывает терапевтическое действие на подвергнутого лечению субъекта, с разумным соотношением польза/риск, применимым к любому медикаментозному лечению. Терапевтическое действие может быть объективным (т.е., измеримым по некоторому анализу или маркеру) или субъективным (т.е. субъект указывает на ощущение действия). В частности, «терапевтически эффективное количество» относится к количеству терапевтического химерного белка или композиции, эффективным при лечении, облегчении или предупреждении заданного заболевания или патологического состояния, или при проявлении определимого терапевтического или профилактического действия, такого как облегчение симптомов, ассоциированных с заболеванием, предупреждение или отсрочка начала заболевания, и/или также уменьшение тяжести или частоты симптомов заболевания. Терапевтически эффективное количество обычно вводят при режиме дозирования, который может включать несколько единиц дозирования. Для любого конкретного терапевтического химерного белка терапевтически эффективное количество (и/или соответствующая единица дозирования в рамках эффективного режима дозирования) может варьировать, например, в зависимости от пути введения, от сочетания с другими фармацевтическими агентами. Также специфическое терапевтически эффективное количество (и/или единица дозирования) для любого конкретного пациента может зависеть от целого ряда факторов, включая расстройство, которое требуется лечить, и тяжесть указанного расстройства; активность специфического применяемого фармацевтического агента; специфическая применяемая композиция; возраст, масса тела, общее состояние здоровья, пол и диета пациента; время введения, путь введения и/или скорость выведения или метаболизма специфического применяемого химерного белка; продолжительность лечения и подобные факторы, которые хорошо известны специалистам в области медицины.

[0076] Лечение: В настоящей заявке термин «лечение» (а также «лечить») относится к любому введению терапевтического химерного белка или фармацевтической композиции, содержащей указанный терапевтический химерный белок, которые частично или полностью ослабляют, облегчают, подавляют, замедляют начало, уменьшают тяжесть и/или уменьшают частоту возникновения одного или более симптомов или признаков конкретного заболевания, расстройства и/или патологического состояния. Такое лечение может проводиться в отношении субъекта, у которого нет проявления признаков соответствующего заболевания, расстройства и/или патологического состояния, и/или субъекта, у которого проявились лишь ранние признаки заболевания, расстройства и/или патологического состояния. В качестве альтернативы или дополнительно, такое лечение может проводиться в отношении субъекта, у которого проявились один или более установленных признаков соответствующего заболевания, расстройства и/или патологического состояния. Например, лечение может относиться к улучшению состояния сердца (например, повышение конечно-диастолического и/или конечно-систолического объема, или уменьшение, облегчение или предупреждение прогрессирования кардиомиопатии, которое, например, типично для болезни Помпе) или функции легких (например, увеличение жизненной емкости легких при крике по сравнению с емкостью в исходном состоянии, и/или нормализация снижения насыщения кислородом при крике); улучшение неврологического развития и/или двигательных навыков (например, повышение балла AIMS); уменьшение накопления (например, уровня гликозаминогликанов (GAG) в ткани индивидуума, пораженного заболеванием; или любое сочетание указанных эффектов). Согласно некоторым вариантам реализации лечение включает улучшение клиренса гликозаминогликанов (GAG), в частности, снижение или предупреждение нейрональных симптомов, ассоциированных с MPS IIIB (Синдромом Санфилиппо В).

[0077] В настоящей заявке термины «примерно» или «приблизительно» применяются как эквиваленты. Предполагается, что любые численные значения, применяемые в настоящей заявке, с терминами примерно/приблизительно или без них охватывают любые нормальные колебания, признаваемые специалистами в соответствующей области техники.

Подробное описание изобретения

[0078] Настоящее изобретение относится к усовершенствованным способам и композициям для направленной доставки лизосомальных ферментов на основе технологии направленной доставки в лизосомы, независимой от гликозилирования (GILT). Среди прочего согласно настоящему изобретению предложены мутеины IGF-II, которые устойчивы к фурину и/или обладают сниженным или уменьшенным сродством связывания с рецептором инсулина, и/или обладают сниженным или уменьшенным сродством связывания в отношении рецептора IGF-I, и направленные терапевтические химерные белки, содержащие мутеин IGF-II согласно настоящему изобретению. Также согласно настоящему изобретению предложены способы их получения и применения.

[0079] Разные аспекты настоящего изобретения описаны подробно в следующих разделах. Применение разделов не предназначено для ограничения изобретения. Каждый раздел может быть применим к любому аспекту изобретения. В настоящей заявке применение союзов «или» означает «и/или», если не указано другое.

Лизосомальные ферменты

[0080] Лизосомальный фермент, подходящий для реализации настоящего изобретения, включает любой фермент, который способен уменьшить накопление материала в лизосомах млекопитающих, или который может избавить от одного или нескольких симптомов лизосомальных болезней накопления или облегчить их. Подходящие лизосомальные ферменты включают лизосомальные ферменты дикого типа или модифицированные лизосомальные ферменты, и их можно получить рекомбинантным путем или при помощи синтеза, или очистить из природных источников. Примеры лизосомальных ферментов перечислены в таблице 1.

Таблица 1 Лизосомальные болезни накопления и ассоциированные дефекты ферментов A. Расстройства накопления гликогена Название заболевания Дефект фермента Накапливающееся вещество

Болезнь Помпе Кислая-αl, 4-глюкозидаза Олигосахариды гликогена, связанные αl-4-связью B. Гликолипидозы Название заболевания Дефект фермента Накапливающееся вещество GM1 ганглиозидоз β-галактозидаза GM₁ ганглиозиды Болезнь Тея-Сакса β-гексозаминидаза А GM₂ ганглиозид GM2 ганглиозидоз: вариант AB Активирующий белок GM₂ GM₂ ганглиозид Болезнь Сандхоффа β-гексозаминидаза A и B GM₂ ганглиозид Болезнь Фабри α-галактозидаза A Глобозиды Болезнь Гоше Глюкоцереброзидаза Глюкозилцерамид Метахромная лейкодистрофия Арилсульфатаза A Сульфатиды Болезнь Краббе Галактозилцерамидаза Галактоцеребразид Ниманна-Пика, типы A и B Кислая сфингомиелиназа Сфингомиелин Ниманна-Пика, тип C Дефект этерификации холестерина Сфингомиелин Ниманна-Пика, тип D Неизвестно Сфингомиелин Болезнь Фарбера Кислая церамидаза Церамид Болезнь Вольмана Кислая липаза Эфиры холестерина C. Расстройства накопления мукополисахаридов Название заболевания Дефект фермента Накапливающееся вещество Болезнь Гурлера (MPS IH) α-L-идуронидаза Гепаран и дерматансульфаты

Синдром Шейе (MPS IS) α-L-идуронидаза Гепаран и дерматансульфаты Гурлера-Шейе (MPS IH/S) α-L-идуронидаза Гепаран и дерматансульфаты Синдром Хантера (MPS II) Идуронатсульфатаза Гепаран и дерматансульфаты Санфилиппо A (MPS IIIA) Гепаран-N-сульфатаза Гепарансульфат Санфилиппо B (MPS IIIB) α-N-ацетилглюкозаминидаза Гепарансульфат Санфилиппо C (MPS IIIC) Ацетил-КоА-глюкозаминид-ацетилтрансфераза Гепарансульфат Санфилиппо D (MPS IIID) N-ацетилглюкозамин-6-сульфатаза Гепарансульфат Моркио A (MPS IVA) Галактозамин-6-сульфатаза Кератансульфат Моркио B (MPS IVB) β-галактозидаза Кератансульфат Болезнь Маротто-Лами (MPS VI) Арилсульфатаза B Дерматансульфат Синдром Слая (Мукополисахаридоз VII типа (MPS VII)) β-глюкуронидаза D. Расстройства накопления олигосахаридов/гликопротеинов Название заболевания Дефект фермента Накапливающееся вещество α-маннозидоз α-маннозидаза Манноза/ олигосахариды β-маннозидоз β-маннозидаза Манноза/ олигосахариды Фукозидоз α-L-фукозидаза Фукозил-олигосахариды

Аспартилглюкозаминурия N-аспартил-β-глюкозаминидаза Аспартилглюкозамин
Аспарагины Сиалидоз (Муколипидоз I) α-нейраминидаза Сиалолигосахариды Галактосиалидоз
(Синдром Гольдберга) Недостаточность лизосомального защитного белка Сиалолигосахариды Болезнь Шиндлера α-N-ацетил-галактозаминидаза E. Расстройства ферментов лизосомального транспорта Название заболевания Дефект фермента Накапливающееся вещество Муколипидоз II (Болезнь I-клеток) N-ацетилглюкозамин-1-фосфотрансфераза Гепарансульфат Муколипидоз III (псевдополидистрофия Гурлер) Тот же, что и при ML II F. Расстройства транспорта через мембрану лизосомы Название заболевания Дефект фермента Накапливающееся вещество Цистиноз Белок-переносчик цистеина Свободный цистеин Болезнь Салла Белок-переносчик сиаловой кислоты Свободная сиаловая кислота и глюкуроновая кислота Болезнь накопления сиаловой кислоты Белок-переносчик сиаловой кислоты Свободная сиаловая кислота и глюкуроновая кислота G. Прочие

Название заболевания Дефект фермента Накапливающееся вещество Болезнь Баттена
(Ювенильный нейрональный цероидный липофусциноз) Неизвестно Липофусцины Младенческий нейрональный цероидный липофусциноз Тиоэстераза пальмитоил-белков Липофусцины Поздний младенческий нейрональный цероидный липофусциноз Трипептидил-пептидаза I Липофусцины Муколипидоз IV Неизвестно Ганглиозиды и гиалуроновая кислота Просапосин Сапозины A, B, C или D

[0081] Согласно некоторым вариантам реализации лизосомальный белок, рассматриваемый в настоящей заявке, включает полипептидную последовательность, на 50-100%, включая 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% и 100%, идентичную последовательности существующей в природе полинуклеотидной последовательности фермента человека, показанного в таблице 1, при этом кодирующую белок, который функционален, т.е. способен уменьшать накопление вещества, например, гликозаминогликана (GAG), в лизосомах млекопитающих, или которые могут избавлять от одного или более симптомов лизосомальной болезни накопления или облегчать их.

[0082] «Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности» применительно к последовательностям лизосомальных ферментов определяют как процент аминокислотных остатков в кандидатной последовательности, которые идентичны аминокислотным остаткам в последовательности существующего в природе фермента человека, после выравнивания последовательностей и введения пробелов (гэпов), при необходимости, для достижения максимального процента идентичности последовательностей, и не учитывая никакие консервативные замены при расчете степени идентичсности последовательности. Выравнивание в целях определения процента идентичности аминокислотных последовательностей можно построить разными путями, которые известны специалистам в данной области техники, например, с применением общедоступных компьютерных программ, таких как BLAST, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области техники могут определить соответствующие параметры построения выравнивания, включая любые алгоритмы, которые нужны для достижения максимального выравнивания по всей длине последовательностей, которые сравнивают. Предпочтительно для определения идентичности аминокислотных последовательностей применяют программу WU-BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266, 460-480 (1996). WU-BLAST-2 основана на нескольких параметрах поиска, большинство из которых являются величинами по умолчанию. Настраиваемым параметрам придают следующие значения: длина перекрывания =1, доля перекрывания =0,125, порог окружения (world threshold, T)=11. Балл HSP (S) и HSP S2 являются динамическими величинами и устанавливаются самой программой, в зависимости от состава конкретной последовательности, однако минимальные величины могут быть настроены и установлены, как указано выше.

Альфа-N-ацетилглюкозаминидаза

[0083] Альфа-N-ацетилглюкозаминидаза - Naglu - вырабатывается как молекула-предшественник, зрелая форма которой образуется в результате ее процессинга. Данный процесс, как правило, происходит путем удаления сигнального пептида, состоящего из 23 аминокислот по мере того, как белок поступает в эндоплазматический ретикулум. Обычно, форму - предшественника называют также непроцессированным предшественником или непроцессированным белком Naglu, который содержит 743 аминокислоты (SEQ ID NO:1). N-концевые 23 аминокислоты отщепляются, когда белок-предшественник поступает в эндоплазматический ретикулум, что приводит к образованию процессированной или зрелой формы. Таким образом, подразумевается, что N-концевые 23 аминокислоты обычно не требуются для активности белка Naglu. Аминокислотные последовательности зрелой формы и непроцессированного предшественника типичного белка Naglu человека, дикого типа или существующего в природе, показаны на фигуре 1 и описаны в последовательности SEQ ID NO:1. Нуклеотидная последовательность кодирующей области Naglu человека приведена в SEQ ID NO:3. Последовательность мРНК Naglu человека приведена под номером доступа NM_000263 в Genbank. Согласно различным вариантам реализации Naglu является Naglu человека, с сигнальной последовательностью (аминокислоты 1-743) или без нее (аминокислоты 24-43).

[0084] В патенте США № 6255096 описано, что молекулярная масса очищенной альфа-N-ацетилглюкозаминидазы человека (т.е. 82 кДа и 77 кДа) и рекомбинантной альфа-N-ацетилглюкозаминидазы млекопитающих, вырабатываемой к клетках яичника китайского хомячка (CHO) (т.е. 89 кДа и 79 кДа) больше, чем рассчетная молекулярная масса полипептида Naglu (т.е. 70 кДа), что указывает на то, что очищенный и рекомбинантный полипептиды подвергаются посттрансляционной модификации. Смотрите также Weber et al., Hum Mol Genet 5:771-777, 1996.

Мукополисахаридоз III B (Синдром Санфилиппо В)

[0085] Одним примером лизосомальной болезни накопления является мукополисахаридоз III B (MPS IIIB), также известный под названием синдром Санфилиппо В. MPS IIIB, синдром Санфилиппо III - редкое аутосомно-рецессивное генетическое нарушение, которое характеризуется недостаточностью фермента альфа-N-ацетилглюкозаминидазы (Naglu). В отсутствии указанного фермента гликозаминогликаны GAG), например GAG гепарансульфат, и частично распавшиеся молекулы GAG не могут выводиться из организма и накапливаются в лизосомах разных тканей, что ведет к прогрессирующей распространенной соматической дисфункции (Kakkis et al., N Engl J Med. 344(3):182-8, 2001). Было показано, что GAG накапливаются в лизосомах нейронов и глиальных клеток, и в меньшей степени накапливаются за пределами головного мозга.

[0086] Было идентифицировано четыре разных формы MPS III, обозначаемые MPS III A, B, C и D. Каждая форма заболевания представляет собой недостаточность одного из четырех ферментов, участвующих в расщеплении GAG гепарансульфата (таблица 1). Все формы включают разные степени проявления одних и тех же клинических симптомов, включая крупные черты лица, гепатоспленомегалию, помутнение роговицы и деформацию скелета. Однако наиболее заметной является тяжелая и прогрессирующая утрата когнитивных способностей, которая связана не только с накоплением гепарансульфата в нейронах, но и с последующим повышением уровня ганглиозидов GM2, GM3 и GD2, вызванным первичным накоплением GAG (Walkley et al., Ann N Y Acad Sci. 845:188-99, 1998).

[0087] Характерным клиническим признаком синдрома Санфилиппо B является дегенерация центральной нервной системы (ЦНС), указанная дегенерация приводит к утрате основных этапов развития или неспособности их достичь. Прогрессирующее снижение когнитивных способностей достигает кульминации в форме деменции и ранней смертности. Данное заболевание, как правило, проявляется само в раннем детском возрасте, и продолжительность жизни больного обычно не превышает раннего подросткового возраста или первой половины третьего десятка лет жизни.

[0088] Все заболевания MPS III имеют сходные симптомы, которые обычно проявляются в раннем детстве. Больные младенцы выглядят нормальными, хотя может быть заметен легкий лицевой дисморфизм. Скованность в суставах, волосатость и жесткая фактура волос, характерные для других типов мукополисахаридоза, обычно не проявляются на ранних стадиях данного заболевания. После начального бессимптомного периода у пациентов обычно возникает задержка развития и/или проблемы с поведением, после чего происходит прогрессирующее снижение умственных способностей, приводящее к тяжелой деменции и прогрессирующему двигательному растройству. Становление речи часто замедленное и неполное. Заболевание прогрессирует до более выраженных нарушений поведения, включая приступы ярости, гиперактивность, разрушительные действия, агрессивное поведение, извращенный аппетит и нарушения сна. Поскольку больной ребенок обладает нормальной мышечной силой и подвижностью, нарушения поведения очень трудно контролировать. В конечной фазе заболевания у детей нарастает неподвижность и нечувствительность, часто требуется инвалидное кресло, а также развивается затрудненное глотание и судороги. Продолжительность жизни больного ребенка, как правило, не превышает второго или третьего десятка лет жизни.

[0089] Фермент альфа-N-ацетилглюкозаминидаза, пригодный для лечения MPS IIIB (Синдром Санфилиппо B), включает альфа-N-ацетилглюкозаминидазу (SEQ ID NO:1 или 3) человека дикого типа, или функциональный фрагмент или вариант его последовательности, который сохраняет способность быть захваченными лизосомами млекопитающих и гидролизовать альфа-1,4-связи на концевом остатке N-ацетил-D-глюкозамина в линейных олигосахаридах.

[0090] Эффективность лечения MPS IIIB (Синдром Санфилиппо B) с применением рекомбинантных направленных терапевтических химерных белков, описываемых в настоящей заявке, можно оценить при помощи способов, известных в технике, а также посредством анализа лизосомальных и нейрональных биомаркеров. Начальные эксперименты проводят на животных с нокаутом гена Naglu (смотрите Li et al., Proc Natl Acad Sci USA 96:14505-510, 1999). У животных, нокаутных по Naglu, накапливаются большие количества гепарансульфата в печени и почках, а в головном мозге повышается уровень ганглиозидов.

[0091] Анализ включает анализ активности и биоразложения экзогенного фермента, снижения накопления GAG в лизосомах, особенно в клетках головного мозга, и активации астроцитов и микроглии. Уровень разных лизосомальных и нейрональных биомаркеров включает без ограничений ассоциированный с лизосомами мембранный белок 1 (LAMP1), глипикан, ганглиозиды, холестерин, субъединицу С митохондриальной АТФ-синтазы (SCMAS), убиквинтин, Р-GSK3b, бета-амилоид и P-тау. Также проводят анализ выживаемости и поведения при помощи способов, известных в данной области техники.

[0092] Эксперименты показали, что в лизосмах животных с MPS IIIB накапливается субъединица С митохондриальной АТФ-синтазы (SCMAS) (Ryazantsev et al., Mol Genet Metab. 90(4): 393-401, 2007). Также было показано, что у животных с MPS IIIB также повышается уровень LAMP-1 и GM130 (Vitry et al., Am J Pathol. 177(6):2984-99, 2010).

[0093] Согласно различным вариантам реализации под лечением лизосомальной болезни накопления понимают снижение накопления в лизосомах (например, GAG) в разных тканях. Согласно различным вариантам реализации под лечением понимают снижение накопления в лизосомах в ткани головного мозга, в нейронах спинного мозга и/или периферических тканях-мишенях. Согласно определенным вариантам реализации накопление в лизосомах снижается приблизительно на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% или более по сравнению с контролем. Согласно различным вариантам реализации накопление в лизосомах снижается по меньшей мере в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более раз по сравнению с контролем.

[0094] Согласно различным вариантам реализации под лечением понимают повышение активности ферментов в разных тканях. Согласно различным вариантам реализации активность ферментов увеличивается в тканях-мишенях головного мозга, нейронах спинного мозга и/или периферических тканях-мишенях. Согласно различным вариантам реализации активность ферментов увеличивается приблизительно на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900% 1000% или более по сравнению с контролем. Согласно различным вариантам реализации активность ферментов увеличивается по меньшей мере в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более раз по сравнению с контролем. Согласно различным вариантам реализации увеличенная активность ферментов составляет по меньшей мере приблизительно 10 нмоль/ч/мг, 20 нмоль/ч/мг, 40 нмоль/ч/мг, 50 нмоль/ч/мг, 60 нмоль/ч/мг, 70 нмоль/ч/мг, 80 нмоль/ч/мг, 90 нмоль/ч/мг, 100 нмоль/ч/мг, 150 нмоль/ч/мг, 200 нмоль/ч/мг, 250 нмоль/ч/мг, 300 нмоль/ч/мг, 350 нмоль/ч/мг, 400 нмоль/ч/мг, 450 нмоль/ч/мг, 500 нмоль/ч/мг, 550 нмоль/ч/мг, 600 нмоль/ч/мг или более. Согласно различным вариантам реализации указанным лизосмальным ферментом является Naglu.

Ферментозаместительная терапия

[0095] Ферментозаместительная терапия (ERT) представляет собой стратегию терапии, направленную на коррекцию недостаточности ферментов путем инфузии утраченного фермента в кровяное русло. Поскольку кровь протекает через ткани пациента, фермент захватывается клетками и транспортируется в лизосомы, где ферменты осуществляют свою функцию, удаляя материал, который был накоплен в лизосомах вследствие недостаточности указанного фермента. Чтобы заместительная терапия ферментами лизосом была эффективной, терапевтический фермент должен быть доставлен в лизосомы в соответствующих клетках в тех тканях, где проявляется дефект. Традиционные лекарственные средства для заместительной терапии ферментами лизосом доставляются при помощи углеводов, от природы присоединенных к белку для того чтобы задействовать специфические рецепторы на поверхности клетки-мишени. Один рецептор - катион-независимый рецептор M6P (CI-MPR) - особенно важен для направленного восполнения лизосомальных ферментов, поскольку CI-MPR присутствует на поверхности клеток большинства типов.

[0096] В настоящей заявке термины «катион-независимый рецептор манноза-6-фосфат (CI-MRP)», «рецептор M6P/IGF-II», «рецептор IGF-II» или «рецептор IGF2» или их сокращения применяются взаимозаменяемо и относятся к рецепторам клеток, которые связываются и с M6P, и с IGF-II.

Комбинированная терапия, направленная на снижение иммуногенности субъектов к ферментозаместительной терапии

[0097] Было показано, что во время введения таких агентов, как рекомбинантные белки и другие терапевтические средства у субъекта может возникать иммунный ответ на указанные агенты, что ведет к образованию антител, которые связываются с ними и препятствуют терапевтической активности, а также вызывают острые или хронические иммунологические реакции. Данная проблема наиболее значительна для лекарственных белков, поскольку белки являются сложными антигенами и во многих случаях иммунная система субъекта впервые конатктирует с такими антигенами. Таким образом, согласно определенным аспектам настоящего изобретения может быть полезным обеспечить толерантность субъекта, получающего терапевтический фермент, к ферментозаместительной терапии. В данном контексте ферментозаместительную терапию можно проводить у субъекта в составе комбинированной терапии со схемой лечения, снижающей иммуногенность.

[0098] В патенте США 7485314 (включен в настоящую заявку посредством ссылки) раскрывается лечение лизосомальных болезней накопления с применением индукции иммунологической толерантности. Если кратко, применение такой схемы лечения, направленной на развитие толерантности, может быть полезно для предупреждения иммунного ответа в организме субъекта на ферментозаместительную терапию и, как следствие, предотвращения снижения или другого нарушения потенциально полезных эффектов ферментозаместительной терапии.

[0099] Согласно одному способу настоящее изобретение предусматривает предупреждение клинически значимого антиген-специфичного иммунного ответа на рекомбинантный терапевтический химерный белок, например, включающий Naglu, применяемый для лечения лизосомальной болезни накопления, например, мукополисахаридоза IIIB (MPS IIIB или синдрома Санфилиппо B), при котором химерный белок вводят интратекально. Способ подразумевает введение в течение первых 30-60 дней иммуносупрессорного агента, действующего на Т-лимфоциты, такого как циклоспорин А (CsA) и антипролиферативного агента, такого как азатиоприн (Aza), в сочетании с еженедельными интратекальными инфузиями низких доз фермента, например, Naglu. Типично сильный опосредованный IgG ответ на еженедельные инфузии фермента значительно уменьшен или предотвращен при применении 60-дневной схемы иммуносупрессорного лечения циклоспорином А (CsA) и азатиоприном (Aza) в сочетании с еженедельными интратекальными или внутривенными инфузиями низких доз химерного белка, содержащего фермент. При применении такой схемы снижения иммуногенности возможно обеспечить переносимость у субъекта более высоких терапевтических доз терапевтического химерного белка до 6 месяцев без повышения титра антител на Naglu, или фактически на любой другой фермент, который можно применять для ферментозаместительной терапии лизосомальной болезни накопления. Такие схемы снижения иммуногенности были описаны в Патенте США № 7485314.

Направленная доставка в лизосомы, независимая от гликозилирования

[0100] Технология независимой от гликозилирования направленной доставки в лизосомы (GILT) была разработана для того, чтобы направлять терапевтические ферменты в лизосомы. Более конкретно, технология GILT основана на применении пептидной метки вместо M6P для вовлечения GI-MPR в процесс направленной доставки в лизосомы. Как правило, метка для GILT представляет собой белок, пептид или другой фрагмент, который связывается с CI-MPR независимым от манноза-6-фосфата путем. Преимуществом является то, что данная технология имитирует нормальный биологический механизм захвата лизосомальных ферментов, при этом совершая это независимым от манноза-6-фосфата путем.

[0101] Предпочтительно метку GILT получают из инсулиноподобного фактора роста II (IGF-II) человека. IGF-II является высокоаффинным лигандом для CI-MPR, который также называется рецептором IGF-II. Связывание GILT-меченных терапевтических ферментов с рецептором M6P/ IGF-II направляет белок в лизосому по пути эндоцитоза. Данный способ имеет целый ряд преимуществ по сравнению со способами, основанными на гликозилировании, включая простоту и экономичность, поскольку после выделения белка никаких дополнительных модификаций не требуется.

[0102] Подробное описание технологии GILT и метки GILT можно найти в публикациях патентов США № 20030082176, 20040006008, 20040005309 и 20050281805, принципы которых включены в настоящую заявку посредством ссылок в полном объеме.

Фурин-устойчивая метка GILT

[0103] В ходе разработки GILT-меченных ферментов для лечения лизосомальных болезней накопления стало очевидно, что метка GILT полученная из IGF-II может подвергаться протеолитическому расщеплению фурином во время ее производства в клетках млекопитающих (смотрите раздел «Примеры»). Протеаза фурин обычно распознает и расщепляет сайт расщепления с консенсусной последовательностью Arg-X-X-Arg (SEQ ID NO:6), где X является любой аминокислотой. Сайт расщепления расположен после С-концевого остатка аргинина (Arg) в последовательности. Согласно некоторым вариантам реализации сайт расщепления фурином обладает консенсусной последовательностью Lys/Arg-X-X-X-Lys/Arg-Arg (SEQ ID NO:7), где X является любой аминокислотой. Сайт расщепления расположен после С-концевого остатка аргинина (Arg) в последовательности. В настоящей заявке термин «фурин» относится к любой протеазе, которая может распознавать и расщеплять сайт расщепления протеазой фурином, согласно определению выше, включая фурин или фуриноподобную протеазу. Фурин также называют ферментом, расщепляющим парные основные аминокислоты (PACE). Фурин относится к семейству субтилизин-подобных пропротеинконвертаз. Ген, кодирующий фурин, называется FUR (FES-вышележащая область).

[0104] Последовательность зрелого пептида IGF-II человека приведена ниже.

[0105] AYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRPASRVSR↑RSR↑GIVEECCFRSCDLALLETYC ATPAKSE (SEQ ID NO:5)

[0106] Как показано выше, зрелый IGF-II человека содержит два потенциально перекрывающихся сайта расщепления фурином между остатками 34-40 (выделены жирным шрифтом и подчеркнуты). Стрелки вставлены в двух потенциальных положениях расщепления фурином.

[0107] Модифицированные метки GILT, которые устойчивы к расщеплению фурином, и все еще сохраняют способность связыватья с CI-MPR независимо от маннозо-6-фосфата, описаны в Патенте США 20110223147. В частности, устойчивые к фурину метки GILT можно сконструировать путем введения мутации в аминокислотную последовательность в одном или более сайтах расщепления фурином так, что мутация приводит к исчезновению по меньшей мере одного сайта расщепления фурином. Таким образом, согласно некоторым вариантам реализации фурин-устойчивой меткой GILT является фурин-устойчивый мутеин IGF-II, содержащий мутацию, которая приводит к исчезновению по меньшей мере одного сайт расщепления фурином, или изменения последовательности вблизи сайта расщепления протеазой фурином, такие что расщепление фурином предотвращено, подавлено, уменьшено или замедлено по сравнению с пептидом IGF-II дикого типа (например, зрелый IGF-II человека дикого типа). Обычно подходящая мутация не влияет на способность фурин-устойчивой метки GILT связываться с катион-независимым рецептором манноза-6-фосфата человека. В частности, фурин-устойчивый мутеин IGF-II, подходящий для реализации настоящего изобретения, связывается с катион-независимым рецептором манноза-6-фосфата человека независимым от манноза-6-фосфата образом с константой диссоциации 10^-7М или менее (например, 10^-8, 10^-9, 10^-10, 10^-11 или менее) при рН 7,4. Согласно некоторым вариантам реализации фурин-устойчивый мутеин IGF-II содержит мутацию в области, соответствующей аминокислотам 30-40 (например, 30-40, 31-40, 32-40, 33-40, 34-40, 30-39, 31-39, 32-39, 34-37, 33- 39, 34-39, 35-39, 36-39, 37-40) зрелого IGF-II человека. Согласно некоторым вариантам реализации подходящая мутация упраздняет по меньшей мере один сайт расщепления протеазой фурином. Мутацией могут быть аминокислотные замены, делеции, инсерции. Например, любая из аминокислот в области, соответствующей остаткам 30-40 (например, 30-40, 31-40, 32-40, 33-40, 34-40, 30-39, 31-39, 32-39, 34-37, 33-39, 34-39, 35-39, 36-39, 37-40) последовательности SEQ ID NO:5 может быть заменена любой другой аминокислотой или делетирована. Например, замены в положении 34 могут влиять на распознавание фурином первого сайта расщепления. Инсерция одной или более дополнительных аминокислот в каждый сайт распознавания может приводить к исчезновению одного или обоих сайтов расщепления. Делеция одного или более остатков в вырожденных положениях также может упразднять сайт расщепления фурином.

[0108] Согласно различным вариантам реализации фурин-устойчивый мутеин IGF-II содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих Arg37 или Arg40 зрелого IGF-II человека. Согласно некоторым вариантам реализации фурин-устойчивый мутеин IGF-II содержит замену Lys или Ala в положениях Arg37 или Arg40. Возможны другие замены, включая сочетания мутаций Lys и/или Ala в обоих положениях - 37 и 40, или замены аминокислот, отличных от Lys или Ala.

[0109] Согласно различным вариантам реализации мутеин IGF-II, подходящий для применения в настоящем изобретении, содержит дополнительные мутации. Например, может быть изменено до 30% остатков в последовательности SEQ ID NO:1 (например, до 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30% или более остатков может быть изменено). Таким образом, мутеин IGF-II, подходящий для применения в настоящем изобретении, может обладать последовательностью, которая идентична последовательности зрелого IGF-II человека по меньшей мере на 70%, включая по меньшей мере на 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более.

[0110] Согласно различным вариантам реализации мутеин IGF-II, подходящий для применения в настоящем изобретении, специфически направлен на CI-MRP. Особенно полезны мутации в полипептиде IGF-II, которые приводят к образованию белка, который связывается с CI-MPR с высоким сродством (например, с константой диссоциации 10^-7 М или менее при рН 7,4), тогда как известно, что он связывается с другими рецепторами со сниженным сродством по сравнению с нативным IGF-II. Например, мутеин IGF-II, подходящий для применения в настоящем изобретении, может быть модифицирован так, чтобы обладать сниженным сродством связывания с рецептором IGF-I по сравнению со сродством существующего в природе IGF-II человека в отношении рецептора IGF-I. Например, замена остатков Tyr 27 на Leu, Leu 43 на Val или Ser 26 на Phe в IGF-II приводит к снижению сродства IGF-II к рецептору IGF-I в 94, 56 и 4 раза, соответственно (Torres et al. (1995) J. Mol. Biol. 248(2):385-401). Делеция остатков 1-7 IGF-II человека приводила к 30-кратному снижению сродства к рецептору IGF-II крысы (Hashimoto et al. (1995) J. Biol. Chem. 270(30):18013-8). Исследование структуры IGF-II методом ЯМР показывает, что Thr-7 расположен вблизи остатков Phe-48 Phe и Ser-50, а также вблизи дисульфидного мостика Cys-9-Cys-47. Предполагается, что взаимодействие Thr-7 с указанными остатками может стабилизировать гибкий N-концевой гексапептид, который требуется для связывания с рецептором IGF-I (Terasawa et al. (1994) EMBO J. 13(23)5590-7). В то же время, данное взаимодействие может модулировать связывание с рецептором IGF-II. Укорочение C-конца IGF-II (остатки 62-67) также, по-видимому, снижает сродство IGF-II к рецептору IGF-I в 5 раз (Roth et al. (1991) Biochem. Biophys. Res. Commun. 181(2):907-14).

[0111] Связывающие поверхности для IGF-I и катион-независимых рецепторов M6P находятся на разных сторонах IGF-II. На основании структурных и мутационных данных можно сконструировать функциональные домены катион-независимого связывания M6P, которые по существу меньше, чем у IGF-II человека. Например, N-концевые аминокислоты (например, 1-7 или 2-7) и/или C-концевые остатки 62-67 могут быть делетированы или заменены. Кроме того, аминокислоты 29-40, вероятно, могут быть упразднены или заменены без изменения фолдинга оставшегося полипептида или изменения связывания с катион-независимым рецептором M6P. Таким образом, можно сконструировать компонент для направленной доставки, включающий аминокислоты 8-28 и 41-61. Указанные участки аминокислот, вероятно, можно было бы соединить напрямую или разделить линкером. В качестве альтернативы, аминокислоты 8-28 и 41-46 можно представить на раздельных полипептидных цепях. Сопоставимые домены инсулина, которые гомологичны IGF-II и обладают третичной структурой, близкой к структуре IGF-II, дают достаточную структурную информацию, чтобы был возможен правильный рефолдинг в соответствующую третичную структуру, даже когда они присутствуют на разных полипептидных цепях (Wang et al. (1991) Trends Biochem. Sci. 279-281). Таким образом, например, аминокислоты 8-28 или вариант их консервативной замены, могут быть соединены с лизосомальным ферментом; получаемый в результате химерный белок можно было бы добавить к аминокислотам 41-46, или варианту их консервативной замены, и вводить пациенту.

[0112] IGF-II можно также модифицировать так, чтобы минимизировать связывание с белками сыворотки крови, связывающими IGF (Baxter (2000) Am. J. Physiol Endocrinol Metab. 278(6):967-76), чтобы избежать секвестрирования конструкций IGF-II/GILT. Целый ряд исследований позволил локализовать остатки в IGF-II, которые необходимы для связывания с IGF-связывающими белками. Конструкции с мутациями в указанных остатках можно подвергнуть скринингу на сохранение высокого сродства связывания с рецептором M6P/IGF-II и на сниженное сродство к IGF-связывающим белкам. Например, сообщается, что замена Phe-26 IGF-II на Ser снижает сродство IGF-II к IGFBP-1 и -6 без действия на связывание с рецептором M6P/IGF-II (Bach et al. (1993) J. Biol. Chem. 268(13):9246-54). Другие замены, такие как замена Lys на Glu-9, также могут быть благоприятными. Аналогичные мутации, по-отдельности или в сочетании, в области IGF-I, которая высоко консервативна, на IGF-II приводят к значительному снижению связывания с IGF-BP (Magee et al. (1999) Biochemistry 38(48):15863-70).

[0113] Альтернативный подход состоит в том, чтобы идентифицировать минимальные области IGF-II, которые с высоким сродством связываются с рецептором M6P/IGF-II. Остатки, для которых было показано участие в связывании IGF-II с рецептором M6P/IGF-II, группируются главным образом на одной поверхности IGF-II (Terasawa et al. (1994) EMBO J. 13(23):5590-7). Хотя третичная структура IGF-II в норме поддерживается тремя внутримолекулярными дисульфидными связями, может быть сконструирован пептид, включающий аминокислотную последовательность поверхности IGF-II, связывающейся с рецептором M6P/IGF-II, который будет обладать правильным фолдингом и связывающей активностью. Такой минимальный связывающий пептид представляет собой весьма желательный домен направленной доставки в лизосому. Например, предпочтительный домен направленной доставки в лизосому предсталяет собой последовательность аминокислот 8-67 IGF-II человека. Сконструированные пептиды, основанные на области вокруг аминокислот 48-55, которые связываются с рецептором M6P/IGF-II, также являются желательными доменами направленной доставки в лизосому. В качестве альтернативы, можно проводить скрининг случайной библиотеки пептидов на способность связываться с рецептором M6P/IGF-II либо посредством использования дрожжевой двугибридной системы, либо посредством анализа по типу фагового дисплея.

Сродство связывания с рецептором инсулина

[0114] Многие мутеины IGF-II, включая фурин-устойчивые мутеины IIIGF-II, описываемые в настоящей заявке, обладают сниженным или уменьшенным сродством связывания с рецептором инсулина. Таким образом, согласно некоторым вариантам реализации пептидная метка, подходящая для реализации настоящего изобретения, обладает сниженным или уменьшенным сродством связывания с рецептором инсулина по сравнению со сродством существующего в природе IGF-II человека в отношении рецептора инсулина. Согласно некоторым вариантам реализации пептидные метки со сниженным или уменьшенным сродством связывания с рецептором инсулина, подходящие для реализации настоящего изобретения, включают пептидные метки, обладающие сродством связывания с рецептором инсулина больше чем в 1,5 ,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 0, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 раз меньше, чем сродство зрелого IGF-II человека дикого типа. Сродство связывания с рецептором инсулина можно измерить посредством разных анализов in vitro и in vivo, известных в технике. Примеры анализов по оценке связывания описаны в разделе «Примеры».

Мутагенез

[0115] Мутеины IGF-II можно получить путем введения соответствующих нуклеотидных замен в ДНК IGF-II, или путем синтеза желаемого полипептида IGF-II. Можно вносить вариации в последовательность IGF-II, например, с применением любого из способов и рекомендаций по консервативным и неконсервативным заменам, приведенным, например, в Патенте США № 5364934. Вариации могут представлять собой замену, делецию или инсерцию одного или более кодонов, кодирующих IGF-II, которые приводят к получению измененной аминокислотной последовательности IGF-II по сравнению с существующей в природе последовательностью зрелого IGF-II человека. Аминокислотные замены могут быть следствием замещения аминокислоты другой аминокислотой, обладающей сходными структурными и/или химическими свойствами, как при замене лейцина на серин, т.е. консервативные аминокислотные замены. Аминокислотные замены также могут быть следствием замещения одной аминокислоты другой аминокислотой, обладающей несходными структурными и/или химическими свойствами, т.е. неконсервативные аминокислотные замены. Инсерции или делеции могут необязательно охватывать от 1 до 5 аминокислот. Допустимую вариацию можно определить путем систематического проведения инсерций, делеций или замен аминокислот в последовательности и тестирования образующихся вариантов на предмет активности в анализах in vitro и in vivo, известных в технике (таких как анализ связывания с CI-MRP или анализ расщепления фурином).

[0116] Также можно применять сканирующий анализ аминокислот для идентификации одной или более аминокислот по всей непрерывной последовательности. Среди предпочтительных аминокислот для сканирования - относительно маленькие, нейтральные аминокислоты. Такие аминокислоты включают аланин, глицин, серин и цистеин. Аланин обычно является предпочтительной аминокислотой для сканирования среди указанной группы, поскольку он исключает боковую цепь за пределами бета-атома углерода и с меньшей вероятностью изменяет конформацию основной цепи рассматриваемого варианта. Аланин также обычно предпочитают, поскольку он является наиболее распространенной аминокислотой. Также он обнаруживается как в скрытых, так в и поверхностных положениях [Creighton, The Proteins, (W. H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]. Если замены аланина не дают достаточного количества вариантов, можно применять изотерическую (isoteric) аминокислоту.

[0117] Вариации можно получить при помощи способов, известных в технике, таких как олигонуклеотид-опосредуемый мутагенез (сайт-специфический мутагенез), сканирование на аланин и ПЦР-мутагенез. Чтобы получить мутеины IGF-II, можно проводить в отношении клонированной ДНК сайт-специфичный мутагенез [Carter et al., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)], кассетный мутагенез [Wells et al., Gene, 34:315 (1985)], ограниченный рестрикцией мутагенез [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)] или другие известные способы.

Спейсер

[0118] Метку GILT можно присоединять к N-концу или C-концу лизосомального фермента. Метку GILT можно присоединять напрямую к лизосомальному ферменту или можно отделить от лизосомального фермента линкером или спейсером. Аминокислотный линкер или спейсер, как правило, конструируют так, чтобы он был жесткий, гибкий или образовывал структуру, такую как альфа-спираль, между двумя белковыми компонентами. Линкер или спейсер может быть относительно короткий, например, такой как последовательность Gly-Ala-Pro (GAP) (SEQ ID NO:9), Gly-Gly-Gly-Gly-Ala (GGGGA) (SEQ ID NO:60) или Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (GGGGS) (SEQ ID NO:12), или может быть более длинным, например, 10-25 аминокислот длиной, 25-50 аминокислот длиной или 35-55 аминокислот длиной. Сайт соединения следует выбирать с осторожностью, чтобы способствовать правильному фолдингу и активности обоих партнеров по соединению, и чтобы предупредить преждевременное отделение пептидной метки от лизосомального фермента, например, альфа-N-ацетилглюкозаминидазы.

[0119] Согласно различным вариантам реализации, указанный спейсерный пептид содержит одну или более аминокислотных последовательностей GGGPS (SEQ ID NO:14) или GGGSP (SEQ ID NO:15), и необязательно дополнительно содержит одну или более последовательностей (i) GAP (SEQ ID NO:9), (ii) GGGGS (SEQ ID NO:12), (iii) GGGS (SEQ ID NO:16), (iv) AAAAS (SEQ ID NO:17), (v) AAAS (SEQ ID NO:18), (vi) PAPA (SEQ ID NO:19), (vii) TPAPA (SEQ ID NO:20), (viii) AAAKE (SEQ ID NO:21) или (ix) GGGGA (SEQ ID NO:60). Согласно различным вариантам реализации спейсер содержит аминокислотную последовательность GAP (SEQ ID NO:9), GPS (SEQ ID NO:10) или GGS (SEQ ID NO:11).

[0120] Согласно различным вариантам реализации, указанный спейсерный пептид содержит одну или более аминокислотных последовательностей GGGGS (SEQ ID NO:12) или GGGS (SEQ ID NO:16). Согласно различным вариантам реализации, указанный спейсерный пептид содержит одну или более аминокислотных последовательностей GGGPS (SEQ ID NO:14) или GGGSP (SEQ ID NO:15). Согласно различным вариантам реализации, указанный спейсерный пептид содержит одну или более аминокислотных последовательностей AAAAS (SEQ ID NO:17) или AAAS (SEQ ID NO:18). Согласно различным вариантам реализации, указанный спейсерный пептид содержит одну или более аминокислотных последовательностей PAPA (SEQ ID NO:19) или TPAPA (SEQ ID NO:20). Согласно различным вариантам реализации, указанный спейсерный пептид содержит одну или более аминокислотных последовательностей AAAKE (SEQ ID NO:21). Согласно различным вариантам реализации, указанный спейсерный пептид содержит одну или более аминокислотных последовательностей GGGGA (SEQ ID NO:60).

[0121] Согласно различным вариантам реализации, указанный спейсерный пептид содержит последовательность, выбираемую из группы, состоящей из: (GGGGS)_n (SEQ ID NO:12, 56, 58, 91-94), (GGGGS)_n-GGGPS (SEQ ID NO:36, 95-100), GAP-(GGGGS)_n-GGGPS (SEQ ID NO:101-107), GAP-(GGGGS)_n-GGGPS-GAP (SEQ ID NO:37, 108-113), GAP-(GGGGS)_n-GGGPS-(GGGGS)_n-GAP (SEQ ID NO:114-162), GAP-GGGPS-(GGGGS)_n-GAP (SEQ ID NO:163-169), GAP-(GGGGS)_n-AAAAS-GGGPS-(GGGGS)_n-AAAA-GAP (SEQ ID NO:170-218), GAP-(GGGGS)_n-PAPAP-(Xaa)_n-GAP (SEQ ID NO:219-267), GAP-(GGGGS)_n-PAPAPT-(Xaa)_n-GAP (SEQ ID NO:268-316), GAP-(GGGGS)_n-(Xaa)_n-PAPAP-(Xaa)_n-(AAAKE)_n-(Xaa)_n-(GGGGS)_n-GAP (SEQ ID NO:544-551), (GGGGA)_n (SEQ ID NO:60, 79, 81, 317-320), (GGGGA)_n-GGGPS (SEQ ID NO:321-326), GAP-(GGGGA)_n-GGGPS (SEQ ID NO:327-333), GAP-(GGGGA)_n-GGGPS-GAP (SEQ ID NO:334-340), GAP-(GGGGA)_n-GGGPS-(GGGGA)_n-GAP (SEQ ID NO:341-389), GAP-GGGPS-(GGGGA)_n-GAP (SEQ ID NO:390-396), GAP-(GGGGA)_n-AAAAS-GGGPS-(GGGGA)_n-AAAA-GAP (SEQ ID NO:397-445), GAP-(GGGGA)_n-PAPAP-(Xaa)_n-GAP (SEQ ID NO:446-494), GAP-(GGGGA)_n-PAPAPT-(Xaa)_n-GAP (SEQ ID NO:495-543), GAP-(GGGGA)_n-(Xaa)_n-PAPAP-(Xaa)_n-(AAAKE)_n-(Xaa)_n-(GGGGA)_n-GAP (SEQ ID NO:552-559); причем n равно 1-7. Согласно различным вариантам реализации n равно 1-4.

[0122] Согласно различным вариантам реализации спейсер выбран из группы, состоящей из EFGGGGSTR (SEQ ID NO:22), GAP (SEQ ID NO:9), GGGGS (SEQ ID NO:12), GPSGSPG (SEQ ID NO:23), GPSGSPGT (SEQ ID NO:24), GPSGSPGH (SEQ ID NO:25), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPST (SEQ ID NO:26), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSH (SEQ ID NO:27), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO:28), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO:29), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO:30), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO:31), GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO:32), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO:33), GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO:34), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO:35), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO:36), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO:37), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPS (SEQ ID NO:38), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO:39), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPS (SEQ ID NO:40), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGAP (SEQ ID NO:41), GGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPS (SEQ ID NO:42), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGAP (SEQ ID NO:43), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS (SEQ ID NO:44), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP (SEQ ID NO:45), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS (SEQ ID NO:46), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP (SEQ ID NO:47), GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS (SEQ ID NO:48), GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP (SEQ ID NO:49), GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS (SEQ ID NO:50), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEQ ID NO:51), GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS (SEQ ID NO:52), GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP (SEQ ID NO:53), GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG (SEQ ID NO:54), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEQ ID NO:55), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:56), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGAP (SEQ ID NO:57), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:58), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGAP (SEQ ID NO:59), GGGGA (SEQ ID NO:60), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPST (SEQ ID NO:61), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH (SEQ ID NO:62), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPS (SEQ ID NO:63), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO:64), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO:65), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO:66), GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO:67), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO:68), GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO:69), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO:70), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO:71), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO:72), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPS (SEQ ID NO:73), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO:74), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPS (SEQ ID NO:75), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGAP (SEQ ID NO:76), GGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPS (SEQ ID NO:77), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGAP (SEQ ID NO:78), GGGGAGGGGAGGGGA (SEQ ID NO:79), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGAP (SEQ ID NO:80), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA (SEQ ID NO:81), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGAP (SEQ ID NO:82), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS [или (GGGGA)₈GGGPS] (SEQ ID NO:83), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH [или (GGGGA)₈GGGPSH] (SEQ ID NO:84), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS [или (GGGGA)₉GGGPS] (SEQ ID NO:85), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH [или (GGGGA)₉GGGPSH] (SEQ ID NO:86), GGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPS (SEQ ID NO:87), GAPGGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPGGAP (SEQ ID NO:88), GGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPS (SEQ ID NO:89) и GAPGGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPGGAP (SEQ ID NO:90).

[0123] Согласно различным вариантам реализации спейсер выбран из группы, состоящей из GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO:36), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS (SEQ ID NO:44), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP (SEQ ID NO:45), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS (SEQ ID NO:46), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP (SEQ ID NO:47), GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS (SEQ ID NO:48), GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP (SEQ ID NO:49), GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS (SEQ ID NO:50), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEQ ID NO:51), GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS (SEQ ID NO:52), GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP (SEQ ID NO:53), GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG (SEQ ID NO:54), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEQ ID NO:55) и GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO:71).

[0124] Согласно различным вариантам реализации спейсер выбран из группы, состоящей из GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO:36), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP (SEQ ID NO:47), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEQ ID NO:51), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEQ ID NO:55) и GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO:71).

[0125] Дополнительные конструкции белков альфа-N-ацетилглюкозаминидазы с меткой GILT, которые можно применять при реализации способов и композиций согласно настоящему изобретению, были описаны подробно в Публикациях патентов США № 20050244400 и 20050281805, полное содержание которых включено в настоящую заявку посредством ссылки.

Клетки

[0126] Согласно настоящему изобретению можно применять любые клетки или типы клеток млекопитающих, восприимчивых к культивированию клеток и экспрессии полипептидов, например, такие как клетки эмбриональной почки человека (HEK) 293, клетки яичников китайского хомячка (CHO), почек обезьян (COS), HT1080, C10, HeLa, почек новорожденного хомячка (BHK), 3T3, C127, CV-1, HaK, NS/0 и клетки L-929. Неограничивающие примеры клеток млекопитающих, которые можно применять согласно настоящему изобретению, включают без ограничений, линию миеломы мышей BALB/c (NS0/1, ECACC №: 85110503); ретинобласты человека (PER.C6 (CruCell, Лейден, Нидерланды); клетки почек обезьяны линии CV1, трансформированные SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); линию клеток почки эмбриона человека (293 или клетки 293, субклонированные для роста в среде на основе суспензии, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); клетки почек новорожденных хомячков (BHK, ATCC CCL 10); клетки яичника китайского хомячка +/-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); клетки Сертолли мыши (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); клетки почек обезьяны (CV1 ATCC CCL 70); клетки почек африканской зеленой мартышки (VERO-76, ATCC CRL-1 587); клетки карциномы шейки матки человека (HeLa, ATCC CCL 2); клетки почек собаки (MDCK, ATCC CCL 34); клетки печени серых крыс (BRL 3A, ATCC CRL 1442); клетки легких человека (W138, ATCC CCL 75); клетки печени человека (Hep G2, HB 8065); клетки опухоли молочной железы мыши (MMT 060562, ATCC CCL51); клетки TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)); клетки MRC 5; клетки FS4; и клетки линии гепатомы человека (Hep G2). Согласно некоторым вариантам реализации химерный белок согласно настоящему изобретению получают в линиях клеток CHO.

[0127] Также химерный белок согласно настоящему изобретению можно экспрессировать в разных клетках-хозяевах немлекопитающих, например, насекомых (например, Sf-9, Sf-21, Hi5), растений (например, Leguminosa, зерновых культур или табака), дрожжей (например, S. cerivisae, P. pastoris), прокариот (например, E. Coli, B. subtilis и других видов Bacillus, видов Pseudomonas, видов Streptomyces) или грибов.

[0128] Согласно некоторым вариантам реализации химерный белок с меткой GILT или без нее можно получать в клетках с недостаточностью фурина. В настоящей заявке термин «клетки с недостаточностью фурина» относится к любым клеткам, у которых ингибирована, снижена или упразднена активность протеазы фурина. Клетки с недостаточностью фурина включают клетки как млекопитающих, так и немлекопитающих, которые не вырабатывают фурин или вырабатывают уменьшенное количество фурина или дефектную протеазу фурин. Примеры клеток с недостаточностью фурина известны и доступны специалистам в данной области техники, включая без ограничений клетки FD11 (Gordon et al (1997) Infection and Immunity 65(8):3370 3375), и мутантные клетки, описанные у Moebring and Moehring (1983) (Infection and Immunity 41(3):998 1009). В качестве альтернативы, клетки с недостаточностью фурина можно получить путем воздействия на перечисленные выше клетки млекопитающих и немлекопитающих средствами, вызывающими мутагенез, например, излучением, бромистым этидием, бромдезоксиуридином (BrdU), предпочтительно средствами химического мутагенеза и более предпочтительно этилметансульфонатом, путем восстановления клеток, которые выжили после обработки и селекции клеток, для которых показана устойчивость к токсичности, вызванной эндотоксином синегнойной палочки А (смотрите Moehring and Moehrin (1983) Infection and Immunity 41(3):998 1009).

[0129] Согласно различным вариантам реализации подразумевается, что некоторые из направленных терапевтических белков, содержащих спейсер, описанный в настоящей заявке, могут проявлять увеличенную экспрессию активного белка, когда они экспрессируются рекомбинантным путем, по сравнению с направленными терапевтическими белками, содержащими другой спейсерный пептид. Согласно различным вариантам реализации также подразумевается, что направленные терапевтические белки, описываемые в настоящей заявке, могут обладать увеличенной активностью по сравнению с другими направленными терапевтическими белками в настоящей заявке. Подразумевается, что такие направленные терапевтические белки, проявляющие увеличенную экспрессию активного белка и/или обладающие увеличенной активностью по сравнению с другими направленными терапевтическими белками, содержащими другой спейсерный пептид, применяют для дальнейших экспериментов.

Введение терапевтических белков

[0130] Согласно настоящему изобретению терапевтический белок обычно вводят индивидууму отдельно или в составе композиций или лекарственных препаратов, содержащих указанный терапевтический белок (например, при производстве лекарственного препарата для лечения заболевания), описываемый в настоящей заявке. Композиции можно составлять с применением физиологически приемлемого носителя или вспомогательного вещества для приготовления фармацевтической композиции. Указанные носитель и композиция могут быть стерильными. Лекарственная форма должна соответствовать пути введения.

[0131] Подходящие фармацевтически приемлемые носители включают без ограничений воду, растворы солей (например, NaCl), физиологический раствор, буферный физиологический раствор, спирты, глицерин, этанол, аравийскую камедь, растительные масла, бензиловые спирты, полиэтиленгликоли, желатин, углеводы, такие как лактоза, амилоза или крахмал, сахара, такие как маннитол, сахароза или другие, декстроза, стеарат магния, тальк, кремниевая кислота, вязкий парафин, парфюмерное масло, сложные эфиры жирных кислот, гидроксиметилцеллюлоза, поливинилпирролидон и др., а также их комбинации. Лекарственные препараты при желании можно смешивать с вспомогательными средствами (например, скользящие вещества, консерванты, стабилизаторы, смачивающие вещества, эмульгаторы, соли для регуляции осмотического давления, буферы, красители, ароматизаторы и/или ароматические вещества и подобные), которые не вступают во вредные реакции с активными веществами и не препятствуют их активности. Согласно предпочтительным вариантам реализации применяется водорастворимый носитель, подходящий для внутривенного введения.

[0132] При желании композиция или лекарственный препарат могут содержать незначительные количества смачивающих веществ или эмульгаторов, или буферов рН. Указанная композиция может быть жидким раствором, суспензией, эмульсией, таблеткой, пилюлей, капсулой, формой с замедленным высвобождением или порошком. Также указанную композиция можно составлять в виде суппозитория, с традиционными связующими веществами и носителями, такими как триглицериды. Лекарственная форма для перорального введения может включать стандартные носители, такие как маннитол, лактоза, крахмал, стеарат магния, поливинилпирролидон, сахарин натрия, целлюлозу, карбонат натрия и др. фармацевтической степени чистоты.

[0133] Композиция или лекарственный препарат могут быть составлены в соответствии со стандартными способами, при помощи которых фармацевтическая композиция адаптируется к введению человеку. Например, согласно предпочтительным вариантам реализации композиция для внутривенного введения обычно является раствором в стерильном изотоническом водном буфере. При необходимости композиция может также включать агент, повышающий растворимость, и местный анестетик для облегчения боли в области введения. Как правило, ингредиенты поставляют либо по отдельности, либо смешанными в виде единичной лекарственной формы, например, в виде сухого лиофилизированного порошка или безводного концентрата в герметичном контейнере, таком как ампула или саше, на котором указано количество активного агента. Когда композиция предназначена для введения путем инфузии, ее можно распределить во флаконе для инфузий, содержащем стерильную воду, физиологический раствор и/или декстрозу/воду фармацевтической степени чистоты. В тех случаях, когда композицию вводят путем инъекций, можно предоставлять ампулу со стерильной водой для инъекций или физиологическим раствором, так чтобы ингредиенты можно было смешать перед введением.

[0134] Терапевтический белок можно представлять в форме нейтрального вещества или соли. Фармацевтически приемлемые соли включают соли, которые образованы свободными аминогруппами, такие как получают из соляной, фосфорной, уксусной, щавелевой, винной кислот и др., и образованы свободными карбоксильными группами, такие как получают из гидрооксида натрия, калия, аммония, кальция, железа, изопропиламина, триэтиламина, 2-этиламиноэтанола, гистидина, прокаина и др.

[0135] Терапевтический белок (или композицию или лекарственный препарат, содержащий указанный терапевтический белок) вводят любым подходящим путем. Согласно различным вариантам реализации терапевтический белок вводят внутривенно. Согласно другим вариантам реализации терапевтический белок вводят путем прямого введения в ткань-мишень, например, в сердце или в мышцу (например, внутримышечно), или нервную систему (например, прямая инъекция в головной мозг; в желудочки головного мозга; интратекально). Согласно различным вариантам реализации терапевтический белок вводят интратекально. В качестве альтернативы терапевтический белок (или композицию или лекарственный препарат, содержащий указанный терапевтический белок) можно вводить парентерально, чрескожно, через слизистую оболочку (например, перорально или назально). При желании совместно можно применять более одного пути введения, например, терапевтический белок вводят внутривенно и интратекально. Сопутствующее внутривенное и интратекальное введение не обязательно должно быть одновременным, а может быть последовательным.

[0136] Терапевтический белок (или композицию или лекарственный препарат, содержащий указанный терапевтический белок) можно вводить один, или в сочетании с другими агентами, такими как антигистаминные средства (например, дифенгидрамин) или иммуносупрессорные или другие иммунотерапевтические агенты, которые противодействуют антителам на лизосомальный фермент с меткой GILT. Термин «в сочетании с» указывает на то, что агент вводят до введения терапевтического белка (или композиции или лекарственного препарата, содержащего указанный терапевтический белок), приблизительно в то же время или после его введения. Например, указанный агент можно примешать к композиции, содержащей терапевтический белок, и, таким образом, вводить одновременно с терапевтическим белком; в качестве альтернативы, указанный агент можно вводить одновременно без смешивания (например, путем совмещенной доставки агента по внутривенной линии, через которую также вводится терапевтический белок, или наоборот). Согласно другому примеру указанный агент можно вводить отдельно (например, не смешивая), но с коротким временным интервалом (например, 24 часа) относительно введения терапевтического белка.

[0137] Терапевтический белок (или композицию или лекарственный препарат, содержащий указанный терапевтический белок) вводят в терапевтически эффективном количестве (т.е., доза, которая при введении через регулярные интервалы достаточна для лечения заболевания, такого как облегчение симптомов, ассоциированных с заболеванием, предупреждение или отсрочка начала заболевания, и/или уменьшение тяжести или частоты симптомов заболевания, которые описаны выше). Доза, которая должна быть терапевтически эффективной при лечении заболевания, будет зависеть от природы и степени эффектов заболевания, и ее можно определить стандартными клиническими способами. Кроме того, необязательно можно применять анализы in vitro и in vivo, которые могут помочь определить оптимальный диапазон доз при помощи способов, известных в технике. Точная доза, которую следует применять, будет также зависеть от пути введения, и от серьезности заболевания, и решение о ней следует принимать на основании мнения врача и обстоятельств каждого пациента. Эффективные дозы можно экстраполировать из кривых зависимости «доза-ответ», полученных в системах in vitro или в модельных системах на животных. Терапевтически эффективная доза может составлять, например, приблизительно 0,1-1 мг/кг, приблизительно 1-5 мг/кг, приблизительно 2,5-20 мг/кг, приблизительно 5-20 мг/кг, приблизительно 20-50 мг/кг, или приблизительно 20-100 мг/кг или приблизительно 50-200 мг/кг, или приблизительно от 2,5 до 20 мг/кг массы тела. Эффективная доза для конкретного индивидуума может варьировать (например, увеличиваться или уменьшаться) со временем, в зависимости от потребностей указанного индивидуума. Например, во время соматического заболевания или стресса, или если симптомы заболевания усугубляются, доза может увеличиваться.

[0138] Терапевтически эффективное количество терапевтического белка (или композиции или лекарственного препарата, содержащего указанный терапевтический белок) вводят с регулярными интервалами, в зависимости от природы и степени эффектов заболевания и постоянно. В настоящей заявке под введением «с интервалами» понимают, что терапевтически эффективное количество вводят периодически (что отличается от однократной дозы). Интервал можно определить при помощи стандартных клинических способов. Согласно некоторым вариантам реализации терапевтический белок вводят раз в два месяца, раз в месяц, два раза в месяц, раз в три недели, раз в неделю, два раза в неделю, три раза в неделю или ежедневно. Интервал введения для отдельного индивидуума не обязательно является фиксированным интервалом, а может варьировать со временем, в зависимости от потребностей указанного индивидуума. Например, во время соматического заболевания или стресса, или если симптомы заболевания усугубляются, интервал между дозами может уменьшаться.

[0139] В настоящей заявке термин «раз в два месяца» означает введение один раз в два месяца (т.е., один раз каждые два месяца); термин «раз в месяц» означает введение один раз в месяц; термин «раз в три недели» означает введение один раз в три недели (т.е. один раз каждые три недели); термин «раз в две недели» означает введение один раз в две недели (т.е., один раз каждые две недели); термин «раз в неделю» означает введение один раз в неделю; а термин «ежедневно» означает введение один раз в день.

[0140] Настоящее описание относится также к фармацевтической композиции, содержащей терапевтический белок, предложенный в настоящей заявке, в контейнере (например, флаконе, бутыли, пакете для внутривенного введения, шприце и др.) с информацией, содержащей инструкции по введению указанной композиции для лечения мукополисахаридоза IIIB типа (Синдром Санфилиппо В), например, способами, описываемыми в настоящей заявке.

Интратекальное введение фармацевтически приемлемых лекарственных форм

[0141] Согласно различным вариантам реализации, указанный химерный белок на основе фермента вводят путем доставки в центральную нервную систему субъекта; например, в спинномозговую жидкость субъекта. Согласно определенным аспектам настоящего изобретения фермент вводят интратекально, например, в поясничную область, или в мозжечково-мозговую цистерну, или в пространство желудочков головного мозга. Способы введения лизосомального фермента интратекально описаны в Патенте США 7442372, включенном в настоящую заявку посредством ссылки в полном объеме.

[0142] Специалистам в данной области техники знакомы устройства, которые можно применять для проведения интратекального введения терапевтической композиции. Например, терапию можно проводить при помощи резервуара Оммайа, который часто применяют для интратекального введения препаратов при канцероматозе мозговых оболочек (Ommaya AK, Lancet 2: 983-84, 1963). Более конкретно, при данном способе через отверстие, образованное передним рогом, вводят вентрикулярную трубку и соединяют ее с резервуаром Оммайа, введенным под кожу черепа, и резервуар прокалывают под кожей с целью интратекальной доставки конкретного фермента, который восполняется, и который был введен в резервуар. Другие устройства для интратекального введения терапевтических композиций индивидууму описаны в Патенте США № 6217552, включенном в настоящую заявку посредством ссылки. В качестве альтернативы, композицию можно вводить интратекально, например, посредством однократной инъекции или непрерывной инфузии. Следует понимать, что медикаментозное лечение можно проводить в форме однократного введения или введения нескольких доз.

[0143] В настоящей заявке под термином «интратекальное введение» следует понимать доставку фармацевтической композиции непосредственно в спинномозговую жидкость субъекта, при помощи способов, включающих латеральную церебровентрикулярную инъекцию (т.е., в желудочки головного мозга) через трепанационное отверстие или прокол цистерны или поясничного отдела или подобные (описано у Lazorthes et al. Advances in Drug Delivery Systems and Applications in Neurosurgery, 143-192 and Omaya et al., Cancer Drug Delivery, 1: 169-179, содержание которой включено в настоящую заявку посредством ссылки). Под термином «поясничный отдел» следует понимать область между третьим и четвертым поясничными позвонками (низ спины) и, более содержательно - область позвоночника L2-S1. Под термином «мозжечково-мозговая цистерна» следует понимать доступ к пространству около и ниже мозжечка через отверстие между черепом и вершиной позвоночника. Под термином «желудочек головного мозга» следует понимать полости в головном мозге, которые соединяются с центральным каналом спинного мозга. Введения фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению в любой из перечисленных выше участков можно достичь путем прямой инъекции композиции или путем применения инфузионных насосов. Для инъекции композицию согласно настоящему изобретению можно преобразовать в жидкие растворы, предпочтительно в физиологически совместимых буферах, таких как раствор Хенкса, раствор Рингера или фосфатный буфер. Кроме того, фермент можно преобразовать в твердую форму и повторно растворять или суспендировать непосредственно перед применением. Лиофилизированные формы также включены в изобретение. Инъекция может быть, например, в форме болюсной инъекции и непрерывной инфузии фермента (например, с применением инфузионных насосов).

[0144] Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения фермент вводят путем латеральной церебровентрикулярной инъекции в головной мозг субъекта. Например, инъекцию проводят через трепанационное отверстие, сделанное в черепе субъекта. Согласно другому варианту реализации фермент и/или другую фармацевтическую композицию вводят через введенный хирургическим путем шунт в желудочек головного мозга субъекта. Например, инъекцию можно произвести в латеральный желудочек, который более крупный, даже хотя также может проводиться инъекция в третий и четвертый более маленькие желудочки.

[0145] Согласно различным вариантам реализации фармацевтические композиции, применяемые согласно настоящему изобретению, вводят путем инъекции в мозжечково-мозговую цистерну, или в поясничную область субъекта. Согласно другому варианту реализации способу настоящего изобретения фармацевтически приемлемая лекарственная форма обеспечивает длительную доставку, например, «замедленное высвобождение» фермента или другой фармацевтической композиции, применяемой согласно настоящему изобретению, у субъекта в течение по меньшей мере одного, двух, трех или четырех недель или более длительных периодов времени после того, как фармацевтически приемлемая лекарственная форма была введена субъекту.

[0146] Согласно различным вариантам реализации терапевтический химерный белок доставляют к одной или более поверхностям неглубоких тканей головного или спинного мозга. Например, согласно различным вариантам реализации терапевтический химерный белок доставляют к одной или более поверхностям неглубоких тканей полушарий головного мозга или спинного мозга. Согласно некоторым вариантам реализации целевая поверхность неглубоких тканей полушарий головного мозга или спинного мозга расположена на глубине 4 мм от поверхности полушарий головного мозга. Согласно некоторым вариантам реализации целевую поверхность неглубоких тканей полушарий головного выбран из мягкой мозговой оболочки, тканей борозд коры головного мозга, гиппокампа, периваскулярного пространства, кровеносных сосудов в периваскулярном пространстве, гиппокампа, часто гипоталамуса на нижней поверхности головного мозга, зрительных нервов и трактов, обонятельной луковицы и проекций, и их сочетаний.

[0147] Согласно некоторым вариантам реализации терапевтический химерный белок доставляют в одну или более глубоких тканей полушарий головного мозга или спинного мозга. Согласно некоторым вариантам реализации целевая поверхность или неглубокие ткани полушарий головного мозга или спинного мозга расположены на глубине на 4 мм (например, 5 мм, 6 мм, 7 мм, 8 мм, 9 мм или 10 мм) ниже (или в более внутреннем положении) поверхности полушарий головного мозга. Согласно некоторым вариантам реализации целевые глубокие ткани больших полушарий включают борозды коры больших полушарий. Согласно некоторым вариантам реализации целевые глубокие ткани больших полушарий включают один или более отделов промежуточного мозга (например, гипоталамус, таламус, преталамус, субталамус и др.), задний мозг, чечевицеобразное ядро, базальные ганглии, хвостатое ядро, скорлупу, миндалину, бледный шар и их сочетание.

[0148] Согласно различным вариантам реализации целевая поверхность неглубоких тканей спинного мозга включает мягкую мозговую оболочку и/или тракты белого вещества. Согласно различным вариантам реализации целевые глубокие ткани спинного мозга включают серое вещество спинного мозга и/или эпиндимные клетки. Согласно некоторым вариантам реализации терапевтический химерный белок доставляют к нейронам спинного мозга.

[0149] Согласно различным вариантам реализации терапевтический химерный белок доставляют к одной или более тканям мозжечка. Согласно определенным вариантам реализации целевые одна или более тканей мозжечка выбран из группы, состоящей из тканей молекулярного слоя, тканей слоя клеток Пуркинье, тканей гранулярного слоя, ножек мозжечка и их сочетания. Согласно некоторым вариантам реализации терапевтические агенты (например, ферменты) доставляют к одной или более глубоким тканям мозжечка, включая без ограничений ткани слоя клеток Пуркинье, ткани гранулярного слоя, глубокой ткани белого вещества мозжечка (например, более глубокой по сравнению с гранулярным слоем) и ткани глубокого ядерного слоя.

[0150] Согласно различным вариантам реализации терапевтический химерный белок доставляют к одной или более тканям ствола головного мозга. Согласно некоторым вариантам реализации целевые одна или более ткани ствола головного мозга включают белое вещество ствола головного мозга и/или ткань ядер ствола головного мозга.

[0151] Согласно различным вариантам реализации терапевтический химерный белок доставляют к разным тканям головного мозга, включая без ограничений серое вещество, белое вещество, перивентрикулярные области, мягкую и паутинную оболочку головного мозга, твердую оболочку головного мозга, новую кору, мозжечок, глубокие ткани в коре головного мозга, молекулярный слой, область хвостатого ядра/скорлупы, средний мозг, глубокие области моста или медуллярного вещества, и их сочетания.

[0152] Согласно различным вариантам реализации терапевтический химерный белок доставляют к разным клеткам головного мозга, включая без ограничений нейроны, клетки глии, периваскулярные клетки и/или клетки оболочек мозга. Согласно некоторым вариантам реализации терапевтический химерный белок доставляют к олигодендроцитам глубоких слоев белого вещества.

Наборы для применения при реализации способов согласно настоящему изобретению

[0153] Агенты, применяемые при реализации способов согласно настоящему изобретению, можно предоставлять в составе набора, который может дополнительно включать инструкцию по применению. Такой набор может содержать химерный белок, описываемый в настоящей заявке, содержащий фермент для применения при лечении лизосомальнгой болезни накопления, и компонент для направленной доставки в лизосомы, обычно в дозе и форме, подходящих для введения хозяину. Согласно различным вариантам реализации, указанный набор, как правило, содержит устройство для интратекальной доставки фермента.

[0154] Также можно предлагать набор для конъюгации антигена, в частности полипептидного антигена, для высокой степени захвата компонента, с целью создания терапевтической композиции. Например, может быть предложен компонент, такой как мутеин IGF-II, каким-либо образом конъюгированный с линкером, подходящим для соединения с полипептидом. Компонент высокой степени захвата также может быть предложен в неконъюгированной форме, в сочетании с подходящим линкером, и с инструкцией по применению.

[0155] Другой набор может содержать инструкции по интратекальному введению терапевтических композиций согласно настоящему изобретению, в дополнение к терапевтической композиции. Согласно определенным вариантам реализации набор согласно настоящему изобретению может содержать катетеры или другие устройства для интратекального введения средства ферментозаместительной терапии, в которые предварительно набраны терапевтические композиции согласно настоящему изобретению. Например, в частности рассматриваются катетеры, в которые предварительно набирают 0,001-0,01 мг, 0,01-0,1 мг, 0,1-1,0 мг, 1,0-10 мг, 10-100 мг или более терапевтического белка, включающего лизосомальный фермент и компонент для направленной доставки в лизосомы, такой как Naglu и мутеин IGF-II, в фармацевтически приемлемой форме. Примеры катетеров могут включать одноразовые катетеры, которые можно выбросить после применения. В качестве альтернативы, предварительно заполненные катетеры могут быть перезаполняемыми, и могут быть предложены в составе наборов, которые содержат соответствующие количества фермента для перезаполнения таких катетеров.

[0156] Настоящее изобретение будет более подробно и более конкретно описано в следующих примерах. Однако примеры включены только в целях иллюстрации, но не ограничения.

ПРИМЕР 1 - ГЕНЕРИРОВАНИЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ СПЕЙСЕРОВ

[0157] Лизосомальные ферменты, содержащие метки GILT и спейсеры, были раскрыты в Публикациях патентов США № 20030082176, 20040006008, 20040005309 и 20050281805. Химерные белки альфа-N-ацетилглюкозаминидазы (Naglu), содержащие пептидные спейсеры, описаны в Публикации патента США № 201120232021. Дополнительные пептидные спейсеры для применения в составе направленных терапевтических химерных белков, содержащих лизосомальный белок и метку GILT, были разработаны, как описано ниже.

[0158] Можно разработать спейсер, который связывал бы мутеины IGF-II и фурин-устойчивые мутеины IGF-II. Примеры спейсеров включают следующие аминокислотные последовательности: EFGGGGSTR (SEQ ID NO:22) GAP (SEQ ID NO:9), GGGGS (SEQ ID NO:12), GGGGA (SEQ ID NO:60), GPSGSPG (SEQ ID NO:23), GPSGSPGT (SEQ ID NO:24), GPSGSPH (SEQ ID NO:25), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO:36), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO:71), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPST (SEQ ID NO:26), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSH (SEQ ID NO:27) и GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH (SEQ ID NO:62).

[0159] Были созданы конструкции, содержащие спейсер, непроцессированный Naglu (включая сигнальную последовательность) и пептид IGF-II, в которых между непроцессированным Naglu и IGF2 8-67 R37A была введена последовательность спейсера (спейсер EFGGGGSTR (SEQ ID NO:22), спейсера GAP (SEQ ID NO:9), спейсера GGGGS (SEQ ID NO:12), спейсера GPSGSPG (SEQ ID NO:23), или спейсера GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO:36)) (SEQ ID NO:560-564).

[0160] Были созданы дополнительные линкеры на основе способа XTEN, который описан у Schellenberger et al. (Nat Biotech 27:1186-1190, 2009). XTEN-подобные линкеры могут обеспечивать более длительный период полувыведения сконструированному химерному белку по сравнению с другими линкерами. Примеры спейсеров обладают аминокислотными последовательностями GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS (SEQ ID NO:44), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP (SEQ ID NO:45), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS (SEQ ID NO:46) и GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP (SEQ ID NO:47). Спейсер можно вводить между Naglu и мутеином IGF-2, необязательно через сайты AscI конструкций.

[0161] Экспрессия белка была ассоциирована с кодоном ДНК, применяемым для кодирования определенной аминокислоты, например, изменение кодона для определенной аминокислоты может приводить к повышению экспрессии белка без изменения аминокислотной последовательности указанного белка (Trinh et al, Mol. Immunol 40:717-722, 2004). Изменение кодона, кодирующего пептид, приводило к повышению уровня выработки рекомбинантного химерного белка. При помощи данного способа был разработан дополнительный спейсер для применения в составе терапевтического химерного белка с лизосомальным ферментом, такой как GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:56), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGAP (SEQ ID NO:57), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:58) и GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGAP (SEQ ID NO:59). Дополнительные последовательности спейсеров включали GGGGAGGGGAGGGGA (SEQ ID NO:79), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGAP (SEQ ID NO:80), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA (SEQ ID NO:81) и GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGAP (SEQ ID NO:82). Любой из указанных спейсеров вводят между Naglu и мутеином IGF-II, необязательно через сайты AscI в указанной конструкции.

[0162] Примеры жестких линкеров, которые содержат несколько остатков пролина, способствующих жесткости, обладают следующей последовательностью GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS (SEQ ID NO:48), GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP (SEQ ID NO:49), GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS (SEQ ID NO:50) или GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEQ ID NO:51), тогда как примеры спиральных линкеров обладают следующей последовательностью GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS (SEQ ID NO:52), GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP (SEQ ID NO:53), GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG (SEQ ID NO:54) или GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEQ ID NO:55). Любые из указанных спейсеров вводят между Naglu и мутеином IGF-II, необязательно через сайты AscI в указанной конструкции.

[0163] Дополнительные спейсеры можно можно создать посредством оптимизации кодонов, с применением технологии, разработанной в DNA 2.0 (Menlo Park, CA). Рассматриваемые спейсеры включают GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO:32), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO:33), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO:28), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO:29), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO:30), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO:31), GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO:34), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO:35), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO:36), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO:37), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPS (SEQ ID NO:38), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO:39), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPS (SEQ ID NO:40), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGAP (SEQ ID NO:41), GGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPS (SEQ ID NO:42), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGAP (SEQ ID NO:43), GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO:67), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO:68), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPS (SEQ ID NO:63), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO:64), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO:65), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO:66), GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO:69), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO:70), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO:71), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO:72), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPS (SEQ ID NO:73), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO:74), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPS (SEQ ID NO:75), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGAP (SEQ ID NO:76), GGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPS (SEQ ID NO:77), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGAP (SEQ ID NO:78), GGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPS (SEQ ID NO:87), GAPGGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPGGAP (SEQ ID NO:88), GGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPS (SEQ ID NO:89) и GAPGGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPGGAP (SEQ ID NO:90). Любые из указанных спейсеров вводят между Naglu и мутеином IGF-II, необязательно через сайты AscI в указанной конструкции.

[0164] Согласно определенным вариантам реализации, если применяют последовательность сигнального пептида белков внеклеточного матрикса (Nischt et al., Eur J. Biochem 200:529-536, 1991), Naglu в указанной конструкции не содержит собственной последовательности сигнального пептида. Указанный спейсер вводят между последовательностью Naglu и последовательностью мутеина IGF-II (например, IGF2 8-67 R37A). Примером последовательности сигнального пептида является MRAWIFFLLCLAGRALA (SEQ ID NO:8). К спейсеру можно добавлять пептид GAP для облегчения клонирования и добавления сайта для клонирования AscI. Согласно определенным вариантам реализации, если применяют нативную последовательность сигнального пептида Naglu (Weber et al., Hum Mol Genet. 5:771-777, 1996), указанный Naglu является непроцессированным Naglu, и спейсер вводят между непроцессированным Naglu и последовательностью мутеина IGF-II (например, IGF2 8-67 R37A). К спейсеру можно добавлять пептид GAP для облегчения клонирования и добавления сайта для клонирования AscI.

[0165] В примерных конструкциях Naglu человека была «оптимизирована по кодонам» с применением технологии DNA 2.0. Подразумевается, что указанная Naglu содержит аминокислоты 1-743 или 24-743 Naglu человека. В примерных конструкциях спейсер необязательно содержит спейсер GAP (для клонирования применяется сайт рестрикции AscI) или любую из следующих последовательностей: EFGGGGSTR (SEQ ID NO:22), GAP (SEQ ID NO:9), GGGGS (SEQ ID NO:12), GPSGSPG (SEQ ID NO:23), GPSGSPGT (SEQ ID NO:24), GPSGSPGH (SEQ ID NO:25), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPST (SEQ ID NO:26), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSH (SEQ ID NO:27), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO:28), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO:29), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO:30), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO:31), GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO:32), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO:33), GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO:34), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO:35), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO:36), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO:37), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPS (SEQ ID NO:38), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO:39), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPS (SEQ ID NO:40), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGAP (SEQ ID NO:41), GGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPS (SEQ ID NO:42), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGAP (SEQ ID NO:43), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS (SEQ ID NO:44), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP (SEQ ID NO:45), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS (SEQ ID NO:46), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP (SEQ ID NO:47), GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS (SEQ ID NO:48), GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP (SEQ ID NO:49), GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS (SEQ ID NO:50), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEQ ID NO:51), GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS (SEQ ID NO:52), GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP (SEQ ID NO:53), GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG (SEQ ID NO:54), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEQ ID NO:55), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:56), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGAP (SEQ ID NO:57), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:58), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGAP (SEQ ID NO:59), GGGGA (SEQ ID NO:60), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPST (SEQ ID NO:61), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH (SEQ ID NO:62), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPS (SEQ ID NO:63), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO:64), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO:65), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO:66), GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO:67), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO:68), GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO:69), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO:70), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO:71), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO:72), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPS (SEQ ID NO:73), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO:74), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPS (SEQ ID NO:75), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGAP (SEQ ID NO:76), GGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPS (SEQ ID NO:77), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGAP (SEQ ID NO:78), GGGGAGGGGAGGGGA (SEQ ID NO:79), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGAP (SEQ ID NO:80), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA (SEQ ID NO:81), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGAP (SEQ ID NO:82), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS [или (GGGGA)₈GGGPS] (SEQ ID NO:83), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH [или (GGGGA)₈GGGPSH] (SEQ ID NO:84), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS [или (GGGGA)₉GGGPS] (SEQ ID NO:85), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH [или (GGGGA)₉GGGPSH] (SEQ ID NO:86), GGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPS (SEQ ID NO:87), GAPGGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPGGAP (SEQ ID NO:88), GGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPS (SEQ ID NO:89) и GAPGGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPGGAP (SEQ ID NO:90). Перечисленные выше спейсеры необязательно «оптимизированы по кодону» с применением технологии DNA 2.0.

[0166] Любой из мутеинов IGF-II, описываемых в настоящей заявке, который необязательно «отимизирован по кодону» с применением технологии DNA 2.0, применим в составе настоящих конструкций. В примерных конструкциях мутеин IGF-II представляет собой фурин-устойчивый мутеин IGF-II-IGF2 Δ8-67 R37A.

ПРИМЕР 2 - ЭКСПРЕССИЯ И ОЧИСТКА КОНСТРУКЦИЙ

[0167] Создают конструкции, содержащие перечисленные выше спейсеры, фермент Naglu и направленный пептид IGF-II, и проводят их рекомбинантную экспрессию. Согласно определенным вариантам реализации указанные конструкции содержат сигнальный пептид. Примеры сигнальных пептидов включают без ограничений сигнальный пептид Haglu, содержащий аминокислоты 1-23 непроцессированного Naglu (Weber et al., Hum Mol Genet 5:771-777, 1996) или сигнальный пептид, полученный из белка внеклеточного матрикса BM-40 (Nischt et al., Eur J Biochem 200:529-536, 1991).

[0168] ДНК, кодирующую последовательность Naglu, мутеин IGF-II и спейсерный пептид, вводят в соответствующий вектор экспрессии, такой как векторы экспрессии pEE и pXC GS («Lonza Biologics», Беркшир, Великобритания) и вектор экспрессии pC3B (BioMarin, внутренний). В указанный вектор можно ввести сайт рестрикции AscI (ggcgcgcc (SEQ ID NO:570), чтобы обеспечить направленное клонирование терапевтических химерных белков, описываемых в настоящей заявке.

[0169] Примеры конструкций содержат последовательность непроцессированного Naglu (фигура 1 и фигура 2), включающего сигнальный пептид, спейсерный пептид (фигура 3) и пептид IGF-II, содержащий остатки 8-67 и включающий замену аминокислоты Ala в остатке Arg-37, R37A (фигуры 1 и 2), которая придает пептиду IGF-II устойчивость к фурину.

[0170] Последовательности разных линкеров или спейсеров, описанных в примере 1, присоединенные к Naglu и пептиду IGF-II, сначала оценивают при помощи системы временной экспрессии. Плазмиды Naglu с меткой GILT (pXC17.4, Lonza) трансфецируют в суспензию клеток CHOK1SV GS KO (Lonza). 15 мг ДНК плазмиды трансфецируют в 10⁶ клеток посредством электропорации. Среду полностью заменяют через 24 часа после трансфекции. Трансфецированные клетки засевают во флаконы с возможностью встряхивания при плотности 1,5×10⁶ клеток/мл без селекции. По мере того, как клетки растут при 30°C в течение 14 дней, определяют рост, жизнеспособность, титр и удельную продуктивность клеток.

[0171] Плазмиды Naglu с меткой GILT трансфецируют в суспензию клеток CHOK1SV (Lonza). Клетки выращивают в среде CDCHO («Invitrogen») с 6 мМ глутамина во флаконах с возможностью встряхивания при 37°C и 8% CO₂. 30 мкг линеаризованной ДНК плазмиды трансфецируют в 1×10⁷ клеток посредством электропорации. Через 48 часов после трансфекции суспензию клеток разливают в планшеты с плотностью 5000 клеток/лунку в среде CDCHO + мкМ MSX. Планшеты инкубируют при 37°C и 8% CO₂ приблизительно в течение 4-6 недель для идентификации роста клонов. Затем проводят скрининг колоний посредством анализа активности 4MU на Naglu (смотрите пример 3), колонии с максимальной экспрессией переносят в планшеты на 24 лунки в среде CDCHO + 40 мкМ MSX, а затем продолжают пересев клонов с максимальной экспрессией в планшеты на 6 лунок, затем во флаконы с возможностью встряхивания для идентификации клонов с максимальной экспрессией, чтобы получить химерные белки Naglu с меткой GILT.

[0172] Очистку проводят при помощи стандартных технологий очистки белков. Например, согласно примерному способу очистки исходное сырье надосадочной жидкости культуры клеток млекопитающих, как описано выше, размораживают после хранения при -80°C. В указанный материал добавляют NaCl, чтобы скорректировать концентрацию до 1М, после чего проводят стерильную фильтрацию через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм.

[0173] Профильтрованный материал загружают на колонку с бутилом для гидрофобного взаимодействия, заранее уравновешенную бутиловым загрузочным буфером (20 мМ Тris, 1 М NaCl, рН 7,5). Связанный материал элюируют в линейном градиенте с 10 объемами колонки, с применением бутилового буфера для десорбции (20 мМ Tris, рН 7,5). Образцы из пиков десорбции объединяют, заменяют буфер на 20 мМ Tris, рН 7,5, и загружают в анионообменную колонку Q. Затем связанный белок элюируют в линейном градиенте (10 объемов колонки) с применением элюирующего буфера Q (20 mM Tris, 1 M NaCl, pH 7,5). Затем в очищенных образцах заменяют буфер с применением центрифужных концентраторов, и проводят стерильную фильтрацию для дальнейшего хранения.

[0174] Конструирование, экспрессия, получение, очистка и преобразование в лекарственную форму примерного химерного белка Naglu: Naglu-(GGGGS)₄GGGPS-IGF-II (SEQ ID NO:568). Конструкцию ДНК, кодирующую Naglu-(GGGGS)₄GGGPS-IGF-II (SEQ ID NO:568) генерировали стандартными способами рекомбинантных ДНК. Naglu соответствует аминокислотам 1-743 непроцессированной Naglu человека, а IGF-II соответствует мутеину IGF-II, содержащему аминокислоты 8-67 зрелого IGF-II человека с аминокислотной заменой R37A, которая придает устойчивость к фурину. Клетки CHOK1SV трансфецировали указанной конструкцией ДНК, и клон, стабильно экспрессирующий химерный белок Naglu-IGF-II с меткой GILT, выделяли, как было описано выше.

[0175] Клетки, экспрессирующие Naglu-(GGGGS)₄GGGPS-IGF-II (SEQ ID NO:568), выращивали в биореакторе, и химерный белок Naglu очищали из среды для культивирования клеток следующим образом. В материале, полученном при сборе клеток, корректировали концентрацию NaCl до 1 М, затем загружали на колонку с бутилсефарозой 4 FF. Химерный белок Naglu элюировали солью с колонки с бутилсефарозой 4 FF, собирали и подвергали диализу, а затем загружали на колонку с гепарансульфатом 6 FF. Химерный белок Naglu отбирали в проточной фракции и загружали на колонку с сефарозой Q. Химерный белок Naglu элюировали солью с колонки с сефарозой Q HP, концентрировали а затем проводили более тонкую очистку посредством препаративной эксклюзионной хроматографии на Сефакриле S300.

[0176] При применении данной процедуры очистки получали химерный белок Naglu Naglu-(GGGGS)₄GGGPS-IGF-II (SEQ ID NO:568) с высокой степенью чистоты и ферментативной активностью. Из очищенного химерного белка Naglu составляли раствор 20 мг/мл в искусственном ликворе (1 мМ фосфата натрия, 148 мМ хлорида натрия, 3 мМ хлорида калия, 0,8 мМ хлорида магния, 1,4 мМ хлорида кальция, рН 7,2).

[0177] Конструирование, экспрессия, получение, очистка и преобразование в лекарственную форму примерных химерных белков Naglu. Конструкции ДНК, кодирующие Naglu-(GGGGA)₄GGGPS-IGF-II (SEQ ID NO:569), Naglu-Rigid-IGF-II (SEQ ID NO:566), Naglu-Helical-IGF-II (SEQ ID NO:567) и Naglu-XTEN-IGF-II (SEQ ID NO:565) генерировали стандартными способами рекомбинантных ДНК. Naglu соответствует аминокислотам 1-743 непроцессированной Naglu Человека, а IGF-II соответствует мутеину IGF-II, содержащему аминокислоты 8-67 зрелого IGF-II человека с аминокислотной заменой R37A, которая придает устойчивость к фурину. Примеры жестких, спиральных линкеров и линкеров XTEN описаны в примере 1. Клетки CHOK1SV трансфецировали указанными конструкциями ДНК, и клоны, стабильно экспрессирующие химерный белок Naglu-IGF-II с меткой GILT, выделяли, как было описано выше.

[0178] Клетки, экспрессирующие Naglu- IGF-II, выращивали в биореакторе. В типичных циклах выработки с подпиткой (10-16 дней), конструкции Naglu-IGF-II с разными титрами достигали титров выше 30 мг/мл при высокой жизнеспособности клеток - выше 80%.

[0179] Химерные белки Naglu очищали из среды для культивирования клеток, как было описано выше. При помощи данной процедуры очистки ферментативно активные химерные белки Naglu без метки и Naglu-IGF-II, такие как Naglu-Rigid-IGF-II (SEQ ID NO:566), Naglu-Helical-IGF-II (SEQ ID NO:567), Naglu-XTEN-IGF-II (SEQ ID NO:565) и Naglu-(GGGGA)₄GGGPS-IGF-II (SEQ ID NO:569) очищали до степени чистоты приблизительно 99%, что определяли посредством ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографии) с обращенной фазой. Очищенные Naglu без метки и химерные белки Naglu преобразовывали в раствор 20 мг/мл в искусственном CSF (1 мМ фосфата натрия, 148 мМ хлорида натрия, 3 мМ хлорида калия, 0,8 мМ хлорида магния, 1,4 мМ хлорида кальция, рН 7,2).

[0180] Предполагается, что химерные белки, описываемые в настоящей заявке, которые демонстрируют более высокий уровень рекомбинантной экспрессии активного белка и/или увеличенную ферментативную активность по сравнению с химерными белками, содержащими другой спейсерный пептид, можно применять для дальнейших экспериментов, таких как анализ активности, анализ связывания, анализ захвата и анализ активности in vivo, как более подробно описано далее.

ПРИМЕР 3 - АНАЛИЗ АКТИВНОСТИ

[0181] Для определения ферментативной активности химерных белков Naglu проводят анализ активности Naglu in vitro с применением синтетического субстрата с флуоресцентной меткой.

[0182] Материалы, применяемые при таком анализе, включают: 4-метилумбеллиферил-N-ацетил-α-D-глюкозаминид (субстрат 4-MU-NaGlu) («Calbiochem», по каталогу № 474500), приготовленный в конечной концентрации в 10% DMSO (диметилсульфоксид) в буфере для анализа (0,2 М ацетат натрия, с 1 мг/мл БСА или без него, и 0,005% Tween 20, pH 4,3-4,8), и хранимый при -80°C стоковый раствор 4-метилумбеллиферона (стандарт 4-MU) (Sigma, по каталогу № M1381) готовят в концентрации 10 мМ в DMSO и хранят при -20°С в малых аликвотах. Контроль rhNaglu-His6 (0,5 мг/мл R&D Systems, кат. № 7096-GH) разводят до концентрации 10 мкг/мл в 25 мМ Tris, 125 мМ NaCl, 0,001% Tween 20, pH 7,5 и хранят при -80°C в малых аликвотах.

[0183] В прозрачном планшете для разведения на 96 лунок («Granger») применяют 2 последовательных разведения стандартов в буфере для разведения (1×ФСБ (фосфатно-солевой буфер), с 1 мг/мл БСА (бычьего сывороточного альбумина) или без него, 0,005% Tween 20, с 200 мкМ до 1,563 мкМ плюс одна пустая проба. В прозрачном планшете для разведения пробы готовят в нескольких разведениях (в буфере для разведения), чтобы обеспечить попадание в пределы стандартной кривой.

[0184] 10 мкл стандартов (200 мкМ до 1,563 мкМ), контроля и рабочих проб переносят в черный не обработанный полистеролом планшет на 96 лунок («Costar», по каталогу № 3915). В каждую лунку добавляют 75 мкл субстрата (2 мМ), затем инкубируют в течение 30 минут при 37°C. Затем реакцию гасят путем добавления 200 мкл буфера для прекращения реакции (0,5 М глицина/NaOH, рН 10,7). Показания с планшетов считывают на Ex355 Em460 с уровнем отсечки 455 на планшетном ридере для считывания флуоресценции в планшетах на 96 лунок.

[0185] Посредством указанного анализа было показано, что химерные белки Naglu, включая GGGGS)₄GGGPS-IGF-II (SEQ ID NO:568), Naglu-(GGGGA)₄GGGPS-IGF-II (SEQ ID NO:569), Naglu-Rigid-IGF-II (SEQ ID NO:566), Naglu-Helical-IGF-II (SEQ ID NO:567) и Naglu-XTEN-IGF-II (SEQ ID NO:565), обладают ферментативной активностью in vitro, и проявляют специфическую активность в отношении синтетического субстрата 4MU-Naglu в диапазоне от приблизительно 175 000 до приблизительно 220 000 нмоль/ч/мг. Ферментативная активность химерных белков Naglu была сопоставима с активностью белка Naglu без метки (приблизительно 190 000 нмоль/ч/мг). Данные о ферментативной активности для примеров химерных белков Naglu приведены в таблице 1.

Таблица 2 Активность химерных белков Naglu Naglu¹ Линкер² Спец.акт.³ IC₅₀⁴ K_{захвата}⁵ t_1/2⁵

Naglu без метки - 190000 - - 9,7 Naglu-(GGGGS)₄GGGPS-IGF-II 36 190000 0,27 0,23 5,4 НО Naglu-(GGGGA)₄GGGPS-IGF-II 71 220000 0,36 6,3 НО Naglu-Rigid-IGF-II (жесткий) 51 190000 0,23 2,4 9,5 Naglu-Helical-IGF-II (спиральный) 55 175000 0,25 2,3 9,4 Naglu-XTEN-IGF-II 47 170000 0,24 3,7 НО

¹Naglu без метки и химерные белки Naglu были сконструированы, экспрессированы и очищены, как описано в примере 2; примеры жестких, спиральных линкеров и линкеров XTEN описаны в примере 1.

²SEQ ID NO:линкеров в химерных белках Naglu оценивали в примерах 3-5.

³Специфическая активность (нмоль/ч/мг) для белков Naglu измеряли, как описано в примере 3.

⁴IC₅₀ (половинная ингибирующая концентрация) для белков Naglu в отношении конкурентного связывания с IGF2R измеряли, как описано в примере 4.

⁵K_{захвата} и период полувыведения (t_1/2) для белков Naglu в фибробластах MPS-IIIB измеряли, как описано в примере 5.

ПРИМЕР 4 - АНАЛИЗ СВЯЗЫВАНИЯ

[0186] Анализ связывания с целью определения связывания химерных белков Naglu с рецепторами IGF-I, IGF-II и инсулина проводят в целом, как описано в Патенте США 20120213762. Если кратко, для конструкций химерных белков оценивают сродство связывания с рецептором инсулина в анализе, в котором измеряют конкурентное связывание биотинилированного инсулина и инсулина, нанесенного на планшет. Анализ связывания с рецептором инсулина проводят на основе конкуренции инсулина, IGF-II и химерного белка с биотинилированным инсулином, связывающимся с рецептором инсулина (инсулин-R).

[0187] Более конкретно, в белые планшеты Reacti-Bind наносят инсулин-R в концентрации 1 мкг/лунку (38,4 нМ). Планшеты с нанесенным рецептором инкубируют в течение ночи при комнатной температуре, затем отмывают 3 раза буфером для отмывки (300 мкл/лунку). Затем содержимое планшетов блокируют блокирующим буфером (300 мкл/лунку) в течение 1 часа. Этапы отмывки повторяют, и удаляют любые следы раствора. Биотинилированный инсулин смешивают в концентрации 20 нМ с разными концентрациями инсулина, IGF-II или химерного белка, путем последовательных разведений. 100 мкл разведенного инсулина, IGF-II или химерного белка Naglu в 20 нМ инсулина-биотина добавляют в планшеты с нанесенным рецептором, и планшеты инкубируют при комнатной температуре в течение 2 часов. Затем содержимое планшетов отмывают 3 раза буфером для отмывки. 100 мкл рабочего раствора стрептавидина-HRP (50 мкл стрептавидина-HRP в 10 мл блокирующего буфера) добавляют в планшеты, и планшеты инкубируют при комнатной температуре в течение 30 минут. Добавляют 100 мкл рабочего раствора Elisa-Pico, содержащего хемилюминесцентный субстрат Elisa-Pico, и затем измеряют хемилюминесценцию на длине волны 425 нм.

Анализ конкурентного связывания с IGF2R

[0188] Для измерения способности конструкций химерных белков Naglu к связыванию с рецептором IGF-II проводят анализ конкурентного связывания. Фрагмент IGFIIR, участвующий в связывании с IGF-II (домены 10-13, именуемые белком 1288) наносят в планшеты на 96 лунок. Биотинилированный IGF-II инкубируют с указанным рецептором в присутствии увеличенного количества конкурентов: контрольного IGF-II (небиотинилированного) либо образца химерного белка (содержащего полученную из IGF-II эпитопную метку GILT). Связавшийся с рецептором биотинилированный IGF-II детектируют при помощи стрептавидина, конъюгированного с пероксидазой хрена (HRP) и хемилюминесцентного субстрата HRP. Способность химерного белка к ингибированию связывания биотинилированного IGF-II с IGFIIR рассчитывают по кривым ингибирования и выражают как значение IC₅₀ (концентрация, требуемая для 50% ингибирования связывания).

[0189] Для указанного анализа IGFIIR наносят в белый планшет Reacti-bind («Pierce», по каталогу № 437111) в концентрации 0,5 мкг/лунку в объеме 100 мкл (69,6 нМ/лунку) в буфере для иммобилизации. Планшет запечатывают и инкубируют в течение ночи при комнатной температуре. Затем содержимое планшета отмывают и инкубируют его в течение ночи при комнатной температуре. Затем содержимое планшета промывают 3 раза буфером для промывки, блокируют блокирующим буфером, а затем повторно отмывают 3 раза буфером для отмывки (300 мкл/лунку).

[0190] Затем 8 нМ IGF-II-биотина смешивают с разными концентрациями конкурентов (IGF-II (небиотинилированный)), белок сравнения или образцы химерных белков Naglu) и добавляют в планшеты с нанесенным IGFIIR в 2-кратных последовательных разведениях.

[0191] Планшет инкубируют при комнатной температуре в течение 2 часов, затем отмывают содержимое планшета 3 раза буфером для отмывки. Готовят стрептавидин-HRP в блокирующем буфере (разведение 1:200), и добавляют в планшет в количестве 100 мкл/лунку. Активность связывания с IGF-II-биотином определяют при помощи стрептавидина HRP с применением реагентов Pico-Elisa. Если кратко, приготовленный рабочий раствор Pico-Elisa добавляют в лунки (100 мкг/лунку) и инкубируют при комнатной температуре в течение 5 минут при плавном взбалтывании, затем измеряют хемилюминесценцию на длине волны 425 нм.

[0192] IC₅₀ образцов рассчитывают на основании процента IGF-II-биотина, связавшегося при каждой концентрации ингибитора.

[0193] При применении указанного анализа конкурентного связывания с IGFIIR было показано, что примерные химерные белки Naglu, включая Naglu-(GGGGS)₄GGGPS-IGF-II (SEQ ID NO:568), Naglu-(GGGGA)₄GGGPS-IGF-II (SEQ ID NO:569), Naglu-Rigid-IGF-II (SEQ ID NO:566), Naglu-Helical-IGF-II (SEQ ID NO:567) и Naglu-XTEN-IGF-II (SEQ ID NO:565), демонстрируют значение IC₅₀ 0,23-0,36 нМ. Белок Naglu без метки не демонстрировал определимого связывания в данном анализе. Данные о конкурентном связывании с IGF2R для примерных химерных белков Naglu приведены в таблице 1.

ПРИМЕР 5 - АНАЛИЗ ЗАХВАТА

[0194] Чтобы измерить способность фермента для борьбы с лизосомальными болезнями накопления поступать в клетки по пути рецептор-опосредуемого эндоцитоза, проводят анализ захвата, который позволяет измерить захват при помощи рецептора CI-MRP в миобластах крыс L6 или в фибробластах человека с MPS IIIB. Чтобы определить сайт связывания с рецептором CI-MPR, в качестве ингибитора применяют манноза-6-фосфат (M6P) и IGF-II. Собирают данные и создают кривую насыщения для захвата фермента, и определяют кинетический параметр K_{захвата}, для данного процесса.

[0195] Перед анализом захвата (за 24 часа) клетки L6 (миобласты крысы L6, ATCC№ CRL-1458) или фибробласты человека с MPS IIIB высевают в планшеты с плотностью 1х10⁵ клеток на лунку в планшеты на 24 лунки (VWR № 62406-183) и доливают по 0,5 мл на лунку. Утром дня проведения анализа фермент смешивают со средой для анализа захвата (1 л DMEM, 1,5 г бикарбоната натрия, 0,5 г бычьего сывороточного альбумина, 20 мл L-глутамина (20 мМ («Gibco» № 25030-081)), 20 мл 1М HEPES ((«Gibco» №1563080) (конечная концентрация 20 мМ), рН 7,2) в вытяжном шкафу с ламинарным потоком воздуха. Количества фермента могут варьировать в диапазоне 2-500 нМ. Конечный объем среды для анализа захвата + фермента составляет 0,5 мл на лунку. M6P (конечная концентрация 5 мМ) и/или IGF-II (конечная концентрация 2,4 мкМ или 18 мкг/мл) добавляют к соответствующим образцам. Для ингибирования захвата добавляют 18 мкл стокового раствора IGF-II (1 мг/мл, 133,9 мкМ) на 1 мл среды для анализа захвата.

[0196] Клетки освобождают от среды для культивирования клеток путем аспирации и в каждую лунку добавляют 0,450 мл фермента в буфере для анализа захвата. Отмечают время и возвращают клетки в инкубатор на 18 часов. Вынимают планшет из инкубатора, и клетки освобождают от буфера для анализа захвата путем аспирации. Проводят отмывку содержимого планшетов 4 раза путем добавления 0,5 мл ФСБ Дульбекко и его отсасывания. В планшеты добавляют 200 мкл лизирующего буфера CelLytic M («Sigma») и взбалтывают при комнатной температуре в течение 20-30 минут. Клетки освобождают от лизата и хранят в закрытых эластичной лентой прозрачных планшетах на 96 лунок (VWR) при -80°С до проведения анализа.

[0197] Для анализа ферментативной активности 5 мкл каждого лизата добавляют в двух экземплярах путем добавления к 15 мкл реакционной смеси ферментов (например, пробы Naglu+4MU) в черном планшете на 96 лунок (VWR) (смотрите выше) и в каждом лизате определяют фермент/единиц/мл/ч.

[0198] Для анализа белка в лизате 10 мкл каждого лизата в двойном экземпляре анализируют с применением набора для определения белков Pierce BCA в соответствии с инструкциями производителя. Для измерения поглощения, поглощение считывают на длине волны 562 нм на планшетном ридере (планшетный ридер BMG FluoStar Optima), и определяют концентрацию в мкг/мл.

[0199] Для каждой загрузки фермента захват определяют как активность фермента/мг лизата. Чтобы определить захват, единицы фермента/мл делят на содержание белка в мкг/мл и умножают на 1000 (вычитая захват, измеренный в пустой пробе). Результаты анализа с ингибиторами и без них сравнивают и определяют специфичность рецепторного захвата.

[0200] Для построения кривых насыщения применяют 10 концентраций загрузки фермента в диапазоне 0,2-100 нМ и генерируют кривую насыщения с применением анализа, описанного выше.

[0201] При помощи указанного анализа было показано, что примерный химерный белок Naglu - Naglu-(GGGGS)₄GGGPS-IGF-II (SEQ ID NO:568) демонстрирует K_{захвата} 7-9 нМ в фибробластах MPS-IIIB.

[0202] В качестве альтернативы перед проведением анализа захвата (за 24 часа) клетки L6 или фибробласты человека с MPS IIIB высевают в планшеты с плотностью 1х10⁵ клеток на 0,5 мл на лунку в планшеты на 24 лунки. Образцы ферментов в концентрации 1,6-50 нМ готовят в среде для анализа захвата: 1 л DMEM, 1,5 г бикарбоната натрия, 0,5 г бычьего сывороточного альбумина, 20 мл 200 мМ L-глутамина и 20 мл 1М HEPES, рН 7,2. Для ингибирования захвата к соответствующим образцам добавляют M6P (до конечной концентрации 5,0 мМ) и/или IGF-II (до конечной концентрации).

[0203] Среду для культивирования клеток отсасывают, оставляя клетки, и заменяют ее на 0,5 мл препарата фермента в буфере для анализа захвата на лунку. После инкубации в течение 4 часов планшеты промывают 2 раза 0,5 мл ФСБ Дульбекко. В планшеты добавляют 100 мкл лизирующего буфера M-REP («Pierce») и взбалтывают при комнатной температуре в течение 10 минут. Лизат хранят при -80°C до проведения анализа.

[0204] Для анализа ферментативной активности 10 мкл каждого лизата добавляют в двух экземплярах в черный планшет на 96 лунок (VWR) (смотрите выше).

[0205] Для анализа белка в лизате 10 мкл каждого лизата в двойном экземпляре анализируют с применением набора для определения белков Pierce BCA в соответствии с инструкциями производителя. Поглощение считывают на длине волны 562 нм на планшетном ридере (планшетный ридер BMG FluoStar Optima), и определяют концентрацию в мкг/мл, применяя в качестве стандарта BSA.

[0206] Для каждой загрузки фермента захват выражают в ммолях 4-MU, высвободившегося за 30 минут. Для построения кривых насыщения применяют концентрации в диапазоне 1,6-50 нМ и генерируют кривую насыщения с применением анализа, описанного выше.

[0207] Стабильность химерных белков Naglu в клетках определяли путем мониторинга внутриклеточной активности Naglu за период приблизительно 8 дней. Фибробласты человека с MPS IIIB, засеянные в планшеты при плотности 1х10⁵ клеток на лунку в планшетах на 24 лунки (VWR №62406-183), обрабатывали химерным белком Naglu в конечной концентрации 20 нМ в течение 4 часов. После инкубации в течение 4 часов клетки переводили на среду для культивирования клеток без химерного белка Naglu. В каждый из моментов времени (4 часа, 28 часов, 4 дня, 6 дней и 8 дней) клетки лизировали в 100 мкл лизирующего буфера M-PER (Pierce) при комнатной температуре в течение 10 минут, и проводили анализ на ферментативную активность с применением меченного 4-MU субстрата. Снижение активности Naglu за 8-дневный период можно аппроксимировать кинетикой первого порядка, чтобы извлечь приблизительный период полувыведения из клетки.

[0208] При помощи указанного анализа было показано, что примерные химерные белки Naglu, включая Naglu-(GGGGS)₄GGGPS-IGF-II (SEQ ID NO:568), Naglu-(GGGGA)₄GGGPS-IGF-II (SEQ ID NO:569), Naglu-Rigid-IGF-II (SEQ ID NO:566), Naglu-Helical-IGF-II (SEQ ID NO:567) и Naglu-XTEN-IGF-II (SEQ ID NO:565), интернализуются в фибробласты MPS IIIB с K_{захвата} приблизительно 2,3-6,3 нМ. Белок Naglu без метки, напротив, не захватывался клетками в данных экспериментальных условиях. Кроме того, наблюдаемый захват химерного белка Naglu ингибировался IGF-II, но не M6P. Было показано, что после захвата примерные химерные белки были стабильны и демонстрировали период полувыведения приблизительно 9,5 дней, оцениваемый по ферментативной активности (субстрат 4-MU) в лизатах клеток. Данные о захвате и периоде полувыведения для примерных химерных белков Naglu приведены в таблице 1.

ПРИМЕР 6 - АКТИВНОСТЬ ХИМЕРНОГО БЕЛКА NAGLU IN VIVO

[0209] Чтобы определить активность химерных белков Naglu in vivo, указанные химерные белки вводили животным с нокаутными генами Naglu (смотрите Li et al., Proc Natl Acad Sci USA 96:14505-510, 1999). Животные-нокауты по Naglu демонстрируют большое количество гепарансульфата в головном мозге, печени и почках, повышение активности бета-гексаминидазы и окрашивание по лизосомально-ассоциированному мембранному белку 2 (LAMP-2), а также повышение уровня ганглиозидов в головном мозге.

[0210] Активность и биораспределение экзогенного фермента определяют после 4 инъекций ICV (в желудочки головного мозга) рекомбинантного Naglu-IGF2 человека (rh) за период две недели (100 мкг/инъекцию). Мышам устанавливают постоянный катетер (n=12/группу, начальный возраст 8-12 недель) и корректируют группы с учетом мышей, у которых катетер не находится в желудочке головного мозга. Измерения конечных точек включают биораспределение Naglu, снижение уровня GAG, например, гепарансульфата, накопление материала в лизосомах клеток мозга и активацию астроцитов и микроглии. Уровень разных лизосомальных или нейрональных биомаркеров (Ohmi et al., PLoS One 6:e27461, 2011) измеряют у получавшей препарат и контрольной группы, и указанные маркеры включают без ограничений лизосомально-ассоциированный мембранный белок 1 (LAMP-1), LAMP-2, глипикан 5, Naglu-специфические невосстанавливающие концы (NRE) гепарансульфата, ганлиозиды, холестерин, субъедининца c митохондриальной АТФ-синтазы (SCMAS), убиквинтин, P-GSK3 бета, бета-амилоид, P-тау (фосфорилированный-Tau), GFAP (активация астроцитов) и CD68 (активация митохондрий).

[0211] На мышах, получивших 4 инъекции rhNaglu-IGF2 ICV за двухнедельный период (n=12/группу, начальный возраст 5 месяцев, 100 мкг/инъекцию), проводили дополнительные эксперименты по определению выживания и анализу поведения. Конечные точки для измерения включали время выживания, активность в открытом поле, биораспределение Naglu, снижение уровня GAG, гепарансульфата, накопление в лизосомах, уровень лизосомальных или нейрональных биомаркеров, таких как LAMP-1, LAMP-2, глипикан 5, ганглиозиды, холестерин, SCMAS, убиквинтин, P-GSK3 бета, бета-амилоид, P-тау, GFAP и CD68.

[0212] Были воспроизведены мыши с нокаутом гена Naglu (Naglu -/-) на основе мутации в 6-ом экзоне гена naglu (Li et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 96:14505-10, 1999). Сайт в 6-ом экзоне был выбран потому, что это сайт многих мутаций у человека. У гомозиготных мышей активности Naglu не выявлена а у гетерозигот активность Naglu была снижена. Мыши Naglu -/- демонстрировали сокращенное время выживания (6-12 месяцев), и у них могут быть другие функциональные фенотипы, такие как сниженный уровень активности. Анализируют эффекты химерных белков Naglu на мышей Naglu -/-.

[0213] Мышам Naglu -/- (n=8) и 8 контрольным мышам Naglu -/- (n=8 однопометных гетерозигот) вводили 4 дозы NCV путем (100 мкг Naglu-IGF2/дозу) за период 2 недели. В день -2 мышей анестезировали и вводили катетер в левый латеральный желудочек головного мозга. Мышам давали восстановиться. В дни 1, 5, 10 и 14 мышей анестезировали (бенедрил, 5 мг/кг в/б) за 15 минут до ICV введения дозы. Проводили инфузию дозы через катетер ICV в объеме 5 мкл в течение 15 минут, и мышам давали восстановиться. На 15-ый день мышей умерщвляли, выпускали кровь, а сыворотку замораживали. Изымали головной мозг, и в катетер вводили ИК краситель, затем катетер визуализировали.

[0214] Для определения эффектов химерных белков Naglu проводили следующий анализ: оценка массы тела, визуализация катетера в ближнем инфракрасном диапазоне для оценки его положения, оценка уровня Naglu-IGF2, GFAP, LAMP-1 и LAMP-2 в головном мозге при помощи иммуногистохимии, биохимический анализ активности Naglu, уровень и активность β-гексосаминадазы, анализ SensiPro для определения невосстанавливающих концов накопленных аминогликозидов (GAG), специфичных для мукополисахаридоза IIIb (MPS-IIIb) (WO 2010/078511A2), уровень ганглиозидов GM3, измеряемый путем биохимического анализа, а также иммунное окрашивание на SCMAS, А-бета, глипикан 5, CD68, GFAP и Naglu в медиальной энторинальной области коры (Li et al., supra).

[0215] Ожидается, что эффективное лечение NNNaglu-IGF2 должно приводить к снижению уровня LAMP-1, LAMP-2, GFAP, CD68, SCMAS, A-бета, глипикана 5, β-гексозаминадазы, ганглиозида GM3 и MPS-IIIb-специфичных GAG.

[0216] Эффективность примерных химерных белков Naglu in vivo в модели MPS IIIb на мышах. Мышам Naglu -/- (n=8) вводили ICV четыре дозы (100 мкг/мл) химерного белка Naglu-IGF-II - либо Naglu-(GGGGS)₄GGGPS-IGF-II (SEQ ID NO:568) либо Naglu-Rigid-IGF-II (SEQ ID NO:566) за период 2 недели. Мышам Naglu -/- (n=8) и восьми однопометным гетерозиготам дикого типа (n=8) в качестве контроля вводили только носитель. В день -5 мышей анестезировали; левый латеральный желудочек головного мозга катетеризовали. Мышам давали восстановиться. В дни 1, 5, 10 и 14 мышей анестезировали путем ингаляционного введения изофлурана. Каждой мыши за 15 минут до ICV введения препарата вводили бенадрил (5 мг/кг в/б), чтобы снизить любое потенциальное выделение гистамина в ответ на лечение Naglu-IGF-II. Дозы препарата вводили ICV в форме инфузии через имплантированный катетер, в объеме 5 мкл в течение 15-20 минут, и мышам давали восстановиться. Через 1, 7, 14 и 28 дней после введения последней дозы мышей умерщвляли. Головной мозг изымали и делили сагитально на 5 срезов для проведения анализа разных типов.

[0217] Для определения эффектов химерных белков Naglu-IGF-II проводили следующий анализ: иммуногистохимическая оценка уровня Naglu, LAMP-2, GFAP и CD68 в головном мозге, биохимический анализ активности Naglu и β-гексозаминадазы, анализ SensiPro (Deakin et al., Glycobiology 18:483, 2008; Lawrence et al., Nat Chem Biol. 8:197, 2012; Lawrence et al., J Biol Chem. 283:33674, 2008) для определения общего содержания гепарансульфата и NRE гепарансульфата, специфичных для мукополисахаридоза IIIb (MPS-IIIb) (WO 2010/078511A2) и иммунное окрашивание на SCMAS, бета-амилоид (А-бета), p-тау, P-GSK3-бета, глипикан 5GFAP и CD68 в медиальной энторинальной области коры (Li et al., supra).

[0218] При оценке через 24 часа после введения последней дозы препарата лечение химерными беклами Naglu-(GGGGS)₄GGGPS-IGF-II (SEQ ID NO:568) или Naglu-Rigid-IGF-II (SEQ ID NO:566) приводило к значимому увеличению активности фермента Naglu, с сопутствующим снижением активности бета-гексоаминадазы и уровня общего гепарансульфата, Naglu-специфичных NRE гепарансульфата и LAMP-2. Фермент Naglu легко определяли в тканях головного мозга, не только в коре, гиппокампе, зубчатой извилине и таламусе, но также и в отдаленных дистальных положениях, включая миндалину, периферическую кору и гипоталамус. Также в мозге мышей Naglu-/- при лечении Naglu-IGF-II наблюдали снижение уровня CD68, SCMAS, бета-амилоида (А-бета), p-тау, P-GSK3-бета и глипикана 5. Окрашивание на GFAP не изменялось через 24 часа после последней дозы. Иммуногистохимия продемонстрировала наличие фермента Naglu во многих областях головного мозга, внутри нейронов и гликальных клеток, в колокализации с LAMP-2.

[0219] Уровень гепарансульфата, Naglu-специфичных NRE и активность бета-гексозаминадазы продолжали снижаться через 7, 14 и 28 дней после введения последней дозы. Через 28 дней все анализируемые показатели приблизились к нормальным значениям у контрольных мышей.

ЭКВИВАЛЕНТЫ

[0220] Специалисты в данной области техники должны понимать, или должны быть способны удостовериться при помощи не более чем стандартных экспериментов, что существует множество эквивалентов специфических вариантов реализации изобретения, описанного в настоящей заявке. Предполагается, что область настоящего изобретения не должна ограничиваться приведенным выше описанием, но скорее описана в прилагаемой формуле изобретения. Определенные и неопределенные артикли в настоящей заявке, применяемые в описании и формуле изобретения, если в явном виде не указано обратное, должны подразумевать включение множественного числа. Пункты формулы изобретения или описание, где между одним или более членами группы присутствует союз «или» считаются выполненными, если один, более одного или все члены группы присутствуют, подразумеваются или иным образом имеют значение для указанного продукта или процесса, если в контексте не указано или из него не следует противоположное. Настоящее изобретение включает варианты реализации, в которых присутствует, подразумевается или иным образом имеет значение для конкретного продукта или процесса именно один член группы. Также изобретение включает варианты реализации, в которых присутствуют, подразумеваются или иным образом имеют значение для конкретного продукта или процесса более одного или все члены группы. Кроме того, следует понимать, что изобретение включает вариации, сочетания и перестановки, в которых одно или более ограничений, элементов, условий, описательных терминов и т.д. из одного или более пунктов формулы изобретения вводятся в другой пункт, зависящий от того же основного пункта (или, если применимо, любого другого пункта), ели не указано другое, или если специалисту в данной области техники не очевидно, что может возникнуть противоречие или несоответствие. Там, где элементы представлены в виде перечня, например, в группах Маркуша или сходной форме, следует понимать, что также раскрывается каждая подгруппа элементов, и любой элемент(ы) могут быть из группы удалены. Следует понимать, что, как правило, в тех случаях, где аспекты изобретения называют как содержащие конкретные элементы, признаки и т.д, определенные варианты реализации или аспекты изобретения состоят или состоят по существу из таких элементов, признаков и т.д. В целях простоты такие варианты изобретения не были в каждом случае специально описаны в настоящей заявке. Следует понимать, что любой вариант реализации настоящего изобретения, например, любой вариант реализации, обнаруживаемый в предыдущем уровне техники, может быть однозначно исключен из формулы изобретения, независимо от того, было ли такое специфическое исключение перечислено в спецификации.

[0221] Также следует понимать что, если не было явно указано противоположное, в любых способах, заявленных в настоящей заявке, которые включают более одного действия, порядок действий способа не обязательно ограничивается порядком, в котором перечислены действия в данном способе, а изобретение включает варианты реализации, в которых порядок действий ограничен таким образом. Кроме того, там, где в пунктах формулы изобретения упоминается композиция, изобретение включает способы применения композиции и способы получения композиции. Там, где в пунктах формулы изобретения упоминается композиция, следует понимать, что, изобретение включает способы применения композиции и способы получения композиции.

[0222] Все публикации и патентная документация, процитированные в настоящей заявке, включены в нее посредством ссылки на их полную версию в той же степени, как если бы в заявку было включено содержание каждой отдельной публикации или патентного документа.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к терапевтическим химерным белкам, которые можно применять в медицине для лечения мукополисахаридоза IIIB типа (Синдром Санфилиппо В). Химерный белок содержит (a) альфа-N-ацетилглюкозаминидазу (Naglu) человека, (b) мутеин IGF-II с мутацией, упраздняющей по меньшей мере один сайт расщепления протеазой фурином в указанном мутеине IGF-II, и (c) спейсерный пептид между указанным лизосомальным ферментом и указанным мутеином IGF-II. Спейсерный пептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS, GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP, GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP, GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP и GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS. Изобретение позволяет эффективно снижать уровни гликозаминогликанов в лечении мукополисахаридоза IIIB типа (Синдромом Санфилиппо В). 7 н. и 13 з.п. ф-лы, 3 ил., 2 табл., 6 пр.

1. Химерный белок для снижения уровней гликозаминогликанов в лечении мукополисахаридоза IIIB типа (Синдромом Санфилиппо В) у субъекта, содержащий (a) альфа-N-ацетилглюкозаминидазу (Naglu) человека, содержащую аминокислоты 1-743 или 24-743 SEQ ID NO:1, (b) мутеин IGF-II, содержащий аминокислоты 8-67 SEQ ID NO:5, где указанный мутеин IGF-II содержит мутацию в области, соответствующей аминокислотам 30-40 SEQ ID NO: 5, так что указанная мутация упраздняет по меньшей мере один сайт расщепления протеазой фурином в указанном мутеине IGF-II, и (c) спейсерный пептид между указанным лизосомальным ферментом и указанным мутеином IGF-II, где указанный спейсерный пептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из

GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 36),

GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP (SEQ ID NO: 47),

GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 51),

GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEQ ID NO: 55) и

GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 71).

2. Химерный белок по п.1, где указанный спейсерный пептид содержит аминокислотную последовательность GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 36).

3. Химерный белок по п.1, где указанный спейсерный пептид содержит аминокислотную последовательность GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP (SEQ ID NO: 47).

4. Химерный белок по п.1, где указанный спейсерный пептид содержит аминокислотную последовательность GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 51).

5. Химерный белок по п.1, где указанный спейсерный пептид содержит аминокислотную последовательность GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEQ ID NO: 55).

6. Химерный белок по п.1, где указанный спейсерный пептид содержит аминокислотную последовательность GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 71).

7. Химерный белок по п.1, где указанный мутеин IGF-II содержит мутацию по одному или обоим из остатка Arg37 или остатка Arg40.

8. Химерный белок по п.7, где указанная мутация представляет собой замену аргинина на аланин.

9. Химерный белок по п.1, где указанный мутеин IGF-II содержит мутацию, которая состоит в делеции аминокислот 30-40 SEQ ID NO: 5.

10. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая химерный белок по любому из пп.1-9.

11. Экспрессионный вектор, включающий молекулу нуклеиновой кислоты по п.10.

12. Клетка для получения химерного белка по любому из пп.1-9, содержащая экспрессионный вектор по п.11, где указанная клетка не является человеческой эмбриональной клеткой.

13. Способ получения химерного белка, включающий этап культивирования клетки по п.12 в условиях, которые делают возможной экспрессию указанного химерного белка.

14. Фармацевтическая композиция для применения в лечении мукополисахаридоза IIIB типа (Синдрома Санфилиппо В), содержащая эффективное количество химерного белка, содержащего: (a) белок альфа-N-ацетилглюкозаминидазу (Naglu) человека, содержащую аминокислоты 1-743 или 24-743 SEQ ID NO:1, (b) мутеин IGF-II, содержащую аминокислоты 8-67 SEQ ID NO:5, где указанный мутеин IGF-II содержит мутацию в области, соответствующей аминокислотам 30-40 SEQ ID NO: 5, так что указанная мутация упраздняет по меньшей мере один сайт расщепления протеазой фурином в указанном мутеине IGF-II, и (c) спейсерный пептид между аминокислотной последовательностью указанного белка Naglu и указанным мутеином IGF-II, где указанный спейсерный пептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из

GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 36),

GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP (SEQ ID NO: 47),

GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 51),

GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEQ ID NO: 55) и

GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 71), и

фармацевтически приемлемый носитель, растворитель или эксципиент.

15. Фармацевтическая композиция для снижения уровня гликозаминогликанов in vivo у субъекта, страдающего мукополисахаридозом IIIB типа (Синдромом Санфилиппо В), содержащая эффективное количество химерного белка, содержащего: (a) альфа-N-ацетилглюкозаминидазу (Naglu) человека, содержащую аминокислоты 1-743 или 24-743 SEQ ID NO:1, (b) мутеин IGF-II, содержащий аминокислоты 8-67 SEQ ID NO:5, где указанный мутеин IGF-II содержит мутацию в области, соответствующей аминокислотам 30-40 SEQ ID NO: 5, так что указанная мутация упраздняет по меньшей мере один сайт расщепления протеазой фурином в указанном мутеине IGF-II, и (c) спейсерный пептид между аминокислотной последовательностью указанного Naglu и указанного мутеина IGF-II, где указанный спейсерный пептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из

GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 36),

GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP (SEQ ID NO: 47),

GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 51),

GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEQ ID NO: 55) и

GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 71), и

фармацевтически приемлемый носитель, растворитель или эксципиент.

16. Фармацевтическая композиция по п.14 или 15, где указанный мутеин IGF-II содержит мутацию в одном или обоих из остатка Arg37 или остатка Arg40.

17. Фармацевтическая композиция по п.16, где указанная мутация представляет собой замену аргинина на аланин.

18. Фармацевтическая композиция по п.14 или 15, где указанный мутеин IGF-II содержит мутацию, которая состоит в делеции аминокислот 30-40 SEQ ID NO: 5.

19. Фармацевтическая композиция по п.14 или 15, где указанную фармацевтическую композицию вводят интратекально.

20. Фармацевтическая композиция по п.19, где указанное интратекальное введение включает введение указанного химерного белка в желудочек головного мозга, поясничную область или мозжечково-мозговую цистерну.