КОМПОЗИЦИИ И ПРИМЕНЕНИЕ ПРОТИВОМИКРОБНЫХ МАТЕРИАЛОВ СО СВОЙСТВАМИ БИОЛОГИЧЕСКОЙ СОВМЕСТИМОСТИ Российский патент 2019 года по МПК A61K9/08 A61K38/16 A61K47/30 A61P31/04 

ВКЛЮЧЕНИЕ ЛЮБЫХ ПРИОРИТЕТНЫХ ЗАЯВОК ПОСРЕДСТВОМ ССЫЛКИ

[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет па основании предварительной заявки на патент США №61/615150, поданной 23 марта 2012 г, предварительной заявки на патент США №61/625757, поданной 18 апреля 2012 г, предварительной заявки на патент США №61/625760, поданной 18 апреля 2012 г и предварительной заявки на патент США №61/716242, поданной 19 октября 2012 г, содержание которых полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0002] Инфекции возникают при повреждении барьеров. Хирургия, травмы и ожоги, применение медицинских технических средств (например, катетеризация, вентиляция), хронические раны (например, диабетические язвы стопы) и различные заболевания нарушают наши естественные защитные барьеры. Почти во всех случаях в эти “раны” попадают микробы. При этом раневая область обеспечивает отличные условия для роста микробов. Начинается борьба, и это позиционная война. Поврежденные ткани («трещины и щели”), измененный кровоток и появление экссудата, изменения местной температуры, pH и оксигенация тканей, а также отсутствие синантропных бактерий, все это может иметь значение. Кроме того, кровотечение и просачивание жидкости через стенки сосудов могут обеспечить наличие жидкостей и питательных веществ, что в конечном итоге способствует росту микроорганизмов. Может возникнуть бактериальная или грибковая колонизация и/или острая инфекция. Микробные биопленки могут помочь микробам создать их собственные местные условия. Различные хирургические операции, травмы и медицинские манипуляции включают нарушение наших естественных защитных барьеров и заслуживают особого внимания, так как исход может варьироваться от быстрого излечения до летального сепсиса.

[0003] Естественные барьеры, как правило, именуют по их анатомическим областям, таким как кожа, легочный эпителий, слизистая оболочка ЖКТ и т.д. Эти названия предполагают несколько упрощенный подход, что не всегда является оправданным. Эти барьеры часто являются как пассивными, так и активными. Они могут включать разнообразие клеток, секретируемых гликопротеинов, матричных компонентов и жидкостей, которые действуют совместно, чтобы обеспечить эффективную защиту от микробной инвазии. В некоторых областях резидентные микробы способствуют барьерному действию против других потенциальных захватчиков. В большинстве случаев, эти физические и функциональные барьеры очень эффективны. Тем не менее, они могут быть довольно легко повреждены посредством механических или химических факторов. Кроме того, некоторые системные заболевания могут ослабить наши естественные барьеры и увеличить риск повреждения, как это происходит в случаях диабетических язв стопы или кистозного фиброза. Наконец, первая инфекция может ослабить защитные силы организма против второй инфекции, как это происходит в случае гриппа с последующей бактериальной пневмонией, или в случае влагалищной трихомонады с последующими некоторыми венерическими заболеваниями (например, ВИЧ).

[0004] Поврежденные защитные барьеры делают организм восприимчивым к инфицированию широким спектром микроорганизмов, от обычных безобидных синантропных организмов до агрессивных патогенов. Как правило, мы сами являемся источником микробов, которые загрязняют наши раны. Организм человека является носителем очень большого количества бактерий, преимущественно на коже, в полости рта и на протяжении желудочно-кишечного тракта. Было установлено, что в одном организме человека бактериальных клеток больше (10¹⁴), чем клеток, относящихся к млекопитающим (10¹³). Несмотря на эти тесные взаимоотношения с микробами, большинство наших тканей (в том числе кровь, подкожная клетчатка, мышцы, мозг) остаются стерильными до разрушения естественных барьеров. Также важны другие люди и источники микробов из окружающей среды, особенно в медицинских учреждениях. После того, как барьер поврежден, может возникнуть микробное загрязнение, критический уровень колонизации, образование биопленки и/или острая инфекция. Полимикробная колонизация и/или инфекция распространена в определенных условиях (например, в случаях диабетических язв стопы, сложных внутрибрюшных инфекциях) и может включать аэробов, анаэробов или и тех, и других.

[0005] Предшествующие подходы к профилактике и лечению этих инфекций показали существенные недостатки. Проблемами являлись отсутствие эффективности и токсичность по отношению к тканям. Противомикробные средства часто не могут достигнуть нужного участка ткани и/или оставаться активными в течение времени, достаточного для профилактики или лечения инфекции. Сложные поверхности, такие как поверхности в брюшной полости или большие ожоги, особенно трудно покрыть эффективно. Наконец, безопасное применение достаточного количества противомикробных материалов на некоторых участках тканей (например, с помощью лапароскопического или артроскопического оборудования) может оказаться непростой задачей. Противомикробные средства, которые легко применимы посредством этих способов, как правило, обычно являются материалами на основе растворов с ограниченной способностью связываться с тканями и оставаться активными в течение долгого времени.

[0006] Особую проблему представляют биопленки. Все большее количество данных указывает на устойчивость бактериальных биопленок к различным противомикробным подходам и на их роль в неблагоприятных исходах для пациента. Эти микробные сообщества противостоят традиционным антисептикам и антибиотикам посредством нескольких механизмов, в том числе, но не ограничиваясь ими, посредством продуцирования ими собственных внеклеточных полимерных веществ, которые часто являются отрицательно заряженными (анионными). Проникновение традиционных противомикробных препаратов через эти материалы часто ограничено. Например, в острых ранах (например при хирургическом вмешательстве и травме), нежизнеспособные ткани и инородные тела (например, протезные имплантаты) могут поддерживать образование биопленки и тем самым увеличивать вероятность острой инфекции. В хронических ранах (например в случае диабетических язв стопы), биопленки могут выживать и приводить к задержке заживления ран. Медицинские инструменты, такие как вентиляторы и катетеры, могут быть областью образования биопленки и служить источником инфекции.

[0007] Противомикробное лечение ранних стадий инфекций может изменить течение инфекции, приводя к более устойчивым и более опасным инфекциям. Общепринятые противомикробные стратегии нацелены на применение селективных антибиотиков (например, пенициллина для грамположительных микроорганизмов) для того, чтобы избежать развития бактерий, устойчивых к антибиотикам широкого спектра действия. Непреднамеренно это важная стратегия может иметь негативные последствия для конкретного пациента, где целевые антибиотики приводят к появлению других агрессивных микроорганизмов (например, Pseudomonas). Таким образом, санированные раны могут стать областью для “парада патогенов”, где ранние доминирующие виды микроорганизмов (например, золотистый стафилококк) заменяются вторыми (например, MRSA, метициллин-устойчивым золотистым стафилококком) и, возможно, даже третьими и четвертыми видами микроорганизмов (например, грамотри нательным и видами с множественной устойчивостью к лекарствам).

[0008] Наличие большого количества неблагоприятных исходов для пациентов в современных передовых медицинских учреждениях подчеркивает недостаточность существующих в уровне техники мер в области профилактики и лечения этих инфекций. Следует упомянуть несколько ключевых недостатков, которые включают:

[0009] 1. Низкую противомикробную активность в окружении тканей и на биопленках;

[0010] 2. Недостаточное распространение в необходимой области ткани;

[0011] 3. Ограниченную барьерную активность, если таковая имеется;

[0012] 4. Узкая область противомикробной активности делает возможным «парад патогенов”;

[0013] 5. Неподходящее лечение способствует большей противомикробной устойчивости; и/или

[0014] 6. Токсичность по отношению к тканям.

[0015] Инфицирование ран и других участков, окружающих поврежденный барьер, являются распространенными и дорогостоящими в лечении. В одних только США в отделениях неотложной помощи каждый год лечат приблизительно 12 миллионов травматических повреждений. Кроме того, проводят более 50 миллионов операций (амбулаторных и стационарных). Министерство здравоохранения и социальных служб США заявляет о более 1,7 миллионах случаев госпитальных инфекций ежегодно, результатом которых является приблизительно 100000 смертей и 30 миллиардов долларов расходов на здравоохранение в год. Многие из этих госпитальных инфекций начинаются с поврежденных барьеров. Примеры включают хирургические инфекции (инфекции послеоперационной раны), катетер-ассоциированные инфекции мочевыводящих путей и пневмонию, ассоциированную с вентиляцией легких. Хронические раны, сопутствующие ранам, возникшим в результате давления (пролежни), и диабетическим язвам стопы представляют отдельную уникальную проблему.

[0016] В дополнение к инфекциям, серьезными проблемами остаются некоторые другие последствия, связанные с ранами. Они включают потерю крови, спайки/рубцы тканей и плохое заживление ран. И в некоторых случаях доступное противомикробное лечение ухудшает эти проблемы. Некоторые виды противомикробной обработки ран (в том числе промывание антибиотиками) могут привести к чрезмерной реакции тканей (например, спайкам тканей или рубцам). Некоторые антисептические/противомикробные вещества могут изменять заживление ран, приводя к недостаточной реакции тканей (например, плохое заживление раны, плохая прочность раны).

[0017] Существенной проблемой также остается эффективный гемостаз в ранах. Гемостатические материалы были описаны и используются в различных случаях, в том числе при травмах и в хирургии. Будучи эффективными в некоторых ситуациях, эти материалы не обеспечивают идеального решения проблем. Во-первых, существует период, когда гемостаз является недостаточным и возникает слишком сильное кровотечение, возможно, с летальными последствиями. В некоторых из этих случаев происходит начальный гемостаз, однако, возникает последующее повторное кровотечение. Это может быть связано с фибринолитической активностью. В дополнение к проблемам в результате кровопотери, внесосудистые компоненты крови в тканях могут способствовать дополнительным случаям неблагоприятных исходов, в том числе инфекциям и фиброзным реакциям, наблюдаемым при послеоперационных спайках тканей. Во-вторых, в некоторых случаях, гемостатические материалы вызывают проблемы, попадая в поток крови и вызывая свертывание (тромбоз) в кровеносных сосудах, возможно, с летальным исходом. В-третьих, в некоторых случаях материалы для обработки ран (включая гемостатические материалы) могут служить в качестве областей для последующей инфекции или могут привести к аномальным реакциям тканей, таким как спайки тканей и/или рубцы, приводя к неблагоприятным медицинским последствиям. Необходимы усовершенствованные подходы к гемостазу.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0018] Согласно вариантам реализации изобретения, смесь противомикробного катионного полипептида и второго фармацевтически приемлемого полимера применяют для лечения и профилактики инфекций, которые возникают, когда наши естественные защитные барьеры повреждены. Эти новые композиции могут обеспечить две функции: прямую противомикробную активность и барьерную активность. Варианты реализации настоящего изобретения направлены на устранение одного или нескольких описанных выше недостатков ранее существовавших противомикробных препаратов. Причем было принято во внимание, что эффективность большинства предыдущих антисептиков и антибиотиков была основана на определении противомикробной активности в растворе с микробной суспензией (определение МИК - минимальной ингибирующей концентрации), полученные результаты которого не обязательно отражают эффективность в тканях, и, таким образом, могут помешать определению эффективности в тканях. В отличие от этого, авторы настоящего изобретения сосредоточились на разработке и выборе агентов с широким спектром противомикробной активности, особенно на поверхностях тканей и в области ран (“трещины и щели”). Это включает формирование барьера, содержащего катионные (положительно заряженные) элементы, которые могут ингибировать передвижение определенных веществ или клеток, которые имеют анионные элементы (например, микробов). В одном варианте реализации настоящего изобретения синтетические катионные полипептиды в этих композициях содержат по меньшей мере один катионный сегмент и по меньшей мере один гидрофобный сегмент, состоят в основном из природных аминокислот и обладают противомикробным действием широкого спектра (то есть, против грамположительных и грамотрицательных бактерий). Также они могут быть сконструированы со свойством самосборки, что основано частично на взаимодействии их гидрофобных сегментов. Более того, синтетические полипептиды составлены со вторым фармацевтически приемлемым полимером с получением композиции, которая является непосредственно противомикробной и эффективно покрывает ткани. Эти смеси могут также проявлять гемостатические свойства. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения второй фармацевтически приемлемый полимер не является полиэтиленгликолем (ПЭГ).

[0019] Варианты реализации настоящего изобретения можно применять отдельно или в сочетании с другими материалами, которые обеспечиваю т аналогичное или дополнительное действие.

[0020] В одном варианте реализации настоящего изобретения предложена водная композиция для профилактики, ингибирования или лечения инфекции, содержащая: смесь, включающую один или более синтетических катионных полипептидов, обладающих противомикробной активностью; и второй фармацевтически приемлемый полимер, который не является синтетическим катионным полипептидом(ами) с противомикробной активностью; при этом количества как указанных одного или более синтетических катионных полипептидов, так и указанного второго фармацевтически приемлемого полимера составляют по меньшей мере примерно 100 мкг/мл в пересчете на общий объем водной композиции; при этом количество указанного второго фармацевтически приемлемого полимера составляет по меньшей мере примерно 10% по массе в пересчете на массу указанных одного или более синтетических катионных полипептидов; и причем указанные синтетический катионный полипептид(ы) и второй фармацевтически приемлемый полимер способны взаимно смешиваться в воде.

[0021] Синтетический катионный полипептид(ы) с противомикробной активностью и второй фармацевтически приемлемый полимер считают взаимно смешиваемыми, если по меньшей мере примерно 90% полимерных компонентов остаются взаимно растворимы в течение 24 часов после смешивания и выдерживания при комнатной температуре в воде при концентрации каждого полимера 1 мг/мл при визуальной оценке.

[0022] В другом варианте реализации настоящего изобретения один или более синтетических катионных полипептидов в указанной водной композиции включают сегмент, имеющий длину цепи по меньшей мере 40 аминокислотных остатков.

[0023] В другом варианте реализации настоящего изобретения синтетический катионный полипептид(ы) в указанной водной композиции содержит практически все субъединицы природных аминокислот.

[0024] В другом варианте реализации настоящего изобретения синтетический катионный полипептид(ы) в водной композиции характеризуется тем, что содержит по меньшей мере один сегмент, содержащий по меньшей мере пять последовательных катионных остатков аминокислот и по меньшей мере один сегмент, содержащий по меньшей мере пять последовательных гидрофобных аминокислотных остатков.

[0025] В другом варианте реализации настоящего изобретения второй фармацевтически приемлемый полимер в указанной водной композиции выбран из группы, состоящей из целлюлозы, альгината, коллагена, полимерного поверхностно-активного вещества, полиэтиленгликоля, поливинилового спирта, полиуретана, поливинилпирролидинона (PVP, ПВП), фибрина (фибриногена), белков крови и тканевых белков.

[0026] В другом варианте реализации настоящего изобретения противомикробная активность водной композиции в отношении Staphylococcus epidermidis и Escherichia coli превышает 3 log при стандартном 60 минутном исследовании активности по времени гибели при концентрации синтетического катионного полипептида(ов) 100 мкг/мл или менее.

[0027] В другом варианте реализации настоящего изобретения указанная водная композиция дополнительно характеризуется тем, что имеет способность разрушать или ингибировать биопленку in vitro при общей концентрации полимера 40 мг/мл или менее.

[0028] В другом варианте реализации настоящего изобретения водная композиция дополнительно характеризуется тем, что имеет барьерную активность, которую измеряют по уменьшению скорости диффузии анионного красителя более чем в 2 log при общей концентрации полимера 40 мг/мл или менее.

[0029] В другом варианте реализации настоящего изобретения водная композиция дополнительно характеризуется тем, что имеет динамический модуль упругости по меньшей мере 50 Па при общей концентрации полимера менее чем 40 мг/мл.

[0030] В другом варианте реализации настоящего изобретения водная композиция дополнительно характеризуется тем, что имеет динамический модуль упругости по меньшей мере 50 Па при общей концентрации полимера менее чем 40 мг/мл и способность проходить через иглу калибра 20G при применении давление менее 60 H.

[0031] В другом варианте реализации настоящего изобретения водная композиция дополнительно характеризуется тем, что имеет способность проходить через иглу калибра 20G и восстанавливать минимум 70% своей прочности (strength), которую измеряют с помощью динамического модуля упругости через 10 минут.

[0032] В другом варианте реализации настоящего изобретения водная композиция находится в форме раствора, геля, крема, пены или перевязочного материала.

[0033] В другом варианте реализации настоящего изобретения водная композиция дополнительно характеризуется тем, что находится в комбинации или соединена с перевязочным материалом, включая, но не ограничиваясь ими, марлю или губку.

[0034] В другом варианте реализации настоящего изобретения водная композиция обладает прокоагулянтной активностью, прогемостатической активностью или обеими тем, и другим.

[0035] В другом варианте реализации настоящего изобретения водная композиция дополнительно содержит активный фармацевтический ингредиент (API), выбранный из группы, состоящей из стероида, провоспалительного агента, противовоспалительного агента, агента против акне, консервантов, гемостатического агента, ангиогенного агента, ранозаживляющего агента, противоракового агента и другого противомикробного агента.

[0036] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложено применение любой из водных композиций, описанных в данном документе, для любого одного или более случаев, выбранных из группы, состоящей из профилактики инфекций, лечения инфекций, обработки для местной дезинфекции, обработки для деколонизации микроорганизмов, лечения ран, обработки хирургических областей, лечения травм, лечения ожогов, лечения диабетических язв стопы, лечения глаз, лечения вагинальных инфекций, лечения инфекций мочевыводящих путей, санитарной обработки рук, применения для покрытия протезов и/или имплантатов, применения для консервации пищи и растворов.

[0037] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен способ профилактики и/или лечения инфекций, включающий осуществление контакта ткани пациента с любой из водных композиций, описанных в данном документе.

[0038] В другом варианте реализации настоящего изобретения способ дополнительно включает применение к области раны отрицательного давления.

[0039] В другом варианте реализации настоящего изобретения способ дополнительно включает системное введение субъекту другого антибиотика и/или местное введение другого противомикробного средства, и/или по меньшей мере одного средства, выбранного из группы, состоящей из антибиотика, агента против биопленки, поверхностно-активного вещества и их комбинации.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0040] На ФИГУРЕ 1 представлены примеры синтетических катионных полипептидов, K_x(rac-L)_y и K_xL_y. Эти полипептиды содержат катионный сегмент аминокислотных остатков лизина и гидрофобный сегмент аминокислотных остатков лейцина. Катионные сегменты обеспечивают мультимерное взаимодействие с анионными веществами, в том числе поверхностями бактерий. Гидрофобные сегменты ассоциируются в водной среде, приводя к образованию различных структур, таких как мультимеры в растворе, мицеллы, листы и фибриллы. Эти гидрофобные взаимодействия играют важную роль в формировании барьера.

[0041] На ФИГУРЕ 2 представлена таблица (Таблица 1), на которой представлены примеры синтетических катионных полипептидов, синтезированных с использованием (А) амина или (В) металлоорганического инициатора Со(РМе₃)₄.

[0042] ФИГУРА 3 представляет собой хроматограмму, полученную путем эксклюзионной гель-проникающей хроматографии при эксперименте по наращиванию цепи.

[0043] ФИГУРА 4 представляет собой хроматограмму типичного незащищенного двублочного сополипептида, полученную путем эксклюзионной гель-проникающей хроматографии.

[0044] ФИГУРА 5 представляет собой интерферограмму мономеров, полученную с помощью ИК-спектроскопии нарушенного полного отражения (ATR-IR) с преобразованием Фурье.

[0045] ФИГУРА 6 представляет собой интерферограмму сырой реакционной смеси и полной полимеризации, полученную с помощью ИК-спектроскопии нарушенного полного отражения (ATR-IR) с преобразованием Фурье.

[0046] На ФИГУРЕ 7 представлен масс-спектр ионизации с матрично-активированной лазерной десорбцией (MALDI) для типичного пептида.

[0047] На ФИГУРЕ 8 представлен спектр жидкостного протонного ядерно-магнитного резонанса (H¹-NMR) типичного незащищенного сополипептида в дейтерированной трифторуксусной кислоте (d-TFA).

[0048] На ФИГУРЕ 9 представлено исследование противомикробной активности K₁₀₀(rac-L)₂₀ по времени гибели (60 мин) S. epidermidis (RMA 18291) и Е. coli (АТСС 25922) in vitro.

[0049] На ФИГУРЕ 10 представлено исследование противомикробной активности K₁₀₀L₄₀ по времени гибели (60 мин) S. epidermidis (RMA 18291) и Е. coli (АТСС 25922) in vitro.

[0050] ФИГУРА 11 представлена таблица (Таблица 2), на которой представлено исследование активности растворов K₁₀₀(rac-L)₂₀ и 1:1 K₁₀₀(rac-L)₂₀ : Полоксамер 407 в концентрациях 10 и 100 мкг/мл по времени гибели S. aureus (29213) и P. aeruginosa (27853) после 5 и 60 мин in vitro.

[0051] На ФИГУРЕ 12 представлена таблица (Таблица 3), на которой представлено исследование противомикробной активности растворов K₁₀₀(rac-L)₂₀ с концентрацией 10 и 100 мкг/мл по времени гибели различных грамположительных и грамотрицательных бактерий и грибов in vitro после времени контакта 60 минут.

[0052] На ФИГУРЕ 13 показано, что K₁₀₀(rac-L)₂₀ и K₁₀₀L₄₀ в концентрации 0,1-20 мг/мл эффективны против биопленок P. aeruginosa in vitro (время контакта 24 часа).

[0053] На ФИГУРЕ 14 показано исследование противомикробной активности по времени гибели S. aureus (29213) и P. aeruginosa (27853) in vitro после 5 и 60 минут, применяя K₁₀₀(rac-L)₂₀ с концентрацией 10 и 100 мкг/мл с другим соотношением вспомогательных веществ: 5:1 K₁₀₀(rac-L)₂₀ : Полоксамер 407, 2:1 K₁₀₀(rac-L)₂₀ : ГЭЦ (НЕС) и 1:3 K₁₀₀(rac-L)₂₀ : ПЭГ 400.

[0054] На ФИГУРЕ 15 показано исследование противомикробной активности по времени гибели S. aureus (29213) in vitro после 30 мин, применяя только K₁₀₀L₄₀ (10 мкг/мл) и в комбинации с эфирами целлюлозы (метилцеллюлозой (МЦ, МС), гидроксипропилметилцеллюлозой (ГПМЦ, НРМС), гидроксипропилцеллюлозой (ГПЦ, НРС) и гидроксиэтилцеллюлозой (ГЭЦ, НЕС)) в соотношении 1:1.

[0055] На ФИГУРЕ 16 представлена таблица (Таблица 4), на которой показано исследование противомикробной активности по времени гибели S. aureus (29213), S. epidermidis (RMA 18291), P. aeruginosa (27853) и E. coli (25922) in vitro после нахождения в контакте в течение 60 мин. Протестированы K₁₀₀L₄₀ в концентрации 10 и 100 мкг/мл с другими соотношениями гидроксиэтилцеллюлозы: 1:2 K₁₀₀(rac-L)₂₀ : ГЭЦ (НЕС) и 1:20 K₁₀₀(rac-L)₂₀.

[0056] На ФИГУРЕ 17 представлено исследование барьерных свойств, в котором средство, содержащее 2% синтетического катионного полипептида (K₁₀₀L₄₀), показало высокую эффективность в блокировании диффузии анионного красителя в течение периода 48 часов. В отличие от этого, краситель легко диффундировал (за 5 минут) через средство, содержащее 2% полиэтиленгликоля (10000).

[0057] На ФИГУРЕ 18 показан синтетический катионный полипептид, связанный с Vitroskin©, синтетическим аналогом ткани. Показано, что значительная часть нанесенных сополипептидов, меченых флуоресцеин изотиоциапатом (FITC), остается связанной с Vitroskin©, что продемонстрировано, применяя 1% растворы K₁₀₀(rac-L)₂₀ и K₁₀₀L₄₀, меченых флуоресцеин изотиоциапатом (FITC). В отличие от этого, большая часть меченой бицинхониновой кислоты (БХК, BSA) было удалено после промывки. Процент остающегося сополимера определяли, используя флуоресценцию флуоресцеин изотиоцианата (FITC) ((λ_ехс=495 нм, λ_em=521 нм) после 1-10 промывок, и считали как 100% минус удаленный процент.

[0058] На ФИГУРЕ 19 показана противомикробная активность K₁₀₀(rac-L)₂₀ и K₁₀₀L₄₀ (100-3000 мкг/мл) in vitro на поверхности Vitroskin© против S. aureus после 0 и 5 промывок (5×1 мл). Каждый кусочек Vitroskin© 3 см × 3 см инкубировали с S. aureus в течение 60 мин.

[0059] На ФИГУРЕ 20 приведены: А) значения прочности смесей 1% растворов синтетических катионных полипептидов с 1% раствором гидроксиэтилцеллюлозы (ГЭЦ, НЕС, Natrosol ННХ) в воде; и В) значения работы адгезии смесей 1% растворов сополипептидов с 1% раствором гидроксиэтилцеллюлозы (ГЭЦ, НЕС, Natrosol ННХ) в воде.

[0060] На ФИГУРЕ 21 представлена таблица (Таблица 5), на которой показаны данные анализа текстурного профиля синтетического катионного полипептида для чистых полипептидов и смесей с ГЭЦ (НЕС), а. Значения для 1% (масс/масс.) раствора полипептида в воде. b. Значения для 1% полипептида/1% ГЭЦ (НЕС) (масс/масс.) в воде. c. Параметр взаимодействия: ΔF=F_{mix(poly/HEC)}-(F_poly+F_HEC). Где F_{mix(poly/HEC)} = прочность раствора 1% полипептида/1% ГЭЦ (НЕС), F_poly = прочность 1% раствора полипептида, и F_HEC = прочность 1% раствора ГЭЦ (НЕС, Natrosol ННХ) в воде. Аналогичная обработка данных представлена для параметра взаимодействия работы адгезии.

[0061] На ФИГУРЕ 22 показано А) деформация и В) частотная зависимость синергетической смеси 1% K₁₀₀L₄₀/1% ГЭЦ (НЕС) и отдельных компонентов в концентрации 1% в воде. ■ = 1% K₁₀₀L₄₀/1% ГЭЦ (НЕС), ● = 1% K₁₀₀L₄₀, и ▼ = 1% ГЭЦ (НЕС). Значения G' = закрашенные символы и G'' = незакрашенные символы.

[0062] ФИГУРА 23 демонстрирует, что растворы синтетических катионных полипептидов (противоинфекционные растворы, слева) и гидрогели синтетических катионных полипептидов (барьерные гели, справа) эффективны при покрытии открытых ран на модели свиньи. Синтетические катиопные полипептиды были мечены флуоресцентной меткой.

[0063] На ФИГУРЕ 24 показана противомикробная активность K₁₀₀(rac-L)₂₀ на модельных инфицированных грызунах. Крысам подкожно вживляли полипропиленовую сетку с нанесенным метициллин-резистентным золотистым стафилококком (MRSA) (33593) в количестве 10⁷. Через 15 мин добавляли 10, 2 или 0,4 мг/мл K₁₀₀(rac-L)₂₀ или воды. Через 2 дня определяли количество бактерий метициллин-резистентного золотистого стафилококка (MRSA) в имплантированной сетке и окружающих тканях.

[0064] На ФИГУРЕ 25 показана противомикробная активность K₁₀₀(rac-L)₂₀ в открытых ранах на модели свиньи. Каждая рана была заражена бактериями (S. epidermidis, P. aeruginosa (клинический изолят свиней)). Через 2 часа раны промывали физиологическим раствором и обрабатывали 5 мл испытуемого образца или воды. Испытуемые образцы: K₁₀₀(rac-L)₂₀ с концентрацией 10,2, 0,4 мг/мл, 10 мг/мл K₁₀₀(rac-L)₂₀ и 30 мг/мл ПЭГ 400 в воде и деионизироваиная вода в качестве контроля. Поверх раны помещали марлю, смоченную в испытуемом образце или воде. Биопсию раны проводили через 4 часа после обработки.

[0065] ФИГУРА 26 демонстрирует, что гидрогель, содержащий K₁₀₀L₄₀ предотвращает инфекцию в открытых ранах на модели свиньи. Гидрогель наносили на поверхность раны и на марлю для каждой раны. Марлю, пропитанную гидрогелем, помещали поверх раны. В качестве контроля использовали физиологический раствор. Через 15 минут каждую рану заражали бактериями (S. epidermidis, P. aeruginosa (свиной клинический изолят)). Испытуемые образцы гидрогеля: K₁₀₀L₄₀ 10 мг/мл, K₁₀₀L₄₀ 5 мг/мл и 10 мг/мл ГЭЦ (НЕС), K₁₀₀L₄₀ 2 мг/мл и 15 мг/мл ГЭЦ (НЕС) и физиологический раствор в качестве контроля. Биопсию раны проводили через 4 часа после применения гидрогеля.

[0066] На ФИГУРЕ 27 отображены синтетические катионные полипептиды, связанные с приемлемым для применения в медицине губчатым материалом. Эта концепция продукта иллюстрирует один из путей, в котором сополипептиды могут быть приведены в контакт с ранами для облегчения доставки гемостатика и/или противомикробной активности.

[0067] На ФИГУРЕ 28 показаны результаты анализа свертывания цельной крови in vitro с K₁₀₀L₄₀ и смесью 1:1 K₁₀₀L₄₀ и ГЭЦ (НЕС) с концентрацией 10 и 100 мкг/мл. В качестве контроля использовали только ГЭЦ (НЕС) с концентрацией 10 и 100 мкг/мл, в качестве отрицательного контроля использовали физиологический раствор и в качестве положительного контроля использовали тромбопластин, TF (50 мкл в 500 мкл цельной крови).

[0068] На ФИГУРЕ 29 показаны результаты анализа агрегации тромбоцитов с K₁₀₀L₄₀ и смесью 1:1 K₁₀₀L₄₀ и ГЭЦ (НЕС) с концентрацией 10 и 100 мкг/мл. В качестве контроля использовали только ГЭЦ (НЕС) с концентрацией 10 и 100 мкг/мл, в качестве отрицательного контроля использовали физиологический раствор и в качестве положительного контроля использовали коллаген.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНОГО ВАРИАНТА

РЕАЛИЗАЦИИ

[0069] В соответствии с вариантами реализации настоящего изобретения, водную композицию, которая содержит смесь противомикробного катионного полипептида и второго фармацевтически приемлемого полимера, применяют для лечения и/или профилактики инфекций, которые возникают, когда наши естественные защитные барьеры повреждены. Это новая композиция может обеспечить две функции: непосредственную противомикробную активность и барьерную активность. Варианты реализации настоящего изобретения направлены на устранение одного или более недостатков существовавших ранее противомикробных препаратов, описанных выше. Существенным является то, что авторы настоящего изобретения начали с осознания того, что большинство предыдущих антисептиков и антибиотиков были основаны на противомикробной активности в растворе с микробной суспензией (определение МИК - минимальной ингибирующей концентрации), подходе, который может помешать проявлению эффективности в тканях. В отличие от этого, авторы настоящего изобретения сосредоточились на разработке и выборе агентов с противомикробной активностью широкого спектра, особенно на поверхностях тканей и в области раны (“трещины и щели”). Это включает формирование барьера, содержащего катионные (положительно заряженные) элементы, которые могут ингибировать передвижение определенных веществ или клеток, которые имеют анионные элементы (например, микробов). В одном варианте реализации настоящего изобретения синтетические катионные полипептиды из этих композиций содержат по меньшей мере один катионный сегмент и по меньшей мере один гидрофобный сегмент, состоят в основном из природных аминокислот и обладают противомикробным действием широкой направленности (то есть, против грамположительных и грамотрицательных бактерий). Также они могут быть сконструированы со свойством самосборки, что основано частично на взаимодействии их гидрофобных сегментов. Более того, синтетические полипептиды объединены со вторым фармацевтически приемлемым полимером с получением композиции, которая обладает непосредственным противомикробным действием и эффективно покрывает ткани. Эти смеси могут также проявлять гемостатические свойства. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения указанный второй фармацевтически приемлемый полимер не является полиэтиленгликолем (ПЭГ).

[0070] Варианты реализации настоящего изобретения можно применять отдельно или в сочетании с другими материалами, которые обеспечивают аналогичное или дополнительное действие.

[0071] Синтетические катионные полипептиды. В водных композициях, описанных в данном документе, можно применять множество синтетических катионных полипептидов. В одном варианте реализации настоящего изобретения синтетический катионный полипептид содержит сегмент повторяющихся единиц или остатков положительно заряженных аминокислот (например, лизина, аргинина) и другой сегмент повторяющихся единиц или остатков гидрофобных аминокислот (например, лейцина, изолейцина, валина, аланина). Примеры включают сополипептиды, состоящие из сегмента или блока одной или нескольких повторяющихся аминокислот лизина и сегмента или блока одной или нескольких повторяющихся аминокислот лейцина с общей структурой K_xL_y (Фиг. 1). В различных вариантах реализации настоящего изобретения один или более синтетических катионных полипептидов включают сегмент, имеющий длину цепи по меньшей мере 40 аминокислотных остатков. В различных вариантах реализации настоящего изобретения синтетические катионные полипептиды содержат в основном все субъединицы природных аминокислот. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения синтетические катионные полипептиды характеризуются тем, что содержат по меньшей мере один сегмент, содержащий по меньшей мере пять последовательных остатков катионных аминокислот, и по меньшей мере один сегмент, содержащий по меньшей мере пять последовательных гидрофобных остатков аминокислот. Например, в некоторых случаях, полипептиды включают один или более сегментов, содержащих по меньшей мере 5 последовательных повторяющихся единиц аминокислоты лизин и один или более сегментов, содержащих по меньшей мере 5 последовательных гидрофобных повторяющихся аминокислот (например, лейцин). В некоторых случаях, катионные полипептиды могут представлять молекулы с относительно длинной цепью, имеющие блоки лизина, содержащие от 50 до 200 или более остатков аминокислоты лизин.

Примеры синтетических катионных полипептидов включают K₅₀(rac-L)₁₀, K₅₀(rac-L)₂₀, K₅₀(rac-L)₃₀, K₅₀(rac-L)₄₀, K₅₀(rac-L)₅₀, K₅₀L₁₀, K₅₀L₂₀, K₅₀L₃₀, K₅₀L₄₀, K₅₀L₅₀, K₁₀₀(rac-L)₁₀, K₁₀₀(rac-L)₂₀, K₁₀₀(rac-L)₃₀, K₁₀₀(rac-L)₄₀, K₁₀₀(rac-L)₅₀, K₁₀₀L₁₀, K₁₀₀L₂₀, K₁₀₀L₃₀, K₁₀₀L₄₀, K₁₀₀L₅₀, K₂₀₀(rac-L)₁₀, K₂₀₀(rac-L)₂₀, K₂₀₀(rac-L)₃₀, K₂₀₀(rac-L)₄₀, K₂₀₀(rac-L)₅₀, K₂₀₀L₁₀, K₂₀₀L₂₀, K₂₀₀L₃₀, K₂₀₀L₄₀, K₂₀₀L₅₀ (Фиг. 2 (Таблица 1)). Также предусмотрены другие синтетические катионные полипептиды (например, с более длинными или более короткими сегментами лизина и более длинными или более короткими сегментами лейцина). Кроме того, данное изобретение охватывает другие синтетические катионные полипептиды, в которых катионные сегменты могут включать другие аминокислоты, такие как аргинин, и гидрофобные блоки, которые могут содержать одну или более гидрофобных аминокислот, в том числе, но не ограничиваясь ими, лейцин, аланин, валин, и/или изолейцин. В некоторых случаях один или более сегментов могут иметь случайную последовательность аминокислот, включая гидрофобные и гидрофильные аминокислоты.

[0072] Примеры синтетических катионных полипептидов включают те, которые описаны в патентах США №6680365.; 6632922; 6686446; 6818732; 7329727; опубликованной заявке на патент США №2008/0125581 и опубликованной заявке на патент США №2011/048869. Вышеуказанные патенты и патентные заявки включены в настоящую заявку посредством ссылки, и в частности с целью описания синтетических катионных полипептидов и способов их получения.

[0073] Были разработаны способы получения синтетических катионных полипептидов с высокой воспроизводимостью, имеющих очень узкий диапазон полидисперсности, и такие полимеры могут быть получены с различными характеристиками, чтобы удовлетворить потребности в противомикробной активности и формировании барьера. Например, блок сополипептида высокого качества синтезируют путем соединения N-карбоксиангидридов α-аминокислот (NCA) высокого качества в безводных растворителях с бензиламином в качестве инициатора. Эти полимеры затем подвергают снятию защитных групп и очистке, чтобы получить конечный продукт.

[0074] Были разработаны и улучшены несколько аналитических методов как для контроля синтеза пептидов, так и для анализа размера, свойств и остаточных примесей полученных полимерных продуктов. Для контроля хода реакции может быть использована инфракрасная спектроскопия, в то время как для контроля размера и состояния полимера на различных стадиях процесса может быть использована эксклюзионная гель-проникающая хроматография. Другие способы анализа, такие как спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР), масс-спектроскопия ионизации с матрично-активированной лазерной десорбцией (MALDJ-MS), и масс-спектроскопия с индуктивно-связанной плазмой (ИСП-МС) можно применять, например, в качестве дополнительных тестов контроля качества, чтобы гарантировать воспроизводимость и чистоту (Фиг. 3-8).

[0075] Можно сконструировать синтетические катионные полипептиды так, чтобы они обладали противомикробной активностью широкого спектра (см. опубликованную патентную заявку №2011/048869). Синтетический катионный полипептид считают обладающим противомикробной активностью, если он обеспечивает гибель Staphylococcus epidermidis и Escherichia coli в количестве, более чем 3 log при стандартном 60 минутном исследовании активности по времени гибели при концентрации синтетического катионного полипептида 1,0 мг/мл или менее. В одном варианте реализации настоящего изобретения синтетический катионный полипептид обладает противомикробной активностью, которая обеспечивает гибель Staphylococcus epidermidis и Escherichia coli в количестве, более чем 3 log при стандартном 60 минутном исследовании активности по времени гибели при концентрации синтетического катионного полипептида 100 мкг/мл или менее. Как показано на Фигурах 9-12, варианты реализации таких синтетических катионных полипептидов демонстрируют противомикробную активность против грамположительных и грамотрицательных бактерий in vitro. Эта активность продемонстрирована посредством исследования активности синтетического катионного полимера по времени гибели in vitro в водной среде. Кроме того, варианты реализации синтетических катионных полипептидов демонстрировали активность против биопленок in vitro, как показано на Фиг. 13. Возможно, что такое действие можно частично объяснить связыванием катионных полипептидов с анионами, присутствующими в матрице биопленки. Кроме того, активность синтетических катионных полипептидов, подобная активности поверхностно-активных веществ, может способствовать эффекту против биопленки. Также обнаружено, что композиции согласно настоящему изобретению могут изменять структуру и/или заряд биопленок, позволяя другим агентам (например, антибиотикам, применяемым местно или системно) проникать через биопленки, тем самым повышая их активность.

[0076] Смеси синтетических катионных полипептидов и других полимеров могут сохранять противомикробную активность in vitro. Второй фармацевтически приемлемый полимер представляет собой полимер, отличный от указанных одного или более синтетических катионных полипептидов, обладающих противомикробной активностью. Согласно варианту реализации настоящего изобретения второй фармацевтически приемлемый полимер обладает маленькой или нулевой противомикробной активностью. Например, согласно варианту реализации настоящего изобретения противомикробная активность указанного второго фармацевтически приемлемого полимера составляет менее 10% от противомикробной активности синтетических катионных полипептидов.

[0077] Индивидуальные количества синтетического катионного полипептида(ов) и второго фармацевтически приемлемого полимера в водной композиции составляют по меньшей мере примерно 100 мкг/мл, и могут быть выше, например, примерно 1 мг/мл, примерно 5 мг/мл или примерно 10 мг/мл или примерно 20 мг/мл или примерно 40 мг/мл или выше. Количество второго фармацевтически приемлемого полимера в водной композиции составляет по меньшей мере примерно 10% по массе в пересчете на массу одного или более синтетических катионных полипептидов, и может быть выше, например, по меньшей мере примерно 20% по массе, по меньшей мере примерно 30% по массе или по меньшей мере примерно 50% по массе, в пересчете таким же образом. Синтетический катионный полипептид(ы) и второй фармацевтически приемлемый полимер в водной композиции выбраны таким образом, что полимеры являются взаимно смешиваемыми. Как отмечено выше, синтетический катионный полипептид(ы) с противомикробной активностью и второй фармацевтически приемлемый полимер считают взаимно смешиваемыми, если по меньшей мере примерно 90% полимерных компонентов остаются взаимно растворимыми в течение 24 часов после смешивания и выдерживания при комнатной температуре в воде при концентрации каждого полимера 1 мг/мл при визуальной оценке. Было неожиданно обнаружено, что такая взаимная смешиваемость воды, синтетического катионного полипептида(ов) и второго фармацевтически приемлемого полимера может быть достигнута несмотря на ожидание разделения фаз в связи с типичной взаимной несовместимостью полимеров в водном растворе с концентрацией 1 мг/мл и молекулярными массами, описанными в настоящем документе. Водные композиции, описанные в настоящем документе, могут быть получены путем смешивания отдельных полимерных компонентов с водой, например, при комнатной температуре при взбалтывании, применяя обычные методы смешивания, известные специалистам в данной области.

Пример 1

[0078] Как отображено на фигурах 14-16, было показано, что варианты реализации синтетических катионных полипептидов сохраняют свою противомикробную активность практически полностью в присутствии других фармацевтически приемлемых полимеров, что продемонстрировано посредством стандартного исследования активности по времени гибели S. aureus, S. epidermidis, P. aeruginosa и E. coli. В этих исследованиях оценивали различные вторые полимеры па основе целлюлозы. Как показано на фиг. 11 и 13, другие исследования продемонстрировали сохранение противомикробной активности in vitro в присутствии других фармацевтически приемлемых полимерных поверхностно-активных веществ. В варианте реализации настоящего изобретения противомикробная активность обеспечивает гибель Staphylococcus epidermidis и Escherichia coli в количестве, более чем 3 log при стандартном 60 минутном исследовании активности по времени гибели при концентрации синтетического катионного полипептида 100 мкг/мл или менее. В другом варианте реализации настоящего изобретения водная композиция дополнительно характеризуется способностью нарушать или ингибировать биопленку in vitro при общей концентрации полимера 40 мг/мл или менее.

[0079] Смеси синтетических катионных полипептидов и других полимеров могут проявлять усиленные физические и вязкоэластичные свойства in vitro. При разработке композиций для применения у пациентов была признана необходимость поддержания противомикробной активности при повышении объема, зоны покрытия тканей и/или биосовместимости. Различные синтетические катионные полипептиды комбинировали с другими фармацевтически приемлемыми полимерами таким образом, чтобы сохранить по меньшей мере примерно 80% (например, по меньшей мере 90%) противомикробной активности синтетических катионных полипептидов и в предпочтительных вариантах реализации настоящего изобретения также усилить покрываемость ткани. Полагают, что амфифильная природа синтетических катионных полипептидов и их способность к самосборке в водном растворе обусловливает стабильные (разрушенные или сольватированные) дисперсии с раздельными фазами гидрофобных и гидратированных гидрофильных материалов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения полагают, что длина цепи сополипептидов (напр., степень полимеризации или n>50) обеспечивает сеть частично разрушенных ячеек гидрофобности, которые замедляют диффузию растворенного вещества и растворителя. Барьерная природа материалов является результатом способности материалов улавливать и замедлять перемещение воды, а следовательно, резко замедлять движение любого растворенного вещества или частиц, присутствующих в воде. Длина полипептида сильно влияет на барьерные свойства (например, резко снижает диффузию). Следовательно, выбор второго полимера для смешивания с синтетическим катионным пептидом(ами) следует проводить осторожно, чтобы избежать нарушения важных биофизических параметров и достичь взаимной растворимости в водной композиции. Специалисты в данной области могу г использовать принятое проведение экспериментов, руководствуясь методами, представленными в настоящем документе, для выбора полимерных компонентов и количеств для получения водных композиций, описанных в настоящем документе.

[0080] Свойства водных композиций, описанных в настоящем документе, могут быть усовершенствованы посредством регулирования соотношения количества катионного полипептида ко второму фармацевтически приемлемому полимеру(ам). Не ограничивающие примеры таких вторых полимеров могут включать целлюлозы (например, гидроксиэтилцеллюлозу (ГЭЦ, НЕС), гидроксипропилцеллюлозу (ГПЦ, НРС), гидроксиметилцеллюлозу (ГМЦ, НМС)), альгинаты, коллагены, полимерные поверхностно-активные вещества, полиэтиленгликоли, поливиниловые спирты, полиуретаны, поливинилпирролидиноны (ПВП, PVP), фибрин (фибриноген) или белки крови или тканевые белки. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения второй фармацевтически приемлемый полимер не является полиэтиленгликолем (ПЭГ). Считают, что барьер композиции находится в динамическом равновесии с ее отдельными компонентами, по меньшей мере один из которых является противомикробным. Выщелачивание агрегатов может быть преимуществом, поскольку утраченный материал может увеличить эффективную площадь поверхности барьера, которая может повысить эффективность взаимодействия между микробами и барьерным материалом (Фиг. 17-19). Барьерные свойства материалов могут быть далее усилены за счет синергетического эффекта полярных биополимеров, которые в дальнейшем образуют самособирающуюся сополипептидную матрицу путем поперечной сшивки. При приготовлении композиции с использованием различных биополимеров, текучесть и механические характеристики материалов можно регулировать и контролировать таким же образом, как и прочность барьера.

Пример 2

[0081] Для определения влияния блока композиции сополипептида и гидрофобной энантиомерной чистоты на механические свойства смесей блока сополипептида/ГЭЦ (НЕС) применяли анализ текстурного профиля (Фиг. 20). Измерение значения прочности для отдельных компонентов показало, что 1% (масс/масс.) раствор K₁₀₀L₄₀ в воде имел прочность 2,94+/-0,25 мН и 1% (масс/масс.) раствор ГЭЦ (НЕС) в воде демонстрировал прочность 5,38+/-0,32 мН (Фиг. 21 (Таблица 5)). Смешивание 1% (масс/масс.) раствора K₁₀₀L₄₀ и 1% (масс/масс.) раствора ГЭЦ (НЕС) вместе привело к значительному увеличению твердости до значения 22,77+/-0,90 мН. Это соответствует значению параметра взаимодействия 14,45 мН и общему увеличению более чем на 170% от того, что можно ожидать от суммируемых значений для отдельных компонентов. Как показано на фиг. 20b, аналогичная тенденция наблюдается и для адгезивности. Для сравнения, комбинация диблока сополипептида K₁₀₀(rac-L)₄₀, (содержащего рацемический гидрофобный блок) с концентрацией 1% (масс/масс.) и ГЭЦ (НЕС) с концентрацией 1% (масс/масс.) также продемонстрировала повышенную прочность и адгезивность; однако увеличение было не столь выраженным, как в случае с K₁₀₀L₄₀, содержащим гидрофобный блок энантиомерной чистоты. Показано, что длина гидрофобного блока также оказывает влияние. Смеси 1% (масс/масс.) K₁₀₀L₂₀ и 1% (масс/масс.) ГЭЦ (НЕС) показали повышение прочности выше, чем прочность отдельного биополимера, но эффект был меньше, чем в случае K₁₀₀L₄₀. Интересно то, что K₁₀₀L₂₀ проявил противоположный эффект по отношению к работе адгезии. Далее, K₁₀₀(rac-L)₂₀ с коротким рацемическим гидрофобным блоком не проявил эффекта. Гомополипсптиды лизина, K₁₀₀ и K₂₀₀, также не привели к повышению прочности и адгезивности ГЭЦ (НЕС) отдельно, и фактически продемонстрировали противоположную активность.

Пример 3

[0082] Реологические измерения дополнительно подтвердили синергетическое взаимодействие между K₁₀₀L₄₀ и ГЭЦ (НЕС). На фиг. 22, эффекты наблюдаются как при осцилляторной деформации сдвига, так при частотной зависимости. Сам по себе 1% (масс/масс.) раствор K₁₀₀L₄₀ проявил характеристики относительно хрупкого, слабого геля. При анализе деформации сдвига хрупкую природу геля наблюдают посредством распада сетки геля при низком значении деформации около γ=0,01; и анализ частотной зависимости показал формирование слабого геля с модулем упругости (G'=22 Па при 1 рад/с). Для сравнения, 1% (масс/масс.) раствор ГЭЦ (НЕС) показал реологические свойства, более характерные для вязкой жидкости. Анализ деформации сдвига 1% раствора ГЭЦ (НЕС) демонстрирует более высокий модуль потерь (G''), чем модуль упругости (С) на всех тестируемых значениях деформации (фиг. 21 А) и анализ частотной зависимости также показал более высокое значение G'', чем G', до достижения высоких частот (100 рад/с) (рис. 21В). Существенные изменения реологических свойств наблюдались при смешивании 1% (масс/масс.) раствора K₁₀₀L₄₀ с 1% (масс/масс.) раствором ГЭЦ (НЕС). В частности, анализ деформации сдвига смеси показал увеличение интервала вязкоэластичности на порядок, показывая уменьшение G' около γ=0,1. Анализ частотной зависимости показал большое синергетическое увеличение модуля упругости G'=141 Па при 1 рад/с, что в семь раз превышает модуль упругости отдельно 1% (масс/масс.) K₁₀₀L₄₀ (G'=22 Па).

[0083] Количество и типы полимерных компонентов в водных композициях, описанные в настоящем документе, могут быть выбраны для достижения различных свойств. В варианте реализации настоящего изобретения водная композиция характеризуется барьерной активностью, как измерено посредством уменьшения скорости диффузии анионного красителя более чем в 2 log при общей концентрации полимера 40 мг/мл или менее. В варианте реализации настоящего изобретения водная композиция характеризуется динамическим модулем упругости не менее 50 Па при общей концентрации полимера менее 40 мг/мл. В варианте реализации настоящего изобретения водная композиция характеризуется динамическим модулем упругости не менее 50 Па при общей концентрации полимера менее 40 мг/мл и способностью проходить через иглу калибра 20g при применении давления менее 60 H. В варианте реализации настоящего изобретения водная композиция характеризуется способностью проходить через иглу калибра 20g и восстанавливать не менее 70% своей прочности, что измеряют с помощью динамического модуля упругости через 10 минут. Специалисты в данной области могут использовать принятое проведение экспериментов, руководствуясь методами, представленными в настоящем документе, для выбора полимерных компонентов и количеств для получения водных композиций, обладающих свойствами, описанными в настоящем документе. Example 4

[0084] Смеси синтетических катионных полипептидов и других полимеров могут проявлять повышенную противомикробную активность in vivo. В частности, синтетические катионные полипептиды в форме мицеллярных растворов и гидрогелей могут быть применены для покрытия тканей in vivo (фиг. 23). Это покрытие тканей может включать связывание катионных пептидов с анионными зарядами, находящимися на поврежденных тканях (а также анионными зарядами бактериальных биопленок), посредством взаимодействия зарядов. Кроме того, самосборка и поперечная сшивка может увеличить количество материала, который связывается и покрывает ткань (например, более тонкое или более толстое покрытие) и, следовательно, может влиять на различную биологическую активность и ответы.

[0085] Как показано на рис. 24, эти синтетические катионные полипептиды являются противомикробными при местном применении in vivo. В стремлении разработать усовершенствованные продукты для применения in vivo, было признано, что свойства этих материалов связываться с тканью и покрывать ткань могут существенно повлиять на их активность, в том числе их противомикробные свойства, их свойства против биопленок и их воздействие на образование спаек ткани и реструктурирование тканей. Молекулярные характеристики синтетических катионных полипептидов (например, длина, заряд, и т.д.), а также структуры, которые они образуют в водных средах (например, мицеллы, листы, фибриллы, гидрогели), могут воздействовать на связывание с тканью и покрытие тканей. Было также признано, что смешивание этих синтетических катионных полипептидов с другими полимерами с образованием водных композиций, как описано в настоящем документе, могут различным образом изменять их биофизические свойства в водной среде и на тканях. Таким образом, мы тестировали смеси синтетических катионных полипептидов и других полимеров in vivo. Example 5

[0086] Водные композиции, которые включают смеси синтетических катионных полипептидов и двух различных полимеров (полиэтиленгликоля 400 и гидроксиэтилцеллюлозы), обе были признаны эффективными in vivo. Как показано на фиг. 25, K₁₀₀(rac-L)₂₀ был эффективным при лечении открытой раны на модельных свиньях один и в комбинации с ПЭГ-400. Как показано на фиг. 26, K₁₀₀L₄₀ был эффективным в предотвращении микробного загрязнения один и в комбинации с гидроксиэтилцеллюлозой. Дополнительно, данные свидетельствуют о том, что расширенные биофизические свойства смесей позволяют повысить противомикробную активность in vivo по сравнению с только синтетическими катионными сополипептидами. Водные композиции, описанные в настоящем документе, могут быть использованы для одной или более процедур и/или применений, включая, по не ограничиваясь ими, профилактику инфекций, лечение инфекций, обработку для местной дезинфекции, обработку для деколонизации микроорганизмов, лечение ран, обработку хирургических областей, лечение травм, лечение ожогов, лечение диабетических язв стопы, лечение глаз, лечение вагинальных инфекций, лечение инфекций мочевыводящих путей, санитарную обработку рук, применение для покрытия протезов и/или имплантатов, применение для консервации пищи и растворов.

[0087] Водные композиции, описанные в настоящем документе, могут быть приготовлены в форме растворов, эмульсий, частиц или гидрогелей с различными вязкоэластичными свойствами для увеличения их противомикробных свойств, их барьерных свойств, или обоих. В одном варианте реализации настоящего изобретения водная композиция согласно настоящему документу включает продукт для промывки ран с одним блоком сополипептида лизин-лейцин в воде, физиологическом растворе или других водных средах, который смешивали со вторым полимером, как правило, поверхностно-активным веществом, таким как Полоксамер 407. В одном варианте реализации настоящего изобретения водная композиция согласно настоящему документу может включать вязкий жидкий/текучий гель, который можно наносить с помощью распылителя для покрытия различных тканей. Это может быть применено для открытых или лапароскопических подходов. Эти материалы могут быть изготовлены в виде различных повязок и бинтов самостоятельно или в комбинации с другими материалами. Они могут включать составляющие или покрытия различных материалов, такие как марлю или губки. Пример может включать водную композицию согласно настоящему документу (например, содержащую синтетический блок сополипептида K_xL_y) в форме покрытия на марле или альгинатных повязках. Другой пример может включать двухслойный материал, в котором водная композиция согласно настоящему документу (например, содержащая синтетический блок сополипептида K_xL_y один или с другим полимером, таким как коллаген) покрывает лицевую поверхность относительно инертного губчатого материала (например, полиакрилового каучука, полиуретана или (polyhema)) (фиг. 27). В этом случае вариант реализации настоящего изобретения может иметь вид прямоугольной губки с одной покрытой поверхностью или сферической губки, у которой покрыта вся поверхность (напоминает теннисный мяч). Это может быть особенно полезно при лечении кровоточащих ран, где необходим гемостаз (фиг. 28-29).

[0088] В варианте реализации настоящего изобретения предложен способ для профилактики и/или лечения инфекций, который включает контактирование ткани пациента с водной композицией согласно настоящему документу, например, с раной. Другой вариант реализации настоящего изобретения включает применение отрицательного давления к обработанной ране. Пациент может представлять собой животное, предпочтительно человека. В варианте реализации настоящего изобретения пациентах дополнительно системно лечили антибиотиком и/или локально другим противомикробным средством и/или по меньшей мере средством, выбранным из группы, состоящей из антибиотика, агента против биопленки, поверхностно-активного вещества и их комбинации.

[0089] Водные композиции, описанные в настоящем документе, могут дополнительно включать один или более активных фармацевтических ингредиентов (API). Примеры таких активных фармацевтических ингредиентов (API) включают стероиды, провоспалительные агенты, противовоспалительные агенты, агенты против акне, консерванты, гемостатические агенты, ангиогенные агенты, ранозаживляющие агенты, противораковые агенты и другие противомикробные агенты.

Группа изобретений относится к медицине, в частности к водным композициям для профилактики, ингибирования или лечения инфекции. Композиция включает смесь, содержащую по меньшей мере один синтетический катионный полипептид, обладающий противомикробной активностью, и второй фармацевтически приемлемый полимер, который не является синтетическим катионным полипептидом, при этом количество как по меньшей мере одного синтетического катионного полипептида, так и второго фармацевтически приемлемого полимера составляет по меньшей мере примерно 100 мкг/мл в пересчете на общий объем водной композиции, причем количество второго фармацевтически приемлемого полимера составляет по меньшей мере примерно 10% по массе в пересчете на массу по меньшей мере одного синтетического катионного полипептида, при этом по меньшей мере один синтетический катионный полипептид содержит сегмент, имеющий длину цепи по меньшей мере 40 остатков аминокислот, при этом синтетический катионный полипептид и второй фармацевтически приемлемый полимер являются взаимно смешиваемыми в воде, и при этом композиция характеризуется улучшенной противомикробной барьерной активностью по сравнению с одним синтетическим катионным полипептидом, обладающим противомикробной активностью, или по сравнению со вторым фармацевтически приемлемым полимером, который не является синтетическим катионным полипептидом. Также описан способ профилактики или лечения инфекции и применение водной композиции для профилактики или лечения инфекции. Группа изобретений обеспечивает получение противомикробных барьеров для защиты кожи от микробной инвазии, образование устойчивого физического барьера и восстановление целостности нарушенного кожного покрова. 3 н. и 16 з.п. ф-лы, 29 ил., 5 пр.

1. Водная композиция для профилактики, ингибирования или лечения инфекции, включающая:

смесь, содержащую по меньшей мере один синтетический катионный полипептид, обладающий противомикробной активностью, и второй фармацевтически приемлемый полимер, который не является синтетическим катионным полипептидом;

при этом количество как указанного по меньшей мере одного синтетического катионного полипептида, так и указанного второго фармацевтически приемлемого полимера составляет по меньшей мере примерно 100 мкг/мл в пересчете на общий объем указанной водной композиции;

причем количество указанного второго фармацевтически приемлемого полимера составляет по меньшей мере примерно 10% по массе в пересчете на массу указанного по меньшей мере одного синтетического катионного полипептида;

при этом по меньшей мере один синтетический катионный полипептид содержит сегмент, имеющий длину цепи по меньшей мере 40 остатков аминокислот;

при этом указанный синтетический катионный полипептид и указанный второй фармацевтически приемлемый полимер являются взаимно смешиваемыми в воде и

при этом указанная композиция характеризуется улучшенной противомикробной барьерной активностью по сравнению только лишь с указанным по меньшей мере одним синтетическим катионным полипептидом, обладающим противомикробной активностью, или по сравнению только лишь с указанным вторым фармацевтически приемлемым полимером, который не является синтетическим катионным полипептидом.

2. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что указанная композиция характеризуется повышенной прочностью по сравнению только лишь с указанным по меньшей мере одним синтетическим катионным полипептидом, обладающим противомикробной активностью, или по сравнению только лишь с указанным вторым фармацевтически приемлемым полимером, который не является синтетическим катионным полипептидом.

3. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что указанный синтетический катионный полипептид содержит, по существу, все субъединицы природных аминокислот.

4. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что указанный синтетический катионный полипептид характеризуется тем, что содержит по меньшей мере один сегмент, содержащий по меньшей мере пять последовательных остатков катионных аминокислот, и по меньшей мере один сегмент, содержащий по меньшей мере пять последовательных остатков гидрофобных аминокислот.

5. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что указанный второй фармацевтически приемлемый полимер выбран из группы, состоящей из целлюлозы, альгината, коллагена, полимерного поверхностно-активного вещества, полиэтиленгликоля, поливинилового спирта, полиуретана, поливинилпирролидинона (PVP), фибрина (фибриногена), белков крови и тканевых белков.

6. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что противомикробная активность в отношении Staphylococcus epidermidis и Escherichia coli превышает 3 log при стандартном 60-минутном исследовании активности по времени гибели при концентрации синтетического катионного полипептида(ов) 100 мкг/мл или менее.

7. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что указанная композиция дополнительно характеризуется тем, что имеет способность разрушать или ингибировать биопленку in vitro при общей концентрации полимера 40 мг/мл или менее.

8. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что указанная композиция дополнительно характеризуется тем, что имеет барьерную активность, которую измеряют по уменьшению скорости диффузии анионного красителя более чем в 2 log при общей концентрации полимера 40 мг/мл или менее.

9. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что указанная композиция дополнительно характеризуется тем, что имеет динамический модуль упругости по меньшей мере 50 Па при общей концентрации полимера менее чем 40 мг/мл.

10. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что указанная композиция дополнительно характеризуется способностью проходить через иглу калибра 20G при применении давления менее 60 Н.

11. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что указанная композиция дополнительно характеризуется тем, что имеет способность проходить через иглу калибра 20G и восстанавливать минимум 70% своей вязкости, которую измеряют с помощью динамического модуля упругости через 10 минут.

12. Композиция по п. 1 в форме раствора, геля, крема, пены или перевязочного материала.

13. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что указанная композиция дополнительно характеризуется тем, что находится в комбинации или соединена с перевязочным материалом, включая, но не ограничиваясь ими, марлю или губку.

14. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что указанная композиция обладает прокоагулянтной активностью, прогемостатической активностью или и тем, и другим.

15. Композиция по п. 1, которая дополнительно содержит активный фармацевтический ингредиент (API), выбранный из группы, состоящей из стероида, провоспалительного агента, противовоспалительного агента, агента против акне, консервантов, гемостатического агента, ангиогенного агента, ранозаживляющего агента, противоракового агента и другого противомикробного агента.

16. Применение композиции по пп. 1-15 для профилактики или лечения инфекции, при этом указанная профилактика или лечение инфекции выбраны из группы, состоящей из обработки для местной дезинфекции, обработки для деколонизации микроорганизмов, лечения ран, обработки хирургических областей, лечения травм, лечения ожогов, лечения диабетических язв стопы, лечения глаз, лечения вагинальных инфекций, лечения инфекций мочевыводящих путей, санитарной обработки рук, применения для покрытия протезов и/или имплантатов, применения для консервации пищи и растворов.

17. Способ профилактики или лечения инфекции, включающий осуществление контакта ткани субъекта с композицией по любому из пп. 1-15.

18. Способ по п. 17, который дополнительно включает применение к ране отрицательного давления.

19. Способ по п. 17, который дополнительно включает лечение субъекта системным введением другого антибиотика и/или местным введением другого противомикробного средства и/или по меньшей мере одного средства, выбранного из группы, состоящей из антибиотика, агента против биопленки, поверхностно-активного вещества и их комбинации.