УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[001] Грамотрицательные бактерии, в частности, представители рода Pseudomonas, являются важной причиной серьезных и потенциально опасных для жизни инвазивных инфекций. Инфекция Pseudomonas представляет собой основную проблему при ожоговых ранах, хронических ранах, хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) и других структурных заболеваниях легких, муковисцидозе, поверхностном росте на имплантированных биоматериалах, а также на поверхностях в больницах и в системах водоснабжения, где она несет множество угроз для уязвимых пациентов, таких как пациенты с подавленным иммунитетом и пациенты в отделении интенсивной терапии (ОИТ).
[002] После развития у пациента инфекции P. aeruginosa, ее может быть особенно сложно лечить. Геном кодирует множество генов устойчивости, включая помпы, выкачивающие множество лекарственных средств, и ферменты, придающие устойчивость к бета-лактамным и аминогликозидным антибиотикам, что делает терапию против этого грамотрицательного патогена особенно проблематичной из-за отсутствия новых противомикробных терапевтических средств. Эта проблема усугубляется способностью P. aeruginosa расти в биопленке, которая может усиливать его способность вызывать инфекции, ограждая бактерии от защитных сил организма хозяина и обычной противомикробной химиотерапии.
[003] В медицинских учреждениях частота устойчивых к лекарственным средствам штаммов Pseudomonas aeruginosa растет. Согласно оценке по данным опроса для выявления распространенности в определенный момент времени в нескольких странах P. aeruginosa вызывал 7% всех внутрибольничных инфекций (HAI) (1). В более чем 6000 (13%) из 51000 случаев HAI, ежегодно вызываемых P. aeruginosa, наблюдается множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) с примерно 400 смертельных случаев в год (2). Штаммы с широкой лекарственной устойчивостью (XDR) и устойчивые ко всем существующим лекарственным средствам (PDR) штаммы представляют собой новые угрозы, для которых существует ограниченное количество доступных средств лечения или они отсутствуют (3). Инвазивные инфекции P. aeruginosa, включая инфекции кровотока (BSI), которые являются одними из самых летальных HAI, - например, P. aeruginosa является причиной от 3 до 7% всех BSI, с показателями смертности от 27 до 48% (4). Частота инвазивных инфекций кровотока, включая те, которые вызваны P. aeruginosa, может быть недооценена, поскольку большинство медицинских услуг в США оказывается в небольших неклинических общественных больницах. В наблюдательном исследовании BSI в общественных больницах P. aeruginosa представлял собой один из 4 самых значимых MDR-патогенов (5), и общая смертность в больнице составила 18%. Кроме того, хорошо описаны вспышки MDR P. aeruginosa (6). Неблагоприятные исходы ассоциированы с MDR-штаммами P. aeruginosa, которые часто требуют лечения лекарственными средствами крайней меры, такими как колистин (7). Очевидно, существует неудовлетворенная медицинская потребность в различных противомикробных средствах с новыми механизмами для нацеливания на MDR P. aeruginosa для лечения инвазивных инфекций, включая, но не ограничиваясь ими, BSI.
[004] Инновационный подход к лечению бактериальных инфекций сосредоточен на семействе кодируемых бактериофагом гидролаз пептидогликана (ПГ) клеточной стенки, называемых лизинами (8). В настоящее время технология на основе лизина опирается на применение очищенных рекомбинантных белков лизина, которые воздействуют извне на ряд грамположительных (GP) патогенов, что приводит к лизису бактериальной клетки при контакте с величиной уничтожения, составляющей несколько порядков. Лизины действуют как «молекулярные ножницы», разрушая, таким образом, пептидогликановую (ПГ) сетчатую структуру, отвечающую за поддержание формы клеток и противодействие внутреннему осмотическому давлению. Разрушение ПГ приводит к осмотическому лизису. В дополнение к быстрому уничтожению и новому способу действия по сравнению с антибиотиками другие признаки активности лизина включают активность против биопленок, отсутствие ранее существовавшей устойчивости, сильную синергию с антибиотиками (в концентрациях, ниже минимальной ингибирующей концентрации (МИК)) и подавление устойчивости к антибиотикам, при применении антибиотиков в дополнение к лизинам. Важно отметить, что несколько групп исследователей продемонстрировали на нескольких моделях на животных возможность контроля грамположительных бактериальных патогенов, устойчивых к антибиотикам, с помощью местного, интраназального и парентерального введения лизинов (9-11).
[005] Технология на основе лизина была первоначально разработана для лечения грамположительных патогенов. До настоящего времени разработка лизинов для нацеливания на грамотрицательные (GN) бактерии была ограничена. Внешняя мембрана (ВМ) грамотрицательных бактерий играет критическую роль в качестве барьера для внеклеточных макромолекул и ограничивает доступ к расположенному ниже пептидогликану (12-14).
[006] ВМ является отличительным признаком грамотрицательных бактерий и содержит липидный бислой с внутренним фосфолипидным листком и внешним амфифильным листком, состоящим в основном из липополисахаридов (ЛПС) (15). ЛПС имеет три основные части: гексаацилированный фосфолипид на основе глюкозамина, называемый липидом A, полисахаридное ядро и удлиненную внешнюю полисахаридную цепь, называемую O-антигеном. ВМ представляет собой нежидкий континуум, стабилизированный тремя основными взаимодействиями, включая: i) авидное связывание молекул ЛПС друг с другом, в частности, если присутствуют катионы для нейтрализации фосфатных групп; ii) плотную упаковку в основном насыщенных ацильных цепей; и iii) гидрофобную укладку («stacking») групп липида А. Полученная структура является барьером как для гидрофобных, так и гидрофильных молекул. ПГ образует тонкий слой под внешней мембраной, который очень чувствителен к гидролитическому расщеплению, в отличие от ПГ грамположительных бактерий, который имеет толщину 30-100 нм и содержит до 40 слоев, ПГ грамотрицательных бактерий имеет толщину всего 2-3 нм и состоит всего из 1-3 слоев. Сильная противомикробная активность может быть достигнута, если лизины, нацеленные на грамотрицательные бактерии, реализованы с возможностью проникать через ВМ как по отдельности, так и в комбинации с агентами и/или антибиотиками, дестабилизирующими ВМ.
[007] Соответственно, обнаружение и разработка GN-лизинов, которые проникают через ВМ, является важной целью и удовлетворит важную, но все еще неудовлетворенную, потребность в разработке эффективных средств терапии для лечения или предотвращения инфекций, вызванных грамотрицательными бактериями. Ранее было описано несколько агентов с видами активности, направленными на пермеабилизацию ВМ и разрушение ВМ. Например, поликатионные соединения, включая полимиксиновые антибиотики и аминогликозиды, конкурируют со стабилизирующими двухвалентными катионами во ВМ за взаимодействия с фосфолипидами в ЛПС, что приводит к нарушению структуры ВМ (16). Аналогичным образом, ЭДТА и слабые кислоты хелатируют двухвалентные катионы, что приводит к нарушению структуры ВМ (17). Также известно, что большая группа природных противомикробных пептидов и их синтетических пептидомиметиков (называемых в настоящей заявке AMP) проникают через ВМ путем самостимулируемого поглощения (18-20). Транслокация как поликатионных, так и амфипатических AMP осуществляется за счет первичного электростатического взаимодействия с ЛПС с последующим смещением катионов, нарушением структуры мембраны и образованием кратковременных пор, а в некоторых случаях за счет интернализации AMP. Противомикробная активность многих AMP, основанная на взаимодействии с мембраной, может быть «активирована» в крови с помощью рационального конструирования амфипатических доменов либо путем изменения гидрофобности, общего заряда и расположения полярных остатков в гидрофобной поверхности, либо путем встраивания остатков D, L вместо всех L-аналогов (18, 19, 21, 22).
[008] Авторы настоящего изобретения улучшили технологию на основе лизина для борьбы с грамотрицательными патогенами, применяя различные методики, чтобы обеспечить проникновение через ВМ, как изложено в настоящей заявке. Действительно, авторы настоящего изобретения ранее подали Международную заявку на патент PCT/US2016/052338, поданную 16 сентября 2016 г. и опубликованную как WO/2017/049233. Эта предыдущая заявка PCT полностью включена в настоящую заявку посредством ссылки для всех целей. Например, лизины GN2, GN4, GN14, GN43 и GN37 были впервые раскрыты в вышеупомянутой заявке PCT.
[009] Вы недавних исследованиях были идентифицированы лизины с собственной противомикробной активностью против грамотрицательных бактерий (12, 13, 17). Противомикробный эффект в некоторых случаях обусловлен N- или C-концевыми амфипатическими или поликатионными α-спиральными доменами, которые опосредуют проникновение через ЛПС и транслокацию через ВМ, что приводит к разрушению ПГ и осмотическому лизису. Интересно отметить, что доступ таких лизинов к ПГ может быть облегчен с помощью соединений, дестабилизирующих ВМ, включая ЭДТА и слабые органические кислоты. Несмотря на то, что комбинации с ЭДТА и слабыми органическими кислотами не применяются на практике в качестве лекарственных средств, полученные результаты иллюстрируют концепцию облегчения активности GN-лизина.
[0010] В более недавнем подходе применяют GN-лизины, гибридизованные с конкретными α-спиральными доменами, обладающими поликатионными, амфипатическими и гидрофобными признаками, чтобы стимулировать транслокацию через ВМ. Эти результаты привели к появлению GN-лизинов, называемых «артилизины», которые очень активны in vitro и предназначены для местного применения (17). Однако сообщалось о низкой активности артилизинов in vivo. Соответственно, артилизин GN126, перечисленный в качестве контроля в настоящем изобретении (см. таблицу 4), также проявлял низкую активность.
[0011] Несмотря на эффективность артилизинов и лизинов in vitro, включая GN-лизины, с собственной противомикробной активностью, остается серьезное ограничение в отношении явного отсутствия активности в матриксах крови человека, что делает системную терапию проблематичной (13, 14). Как полагают, физиологическая соль и двухвалентные катионы конкурируют за сайты связывания ЛПС и служат помехой для α-спиральных доменов транслокации лизинов, включая GN-лизины, что ограничивает активность в крови и, более конкретно, в присутствии сыворотки, ограничивая таким образом возможность применения лизинов для лечения инвазивных инфекций (23). Аналогичное отсутствие активности в крови сообщалось для нескольких различных AMP, проникающих через ВМ и дестабилизирующих ее (18-20, 22).
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0012] Основной проблемой дизайна, стоящей перед разработкой GN-лизина для лечения инвазивных инфекций путем системного введения, является необходимость ослабления инактивации в крови (или, например, в сыворотке человека).
[0013] Нативные GN-лизины с собственной активностью (т. е. с высоким уровнем активности в HEPES-буфере и низким уровнем активности в сыворотке человека) сначала идентифицировали, а затем модифицировали путем замены заряженных аминокислот незаряженными аминокислотами и/или путем гибридизации с альфа-спиральным противомикробным пептидом для улучшения активности и улучшения активности в сыворотке.
[0014] Основываясь на этой работе, были идентифицированы предполагаемые нативные лизины, и их активность была оценена. Лизины перечислены в таблице 3 и описаны по их последовательностям. Немодифицированные лизины проявляют различные уровни активности в присутствии сыворотки человека.
[0015] Модификации белков лизина были основаны на следующем: i) встраивание замен аминокислот в белок лизина для изменения общей pI молекулы, чтобы облегчить проникновение через ВМ или уменьшить чувствительность к сыворотке человека или как для первого, так и для второго; и/или ii) гибридизация последовательности противомикробного пептида (предпочтительно того, который, как известно, активен в сыворотке) с N- или C-концом лизина с образованием гибридного полипептида, чтобы облегчить проникновение через внешнюю мембрану и транслокацию через нее.
[0016] Модифицированные GN-лизины были получены с помощью модификации белков лизина, как описано в настоящей заявке. Показано, что модифицированные GN-лизины проявляют улучшенную активность в сыворотке человека по сравнению с активностью исходных (немодифицированных) лизинов. Заряженные остатки аминокислот нативных белков лизина подвергали случайному мутагенезу для замены незаряженными остатками аминокислот, и испытывали активность полученных полипептидов, включая активность в присутствии сыворотки человека. Активные модифицированные полипептиды, как правило, отличались от исходных полипептидов по 1-3 остаткам аминокислот. Альтернативно или дополнительно последовательности противомикробных пептидов (AMP) гибридизовали на последовательности нативных или модифицированных GN-лизинов с применением линкера или без него. Противомикробные пептиды характеризуются альфа-спиральным доменом, опосредующим разрушение внешней мембраны и транслокацию лизина. Линкеры представляют собой короткие пептидные последовательности от 5 до 20 аминокислот в длину, которые являются гибкими (например, богаты остатками серина и/или глицина) и предназначены для обеспечения свободного движения как AMP, так и лизиновой части гибридного полипептида, без нарушения их структуры.
[0017] Каждый из предполагаемых лизинов и модифицированных GN-лизинов, описанных в настоящей заявке, был или может быть очищен до >90% гомогенности и исследован в ряде анализов для оценки активности in vitro.
[0018] Настоящее изобретение включает полипептиды лизина и модифицированные полипептиды лизина, которые получены синтетически и/или рекомбинантно. Настоящее изобретение включает новые полипептиды лизина и модифицированные полипептиды лизина, а также применение указанных полипептидов для лечения инфекций, вызванных грамотрицательными бактериями, и, в частности, в присутствии матриксов крови, например, сыворотки человека.
[0019] Более того, настоящее изобретение включает применение полипептидов лизина и модифицированных полипептидов лизина для разрушения биопленок, содержащих грамотрицательные микроорганизмы, например, в протезах или других медицинских устройствах, in vivo, ex vivo или in vitro. Грамотрицательные микроорганизмы биопленок включают виды Pseudomonas, например, Pseudomonas aeruginosa.
[0020] Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции или лекарственному составу, содержащим эффективное количество выделенного полипептида лизина, имеющего аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 4, 5 - 9 и SEQ ID NO: 13 - 27, или пептида, который по меньшей мере на 80% идентичен указанным последовательностям, причем указанный пептид обладает литической активностью, при этом указанный полипептид лизина ингибирует рост или уменьшает популяцию, или уничтожает по меньшей мере одного вида грамотрицательных бактерий; и фармацевтически приемлемый носитель.
[0021] Согласно одному варианту реализации фармацевтическая композиция содержит эффективное количество по меньшей мере одного полипептида лизина, выбранного из группы, состоящей из пептидов GN3, CN147, GN146, GN156, GN54, GN92, GN121, GN94, GN9, GN10, GN13, GN17, GN105, GN108, GN123, GN150, GN200, GN201, GN203, GN204 и GN205, или его фрагмента, сохраняющего литическую активность, причем указанный полипептид лизина или фрагмент ингибирует рост или уменьшает популяцию по меньшей мере одного вида грамотрицательных бактерий; и фармацевтически приемлемый носитель.
[0022] Фармацевтические композиции/лекарственные составы согласно настоящему изобретению, в одном варианте реализации, содержат эффективное количество по меньшей мере одного полипептида лизина и по меньшей мере одного антибиотика, подходящего для лечения грамотрицательных бактерий. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения композиция представляет собой комбинацию двух компонентов, которые должны быть введены комбинировано или по отдельности, один из которых содержит лизин в соответствии с настоящим изобретением, а другой содержит антибиотик. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антибиотик обеспечен в субоптимальной дозе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антибиотик может представлять собой антибиотик, к которому у грамотрицательных бактерий развилась устойчивость, лизин применяют для преодоления этой устойчивости.
[0023] Согласно некоторым вариантам реализации композиции (с антибиотиком или без него) или комбинации (с лизином и антибиотиком) согласно настоящему изобретению адаптированы для перорального, местного, парентерального или ингаляционного введения. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения один компонент комбинации может быть адаптирован для введения другим путем, чем другой компонент. Например, в экспериментах, подробно описанных ниже, антибиотики вводят подкожно (п/к), в то время как лизины вводят внутривенно (в/в).
[0024] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения антибиотик может быть выбран из перечня антибиотиков, подходящих для грамотрицательных бактерий, представленного ниже, и их комбинаций. В более конкретном варианте реализации антибиотик может быть выбран из амикацина, азитромицина, азтреонама, ципрофлоксацина, колистина, рифампицина, карбапенемов и тобрамицина и комбинаций двух или более из вышеупомянутых.
[0025] Определенные варианты реализации настоящего изобретения предусматривают стерильный контейнер, который содержит одну из вышеупомянутых фармацевтических композиций, содержащих полипептид лизина и необязательно один или более дополнительных компонентов. В качестве примера, но не ограничиваясь этим, стерильный контейнер представляет собой один компонент набора; набор также может содержать, например, второй стерильный контейнер, который содержит по меньшей мере один дополнительный терапевтический агент. Таким образом, одна из комбинаций GN-антибиотика и GN-лизина, раскрытых в настоящей заявке, необязательно может быть обеспечена в таком наборе.
[0026] Согласно одному аспекту настоящее изобретение включает вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует пептид лизина, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 4, 5 - 9 и SEQ ID NO: 13 - 27, или пептид, который по меньшей мере на 80% идентичен указанным последовательностям, причем указанный пептид обладает литической активностью, при этом указанный кодируемый полипептид лизина ингибирует рост или уменьшает популяцию, или уничтожает по меньшей мере одного вида грамотрицательных бактерий в отсутствие или в присутствии сыворотки человека.
[0027] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения вектор представляет собой рекомбинантный вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую один из вышеупомянутых полипептидов лизина, включая его варианты, которые имеют по меньшей мере 80% идентичность последовательности, причем указанный кодируемый пептид лизина обладает свойством ингибировать рост или уменьшать популяцию по меньшей мере одного вида грамотрицательных бактерий в отсутствие и/или в присутствии сыворотки человека, при этом указанная нуклеиновая кислота функционально связана с гетерологичным промотором.
[0028] Также предусмотрена клетка-хозяин, содержащая вышеупомянутые векторы. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой последовательность кДНК.
[0029] Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к выделенной, очищенной нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид лизина, содержащий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 4, 5 - 9 и SEQ ID NO: 13 - 27. Согласно альтернативному варианту реализации настоящего изобретения выделенная очищенная нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 33 - SEQ ID NO: 54, их вырожденного кода и их транскриптов. В соответствии с вариантами реализации, представленными в настоящей заявке, определенная нуклеиновая кислота включает не только идентичную нуклеиновую кислоту, но также любые незначительные изменения оснований, включая, в частности, замены, приводящие к получению синонимичного кодона (другой кодон, определяющий тот же остаток аминокислоты). Таким образом, считается, что формула изобретения, относящаяся к нуклеиновой кислоте, включает последовательность, комплементарную любой указанной одноцепочечной последовательности. Необязательно нуклеиновая кислота представляет собой кДНК.
[0030] Согласно другим аспектам настоящее изобретение относится к различным способам/вариантам применения. Одним из них является способ/применение для ингибирования роста или уменьшения популяции, или уничтожения по меньшей мере одного вида грамотрицательных бактерий, причем указанный способ включает приведение бактерий в контакт с композицией, содержащей эффективное количество полипептида GN-лизина, содержащего последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 4, 5 - 9 и SEQ ID NO: 13 - 27, или пептида, который по меньшей мере на 80% идентичен указанным последовательностям, причем указанный пептид обладает литической активностью в течение периода времени, достаточного для того чтобы ингибировать указанный рост или уменьшить указанную популяцию, или привести к уничтожению указанного по меньшей мере одного вида грамотрицательных бактерий в отсутствие и/или в присутствии сыворотки человека.
[0031] Другой такой способ/применение предназначен (о) для ингибирования роста или уменьшения популяции, или уничтожения по меньшей мере одного вида грамотрицательных бактерий, причем указанный способ включает приведение бактерий в контакт с композицией, содержащей эффективное количество по меньшей мере одного полипептида GN-лизина, выбранного из группы, состоящей из GN-лизинов, описанных в SEQ ID NO: 2, 4, 5 - 9 и SEQ ID NO: 13 - 27, или их активных фрагментов, причем указанный полипептид или активный фрагмент обладает свойством ингибировать рост или уменьшать популяцию, или приводить к уничтожению P. aeruginosa и необязательно по меньшей мере одного другого вида грамотрицательных бактерий в отсутствие и/или в присутствии сыворотки человека.
[0032] Другой способ/медицинское применение предназначен (о) для лечения бактериальной инфекции, вызванной грамотрицательной бактерией, такой как P. aeruginosa или A. baumannii, и включает введение одной или более из вышеупомянутых композиций субъекту, у которого диагностирована, который подвержен риску или у которого наблюдаются симптомы бактериальной инфекции.
[0033] В любом из вышеупомянутых способов/вариантов медицинского применения грамотрицательная бактерия представляет собой по меньшей мере одну, выбранную из группы, состоящей из Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, E. coli, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, Salmonella spp., N. gonorrhoeae и Shigella spp. Согласно другому варианту грамотрицательная бактерия представляет собой Pseudomonas aeruginosa.
[0034] Другой способ/медицинское применение предназначен (о) для лечения или предотвращения местной или системной патогенной бактериальной инфекции, вызванной грамотрицательными бактериями, и включает введение субъекту, нуждающемуся в лечении, одной из вышеупомянутых композиций. Местные инфекции включают инфекции, которые можно лечить путем локального или местного применения антибактериального агента. Примеры местных инфекций включают инфекции, ограниченные конкретным местом, таким как орган или ткань, или имплантированный протез, или другое медицинское устройство. Примеры включают инфекции кожи, десен, инфицированные раны, инфекции уха и т. д., инфекции в области, в которой установлен катетер и т. д.
[0035] Другой такой способ/медицинское применение предназначен (о) для предотвращения или лечения бактериальной инфекции и включает совместное введение субъекту, у которого диагностирована, который подвержен риску или у которого наблюдаются симптомы бактериальной инфекции, комбинации первого эффективного количества одной из вышеупомянутых композиций и второго эффективного количества антибиотика, подходящего для лечения инфекции, вызванной грамотрицательными бактериями.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Определения
[0036] В настоящей заявке следующие термины и родственные им слова должны иметь значения, представленные для них ниже, если контекст явно не указывает иное.
[0037] «Носитель», применительно к фармацевтическим композициям, относится к разбавителю, вспомогательному веществу, добавке или носителю, с которыми вводят активное соединение. Такие фармацевтические носители могут представлять собой стерильные жидкости, такие как вода, физиологические солевые растворы, водные растворы декстрозы, водные растворы глицерина, а также масла, включая масла нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и тому подобное. Другие примеры включают дисперсионные среды, солюбилизирующие агенты, покрытия, консерванты, изотонические и замедляющие всасывание агенты, поверхностно-активные вещества, пропелленты и тому подобное. Подходящие фармацевтические носители описаны в «Remington's Pharmaceutical Sciences», под ред. E.W. Martin, 18 изд.
[0038] «Фармацевтически приемлемый носитель» включает любой из вышеупомянутых носителей, которые являются физиологически совместимыми. Носитель (и) должен (должны) быть «приемлемым (ми)» в смысле их безвредности для субъекта, подлежащего лечению, в количествах, как правило, применяемых в лекарственных средствах. Фармацевтически приемлемые носители совместимы с другими ингредиентами композиции и не делают композицию неподходящей для предполагаемой цели ее применения. Кроме того, фармацевтически приемлемые носители являются подходящими для применения у субъектов, как предусмотрено в настоящей заявке, без неоправданных нежелательных побочных эффектов (таких как токсичность, раздражение и аллергическая реакция). Побочные эффекты являются «неоправданными», когда их риск превышает пользу, обеспечиваемую композицией.
[0039] «Бактерицидный», применительно к агенту, обычно означает наличие способности вызывать гибель бактерий или способности уничтожать бактерии в степени, которая соответствует уменьшению на по меньшей мере 3-log10 (99,9%) или более исходной популяции бактерий в течение 18-24 часового периода.
[0040] «Бактериостатический» обычно означает наличие способности ингибировать рост бактерий, включая ингибирование роста бактериальных клеток, вызывая таким образом уменьшение на 2-log (99%) или более и до немного менее 3-log исходной популяции бактерий в течение 18-24-часового периода.
[0041] «Антибактериальный», применительно к агенту, в общем случае используется для включения как бактериостатических, так и бактерицидных агентов.
[0042] «Антибиотик» относится к антибиотическому соединению, которое может представлять собой либо соединение, влияющее на биосинтез пептидогликана клеточной стенки, соединение, влияющее на целостность клеточной мембраны, либо соединение, влияющее на синтез ДНК или белка у бактерий. Неограничивающие примеры антибиотиков, активных против грамотрицательных бактерий, включают цефалоспорины, такие как цефтриаксон-цефотаксим, цефтазидим, цефепим, цефоперазон, цефтобипрол, фторхинолоны, такие как ципрофлоксацин, левофлоксацин, аминогликозиды, такие как гентамицин, тобрамицин, амикацин, пиперациллин, тикарциллин, карбапенемы, такие как имипенем, меропенем, дорипенем, другие бета-лактамные антибиотики, активные против грамотрицательных бактерий, такие как пенициллины широкого спектра действия с ингибиторами бета-лактамазы или без них, ансамицины, такие как рифампицин, и бактерицидные полипептиды, такие как полимиксин B и колистин.
[0043] «Устойчивый к лекарственным средствам», применительно к патогену и, более конкретно, бактерии, обычно относится к бактерии, которая устойчива к антибактериальной активности лекарственного средства. При более конкретном использовании устойчивость к лекарственным средствам конкретно относится к устойчивости к антибиотикам. В некоторых случаях бактерия, которая обычно восприимчива к конкретному антибиотику, может выработать устойчивость к антибиотику, в результате чего она становится микроорганизмом или штаммом, устойчивым к лекарственным средствам. Патоген с «множественной лекарственной устойчивостью» («MDR») представляет собой патогена, у которого развилась устойчивость к по меньшей мере двум классам противомикробных лекарственных средств, каждое из которых используется в виде монотерапии. Например, было обнаружено, что определенные штаммы P. aeruginosa устойчивы к нескольким антибиотикам, включая, помимо прочих, цефтолозан-тазобактам, цефтазидим, цефепим, пиперациллин-тазобактам, азтреонам, имипенем, меропенем, ципрофлоксацин, тикарциллин, тобрамицин, амикацин и колистин. Специалист в данной области техники может легко определить, является ли бактерия устойчивой к лекарственным средствам, используя обычные лабораторные методики, которые позволяют определить восприимчивость или устойчивость бактерии к лекарственному средству или антибиотику. См., например, Cabot, G. et al, 2016, Antimicrob. Agents and Chemother. 60(3):1767, DOI: 10.1128/AAC.02676-15; и (Antibiotic Resistant Threats in the United States, 2013, Министерство здравоохранения и социальных служб США, Центры по контролю и предотвращению заболеваний).
[0044] «Эффективное количество» относится к количеству, которое, при применении или введении с соответствующей частотой или схемой дозирования, является достаточным для предотвращения, уменьшения, ингибирования или устранения роста бактерий или бактериальной нагрузки или предотвращения, уменьшения или улучшения начала, степени тяжести, продолжительности или прогрессирования нарушения, которое лечат (в настоящей заявке роста грамотрицательного бактериального патогена или инфекции им), предотвращения прогрессирования нарушения, которое лечат, вызова регрессии нарушения, которое лечат, или усиления или улучшения профилактического (их) или терапевтического (их) эффекта (-ов) другой терапии, такой как терапия антибиотиками или бактериостатиками. Подходящий диапазон эффективного количества для полипептидов согласно настоящему изобретению будет составлять от приблизительно 0,01 мг/кг до приблизительно 50 мг/кг, при этом типичный диапазон составляет от приблизительно 0,01 до 25 мг/кг, а обычный диапазон составляет от приблизительно 0,01 до приблизительно 10 мг/кг. Предусмотрены корректировки в сторону увеличения нижнего предела в зависимости от эффективности конкретного лизина; также предусмотрены корректировки в сторону уменьшения верхнего предела главным образом в зависимости от токсичности конкретного лизина. Такие корректировки находятся в пределах квалификации в данной области техники. Кроме того, если лизин вводят одновременно с антибиотиком, количество лизина можно корректировать на основании количества, необходимого для повторной сенсибилизации бактерий-мишеней к антибиотику, вводимому одновременно.
[0045] «Совместное введение» подразумевает включение отдельного введения полипептида лизина и антибиотика или любого другого антибактериального агента последовательным образом, а также введение этих агентов по существу одновременно, например, в одной смеси/композиции или в дозах, вводимых по отдельности, но, тем не менее, вводимых субъекту по существу одновременно, например, в разные моменты времени в один и тот же день или в течение 24-часового периода. Такое совместное введение полипептидов лизина с одним или более дополнительными антибактериальными агентами может быть обеспечено в виде непрерывного лечения, длящегося в течение периода до дней, недель или месяцев. Кроме того, в зависимости от применения, совместное введение не обязательно должно быть непрерывным или одинаковым по продолжительности. Например, если применение в качестве местного антибактериального агента использовали для лечения, например, бактериальной язвы или инфицированной диабетической язвы, лизин мог быть введен только вначале в течение 24 часов после первого применения антибиотика, а затем можно продолжать применение антибиотика без дополнительного введения лизина.
[0046] «Субъект» относится к субъекту, подлежащему лечению, и включает, помимо прочего, млекопитающее, растение, низшее животное, одноклеточный организм или культуру клеток. Например, термин «субъект» предназначен для включения организмов, например, прокариот и эукариот, которые восприимчивы к бактериальным инфекциям или поражены ими, например, инфекциям, вызванным грамотрицательными бактериями. Примеры субъектов включают млекопитающих, например, людей, собак, коров, лошадей, свиней, овец, коз, кошек, мышей, кроликов, крыс и трансгенных животных, отличных от человека. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения субъект представляет собой человека, например, человека, страдающего, подверженного риску или восприимчивого к инфекции, вызванной грамотрицательными бактериями, против которых эффективен лизин дикого типа (исходный), вне зависимости от того, является ли такая инфекция системной, местной или локализованной иным образом, или ограниченной конкретным органом или тканью.
[0047] В настоящей заявке «полипептид» используется взаимозаменяемо с термином «белок» и «пептид» и относится к полимеру, полученному из остатков аминокислот и обычно имеющему по меньшей мере приблизительно 30 остатков аминокислот. Термин включает не только полипептиды в выделенной форме, но также их активные фрагменты и производные. Термин «полипептид» также включает гибридные белки или гибридные полипептиды, содержащие полипептид лизина, описанный ниже, и сохраняющие функцию лизина. В зависимости от контекста полипептид или белок, или пептид может представлять собой природный полипептид или рекомбинантный, сконструированный или полученный синтетическим способом полипептид. Конкретный полипептид лизина, например, может происходить или может быть выделен из нативного белка (т. е. белок с аминокислотной последовательностью, идентичной последовательности, выделенной для этого белка из природных источников) с помощью ферментативного или химического расщепления или может быть получен с использованием обычных методик синтеза пептидов (например, твердофазного синтеза) или методик молекулярной биологии (таких как те, которые раскрыты в Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), или может быть рационально усечен или сегментирован с получением активных фрагментов, сохраняя активность лизина против той же или по меньшей мере одной общей бактерии-мишени.
[0048] «Гибридный полипептид» относится к продукту экспрессии, полученному в результате гибридизации двух или более сегментов нуклеиновой кислоты с получением гибридного продукта экспрессии, который, как правило, имеет два домена или сегмента с различными свойствами или функциональностью. В более конкретном смысле термин «гибридный полипептид» также относится к полипептиду или пептиду, содержащему два или более гетерологичных полипептидов или пептидов, ковалентно связанных либо непосредственно, либо за счет аминокислотного или пептидного линкера. Полипептиды, образующие гибридный полипептид, как правило, связаны С-концом с N-концом, несмотря на то, что они также могут быть связаны С-концом с С-концом, N-концом с N-концом или N-концом с С-концом. Термин «гибридный полипептид» может быть использован взаимозаменяемо с термином «гибридный белок». Таким образом, неограничивающее выражение «полипептид, содержащий» определенную структуру включает молекулы большего размера, чем указанная структура, такие как гибридные полипептиды.
[0049] «Гетерологичный» относится к нуклеотидным, пептидным или полипептидным последовательностям, которые не являются смежными в природных условиях. Например, применительно к настоящему изобретению термин «гетерологичный» может быть использован для описания комбинации или гибрида двух или более пептидов и/или полипептидов, причем указанный гибридный пептид или полипептид обычно не встречается в природе, например, полипептид лизина или его активный фрагмент и катионный и/или поликатионный пептид, амфипатический пептид, sushi-пептид (Ding et al. Cell Mol Life Sci., 65(7-8):1202-19 (2008)), пептид дефензина (Ganz, T. Nature Reviews Immunology 3, 710-720 (2003)), гидрофобный пептид и/или противомикробный пептид, который может обладать повышенной активностью лизина. В это определение включены два или более полипептидов лизина или их активных фрагментов. Их можно применять для получения гибридного полипептида с активностью лизина.
[0050] «Активный фрагмент» относится к части полноразмерного полипептида, раскрытого в настоящей заявке, которая сохраняет одну или более функций или видов биологической активности выделенного полипептида, из которого был получен фрагмент, например, бактерицидную активность против одной или более грамотрицательных бактерий, или, более конкретно, литическую активность, вне зависимости от того, сохраняет ли она способность связываться с внешней мембраной.
[0051] «Амфипатический пептид» относится к пептиду, имеющему как гидрофильные, так и гидрофобные функциональные группы. Предпочтительно вторичная структура обеспечивает размещение гидрофобных и гидрофильных остатков аминокислот на противоположных сторонах (например, внутренняя сторона по сравнению с внешней стороной) амфипатического пептида. Эти пептиды часто принимают спиральную вторичную структуру.
[0052] «Катионный пептид» относится к пептиду, имеющему высокий процент положительно заряженных остатков аминокислот. Предпочтительно катионный пептид имеет значение pKa 8,0 или выше. Термин «катионный пептид», применительно к настоящему изобретению, также включает поликатионные пептиды, которые представляют собой пептиды, полученные синтетическим способом, состоящие в основном из положительно заряженных остатков аминокислот, в частности, остатков лизина и/или аргинина. Остатки аминокислот, которые не являются положительно заряженными, могут представлять собой нейтрально заряженные остатки аминокислот и/или отрицательно заряженные остатки аминокислот и/или гидрофобные остатки аминокислот.
[0053] «Гидрофобная группа» относится к химической группе, такой как боковая цепь аминокислоты, которая имеет низкую аффинность в отношении молекул воды или не обладает такой аффинностью, но более высокую аффинность в отношении молекул масла. Гидрофобные вещества склонны иметь низкую растворимость в воде или водных фазах или не обладают такой растворимостью и, как правило, являются неполярными, но склонны иметь более высокую растворимость в масляных фазах. Примеры гидрофобных аминокислот включают глицин (Gly), аланин (Ala), валин (Val), лейцин (Leu), изолейцин (Ile), пролин (Pro), фенилаланин (Phe), метионин (Met) и триптофан (Trp).
[0054] «Повышение», применительно к настоящему изобретению, означает, что степень противомикробной активности выше, чем она была бы в ином случае. «Повышение» включает аддитивные, а также синергические (супераддитивные) эффекты. Например, структурные модификации нативных лизинов в соответствии с настоящим изобретением служат для повышения активности лизина в присутствии сыворотки.
[0055] «Синергический» или «сверхаддитивный» в отношении эффекта означает благоприятный эффект, обусловленный двумя активными веществами в комбинации, который превышает, предпочтительно значительно, сумму эффектов двух агентов, действующих независимо. Один или оба активных ингредиента можно применять на подпороговом уровне, т. е. на уровне, при котором активное вещество, если оно применяется отдельно, не вызывает эффекта или он является очень незначительным (или самое меньшее на субоптимальном уровне, т. е. на уровне, при котором активное вещество вызывает эффект, который значительно ниже его максимального эффекта). Согласно другому варианту эффект может быть измерен с помощью анализов, таких как анализ методом «шахматной доски», описанных в настоящей заявке.
[0056] «Лечение» относится к любому способу, действию, применению, терапии или тому подобному, при которых субъекту, включая человека, оказывают медицинскую помощь с целью излечения нарушения или устранения патогена, или улучшения состояния субъекта, непосредственно или косвенно. Лечение также относится к уменьшению заболеваемости или ослаблению симптомов, устранению рецидива, предотвращению рецидива, предотвращению заболеваемости или уменьшению риска заболеваемости, улучшению симптомов, улучшению прогноза или их комбинациям. «Лечение» также включает уменьшение популяции, скорости роста или вирулентности бактерий у субъекта и посредством этого контроль или уменьшение бактериальной инфекции у субъекта или бактериального загрязнения органа или ткани, или окружающей среды. Таким образом, «лечение», которое приводит к уменьшению заболеваемости, является эффективным для ингибирования роста по меньшей мере одной грамположительной бактерии в конкретной среде, будь то субъект или окружающая среда. С другой стороны, «лечение» уже развившейся инфекции относится к уменьшению популяции или уничтожению, ингибированию роста, включая даже устранение, грамположительных бактерий, обуславливающих инфекцию или загрязнение.
[0057] Термин «предотвращение» включает предотвращение заболеваемости, рецидива, распространения, начала или развития нарушения, такого как бактериальная инфекция. Не предусмотрено, что настоящее изобретение ограничено полным предотвращением или предотвращением развития инфекции. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения начало отсрочено, или степень тяжести впоследствии приобретенного заболевания или вероятность приобретения заболевания уменьшается, и это составляет примеры предотвращения.
[0058] Приобретенные заболевания, применительно к настоящему изобретению, включают те, которые проявляются клиническими или субклиническими симптомами, такими как обнаружение лихорадки, сепсиса или бактериемии (BSI), а также обнаружение роста бактериального патогена (например, в культуре), когда симптомы, ассоциированные с такой патологией, еще не проявляются.
[0059] Термин «производное», применительно к пептиду или полипептиду (который, как указано в настоящей заявке, включает активный фрагмент) предназначен для включения, например, полипептида, модифицированного так, чтобы он содержал одну или более химических групп, отличных от аминокислоты, которые не оказывают существенного нежелательного влияния на активность лизина или не нарушают ее. Химическая группа может быть ковалентно связана с пептидом, например, за счет амино-концевого остатка аминокислоты, карбокси-концевого остатка аминокислоты или у внутреннего остатка аминокислоты. Такие модификации включают добавление защитной или кэпирующей группы на реакционноспособную группу, добавление обнаруживаемой метки, такой как антитело и/или флуоресцентная метка, добавление или модификацию гликозилирования или добавление объемной группы, такой как ПЭГ (пегилирование), и другие изменения, которые не оказывают существенного нежелательного влияния на активность полипептида лизина или не нарушают ее. Обычно применяемые защитные группы, которые могут быть добавлены к полипептидам лизина, включают, но не ограничиваются ими, t-Boc и Fmoc. Обычно применяемые белки флуоресцентной метки, такие как, но не ограничиваясь ими, зеленый флуоресцентный белок (GFP), красный флуоресцентный белок (RFP), голубой флуоресцентный белок (CFP), желтый флуоресцентный белок (YFP) и mCherry, являются компактными белками, которые могут быть связаны ковалентно или нековалентно с полипептидом лизина или гибридизованы с полипептидом лизина без нарушения нормальных функций клеточных белков. Как правило, полинуклеотид, кодирующий флуоресцентный белок, вставлен в 5'-направлении или 3'-направлении относительно последовательности полинуклеотида лизина. Это позволяет получить гибридный белок (например, полипептид лизина::GFP), который не нарушает клеточную функцию или функцию полипептида лизина, к которому он присоединен. Конъюгацию полиэтиленгликоля (ПЭГ) с белками применяют в качестве способа увеличения длительности периода полужизни в кровотоке многих фармацевтических белков. Таким образом, применительно к производным полипептида лизина термин «производное» включает полипептиды лизина, химически модифицированные с помощью ковалентного присоединения одной или более молекул ПЭГ. Как ожидается, пегилированные полипептиды лизина проявят пролонгированный период полужизни в кровотоке по сравнению с непегилированными полипептидами лизина, сохраняя при этом биологическую и терапевтическую активность. Другим примером является применение «артилизинов», при этом короткие поликатионные и амфипатические альфа-спирали присоединяют к N- или C-концам стрептококкового лизина для улучшения антистрептококковой активности in vitro (Rodriguez-Rubio et al., 2016).
[0060] «Процент идентичности аминокислотной последовательности» в отношении последовательностей полипептидов лизина определяется в настоящей заявке как процент остатков аминокислот в последовательности-кандидате, которые идентичны остаткам аминокислот в конкретной последовательности полипептида лизина после выравнивания последовательностей и введения пробелов, при необходимости, чтобы достичь максимального процента идентичности последовательностей и без учета каких-либо консервативных замен как части идентичности последовательностей. Выравнивание в целях определения процента идентичности аминокислотной последовательности можно осуществлять различными способами, которые находятся в пределах квалификации в данной области техники, например, с использованием общедоступного программного обеспечения, такого как BLAST, или коммерчески доступного программного обеспечения, например, от DNASTAR. Две или более полипептидных последовательностей могут быть на 0-100% идентичными в любом месте или на любое целочисленное значение в пределах указанных значений. Применительно к настоящему изобретению два полипептида являются «по существу идентичными», когда по меньшей мере 80% остатков аминокислот (предпочтительно по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90% и предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95%) являются идентичными.
[0061] Термин «процент (%) идентичности аминокислотной последовательности», описанный в настоящей заявке, также применим к пептидам лизина. Таким образом, термин «по существу идентичный» будет включать мутированные, усеченные, гибридные варианты или варианты с модифицированной иным образом последовательностью выделенных полипептидов лизина и пептидов, описанных в настоящей заявке, и их активные фрагменты, а также полипептиды с существенной идентичностью последовательности (например, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичностью, измеренной, например, с помощью одного или более способов, указанных выше), по сравнению с эталонным (дикого типа или другим интактным) полипептидом. Две аминокислотные последовательности являются «по существу гомологичными», когда по меньшей мере приблизительно 80% остатков аминокислот (предпочтительно по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90% и предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95% или 98%) являются идентичными или представляют собой консервативные замены. Последовательности полипептидов лизина согласно настоящему изобретению являются по существу гомологичными, когда одна или более, или несколько, или до 10%, или до 15%, или до 20% аминокислот полипептида лизина замещены сходной или консервативной заменой аминокислоты, и при этом полученный лизин имеет профиль видов активности, антибактериальных эффектов и/или видов специфичности в отношении бактерий как и у полипептидов лизина, раскрытых в настоящей заявке. Значение «по существу гомологичный», описанное в настоящей заявке, относится также к пептидам лизина.
[0062] «Ингалируемая композиция» относится к фармацевтическим композициям согласно настоящему изобретению, которые изготовлены для непосредственной доставки в дыхательные пути во время или в сочетании с обычным или искусственным дыханием (например, с помощью интратрахеобронхиального, легочного и/или назального введения), включая, но не ограничиваясь ими, мелкодисперсные, распыленные, сухие порошковые и/или аэрозольные составы.
[0063] «Биопленка» относится к бактериям, которые прикрепляются к поверхностям и агрегируют в гидратированном полимерном матриксе, который может состоять из компонентов, происходящих из бактерий и/или хозяина. Биопленка представляет собой агрегат микроорганизмов, в котором клетки прилипают друг к другу на биотической или абиотической поверхности. Эти прилипшие клетки часто внедрены в матрикс, состоящий из внеклеточного полимерного вещества (EPS), но не ограничиваясь этим. Биопленка EPS, которую также называют слизью (несмотря на то, что не все, описываемое как слизь, представляет собой биопленку) или бляшкой, представляет собой полимерный конгломерат, обычно состоящий из внеклеточной ДНК, белков и полисахаридов.
[0064] «Подходящий», применительно к антибиотику, подходящему для применения против определенных бактерий, относится к антибиотику, который, как было обнаружено, является эффективным против этих бактерий, даже если впоследствии развивается устойчивость.
[0065] Идентификация лизинов с бактерицидной активностью против P. aeruginosa в сыворотке человека. Настоящее изобретение основано на идентификации пяти лизинов с сильной антибактериальной активностью против штамма Pseudomonas aeruginosa PAOl в экспоненциальной фазе роста (примеры 1 и 2). Этот штамм является типичным для штаммов P. aeruginosa. Для идентификации полипептидов лизина согласно настоящему изобретению авторы настоящего изобретения использовали подход, основанный на биоинформатике, в сочетании с антибактериальным скринингом. Предполагаемые лизины и лизиноподобные молекулы (см. таблицу 1) были идентифицированы в базе данных GenBank. Последовательности GenBank были аннотированы как гипотетические или предсказанные белки, а в некоторых случаях были перечислены как предполагаемые фаговые белки и/или предполагаемые лизины. Авторы настоящего изобретения не были осведомлены о каких-либо сообщениях об активности этих полипептидов. Их активность также не могла быть предсказана на основании их последовательности, а тем более их активность в присутствии сыворотки человека.
Таблица 1
[0066] Идентификация модифицированных лизинов с улучшенной бактерицидной активностью против P. aeruginosa в сыворотке человека. Пять лизинов, GN3, GN150, GN203, GN4 и GN37, применяли для получения 12 новых производных GN-лизина. См. таблицу 2. Предусмотрено, что модификации (замены аминокислот или гибридизацию N- или C-концевого пептида с применением линкера или без него) можно по отдельности или одновременно применять к нативному лизину или модифицированному лизину. Таким образом, например, добавление N- и/или C-концевого пептида, раскрытого в таблице 2, предусмотрено для модификации полипептидов лизина. В качестве более конкретного примера, пептид, который является частью GN156 или GN92, предусмотрен для GN147, даже если такая конструкция не была приведена в качестве примера в таблице 2. И такой пептид может быть добавлен, например, либо к GN4, либо к GN146. Другими словами, противомикробный пептид может быть гибридизован с N- или C-концом нативного лизина или лизина, модифицированного с помощью замен заряженных остатков аминокислот незаряженными остатками аминокислот. Кроме того, N-концевые и/или C-концевые пептиды и/или противомикробные пептиды могут быть соединены с полипептидом лизина за счет линкерного домена, например, линкерного домена, определенного в таблице 2, или другого подходящего линкера, описанного в этом разделе выше.
Таблица 2.
(WP_012273008.1/лизоцим)
(YP_002284361.1/лизоцим)
(YP_002284361.1/лизоцим)
(GPRRPRRPGRRAPV; SEQ ID NO:28)
(YP_002284361.1/лизоцим)
(KFFKFFKFFK; SEQ ID NO:29) с линкером (AGAGAGAGAGAGAGAGAS; SEQ ID NO:31)
(YP_002284361.1/лизоцим)
(KRKKRKKRK; SEQ ID NO:30) с линкером (AGAGAGAGAGAGAGAGAS; SEQ ID NO:31)
(WP_012273008.1/лизоцим)
(YP_002284361.1/лизоцим)
(WP_014102102.1/VanY)
(WP_014102102.1/VanY)
(KFFKFFKFFK; SEQ ID NO:29) с линкером (AGAGAGAGAGAGAGAGAS; SEQ ID NO:31)
(WP_034684053.1/VanY)
(YP_024745.1/VanY)
(WP_012273008.1/лизоцим)
(GPRRPRRPGRRAPV; SEQ ID NO:28)
[0067] Лизины и модифицированные GN-лизины, а также их аминокислотные последовательности согласно настоящему изобретению обобщены в таблице 3. Также в таблицу 3 включены немодифицированные лизины, раскрытые в WO/2017/049233, как указано выше.
Таблица 3
[0068] Для GN3 и GN4 (каждый является членом лизоцимоподобного суперсемейства) модифицированные производные GN147 и GN146, соответственно, были получены на основании введения двух замен аминокислот в положениях, эквивалентных тем, которые, как показано (31-33), улучшают антибактериальную активность лизоцима человека как in vitro (в буфере и/или средах), так и in vivo (в модели инфекции на животных).
[0069] Полипептид лизина GN3 был модифицирован для включения замен аминокислот, в частности, замен аминокислот R101D и R117H. В результате этого был получен модифицированный полипептид, GN147. Эти замены аминокислот привели к уменьшению pI с 9,98 в полипептиде GN3 до 9,39 в полипептиде GN147.
[0070] Лизин GN4 был модифицирован для включения замен аминокислот, в частности, K99D, R115H. В результате этого был получен модифицированный полипептид лизина GN146. Эти замены аминокислот привели к снижению pI с 9,58 в полипептиде GN4 до 8,01 в полипептиде GN146.
[0071] Положения для каждой мутации в GN3 и GN4 были рассчитаны на основании примерного сравнения с мутациями в лизоциме человека (HuLYZ), поскольку HuLYZ не обладает значительной гомологией как с GN3, так и с GN4 на уровне аминокислотной последовательности.
[0072] Несмотря на то, что лизины GN3 и GN4 не сходны с лизоцимом T4 на уровне аминокислот, они имеют сходный размер. Ряд их структур выявил заряженные остатки. Поэтому об эквивалентности судили исключительно по наличию заряженного остатка в GN3 и GN4 примерно в том же месте, как и в первичной последовательности лизоцима T4. Аналогичным образом, как описано выше, в целом заряженные аминокислоты были заменены теми, которые не имели заряда, и мутантов подвергали скринингу для определения активности.
[0073] Также были введены дополнительные модификации обоих полипептидов GN3 и GN4, включая добавление N-концевой пептидной последовательности (GPRRPRRPGRRAPV - SEQ ID NO:28), происходящей из гораздо большего противомикробного пептида (AMP), описанного Daniels and Schepartz, 2007 (34), с получением GN205 и GN156, соответственно.
[0074] Полипептиды GN-лизина могут быть дополнительно модифицированы с помощью добавления мутаций, модифицирующих pI. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения аминокислотные замены (R101D) и (R117H) были введены в лизин GN3 с получением лизина GN147. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения аминокислотные замены (K99D) и (R115H) были введены в лизин GN4 с получением лизина GN146.
[0075] Полипептид GN4 также был модифицирован с помощью добавления двух различных, описанных ранее N-концевых катионных AMP, либо KFFKFFKFFK (SEQ ID NO:29), либо KRKKRKKRK (SEQ ID NO:30) (35, 36), соединенных с GN4 за счет линкерного домена AGAGAGAGAGAGAGAGAS (SEQ ID NO:31), описанного ранее Briers et al. 2014 (36), с получением модифицированных лизинов GN92 и GN54, соответственно.
[0076] Модификации лизинов GN37, GN150 и GN203 (каждый является членом суперсемейства VanY) были получены с помощью добавления C-концевого AMP, RKKTRKRLKKIGKVLKWI (SEQ ID NO:32), разработанного ранее как производное миелоидного противомикробного пептида свиньи 36 (PMAP-36) (22). Модификация GN37, GN150 и GN203 с помощью добавления С-концевой пептидной последовательности RI18 привела к получению модифицированных производных GN121, GN200 и GN204, соответственно. Также была включена дополнительная модификация, посредством которой AMP (KFFKFFKFFK - SEQ ID NO:29) (35) и линкерный домен (AGAGAGAGAGAGAGAGAS - SEQ ID NO:31) (36), описанные выше, были присоединены к N-концу GN37 с получением модифицированного лизина GN94.
[0077] Как полагают, пептиды, применявшиеся для получения GN121, GN156, GN200, GN201, GN202, GN204 и GN205, ранее не использовались для модификации лизинов. Их применение было обосновано следующим образом: 1) при добавлении к указанному лизину предсказанная вторичная структура как AMP, так и лизина существенно не изменяется или не изменяется вообще (как определено с использованием известной программы предсказания структуры белка), 2) эти пептиды ранее были описаны в литературе, как обладающие сильной активностью; и 3) авторы настоящего изобретения испытали эти AMP в сыворотке и обнаружили сильную активность. То же самое относится к пептиду, примененному в GN92 и GN9. Однако в этих конструкциях для соединения AMP с лизином также была использована линкерная последовательность с получением соответствующей вторичной структуры AMP (очень сходной со структурой свободного AMP), когда AMP гибридизован с лизином.
[0078] В случае GN54 оба AMP и линкер ранее использовались для модификации лизинов, но в литературе отсутствовали сообщения об активности в сыворотке. GN54 действительно активен в сыворотке.
[0079] Лизины GN3, GN9, GN10, GN13, GN17, GN105, GN108, GN123 и GN150 были синтезированы и/или получены рекомбинантно, очищены до (>90%) гомогенности и исследованы в ряде анализов активности. Анализ МИК выполняли с использованием Pseudomonas aeruginosa, культивируемого в двух типах сред, CAA и CAA с добавлением 25% сыворотки человека («CAA/HuS»). Активность многих GN-лизинов (включая контрольный лизоцим T4 в таблице 4) подавлена как в CAA, так и в CAA/HuS.
Для набора из 9 новых GN-лизинов, исследованных в настоящей заявке (т. е. GN3, GN9, GN10, GN13, GN17, GN105, GN108, GN123 и GN150), мы наблюдали диапазон МИК 2->128 как в CAA, так и в CAA/HuS.
[0081] Каждый из модифицированных лизинов GN54, GN92, GN94, GN121, GN146 и GN147 очищали до (>90%) гомогенности и исследовали в ряде анализов активности in vitro. Значение МИК (в мкг/мл) для каждого из GN-лизинов в CAA/HuS является следующим: GN54, 2; GN92, 4; GN94, 2; GN121, 0,5; GN146, 2; GN147, 4, как показано в таблице 4.
Таблица 4: Анализ минимальной ингибирующей концентрации (МИК) очищенных GN-лизинов.
[0082] Важно, что значения МИК (в мкг/мл), определенные с использованием CAA/HuS для каждой из исходных молекул лизина GN3, GN4 и GN37, составляют 16, 16 и 32, соответственно; следовательно, модификация каждого агента приводила к улучшению активности в сыворотке человека. Лизоцим T4 (МИК => 128 мкг/мл) был включен в качестве контрольного стандарта для GN-лизинов, которые являются неактивными в сыворотке человека. GN126 (МИК = 128 мкг/мл) также был включен в качестве контроля и соответствует Art-175 (37); Art-175 представляет собой артилизин, описанный в литературе, состоящий из гибрида AMP SMAP-29 с GN-лизином KZ144.
[0083] В дополнение к анализу МИК было показано, что модифицированные GN-лизины (GN54, GN92, GN94, GN121, GN146 и GN147) обладают сильной активностью против биопленки, причем значения минимальной концентрации устранения биопленки (MBEC) варьируются от 0,25 до 2 мкг/мл, см. таблицу 5.
[0084] Было показано, что каждый из GN3, GN9, GN10, GN13, GN17, GN105, GN108 и GN123 обладает сильной активностью против биопленки со значениями MBEC, варьирующимися от 0,125 до 4 мкг/мл (таблица 5), и вообще не обладает гемолитической активностью (таблица 6). Ожидается, что остальные модифицированные лизины будут проявлять улучшенную активность против биопленки, по сравнению с исходными лизинами, и будут также иметь уменьшенные гемолитические свойства или вообще будут лишены их, а также повышенную активность в присутствии матриксов крови, включая сыворотку человека.
Таблица 5: Минимальная концентрация устранения биопленки (MBEC)
[0085] Также было показано, что модифицированные GN-лизины (GN54, GN92, GN94, GN121, GN146 и GN147) не обладают гемолитической активностью (значения МГК>128 мкг/мл), см. таблицу 6.
Таблица 6: Анализ минимальной гемолитической концентрации (МГК) очищенных GN-лизинов
[0086] Также было показано, что модифицированные GN-лизины (GN54, GN92, GN94, GN121, GN146 и GN147) обладают бактерицидной активностью в формате анализа зависимости остаточной микробиологической нагрузки от времени, что определяется по уменьшению КОЕ ≥3-Log10 через 3 часа после добавления лизина. См. таблицу 7 и таблицу 8.
[0087] В формате анализа зависимости остаточной микробиологической нагрузки от времени каждый из GN3, GN17, GN108, GN123 и GN150 продемонстрировал бактерицидную активность в 3-часовой временной точке после добавления в концентрации 10 мкг/мл как в CAA/HuS, так и в HEPES-буфере (таблицы 7 и 8, соответственно).
Таблица 7. Анализ активности очищенного GN-лизина в CAA/HuS в отношении зависимости остаточной микробиологической нагрузки от времени
*Предел обнаружения составляет 3,7 Log10КОЕ/мл. Указывает на бактерицидную активность.
Таблица 8: Анализ активности очищенного GN-лизина в HEPES-буфере в отношении зависимости остаточной микробиологической нагрузки от времени
*Предел обнаружения составляет 3,7 Log10КОЕ/мл. Указывает на бактерицидную активность.
[0088] Подгруппа GN-лизинов (GN4, GN37, GN108 и GN150) была исследована в анализе методом «шахматной доски» с использованием CAA/HuS, и было показано синергическое действие с рядом антибиотиков, включая амикацин, азитромицин, азтреонам, ципрофлоксацин, колистин, рифампицин и тобрамицин (таблица 9).
[0089] Важно отметить, что каждый из модифицированных лизинов GN92, GN121 и GN147, как было показано, действует синергически с рядом антибиотиков, обладающих активностью против грамотрицательных бактерий (амикацином, азитромицином, азтреонамом, ципрофлоксацином, колистином, рифампицином и тобрамицином) в CAA/HuS, как показано в таблице 9. Эти данные указывают на то, что синергия будет сохраняться in vivo в присутствии сыворотки человека.
Таблица 9: Анализ методом «шахматной доски» очищенных GN-лизинов с антибиотиками
[0090] На основании активности конкретных GN-лизинов в присутствии сыворотки человека (и характера их аминокислотной последовательности и гомологии с другими лизинами, а также профилей экспрессии и очистки белков) ожидается, что лизины GN3, GN9, GN10, GN13, GN17, GN105, GN108, GN123, GN150 и 203 являются лучшими кандидатами для дальнейшей разработки как в форме нативного лизина, так и после дальнейшей модификации способом, описанным в настоящей заявке, т. е. с применением замены, как правило, от 1 до 3 заряженных остатков аминокислот незаряженными остатками (и с сохранением активности в отсутствие и в присутствии сыворотки человека) и/или путем гибридизации на N- или C-конце с пептидом AMP, имеющим альфа-спиральную структуру.
[0091] Модифицированные лизины, соответствующие GN200-GN205, все еще находятся в процессе анализа и могут иметь виды активности, сходные с GN54, GN92, GN94, GN121, GN146 и GN147.
[0092] Авторы настоящего изобретения выявили GN-лизины с различными уровнями активности в присутствии сыворотки человека. Кроме того, были получены модифицированные GN-лизины, и было продемонстрировано, что они проявляют улучшенную активность в присутствии сыворотки человека по сравнению с активностью исходных лизинов или известного лизоцима (T4), или известного артилизина (GN126).
[0093] Конкретные варианты реализации, раскрытые в настоящей заявке, могут быть также ограничены в формуле изобретения с использованием выражения «состоящий из» и/или «по существу состоящий из». При использовании в формуле изобретения, будь то в виде, в котором она была подана или добавлена в соответствии с поправкой, переходный термин «состоящий из» исключает любой элемент, этап или ингредиент, не указанные в формуле изобретения. Переходный термин «по существу состоящий из» ограничивает объем формулы изобретения указанными материалами или этапами и теми, которые не оказывают существенного влияния на основную и новую характеристику (и). Варианты реализации настоящего изобретения, заявленные таким образом, безусловно или в явном виде описаны и включены в настоящую заявку. Авторы настоящего изобретения оставляют за собой право отказаться от любого варианта реализации или признака, описанных в настоящей заявке.
ПРИМЕРЫ
[0094] Пример 1. Бактериальные штаммы и условия роста. Антибактериальный скрининг выполняли с использованием клинического изолята P. aeruginosa (CFS-1292) из крови человека, полученного в Больнице специальной хирургии в Нью-Йорке (предоставлен доктором Ларсом Вестблэйдом (Lars Westblade), профессором патологии и лабораторной медицины). Штамм CFS-1292 культивировали либо в лизогенном бульоне (LB; Sigma-Aldrich), средах с казаминокислотами (CAA) (5 г/л казаминокислот, Ameresco/VWR; 5,2 мМ K2HPO4, Sigma-Aldrich; 1 мМ MgSO4, Sigma-Aldrich), либо CAA с добавлением 25% сыворотки человека (тип AB, мужская, объединенная; Sigma-Aldrich). Для целей настоящего изобретения конкретный изолят P. aeruginosa не является важным, и в данных экспериментах мог быть использован коммерчески доступный изолят.
[0095] Пример 2. Синтез и клонирование генов. Все лизины и модифицированные лизины синтезировали как gBlocks (IDT Technologies) и клонировали в индуцируемый арабинозой вектор экспрессии pBAD24 (24) с помощью ПЦР с удлинением с перекрытием или путем лигирования совместимых липких концов. Все конструкции трансформировали в штамм E. coli TOP10 (Thermo Fisher Scientific). Могли быть использованы другие коммерчески доступные векторы экспрессии и системы.
[0096] Пример 3. Идентификация лизинов с собственной активностью. Набор, включающий до 250 предполагаемых лизинов и лизиноподобных ферментов, идентифицировали в базе данных GenBank геномных последовательностей P. aeruginosa. Использовали три метода поиска: i) целенаправленный BLASTp-скрининг всех геномов P. aeruginosa с использованием последовательностей известных лизинов для запросов, ii) поиск по ключевым словам всех аннотированных геномов P. aeruginosa, сосредоточенный на всех категориях суперсемейств, ассоциированных с каталитическими и связывающими доменами лизина (и гидролазой клеточной стенки); и iii) визуальный поиск неаннотированных геномов для лизиноподобных генов среди последовательностей фагов. После идентификации последовательности лизина синтезировали как gBlocks, клонировали в pBAD24 и трансформировали в клетки E. coli TOP10. Затем клоны E. coli исследовали в первичном скрининге антибактериальной активности (против живого P. aeruginosa) с использованием метода на основе наложения агарового слоя на чашку с агаром (11, 13) с модификацией, позволяющей обнаруживать активность GN-лизина в накладках, состоящих из мягкого агара, суспендированного в 50 мМ Трис-буфере, pH=7,5. Набор из 109 литических клонов был идентифицирован и отобран для экспрессии и очистки.
[0097] Пример 4. Экспрессия и очистка лизинов и модифицированных лизинов.
[0098] Для экспрессии полинуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептиды лизина согласно настоящему изобретению, можно применять широкий спектр комбинаций хозяин/вектор экспрессии. Специалистам в данной области техники известно большое количество подходящих векторов, которые доступны коммерчески. Примеры подходящих векторов приведены в Sambrook et al, ред., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3 изд.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (2001). Такие векторы включают, помимо прочего, векторы хромосомного, эписомального и вирусного происхождения, например, векторы, происходящие из бактериальных плазмид, из бактериофага, из транспозонов, из эписом дрожжей, из инсерционных элементов, из хромосомных элементов дрожжей, из вирусов, таких как бакуловирусы, паповавирусы, такие как SV40, вирусы осповакцины, аденовирусы, вирусы оспы птиц, вирусы ложного бешенства и ретровирусы, а также векторы, происходящие из их комбинаций, такие как те, которые происходят из генетических элементов плазмиды и бактериофага, такие как космиды и фагмиды. Кроме того, указанные векторы могут обеспечивать конститутивную или индуцируемую экспрессию полипептидов лизина согласно настоящему изобретению. Более конкретно, подходящие векторы включают, но не ограничиваются ими, производные SV40 и известные бактериальные плазмиды, например, плазмиды E. coli colEl, pCRl, pBR322, pMB9 и их производные, плазмиды, такие как RP4, pBAD24 и pBAD-TOPO; ДНК фага, например, многочисленные производные фага λ, например, NM989, и ДНК другого фага, например, M13, и одноцепочечную ДНК нитевидного фага; плазмиды дрожжей, такие как плазмида 2 D или ее производные; векторы, которые можно применять в эукариотических клетках, такие как векторы, которые можно применять в клетках насекомых или млекопитающих; векторы, происходящие из комбинаций плазмид и ДНК фага, таких как плазмиды, которые были модифицированы для применения ДНК фага или других последовательностей контроля экспрессии; и тому подобное. Многие из векторов, упомянутых выше, коммерчески доступны от поставщиков, таких как New England Biolabs, Addgene, Clontech, Life Technologies и т.д., многие из которых также поставляют подходящие клетки-хозяева.
[0099] Кроме того, векторы могут содержать различные регуляторные элементы (включая промотор, сайт связывания рибосомы, терминатор, энхансер, различные цис-элементы для контроля уровня экспрессии), причем вектор конструируют в соответствии с клеткой-хозяином. Любая из широкого спектра последовательностей контроля экспрессии (последовательности, которые контролируют экспрессию полинуклеотидной последовательности, функционально связанной с ними) может быть использована в этих векторах для экспрессии полинуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептиды лизина. Подходящие последовательности контроля включают, но не ограничиваются ими: ранние или поздние промоторы SV40, CMV, осповакцины, полиомы или аденовируса, систему lac, систему trp, систему TAC, систему TRC, систему LTR, основные области оператора и промотора фага λ, области контроля белка оболочки fd, промотор для 3-фосфоглицераткиназы или других гликолитических ферментов, промоторы кислой фосфатазы (например, Pho5), промоторы факторов спаривания дрожжей, промотор E. coli для экспрессии в бактериях и другие промоторные последовательности, которые, как известно, контролируют экспрессию генов прокариотических или эукариотических клеток или их вирусов, а также различные их комбинации.
[00100] При экспрессии полипептидов лизина согласно настоящему изобретению можно применять широкий спектр клеток-хозяев. Неограничивающие примеры клеток-хозяев, подходящих для экспрессии полипептидов лизина согласно настоящему изобретению, включают хорошо известных эукариотических и прокариотических хозяев, таких как штаммы E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, грибки, такие как дрожжи, и клетки животных, такие как клетки CHO, Rl.l, B-W и L-M, клетки почки африканской зеленой мартышки (например, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40 и BMT10), клетки насекомых (например, Sf9), а также клетки человека и клетки растений в культуре ткани. Несмотря на то, что хозяин экспрессии может представлять собой любую известную клетку-хозяина экспрессии, в предпочтительном варианте реализации хозяин экспрессии представляет собой один из штаммов E. coli. Они включают, но не ограничиваются ими, коммерчески доступные штаммы E. coli, такие как Top 10 (Thermo Fisher Scientific), DH5oc (Thermo Fisher Scientific), XLl-Blue (Agilent Technologies), SCS110 (Stratagene), JM109 (Promega), LMG194 (ATCC) и BL21 (Thermo Fisher Scientific). Существует несколько преимуществ использования E. coli в качестве системы-хозяина, включая: быструю кинетику роста, в случае которой при оптимальных условиях окружающей среды время удвоения составляет приблизительно 20 минут (Sezonov et al., J. Bacteriol. 189 8746-8749 (2007)), легкое получение культур высокой плотности, легкую и быструю трансформацию экзогенной ДНК и т. д. Подробная информация, касающаяся экспрессии белка в E. coli, включая отбор плазмид, а также отбор штаммов, подробно обсуждается Rosano, G. and Ceccarelli, E., Front Microbiol., 5: 172 (2014).
[00101] Эффективная экспрессия полипептидов лизина и их векторов зависит от множества факторов, таких как оптимальные сигналы экспрессии (как на уровне транскрипции, так и трансляции), правильное складывание белка и характеристики роста клеток. В отношении способов конструирования вектора и способов трансдукции сконструированного рекомбинантного вектора в клетку-хозяина, могут быть использованы обычные способы, известные в данной области техники. Понятно, что несмотря на то, что не все векторы, последовательности контроля экспрессии и хозяева будут одинаково хорошо функционировать для экспрессии полинуклеотидных последовательностей, кодирующих пептиды лизина согласно настоящему изобретению, специалист в данной области техники сможет выбрать подходящие векторы, последовательности контроля экспрессии и хозяев без излишних экспериментов, чтобы достичь целевой экспрессии, не отступая от объема настоящего изобретения. Согласно некоторым вариантам реализации авторы настоящего изобретения обнаружили корреляцию между уровнем экспрессии и активностью экспрессированного полипептида; в частности, в системах экспрессии E. coli при умеренных уровнях экспрессии (например, от приблизительно 1 до 10 мг/литр) вырабатываются полипептиды лизина с более высокими уровнями активности, чем те, которые экспрессируются при более высоких уровнях в E. coli (например, от приблизительно 20 до приблизительно 100 мг/л), причем в последнем случае иногда вырабатываются полностью неактивные полипептиды.
[00102] Полипептиды лизина согласно настоящему изобретению могут быть выделены и очищены из рекомбинантных клеточных культур с помощью хорошо известных способов, включая, но не ограничиваясь ими, осаждение сульфатом аммония или этанолом, экстракцию кислотой, анионообменную или катионообменную хроматографию, фосфоцеллюлозную хроматографию, хроматографию гидрофобного взаимодействия, аффинную хроматографию, гидроксилапатитную хроматографию и лектиновую хроматографию. Для очистки полипептида лизина также можно применять высокоэффективную жидкостную хроматографию.
[00103] Согласно другому варианту векторная система, применяемая для получения полипептидов лизина согласно настоящему изобретению, может представлять собой бесклеточную систему экспрессии. Различные бесклеточные системы экспрессии доступны коммерчески, включая, но не ограничиваясь ими, системы, доступные от Promega, LifeTechnologies, Clonetech и т. д.
[00104] Солюбилизацию и очистку белка (с использованием одной или более хроматографических методик) выполняют в хорошо забуференном растворе, имеющем подходящую ионную силу одновалентной соли, например, ионную силу, эквивалентную 300-500 мМ NaCl.
[00105] Аффинную хроматографию с использованием иммобилизованного металла (IMAC) предпочтительно используют в качестве начального этапа очистки. Если требуется дополнительная очистка, на следующем этапе можно использовать эксклюзионную хроматографию (гель-фильтрацию). При необходимости ионообменная хроматография может быть использована в качестве конечного этапа.
[00106] Для определения оптимальных условий экспрессии и очистки белка использовали диапазон значений времени индукции и температуры. Основные методологии описаны в предыдущих исследованиях (11, 13, 25). В общих чертах, повторы каждого экспрессируемого клона индуцировали как в LB, так и в RM средах (Thermo Fisher Scientific) в течение 2-24-часовового периода при 24°C-37°C. Индуцированные культуры затем осаждали и разрушали с использованием BugBuster (Millipore Sigma) перед проведением оценки экспрессии растворимого белка методом электрофореза в ДСН-ПААГ с окрашиванием Кумасси. Оптимальное условие для экспрессии каждого лизина затем использовали для увеличения выработки. Очистки выполняли с использованием анионного обмена (HiTrap DEAE FF), катионного обмена (HiTrap Capto MMC), колонок для гидрофобного взаимодействия (HiTrap Phenyl FF) и/или колонок для гель-фильтрации (HiLoad 16/600 SuperDex) с применением системы Akta™ Pure FPLC, управляемой программным обеспечением Unicorn 6.3. Для улучшения растворимости и увеличения способности связываться с хроматографическими смолами иногда использовали добавление Mg2+. Во время очистки целевой GN-лизин идентифицировали по молекулярной массе с использованием восстанавливающего ДСН-ПААГ. После последнего этапа очистки фракции, содержащие представляющий интерес GN-лизин, объединяли, буфер заменяли 25 мМ трис, 150 мМ хлорида натрия со значением pH, варьирующимся от 7,2 до 9,0 (в зависимости от pI белка), и концентрировали до приблизительно 2 мг/мл. Концентрацию измеряли с помощью NanoDrop, и белок хранили при -80°C в аликвотах по 500 мкл.
[00107] Пример 5. Определение минимальной ингибирующей концентрации (МИК). Минимальную ингибирующую концентрацию каждого GN-лизина против P. aeruginosa определяли с использованием модификации стандартного эталонного метода микроразведения бульона, определенного Институтом клинических и лабораторных стандартов (CLSI) (26). Модификация была основана на замене бульона Мюллера-Хинтона либо средами CAA, либо CAA с добавлением 25% сыворотки человека.
[00108] Пример 6. Определение минимальной концентрации устранения биопленки (MBEC). MBEC CF-301 определяли с использованием варианта метода микроразведения бульона для оценки МИК с модификациями (27, 28). В настоящей заявке свежие колонии штамма P. aeruginosa ATCC 17647 суспендировали в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) (0,5 единицы МакФарланда), разводили в TSBg (триптический соевый бульон с добавлением 0,2% глюкозы) в соотношении 1:100, добавляли в виде аликвот по 0,15 мл в устройство Calgary Biofilm Device (96-луночный планшет с крышкой, несущей 96 поликарбонатных колышков; Innovotech) и инкубировали 24 часа при 37°C. Биопленки промывали и обрабатывали 2-кратными последовательными разведениями CF-301 в TSBg при 37°C в течение 24 часов. Все образцы исследовали с тремя повторами. После обработки лунки промывали, высушивали на воздухе при 37°C и окрашивали 0,05% кристаллическим фиолетовым в течение 10 минут. После окрашивания биопленки обесцвечивали в 33% уксусной кислоте и определяли OD600 экстрагированного кристаллического фиолетового. Значение MBEC каждого образца представляло собой минимальную концентрацию лекарственного средства, необходимую для удаления >95% биомассы биопленки, согласно количественной оценке кристаллического фиолетового.
[00109] Пример 7. Анализ методом «шахматной доски» для исследования синергии с антибиотиками. Анализ методом «шахматной доски» основан на модификации метода CLSI для определения МИК с помощью микроразведения бульона (26, 29). «Шахматные доски» конструировали путем сначала подготовки столбцов 96-луночного полипропиленового планшета для микротитрования, в котором в каждой лунке вдоль горизонтальной оси содержалось одинаковое количество антибиотика, разведенного в 2 раза. В отдельном планшете готовили сопоставимые ряды, в которых в каждой лунке вдоль вертикальной оси содержалось одинаковое количество GN-лизина, разведенного в 2 раза. Разведения GN-лизина и антибиотика затем объединяли так, что в каждом столбце содержалось постоянное количество антибиотика и двойные разведения GN-лизина, в то время как в каждом ряду содержалось постоянное количество GN-лизина и двойные разведения антибиотика. Таким образом, каждая лунка имела уникальную комбинацию GN-лизина и антибиотика. Бактерии добавляли к комбинациям лекарственных средств в концентрациях 1×105 КОЕ/мл в CAA с 25% сыворотки человека. Затем МИК каждого лекарственного средства, отдельно и в комбинации, регистрировали через 16 часов при 37°C в окружающем воздухе. Суммарные фракционные ингибирующие концентрации (ΣFIC) рассчитывали для каждого лекарственного средства, и для определения синергии использовали минимальное значение ΣFIC (ΣFICmin). ΣFIC вычисляли следующим образом: ΣFIC = FIC A + FIC B, где FIC A представляет собой МИК каждого антибиотика в комбинации/МИК каждого антибиотика по отдельности, а FIC B представляет собой МИК каждого GN-лизина в комбинации/МИК каждого GN-лизина по отдельности. Комбинация считается синергической, если ΣFIC составляет ≤0,5, сильно аддитивной, если ΣFIC составляет от >0,5 до <1, аддитивной с ΣFIC 1-<2 и антагонистической, если ΣFIC составляет ≥2.
[00110] Пример 8. Анализ гемолитической активности GN-лизина. Гемолитическую активность GN-лизинов измеряли как количество гемоглобина, высвобождаемого в результате лизиса эритроцитов человека (30). В общих чертах, 3 мл свежих клеток крови человека (hRBC), полученных из объединенных образцов здоровых доноров (BioreclamationIVT), в поликарбонатной пробирке, содержащий гепарин, центрифугировали при 1000×g в течение 5 мин при 4°C. Полученные эритроциты промывали три раза фосфатно-солевым буфером (ФСБ) (pH=7,2) и ресуспендировали в 30 ФСБ. По 50 мкл раствора эритроцитов инкубировали с 50 мкл каждого GN-лизина (в ФСБ) в 2-кратном диапазоне разбавления (от 128 мкг/мл до 0,25 мкг/мл) в течение 1 ч при 37°C. Интактные эритроциты осаждали путем центрифугирования при 1000×g в течение 5 мин при 4°C, и супернатант переносили в новый 96-луночный планшет. Высвобождение гемоглобина контролировали путем измерения поглощения при 570 нм. В качестве отрицательного контроля hRBC в ФСБ обрабатывали, как указано выше, с применением 0,1% тритона Х-100.
[00111] Пример 9. Анализ активности GN-лизина в отношении зависимости остаточной микробиологической нагрузки от времени. Ночную культуру P. aeruginosa разводили в соотношении 1:50 в свежих средах CAA и выращивали в течение 2,5 часа при 37°C при перемешивании. Затем бактерии в экспоненциальной фазе роста осаждали и ресуспендировали в 1/5 объема культуры 25 мМ HEPES, pH=7,4 перед окончательной корректировкой до оптической плотности, соответствующей значению МакФарланда 0,5. Скорректированую культуру затем разбавляли в соотношении 1:50 либо в 25 мМ HEPES, pH=7,4, либо в CAA/HuS, и добавляли GN-лизины при конечной концентрации 10 мкг/мл. Включали контрольные культуры без добавления лизина (т. е. буферный контроль). Все варианты обработки инкубировали при 37°C с аэрацией. Образцы культур отбирали для количественного посева на чашки с CAA-агаром в моменты времени до добавления лизина (или буферного контроля) и с интервалами в 1 час и 3 часа после этого.
[00112] Запланированные эксперименты in vivo
[00113] Один или более экспериментов для испытания активности полипептидов согласно настоящему изобретению in vivo проводятся в настоящее время, как описано далее:
A. Предварительный скрининг фармакокинетики (ФК) и эффективности в модели острой летальной бактериемии на мышах
[00114] Чтобы выявить GN-лизины, которые обладают системным воздействием, скрининг ФК будет выполнен на мышах CD1, получавших GN-лизин, введенный в виде однократной в/в инъекции. Профили ФК в крови будут проанализированы для вплоть до 10 GN-лизинов с использованием биоаналитического анализа исследовательского класса, сертифицированного для мышиной сыворотки. Ожидается, что будет идентифицировано несколько GN-лизинов, имеющих соответствующий профиль ФК. Кандидаты, демонстрирующие воздействие на кровь, которое позволяет достичь AUC/концентрация МИК более 1, будут испытаны в модели системной инфекции. Для этой модели штаммы P. aeruginosa (PAO1 и другие клинические изоляты) будут ресуспендированы в муцине желудка свиньи и введены путем внутрибрюшинного введения мышам CD1 в инокуляте, который в течение 24-48 часов вызывает полную заболеваемость и смертность у контрольных мышей. Мышам будут вводить носитель или GN-лизин путем внутривенной (в/в) инъекции в латеральную хвостовую вену через 2 часа после летального заражения. Заболеваемость и смертность будут оценены в течение 72 часов. Ожидается, что при соответствующих концентрациях дозы у мышей, получавших GN-лизин, будет наблюдаться уменьшение заболеваемости и смертности по сравнению с контролями, получавшими носитель. Исследования могут включать совместное введение антибиотиков. A. Данные по выживаемости будут проанализированы с помощью анализа выживаемости Каплана-Мейера с использованием GraphPad prism, и для каждой молекулы будет вычислена 50% эффективная концентрация (ЭК50). Ожидается, что будет идентифицировано несколько GN-лизинов с активностью in vivo.
B. Эффективность GN-лизина в общепризнанных моделях инвазивной инфекции на мышах
[00115] Целью этого эксперимента и других моделей инфекции на мышах, таких как легкие и почки, является получение данных об эффективности в этих моделях. В моделях для оценки эффективности, предложенных в этой дополнительной цели, обычно используются бактериальные инфекции мышей в тканях (бедра, легкие или почки). После обработки лизином бактериальная нагрузка в тканях будет определена количественно (КОЕ/грамм ткани) в конце эксперимента для оценки устойчивости лечения. Кроме того, каждую из этих моделей можно использовать для определения индексов и величины ФК/ФД для оценки эффективности, например, AUC/МИК. Таким образом, эти модели будут использованы для оценки эффективности типичных GN-лизинов против Pseudomonas в модели легочной инфекции на мышах по отдельности или в комбинации с антибиотиком, чтобы определить наилучших GN-лизинов-кандидатов для дальнейшего испытания и разработки in vivo. Сходные модели могут быть созданы с использованием Acinetobacter baumannii и использованы для испытания эффективности лизинов согласно настоящему изобретению.
B.1 Модели нейтропенической инфекции бедра и инфекции легких на мышах
Модель инфекции бедра
[00116] Для создания первой модели у мышей CD-1 (n = 12) вызывают развитие нейтропении путем введения 20 мг/мл циклофосфамида, вводимого внутрибрюшинно в соответствии со схемой дозирования, которая обеспечивает снижение количества нейтрофилов более чем на 99% (150 мг/кг на -4 день и 100 мг/кг в -1 день). Инфекцию бедра создают путем внутримышечной (в/м) инъекции в обе боковые мышцы бедра соответствующего инокулята P. aeruginosa (3×104 или 1×105, или 3×105, или 1×106 КОЕ/бедро) через 24 часа после введения второй дозы иммуносупрессорного агента. Мышей, находящихся под ингаляционной анестезией, инфицируют путем внутримышечной инъекции в обе боковые мышцы бедра. В каждое бедро может быть введено приблизительно 1,4×105 КОЕ A. baumannii NCTC 13301 (и/или эквивалентное количество штамма P. aeruginosa). Однако количество инокулята может быть скорректировано, если испытание показывает, что это целесообразно.
[00117] Группам из 4 мышей (6, только носитель (конечная группа)) вводят испытываемый GN-лизин или носитель, или контрольный лизин путем внутривенной (в/в) инъекции через 2, 6 и 10 ч после инфицирования. Через 2 ч после инфицирования контрольную группу из 4 животных подвергают гуманной эвтаназии, используя передозировку пентобарбитона, чтобы обеспечить контрольную группу, не получавшую лечение (начало). Через 16 часов после инфицирования все остальные группы подвергают гуманной эвтаназии с помощью пентобарбитона. Оба бедра от каждого животного извлекают и взвешивают по отдельности (рассматривается как две независимые оценки). Лизины, которые будут испытаны, будут включать нативные и модифицированные лизины, которые имеют перспективные свойства, т. е. значительную литическую активность и сохранение значительной активности в присутствии матриксов крови. Диапазон дозировок, испытываемый в этом и других экспериментах, подробно описанных в настоящей заявке, будет находиться в пределах широкого диапазона от 0,01 до 500 мг/кг, но верхний предел может зависеть от токсичности, а нижний предел может быть выше в зависимости от собственной активности. Примеры лизинов, подлежащих испытанию, включают GN108, GN121, GN123 и GN156.
[00118] Индивидуальные образцы ткани бедра гомогенизируют в ледяном стерильном фосфатно-солевом буфере. Гомогенаты бедра затем количественно культивируют на агаре CLED и инкубируют при 37°C в течение 24 часов перед подсчетом колоний. Ожидается, что лизины приведут к значительному уменьшению или устранению бактериальных колоний.
Модель инфекции легких на мышах
[00119] Группы, включающие до 8 анестезированных мышей (в/б инъекция смеси 100 мг/кг кетамина/6 мг/кг ксилазина) на обработку, инфицируют путем интраназального закапывания 20 мкл инокулята в каждую ноздрю (5 мин между введением в другую ноздрю) и удерживают в вертикальном положении в течение ~10 минут после инфицирования. Концентрацию и количество соответствующего инокулята предварительно определяют, как описано выше.
[00120] Концентрация инокулята составляет ~2,5×106 КОЕ/мл (1,0×105 КОЕ/легкое) для P. aeruginosa ATCC 27853 или ~8,8×108 КОЕ/мл (3,5×107 КОЕ/легкое) для A. baumannii NCTC 13301. Лизины (например, лизины, идентифицированные в предшествующем эксперименте), дозируют с использованием того же пути введения и основных принципов дозирования, а легкие извлекают и подготавливают для подсчета, как и для модели на бедре. Колонии подсчитывают после инкубации при 37°C в течение 24 часов. Эффективность будет оценена, исходя из массы мышей и бактериальной нагрузки гомогенатов легких. Ожидается, что лизины будут удовлетворительно действовать в ослаблении инфекции, измеренном по значительному уменьшению или устранению бактериальных колоний .
B.2 Модель нейтропенической инфекции легких на мышах
[00121] Мышам BALB/c с нейтропенией будут инокулированы бактерии P. aeruginosa, содержащие инокулят, достаточный для создания инфекции легких, путем интраназального закапывания под анестезией. Группам из 4 мышей (6, только носитель (конечная группа)) вводят GN-лизин, носитель или контрольный лизин путем подкожной (п/к) инъекции через 2, 6 и 10 ч после инфицирования. Через 2 ч после инфицирования контрольную группу из 4 животных подвергают гуманной эвтаназии, используя передозировку пентабарбитона, чтобы обеспечить контрольную группу, не получавшую лечение (начало). Через 16 часов после инфицирования все остальные группы подвергают гуманной эвтаназии с помощью пентабарбитона. Животных взвешивают, и оба легких от каждого животного извлекают и взвешивают по отдельности. Лизины и дозирование могут быть аналогичны тем, которые описаны выше.
[00122] Индивидуальные образцы ткани легкого гомогенизируют в ледяном стерильном фосфатно-солевом буфере. Гомогенаты бедра затем количественно культивируют на агаре CLED и инкубируют при 37°C в течение 24 часов перед подсчетом колоний. Эффективность лечения оценивают, исходя из массы и бактериальной нагрузки.
[00123] Группы, включающие до 8 анестезированных мышей (в/б инъекция смеси 100 мг/кг кетамина/6 мг/кг ксилазина) на обработку, инфицируют путем интраназального закапывания инокулята P. aeruginosa в каждую ноздрю (5 мин между введением в другую ноздрю) и удерживают в вертикальном положении в течение ~10 минут после инфицирования. Мышей ранее подвергали иммуносупрессии с применением циклофосфамида, введенного подкожно при 200 мг/кг на -4 день и 150 мг/кг в -1 день. Инфицирование происходит через 24 часа после введения второй дозы иммуносупрессорного агента.
[00124] Начальная концентрация инокулята может составлять ~2,5×106 КОЕ/мл (1,0×105 КОЕ/легкое) для P. aeruginosa ATCC 27853. Инокулят может быть скорректирован с целью увеличения бактериальной нагрузки у необработанных мышей приблизительно на 1 log 10 КОЕ/г легких. Для исследований выживаемости, описанных ниже, будет выбран инокулят, который приведет к смерти через 24-72 часа.
[00125] Лизины затем дозируют интраназально, мышей подвергают эвтаназии, взвешивают, легкие отделяют и взвешивают, и легкие извлекают и подготавливают к подсчету, как и в модели на бедре. Колонии подсчитывают после инкубации при 37°C в течение 24 часов. Можно применять те же лизины и дозирование, как и описанные выше. Лизины будут введены внутривенно при 5 мл/кг.
[00126] В связанном эксперименте субоптимальная доза антибиотика, обладающего активностью против грамотрицательных бактерий, будет выбрана и использована на подпороговом уровне вместе с лизином. Подходящий подпороговый уровень может быть установлен путем обработки инфицированных мышей различными дозами антибиотика, дозы которого ниже минимальной эффективной дозы, равны ей и превышают ее. Контрольные мыши получат различные дозы только носителя. Один носитель будет использован в качестве замены для лечения лизином, и другой носитель будет использован в качестве замены для антибиотика. Для каждого испытываемого лизина будет использовано 40 мышей (по 5 на группу).
[00127] Если антибиотик представляет собой имипенем, подходящая подпороговая доза, вероятно, будет от 10 до 100 мг/кг (в более общем случае подпороговая или субоптимальная доза может представлять собой дозу, которая вызывает уменьшение бактериальной нагрузки на 1 или 2 log) и будет введена, например, при 5 мл/кг подкожно или внутривенно для этого эксперимента и экспериментов с комбинацией (антибиотик + лизин).
[00128] Предусмотрено, что для эксперимента с комбинацией доза антибиотика (например, имипенема) будет представлять собой максимальную испытанную подпороговую дозу. Подходящая доза лизина будет определена путем испытания различных доз лизина в комбинированном лечении, чтобы обнаружить в каком случае развивается синергический эффект. Будет выбран оптимальный набор количеств лизина и антибиотика. Лизин и первая обработка антибиотиком будут введены через 2 часа после инфицирования; вторая обработка антибиотиком будет введена через 6 часов после инфицирования. Ткань будет собрана через 9 часов после инфицирования.
[00129] Аналогичное исследование будет проведено с использованием аналогичной модели легочной инфекции на мышах, но будет оцениваться только выживаемость мышей. Инфицированным мышам будет введен лизин (или носитель, или контрольный лизин) через 24 часа после инфицирования. Предусмотрено применение трех различных доз каждого лизина. Имипенем (или носитель) будет введен через 6 часов после дозирования лизина. Эксперимент закончится через 72 часа после инфицирования. Предусмотрено, что в эксперименте по выживаемости будет использовано 7 мышей на группу, т. е. 63 мыши для каждого испытанного лизина. Ожидается, что процент выживаемости будет выше при введении комбинации.
C. Анализ ФК/ФД в модели инфекции на мышах
[00130] Эксперименты на животных с применением противоинфекционных средств, в которых определяют переменные ФК/ФД (например, Cmax/МИК, AUC/МИК или % Time/МИК), наиболее тесно связанные с эффективностью, в высокой степени предсказывают клинический успех (31). Фракционирование дозы применяют для определения параметра ФК/ФД, ассоциированного с эффективностью. Путем фракционирования однократной общей дозы для дозирования один раз в сутки (q24h), два раза в сутки (q12h) или четыре раза в сутки (q6h), можно получить несколько значений Cmax и времени, в течение которого концентрация свободного лекарственного средства >МИК (Time>МИК, fT>МИК), при сохранении постоянной AUC. Фракционирование нескольких доз создает уникальные профили воздействия, которые, по сравнению с конечными точками эффективности, позволяют дифференцировать Cmax/МИК, fT>МИК и AUC/МИК в качестве индекса и величины ФК, необходимых для эффективности.
[00131] GN-лизины с устойчивой активностью в одной или более моделях инфекции на мышах, идентифицированные ранее, будут подвергнуты анализу ФК/ФД. Исследования ФК будут проведены для получения нескольких профилей ФК и смоделированы для включения диапазонов Cmax/МИК, AUC/МИК и fT>МИК. Исследования с фракционированием дозы будут проведены на легочной модели для оценки эффективности, как описано выше (мышь, крыса или кролик). Тканевая бактериальная нагрузка будет использована в качестве конечной точки ФД, и данные будут проанализированы путем построения графика КОЕ/г ткани как функции различных параметров ФК/ФД. Значимость какого-либо параметра ФК/ФД в отношении эффективности будет определена с помощью нелинейного регрессионного анализа. Эти данные будут использованы для предоставления информации о дозах для доклинических мероприятий.
[00132] Один из способов проведения исследования ФК включает следующее:
Таблица 10
4, 8, 24
4, 8, 24
4, 8, 24
[00133] В моменты времени, указанные в таблице 10, мышей подвергнут эвтаназии, и в группах из трех мышей на временную точку образцы крови будут собраны путем пункции сердца. Образцы отделенной плазмы будут разделены на две аликвоты. После сбора крови три образца бронхоальвеолярного лаважа (ФСБ) будут собраны из узкого поперечного отверстия, выполненного в трахее. Три образца БАЛ будут объединены и центрифугированы для удаления остатков разрушенных клеток. Супернатант БАЛ будет разделен на две аликвоты. Один образец плазмы и БАЛ будет дополнительно испытан для определения содержания лизина и бактериальной нагрузки. Второй образец будет проанализирован для определения содержания мочевины, чтобы рассчитать разбавление жидкости эпителиальной выстилки (ELF) во время сбора БАЛ.
D. Мониторинг развития устойчивости in vivo
[00134] Чтобы выявить потенциальную возможность развития устойчивости, гомогенаты in vivo из исследований эффективности на мышах будут подвергнуты анализу МИК. Если наблюдается более чем двукратное увеличение МИК, бактерии будут высеяны, и колонии будут выделены для секвенирования всего генома.
ВАРИАНТЫ РЕАЛИЗАЦИИ
[00135] A. Фармацевтическая композиция, содержащая: выделенный полипептид лизина, выбранный из группы, состоящей из одного или более из GN147, GN146, GN156, GN92, GN54, GN201, GN202, GN121, GN94, GN200, GN204, GN205, или его фрагмент, обладающий активностью лизина, или его вариант, обладающий литической активностью и имеющий по меньшей мере 80% идентичность последовательности с указанным полипептидом лизина, и фармацевтически приемлемый носитель, причем указанный полипептид лизина или фрагмент, или вариант присутствует в количестве, эффективном для ингибирования роста или уменьшения популяции, или уничтожения P. aeruginosa и необязательно по меньшей мере одного другого вида грамотрицательных бактерий.
[00136] B. Фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество выделенного полипептида лизина, выбранного из группы, состоящей из одного или более из GN3, GN13, GN17, GN9, GN10, GN105, GN108, GN123, GN150, GN203, или его фрагмента, обладающего активностью лизина, или его варианта, обладающего литической активностью и имеющего по меньшей мере 80% идентичность последовательности с указанным полипептидом лизина, и фармацевтически приемлемый носитель, причем указанный полипептид лизина присутствует в количестве, эффективном для ингибирования роста или уменьшения популяции, или уничтожения P. aeruginosa и необязательно по меньшей мере одного другого вида грамотрицательных бактерий; и фармацевтически приемлемый носитель.
[00137] C. Фармацевтическая композиция согласно варианту реализации A или B, которая представляет собой раствор, суспензию, эмульсию, ингалируемый порошок, аэрозоль или спрей.
[00138] D. Фармацевтическая композиция согласно варианту реализации B, содержащая дополнительно один или более антибиотиков, подходящих для лечения грамотрицательных бактерий.
[00139] E. Вектор, содержащий выделенный полинуклеотид, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид лизина согласно варианту реализации A или B, причем указанный кодируемый полипептид лизина ингибирует рост или уменьшает популяцию, или уничтожает P. aeruginosa и необязательно по меньшей мере одного другого вида грамотрицательных бактерий, или комплементарную последовательность указанного полинуклеотида.
[00140] F. Рекомбинантный вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид лизина, содержащий аминокислотную последовательность полипептида в соответствии с вариантом реализации A или B, причем указанный кодируемый полипептид лизина обладает свойством ингибировать рост или уменьшать популяцию, или приводить к уничтожению P. aeruginosa и необязательно по меньшей мере одного другого вида грамотрицательных бактерий, причем указанная нуклеиновая кислота функционально связана с гетерологичным промотором.
[00141] G. Клетка-хозяин, содержащая вектор согласно варианту реализации E или F.
[00142] H. Рекомбинантный вектор согласно варианту реализации E или F, в котором указанная последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой последовательность кДНК.
[00143] I. Выделенный полинуклеотид, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид лизина, выбранный из группы, состоящей из GN147, GN146, GN156, GN92, GN54, GN201, GN202, GN121, GN94, GN200, GN204, GN205, или его фрагмент, обладающий активностью лизина, или его вариант, обладающий литической активностью и имеющий по меньшей мере 80% идентичность последовательности с указанным полипептидом лизина, причем указанный полипептид лизина ингибирует рост или уменьшает популяцию, или уничтожает P. aeruginosa и необязательно по меньшей мере одного другого вида грамотрицательных бактерий.
J. Полинуклеотид согласно варианту реализации I, который представляет собой кДНК.
[00145] K. Способ ингибирования роста или уменьшения популяции, или уничтожения по меньшей мере одного вида грамотрицательных бактерий, причем указанный способ включает приведение указанных бактерий в контакт с фармацевтической композицией, содержащей полипептид лизина, выбранный из группы, состоящей из одного или более из GN147, GN146, GN156, GN92, GN54, GN201, GN202, GN121, GN94, GN200, GN204, GN205, GN3, GN13, GN17, GN9, GN10, GN105, GN108, GN123, GN150, GN203, или его фрагмент, обладающий литической активностью, или его вариант, обладающий литической активностью и имеющий по меньшей мере 80% идентичность последовательности с указанным полипептидом лизина, в количестве, эффективном для ингибирования роста или уменьшения популяции, или уничтожения P. aeruginosa и необязательно по меньшей мере одного другого вида грамотрицательных бактерий.
[00146] L. Способ лечения бактериальной инфекции, вызванной грамотрицательными бактериями, выбранными из группы, состоящей из P. aeruginosa и необязательно одного или более дополнительных видов грамотрицательных бактерий, включающий введение субъекту, у которого диагностирована, который подвержен риску или у которого наблюдаются симптомы бактериальной инфекции, композиции, содержащей полипептид лизина, выбранный из группы, состоящей из одного или более из GN147, GN146, GN156, GN92, GN54, GN201, GN202, GN121, GN94, GN200, GN204, GN 205, GN3, GN13, GN17, GN9, GN10, GN105, GN108, GN123, GN150, GN203, или его фрагмент, обладающий активностью лизина, или его вариант, обладающий литической активностью и имеющий по меньшей мере 80% идентичность последовательности с указанным полипептидом лизина, в количестве, эффективном для ингибирования роста или уменьшения популяции, или уничтожения P. aeruginosa и необязательно по меньшей мере одного другого вида грамотрицательных бактерий.
[00147] M. Способ согласно варианту реализации L, в котором по меньшей мере один вид грамотрицательных бактерий выбран из группы, состоящей из Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella spp., Enterobacter spp., Escherichia coli, Citrobacter freundii, Salmonella typhimurium, Yersinia pestis и Franciscella tulerensis.
[00148] N. Способ согласно варианту реализации L, в котором указанная инфекция, вызванная грамотрицательными бактериями, представляет собой инфекцию, вызванную Pseudomonas aeruginosa.
[00149] O. Способ лечения местной или системной патогенной бактериальной инфекции, вызванной грамотрицательными бактериями, выбранными из группы, состоящей из P. aeruginosa и необязательно одного или более дополнительных видов грамотрицательных бактерий, у субъекта, включающий введение субъекту композиции, содержащей полипептид лизина, выбранный из группы, состоящей из одного или более из GN147, GN146, GN156, GN92, GN54, GN201, GN202, GN121, GN94, GN200, GN204, GN 205,GN3, GN13, GN17, GN9, GN10, GN105, GN108, GN123, GN150, GN203, или его фрагменты, обладающие активностью лизина, или его варианты, обладающие литической активностью и имеющие по меньшей мере 80% идентичность последовательности с указанным полипептидом лизина, в количестве, эффективном для ингибирования роста или уменьшения популяции, или уничтожения P. aeruginosa и необязательно по меньшей мере одной другой грамотрицательной бактерии.
[00150] P. Способ предотвращения или лечения бактериальной инфекции, включающий совместное введение субъекту, у которого диагностирована, который подвержен риску или у которого наблюдаются симптомы бактериальной инфекции, комбинации первого эффективного количества указанной композиции, содержащей эффективное количество выбранного из группы, состоящей из одного или более из GN147, GN146, GN156, GN92, GN54, GN201, GN202, GN121, GN94, GN200, GN204, GN 205, GN3, GN13, GN17, GN9, GN10, GN105, GN108, GN123, GN150, GN203, или его фрагмента, обладающего литической активностью, или его варианта, обладающего литической активностью и имеющего по меньшей мере 80% идентичность последовательности с указанным полипептидом лизина, и второго эффективного количества антибиотика, подходящего для лечения инфекции, вызванной грамотрицательными бактериями.
[00151] Q. Способ согласно варианту реализации P, в котором указанный антибиотик выбран из одного или более из цефтазидима, цефепима, цефоперазона, цефтобипрола, ципрофлоксацина, левофлоксацина, аминогликозидов, имипенема, меропенема, дорипенема, гентамицина, тобрамицина, амикацина, пиперациллина, тикарциллина, пенициллина, рифампицина, полимиксина В и колистина.
[00152] R. Способ повышения эффективности антибиотика, подходящего для лечения инфекции, вызванной грамотрицательными бактериями, включающий совместное введение указанного антибиотика в комбинации с одним или более полипептидами лизина, выбранными из группы, состоящей из одного или более из GN147, GN146, GN156, GN92, GN54, GN201, GN202, GN121, GN94, GN200, GN204, GN205, GN3, GN13, GN17, GN9, GN10, GN105, GN108, GN123, GN150, GN203, или его фрагментом, обладающим литической активностью, или его вариантом, обладающим литической активностью и имеющим по меньшей мере 80% идентичность последовательности с указанным полипептидом лизина, причем введение указанной комбинации более эффективно ингибирует рост или уменьшает популяцию, или уничтожает указанных грамотрицательных бактерий, чем введение либо указанного антибиотика, либо указанного полипептида лизина, либо его активного фрагмента по отдельности.
[00153] S. Выделенный полипептид лизина, выбранный из группы, состоящей из GN147, GN146, GN156, GN92, GN54, GN201, GN202, GN121, GN94, GN200, GN204, GN205, или его фрагмент, обладающий активностью лизина, или его вариант, обладающий литической активностью и имеющий по меньшей мере 80% идентичность последовательности с указанным полипептидом лизина, причем указанный полипептид лизина ингибирует рост или уменьшает популяцию, или уничтожает P. aeruginosa и необязательно по меньшей мере одного другого вида грамотрицательных бактерий.
[00154] T. Полипептид лизина, содержащий нативный лизин против грамотрицательных бактерий, выбранный из группы, состоящей из GN3, GN9, GN10, GN13, GN17, GN105, GN108, GN123, GN150 и GN203, или его фрагмент, обладающий литической активностью, или его вариант, обладающий литической активностью и имеющий по меньшей мере 80% идентичность последовательности с указанным полипептидом лизина, причем указанный нативный лизин или фрагмент необязательно модифицирован путем замены 1-3 заряженных остатков аминокислот незаряженными остатками аминокислот, при этом указанный модифицированный нативный лизин или фрагмент сохраняет литическую активность.
[00155] U. Полипептид лизина, содержащий нативный лизин против грамотрицательных бактерий, выбранный из группы, состоящей из GN2, GN4, GN14, GN43 и GN37, или его фрагмент, обладающий литической активностью, или его вариант, обладающий литической активностью и имеющий по меньшей мере 80% идентичность последовательности с указанным полипептидом лизина, причем указанный нативный лизин или вариант, или фрагмент модифицирован путем замены 1-3 заряженных остатков аминокислот незаряженными остатками аминокислот, при этом указанный модифицированный нативный лизин или фрагмент сохраняет литическую активность.
[00156] V. Фармацевтическая композиция согласно варианту реализации A или B, в которой указанный полипептид лизина выбран из группы, состоящей из одного или более из GN156, GN121, GN108 и GN123 или их активных фрагментов, или их вариантов, обладающих литической активностью и имеющих по меньшей мере 80% идентичность последовательности с указанным полипептидом лизина.
[00157] W. Способ в соответствии с вариантом реализации K, в котором указанные бактерии находятся в биопленке, причем указанный способ приводит к разрушению биопленки.
ЛИТЕРАТУРНЫЕ ИСТОЧНИКИ
1. Magill SS, Edwards JR, Bamberg W, Beldavs ZG, Dumyati G, Kainer MA, Lynfield R, Maloney M, McAllister-Hollod L, Nadle J, Ray SM, Thompson DL, Wilson LE, Fridkin SK, Emerging Infections Program Healthcare-Associated I, Antimicrobial Use Prevalence Survey T. 2014. Multistate point-prevalence survey of health care-associated infections. N Engl J Med 370:1198-1208.
2. Rossolini GM, Arena F, Pecile P, Pollini S. 2014. Update on the antibiotic resistance crisis. Curr Opin Pharmacol 18:56-60.
3. Potron A, Poirel L, Nordmann P. 2015. Emerging broad-spectrum resistance in Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii: Mechanisms and epidemiology. Int J Antimicrob Agents 45:568-585.
4. Hattemer A, Hauser A, Diaz M, Scheetz M, Shah N, Allen JP, Porhomayon J, El-Solh AA. 2013. Bacterial and clinical characteristics of health care- and community-acquired bloodstream infections due to Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother 57:3969-3975.
5. Anderson DJ, Moehring RW, Sloane R, Schmader KE, Weber DJ, Fowler VG, Jr., Smathers E, Sexton DJ. 2014. Bloodstream infections in community hospitals in the 21st century: a multicenter cohort study. PLoS One 9:e91713.
6. Willmann M, Bezdan D, Zapata L, Susak H, Vogel W, Schroppel K, Liese J, Weidenmaier C, Autenrieth IB, Ossowski S, Peter S. 2015. Analysis of a long-term outbreak of XDR Pseudomonas aeruginosa: a molecular epidemiological study. J Antimicrob Chemother 70:1322-1330.
7. Bassetti M, Righi E. 2015. New antibiotics and antimicrobial combination therapy for the treatment of gram-negative bacterial infections. Curr Opin Crit Care 21:402-411.
8. Wittekind M, Schuch R. 2016. Cell wall hydrolases and antibiotics: exploiting synergy to create efficacious new antimicrobial treatments. Curr Opin Microbiol 33:18-24.
9. Schmelcher M, Donovan DM, Loessner MJ. 2012. Bacteriophage endolysins as novel antimicrobials. Future Microbiol 7:1147-1171.
10. Schuch R, Lee HM, Schneider BC, Sauve KL, Law C, Khan BK, Rotolo JA, Horiuchi Y, Couto DE, Raz A, Fischetti VA, Huang DB, Nowinski RC, Wittekind M. 2014. Combination therapy with lysin CF-301 and antibiotic is superior to antibiotic alone for treating methicillin-resistant Staphylococcus aureus-induced murine bacteremia. J Infect Dis 209:1469-1478.
11. Schuch R, Nelson D, Fischetti VA. 2002. A bacteriolytic agent that detects and kills Bacillus anthracis. Nature 418:884-889.
12. Briers Y, Lavigne R. 2015. Breaking barriers: expansion of the use of endolysins as novel antibacterials against Gram-negative bacteria. Future Microbiol 10:377-390.
13. Lood R. 2015. Novel phage lysin capable of killing the multidrug-resistant gram-negative bacterium Acinetobacter baumannii in a mouse bacteremia model. 59:1983-1991.
14. Thandar M, Lood R, Winer BY, Deutsch DR, Euler CW, Fischetti VA. 2016. Novel Engineered Peptides of a Phage Lysin as Effective Antimicrobials against Multidrug-Resistant Acinetobacter baumannii. Antimicrob Agents Chemother 60:2671-2679.
15. Silhavy TJ, Kahne D, Walker S. 2010. The bacterial cell envelope. Cold Spring Harb Perspect Biol 2:a000414.
16. Vaara M. 1992. Agents that increase the permeability of the outer membrane. Microbiol Rev 56:395-411.
17. Gerstmans H, Rodriguez-Rubio L, Lavigne R, Briers Y. 2016. From endolysins to Artilysin(R)s: novel enzyme-based approaches to kill drug-resistant bacteria. Biochem Soc Trans 44:123-128.
18. Zhu X, Ma Z, Wang J, Chou S, Shan A. 2014. Importance of Tryptophan in Transforming an Amphipathic Peptide into a Pseudomonas aeruginosa-Targeted Antimicrobial Peptide. PLoS One 9:e114605.
19. Deslouches B, Islam K, Craigo JK, Paranjape SM, Montelaro RC, Mietzner TA. 2005. Activity of the de novo engineered antimicrobial peptide WLBU2 against Pseudomonas aeruginosa in human serum and whole blood: implications for systemic applications. Antimicrob Agents Chemother 49:3208-3216.
20. Yeaman MR, Yount NY. 2003. Mechanisms of antimicrobial peptide action and resistance. Pharmacol Rev 55:27-55.
21. Wang J, Chou S, Xu L, Zhu X, Dong N, Shan A, Chen Z. 2015. High specific selectivity and Membrane-Active Mechanism of the synthetic centrosymmetric alpha-helical peptides with Gly-Gly pairs. Sci Rep 5:15963.
22. Lyu Y, Yang Y, Lyu X, Dong N, Shan A. 2016. Antimicrobial activity, improved cell selectivity and mode of action of short PMAP-36-derived peptides against bacteria and Candida. Sci Rep 6:27258.
23. Sanchez-Gomez S, Lamata M, Leiva J, Blondelle SE, Jerala R, Andra J, Brandenburg K, Lohner K, Moriyon I, Martinez-de-Tejada G. 2008. Comparative analysis of selected methods for the assessment of antimicrobial and membrane-permeabilizing activity: a case study for lactoferricin derived peptides. BMC Microbiol 8:196.
24. Guzman LM, Belin D, Carson MJ, Beckwith J. 1995. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose PBAD promoter. J Bacteriol 177:4121-4130.
25. Lood R, Raz A, Molina H, Euler CW, Fischetti VA. 2014. A highly active and negatively charged Streptococcus pyogenes lysin with a rare D-alanyl-L-alanine endopeptidase activity protects mice against streptococcal bacteremia. Antimicrob Agents Chemother 58:3073-3084.
26. CLSI. 2015. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard-10th Edition. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA.
27. Ceri H, Olson ME, Stremick C, Read RR, Morck D, Buret A. 1999. The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J Clin Microbiol 37:1771-1776.
28. Schuch R, Khan BK, Raz A, Rotolo JA, Wittekind M. 2017. Bacteriophage Lysin CF-301, a Potent Antistaphylococcal Biofilm Agent. Antimicrob Agents Chemother 61.
29. Moody J. 2010. Synergy testing: broth microdilution checkerboard and broth macrodilution methods, p 5.12.11-15.12.23. In Garcia LS (ed), Clinical Microbiology Procedures Handbook, vol 2. ASM Press, Washington, D.C.
30. Lv Y, Wang J, Gao H, Wang Z, Dong N, Ma Q, Shan A. 2014. Antimicrobial properties and membrane-active mechanism of a potential alpha-helical antimicrobial derived from cathelicidin PMAP-36. PLoS One 9:e86364.
31. Scanlon TC, Teneback CC, Gill A, Bement JL, Weiner JA, Lamppa JW, Leclair LW, Griswold KE. 2010. Enhanced antimicrobial activity of engineered human lysozyme. ACS Chem Biol 5:809-818.
32. Teneback CC, Scanlon TC, Wargo MJ, Bement JL, Griswold KE, Leclair LW. 2013. Bioengineered lysozyme reduces bacterial burden and inflammation in a murine model of mucoid Pseudomonas aeruginosa lung infection. Antimicrob Agents Chemother 57:5559-5564.
33. Griswold KE, Bement JL, Teneback CC, Scanlon TC, Wargo MJ, Leclair LW. 2014. Bioengineered lysozyme in combination therapies for Pseudomonas aeruginosa lung infections. Bioengineered 5:143-147.
34. Daniels DS, Schepartz A. 2007. Intrinsically cell-permeable miniature proteins based on a minimal cationic PPII motif. J Am Chem Soc 129:14578-14579.
35. Vaara M, Porro M. 1996. Group of peptides that act synergistically with hydrophobic antibiotics against gram-negative enteric bacteria. Antimicrob Agents Chemother 40:1801-1805.
36. Briers Y, Walmagh M, Van Puyenbroeck V, Cornelissen A, Cenens W, Aertsen A, Oliveira H, Azeredo J, Verween G, Pirnay JP, Miller S, Volckaert G, Lavigne R. 2014. Engineered endolysin-based «Artilysins» to combat multidrug-resistant gram-negative pathogens. MBio 5:e01379-01314.
37. Briers Y, Walmagh M, Grymonprez B, Biebl M, Pirnay JP, Defraine V, Michiels J, Cenens W, Aertsen A, Miller S, Lavigne R. 2014. Art-175 is a highly efficient antibacterial against multidrug-resistant strains and persisters of Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother 58:3774-3784.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| ПОЛИПЕПТИДЫ ЛИЗИНА, АКТИВНЫЕ ПРОТИВ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ | 2016 |
|
RU2724545C2 |
| ПРОИСХОДЯЩИЕ ИЗ БАКТЕРИОФАГОВ ПРОТИВОМИКРОБНЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ПРОТИВ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ | 2019 |
|
RU2804774C2 |
| ПОЛИПЕПТИДНЫЕ КОНСТРУКЦИИ ЛИЗИН-ПРОТИВОМИКРОБНЫЙ ПЕПТИД (AMP), ЛИЗИНЫ, ВЫДЕЛЕННЫЕ ПОЛИНУКЛЕОТИДЫ, КОДИРУЮЩИЕ ИХ, А ТАКЖЕ ВАРИАНТЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2019 |
|
RU2803121C2 |
| Модифицированный эндолизин и антибактериальные композиции на его основе для лечения инфекций, вызванных бактериями Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli | 2023 |
|
RU2813626C1 |
| ЛИТИЧЕСКИЙ ФЕРМЕНТ БАКТЕРИОФАГА И АНТИБАКТЕРИАЛЬНАЯ КОМПОЗИЦИЯ НА ЕГО ОСНОВЕ | 2018 |
|
RU2703043C1 |
| БАКТЕРИОФАГ, ОБЛАДАЩИЙ АКТИВНОСТЬЮ ПРОТИВ PSEUDOMONAS AERUGINOSA, БЕЛКИ БАКТЕРИОФАГА И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2010 |
|
RU2580248C9 |
| БАКТЕРИОФАГИ, БЕЛКИ БАКТЕРИОФАГОВ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2014 |
|
RU2671110C2 |
| ЛИЗИНЫ АЦИНЕТОБАКТЕРОВ | 2015 |
|
RU2725809C2 |
| ПРЕДОТВРАЩЕНИЕ, РАЗРУШЕНИЕ И ОБРАБОТКА БИОПЛЕНКИ ЛИЗИНОМ БАКТЕРИОФАГА | 2013 |
|
RU2646102C2 |
| ПОЛИПЕПТИД, ОБЛАДАЮЩИЙ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ АКТИВНОСТЬЮ, КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ СЕПСИСА, КОТОРАЯ ВКЛЮЧАЕТ ЕГО, И АНТИБАКТЕРИАЛЬНАЯ КОМПОЗИЦИЯ | 2020 |
|
RU2797347C2 |
Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой фармацевтическую композицию, содержащую выделенный модифицированный полипептид лизина последовательности SEQ ID NO: 3, выбранный из группы, состоящей из одного или более из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 9, или его фрагмент, обладающий активностью лизина, или его вариант, обладающий литической активностью, причем указанные фрагменты и варианты имеют по меньшей мере 80% идентичность последовательности с указанным модифицированным полипептидом лизина, причем указанный модифицированный полипептид лизина содержит аминокислотные замены K100D и R116H относительно SEQ ID NO: 3 и/или содержит последовательность пептида SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30 на N- или C-конце SEQ ID NO: 3, и фармацевтически приемлемый носитель, причем указанный полипептид или фрагмент или вариант лизина присутствует в количестве, эффективном для ингибирования роста или уменьшения популяции, или уничтожения грамотрицательных бактерий. Изобретение позволяет эффективно лечить грамотрицательную бактериальную инфекцию, вызванную грамотрицательными бактериями. 3 н. и 9 з.п. ф-лы, 10 табл., 9 пр.
1. Фармацевтическая композиция, содержащая: выделенный модифицированный полипептид лизина последовательности SEQ ID NO: 3, выбранный из группы, состоящей из одного или более из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 9, или его фрагмент, обладающий активностью лизина, или его вариант, обладающий литической активностью, причем указанные фрагменты и варианты имеют по меньшей мере 80% идентичность последовательности с указанным модифицированным полипептидом лизина, причем указанный модифицированный полипептид лизина содержит аминокислотные замены K100D и R116H относительно SEQ ID NO: 3 и/или содержит последовательность пептида SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30 на N- или C-конце SEQ ID NO: 3, и фармацевтически приемлемый носитель, причем указанный полипептид или фрагмент или вариант лизина присутствует в количестве, эффективном для ингибирования роста или уменьшения популяции, или уничтожения грамотрицательных бактерий.
2. Фармацевтическая композиция по п. 1, которая представляет собой раствор, суспензию, эмульсию, ингалируемый порошок, аэрозоль или спрей.
3. Фармацевтическая композиция по п. 1, содержащая дополнительно один или более антибиотиков, подходящих для лечения грамотрицательных бактерий.
4. Способ лечения грамотрицательной бактериальной инфекции, вызванной грамотрицательными бактериями, включающий введение субъекту, у которого диагностирована, который подвержен риску или у которого наблюдаются симптомы бактериальной инфекции, композиции, содержащей модифицированный полипептид лизина последовательности SEQ ID NO: 3, выбранный из группы, состоящей из одного или более из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 9, или его фрагмент, обладающий активностью лизина, или его вариант, обладающий литической активностью, причем указанные фрагменты и варианты имеют по меньшей мере 80% идентичность последовательности с указанным модифицированными полипептидом лизина, причем указанный модифицированный лизин содержит аминокислотные замены K100D и R116H относительно SEQ ID NO: 3 и/или содержит последовательность пептида SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30 на N- или C-конце SEQ ID NO: 3, в количестве, эффективном для ингибирования роста или уменьшения популяции, илиуничтожения по меньшей мере одного вида грамотрицательных бактерий.
5. Способ по п. 4, характеризующийся тем, что по меньшей мере один вид грамотрицательных бактерий выбран из группы, состоящей из Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella spp., Enterobacter spp., Escherichia coli, Citrobacter freundii, Salmonella typhimurium, Yersinia pestis и Franciscella tulerensis.
6. Способ по п. 4, характеризующийся тем, что указанная грамотрицательная бактериальная инфекция представляет собой инфекцию, вызванную Pseudomonas aeruginosa.
7. Способ по п. 4, характеризующийся тем, что грамотрицательная бактериальная инфекция представляет собой местную или системную патогенную бактериальную инфекцию.
8. Способ по п. 4, дополнительно включающий совместное введение субъекту, у которого диагностирована, который подвержен риску или у которого наблюдаются симптомы бактериальной инфекции, эффективного количества антибиотика, подходящего для лечения инфекции, вызванной грамотрицательными бактериями.
9. Способ по п. 8, характеризующийся тем, что указанный антибиотик выбран из одного или более из цефтазидима, цефепима, цефоперазона, цефтобипрола, ципрофлоксацина, левофлоксацина, аминогликозидов, имипенема, меропенема, дорипенема, гентамицина, тобрамицина, амикацина, пиперациллина, тикарциллина, пенициллина, рифампицина, полимиксина В и колистина.
10. Способ по п. 8, характеризующийся тем, что способ повышает эффективность антибиотика, подходящего для лечения инфекции, вызванной грамотрицательными бактериями, и при этом введение указанной комбинации более эффективно ингибирует рост или уменьшает популяцию, или уничтожает грамотрицательные бактерии, чем введение либо указанного антибиотика, либо указанного полипептида лизина, либо его активного фрагмента по отдельности.
11. Способ по п. 8, характеризующийся тем, что указанные бактерии находятся в биопленке, причем указанный способ приводит к разрушению биопленки.
12. Выделенный модифицированный полипептид лизина последовательности SEQ ID NO: 3, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 9, или его фрагмент, обладающий активностью лизина, или его вариант, обладающий литической активностью, причем указанные фрагменты и варианты имеют по меньшей мере 80% идентичность последовательности с указанным модифицированным полипептидом лизина, причем указанный модифицированный полипептид лизина содержит аминокислотные замены K100D и R116H относительно SEQ ID NO: 3 и/или содержит последовательность пептида SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30 на N- или C-конце SEQ ID NO: 3, причем указанный полипептид лизина ингибирует рост или уменьшает популяцию, или уничтожает грамотрицательные бактерии.
| WO 2017049233 A2, 23.03.2017 | |||
| WO 2012059545 A1, 10.05.2012 | |||
| Guo M | |||
| et.al | |||
| A Novel Antimicrobial Endolysin, LysPA26, against Pseudomonas aeruginosa | |||
| Microbiol | |||
| Автомобиль-сани, движущиеся на полозьях посредством устанавливающихся по высоте колес с шинами | 1924 |
|
SU2017A1 |
| Печь-кухня, могущая работать, как самостоятельно, так и в комбинации с разного рода нагревательными приборами | 1921 |
|
SU10A1 |
| Автомобиль-сани, движущиеся на полозьях посредством устанавливающихся по высоте колес с шинами | 1924 |
|
SU2017A1 |
| СПОСОБ ТЕРАПЕВТИЧЕСКОГО ИЛИ ПРОФИЛАКТИЧЕСКОГО ЛЕЧЕНИЯ СТРЕПТОКОККОВЫХ ИНФЕКЦИЙ (ВАРИАНТЫ) И КОМПОЗИЦИЯ, ПРЕДНАЗНАЧЕННАЯ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В НЕМ (ВАРИАНТЫ), ЛИЗИНОВЫЙ ФЕРМЕНТ, АССОЦИИРОВАННЫЙ С ФАГОМ СТРЕПТОКОККОВ ГРУППЫ С,- АКТИВНЫЙ АГЕНТ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ КОМПОЗИЦИИ | 1999 |
|
RU2239451C2 |
