КОМПОЗИЦИИ И ПРИМЕНЕНИЯ АНТИМИКРОБНЫХ СРЕДСТВ ДЛЯ МЕСТНОГО ПРИМЕНЕНИЯ С УЛУЧШЕННЫМИ ХАРАКТЕРИСТИКАМИ И БЕЗОПАСНОСТЬЮ Российский патент 2024 года по МПК A61K38/16 A61K9/08 A61P31/04 

ИНФОРМАЦИЯ О РОДСТВЕННОЙ ЗАЯВКЕ

[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США с серийным номером 62/482,630, поданной 6 апреля 2017 г., полностью включенной в настоящую заявку посредством ссылки.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Область техники

[0002] Настоящее изобретение относится к антимикробным фармацевтическим композициям, содержащим катионные антимикробные средства и способам их применения для профилактики и/или лечения инфекций.

Описание уровня техники в данной области

[0003] Антимикробные средства для местного применения, в том числе антисептики и антибиотики, часто оказываются неспособны обеспечить эффективные профилактику и лечение инфекций, что приводит к значительной заболеваемости и смертности среди пациентов. Специфические варианты применения (включая нанесение на различные ткани) и дозы (концентрация, объем, количество нанесений) могут быть ограничены вследствие риска возникновения одного или более из токсических явлений. Опасения относительно такой токсичности могут привести к клиническому применению неадекватных доз или к полному отказу от их применения в определенных патофизиологических условиях.

[0004] Известно, что широкий спектр катионных антимикробных средств обладает способностью связываться с мембранами бактерий и разрушать их; к ним относятся некоторые антибиотики, бис-бигуаниды, полимерные бигуаниды, четвертичные соединения аммония, природные антимикробные пептиды и синтетические катионные полипептиды. В то же время их токсичность для млекопитающих остается постоянной проблемой.

[0005] В патенте США №9,017,730 раскрыты синтетические катионные сополимерные полипептиды, содержащие различные соотношения повторяющихся остатков катионных аминокислот (например, лизина (K)) и остатков гидрофобных аминокислот (например, лейцина (L), изолейцина (I), валина (V), фенилаланина (F) или аланина (А)). В патенте США №9,017,730 раскрыто, что сегментированная или блочная архитектура, включающая протяженные участки из катионных аминокислот и протяженные участки из гидрофобных аминокислот, может улучшить совместимость с клетками млекопитающих, согласно измерениям в анализах цитотоксичности in vitro. Кроме того, в патенте США №9,017,730 раскрыто, что включение выбранных катионных блок-сополимерных полипептидов в эмульсию может улучшить совместимость с клетками млекопитающих in vitro, согласно измерениям с помощью анализов цитотоксичности. Хотя в патенте США №9,017,730 раскрыто местное применение ряда синтетических катионных сополимерных полипептидных препаратов, в нем не представлены доказательства токсичности, которая может возникнуть в результате применения этих препаратов in vivo.

[0006] В патенте США №9,446,090 раскрыт синтетический(е) катионный(е) полипептид(ы) наряду со смесями, взаимосмешивающимися с водой, содержащими такой полипептид и второй фармацевтически приемлемый полимер. В конкретных примерах описана антимикробная активность против определенных бактерий при применении конкретных смесей синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов) со вторыми полимерами, например, полиэтиленгликолем (ПЭГ), гидроксиэтилцеллюлозой (ГЭЦ) и полоксамером 407. Несмотря на то, что неизвестно, что вторые полимеры сами по себе характеризуются значительной антимикробной активностью, данные показывают, что добавление второго полимера в смеси поддерживает антимикробную активность синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов) in vitro, а в некоторых случаях усиливает общие антимикробные характеристики in vivo. В то же время в патенте США №9,446,090 не представлены доказательства токсичности, которая может возникнуть в результате применения этих смесей синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов) с другими фармацевтически приемлемыми полимерами in vivo. Кроме того, при этом остается возможность того, что второй полимер может увеличивать токсичность смесей по сравнению с синтетическим(и) катионным(и) полипептидом(ами) самими по себе.

[0007] Хотя в патентах США №№9,017,730 и 9,446,090 раскрыты значительные достижения в данной области техники, остается нерешенным ряд проблем, в частности, в отношении разработки фармацевтически приемлемых препаратов катионных антимикробных средств для местного применения, обладающих как высокой эффективностью, так и высокой безопасностью in vivo.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0008] Авторы настоящего изобретения разработали катионные антимикробные фармацевтические композиции и способы их применения, обеспечивающие местное применение in vivo доз, обеспечивающих антимикробную эффективность при низком риске местной токсичности для тканей и/или низком риске системной/отдаленной токсичности для органов.

[0009] При разработке настоящего изобретения авторы настоящего изобретения обнаружили, что риск токсичности после местного применения катионных антимикробных средств in vivo особенно значителен при нанесении их большого количества на участки ткани или в патофизиологических условиях, отличных от здоровой неповрежденной кожи. Такие участки и патофизиологические условия могут включать открытые раны, полости тела, отверстия тела, пораженную заболеванием кожу и т.д. Эти участки ткани и патофизиологические параметры могут отличаться более высокой местной чувствительностью и/или более интенсивным всасыванием и системным распределением антимикробных агентов или вспомогательных веществ для местного применения по сравнению со здоровой неповрежденной кожей. За этим может последовать повышенная местная токсичность для тканей и повышенная системная/отдаленная токсичность для органов.

[0010] Кроме того, авторы настоящего изобретения сделали ряд открытий, которые помогли при разработке настоящего изобретения. Во-первых, авторы настоящего изобретения обнаружили, что изменения в молекулярной структуре синтетических катионных полипептидов могут по-разному влиять на их антимикробную эффективность и токсичность in vivo; во-вторых, авторы настоящего изобретения обнаружили, что изменения состава композиций на основе синтетических катионных полипептидов могут по-разному влиять на их антимикробную эффективность и токсичность in vivo; и в-третьих, авторы настоящего изобретения обнаружили, что стерилизация препаратов, содержащих синтетические катионные полипептиды может оказывать отрицательное влияние на их молекулярную целостность и биофизические свойства и, таким образом, влиять на их антимикробную эффективность и/или токсичность. Таким образом, авторы настоящего изобретения обнаружили совокупность проблем, для которых были разработаны решения.

[0011] В различных вариантах реализации предложены фармацевтические композиции и способы применения, обеспечивающие местное нанесение эффективных доз по меньшей мере одного антимикробного синтетического катионного полипептида на различные участки ткани и/или в различных патофизиологических условиях с низким риском локальной и/или системной токсичности. Без ограничения сущности изобретения, в различных вариантах реализации это достигается одним или несколькими путями из (А), (В) и (С) следующим образом:

[0012] (А) Конструированием по меньшей мере одного антимикробного синтетического катионного полипептида, в особенности конструирование гидрофобного состава и конфигурация последовательности, с целью повышения вязкости в воде. Неожиданно было обнаружено, что эта конструктивная особенность повышает безопасность in vivo.

[0013] (В) Обеспечением по меньшей мере одного антимикробного синтетического катионного полипептида в составе фармацевтических композиций, что обеспечивает возможность проявления свойств, улучшающих вязкость. Без ограничения сущности изобретения, считается, что этот подход улучшает покрытие ткани и/или увеличивает времени удерживания, обеспечивая повышенную эффективность наносимой дозы. Кроме того, неожиданно было обнаружено, что такие улучшения состава повышают его безопасность. Без ограничения сущности изобретения, вспомогательные вещества могут включать соли, например, хлорид натрия и хлорид калия, сахара и сахароспирты, например, декстрозу, маннит, глицерин, ксилит и сорбит, поверхностно-активные вещества и их комбинации.

[0014] (С) Стерилизацией фармацевтических композиций таким образом, который обеспечивает вязкость стерилизованной фармацевтической композиции, сопоставимую с вязкостью нестерилизованной фармацевтической композиции. Без ограничения сущности изобретения, считается, что этот подход обеспечивает защиту молекулярной структуры и функции антимикробных синтетических катионных полипептидов, а также снижение риска заражения (контаминации) продукта некоторыми микроорганизмами (например, грибками-дерматофитами), которые могут быть устойчивы к воздействию антимикробных синтетических катионных полипептидов.

[0015] В варианте реализации предложена антимикробная фармацевтическая композиция, содержащая: водный носитель; и по меньшей мере один антимикробный синтетический катионный полипептид, диспергированный в водном носителе в диапазоне массовых концентраций от приблизительно 0,01% до приблизительно 5% в пересчете на общую массу антимикробной фармацевтической композиции. В одном варианте реализации указанный по меньшей мере один антимикробный синтетический катионный полипептид содержит множество остатков положительно заряженных аминокислот при нейтральном рН. В одном варианте реализации указанный по меньшей мере один антимикробный синтетический катионный полипептид в концентрации 2 масс. % в деионизованной воде характеризуются вязкостью при 37°С, равной 2 сантистокса (сСт) или более. В одном варианте реализации водный носитель, содержащий указанный по меньшей мере один антимикробный синтетический катионный полипептид в количестве 2 масс. %, характеризуется вязкостью при 37°С, превышающей вязкость водного носителя, содержащего 2 масс. % альбумина вместо указанного по меньшей мере одного антимикробного синтетического катионного полипептида. В одном варианте реализации водный носитель, содержащий указанный по меньшей мере один антимикробный синтетический катионный полипептид в количестве 2 масс. %, характеризуется вязкостью при 37°С, по меньшей мере приблизительно на 20% превышающей вязкость водного носителя, содержащего 2 масс. % альбумина вместо указанного по меньшей мере одного антимикробного синтетического катионного полипептида. В одном варианте реализации водный носитель, содержащий указанный по меньшей мере один антимикробный синтетический катионный полипептид в количестве 2 масс. %, характеризуется вязкостью при 37°С, по меньшей мере приблизительно на 50% превышающей вязкость водного носителя, содержащего 2 масс. % альбумина вместо указанного по меньшей мере одного антимикробного синтетического катионного полипептида. В одном варианте реализации водный носитель, содержащий указанный по меньшей мере один антимикробный синтетический катионный полипептид в количестве 2 масс. %, характеризуется вязкостью при 37°С, по меньшей мере приблизительно на 100% превышающей вязкость водного носителя, содержащего 2 масс. % альбумина вместо указанного по меньшей мере одного антимикробного синтетического катионного полипептида. В одном варианте реализации антимикробная фармацевтическая композиция обладает низкой токсичностью после инфузии в брюшную полость множества здоровых молодых взрослых мышей в дозе 10 мл/кг, согласно измерению уровня выживаемости мышей, составляющему 50% или более через 72 часа

[0016] В еще одном варианте реализации предложен способ предотвращения микробного заражения тканей, отличных от неповрежденной здоровой кожи, включающий: выявление субъекта-млекопитающего, у которого есть участок ткани, отличный от неповрежденной здоровой кожи, подверженный риску микробного заражения; и введение антимикробной фармацевтической композиции, описанной в настоящем заявке, в указанный участок в количестве, эффективном для по меньшей мере частичной защиты участка ткани от заражения микробами.

[0017] В еще одном варианте реализации предложен способ снижения микробной нагрузки в или на тканях, отличных от неповрежденной здоровой кожи, включающий: выявление субъекта-млекопитающего, у которого есть участок ткани, отличный от неповрежденной здоровой кожи, характеризующийся наличием микробной нагрузки; и введение антимикробной фармацевтической композиции, описанной в настоящем заявке, в указанный участок ткани в количестве, эффективном для по меньшей мере частичного снижения микробной нагрузки.

[0018] Эти и другие варианты реализации подробнее описаны ниже.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0019] Фигура 1. Схематическое изображение синтетических катионных полипептидов с различными конфигурациями аминокислотных последовательностей. Некоторые конфигурации могут называться блоками или сегментами.

[0020] Фигура 2. Синтетические катионные полипептиды подразделяют на три группы в зависимости от длины катионного сегмента (количества аминокислотных остатков).

[0021] Фигура 3. Примеры синтетических катионных полипептидов, подразделенные на группы (I) полипептиды с длинным катионным сегментом (≥ 200 остатков), (II) полипептиды со средним катионным сегментом (от 100 до 199 остатков) и (III) полипептиды с коротким катионным сегментом (10-99 остатков). Катионные сегменты содержат множество катионных аминокислотных остатков, но не обязательно полностью состоят из катионных аминокислотных остатков. Гидрофобные сегменты содержат множество гидрофобных аминокислотных остатков, но не обязательно полностью состоят из гидрофобных аминокислотных остатков.

[0022] Фигура 4. Пример синтетического катионного полипептида с катионно-гидрофобной блочной конфигурацией последовательности на основе аминокислотных остатков лизина и энантиомерно чистого L-лейцина. Средняя общая длина цепи полипептидного препарата составляет приблизительно 160 аминокислотных остатков. Обнаружено, что отношение лизина к лейцину, или отношение K:L составляло 3,2. Этот синтетический катионный полипептид обозначен как KL-160/3.2. Анализ посредством эксклюзионной хроматографии демонстрирует две перекрывающиеся кривые на основе двух инъекций. Дисперсность = средневзвешенная молярная масса (Mw)/среднечисловая молярная масса (Mn).

[0023] Фигура 5. Антимикробный анализ примера синтетического(их) катионного полипептида группы 2 (со средним катионным сегментом) с архитектурой на основе блоков из лизина и энантиомерно чистого лейцина, общей длиной цепи приблизительно 160 и соотношением K:L, равным 3,2. Этот синтетический катионный полипептид обозначен как KL-160/3.2. Анализ зависимости гибели клеток от времени in vitro в течение шестидесяти минут использовали для определения микробицидной активности (снижения lg КОЕ) против S. aureus (АТСС 6538), P. aeruginosa (АТСС 27853) и С.albicans (АТСС 24433) при различных концентрациях в образце от 1,6 мкг/мл до 100 мкг/мл (партия ВАС003).

[0024] Фигура 6. Сводная информация по нескольким анализам активности антимикробного средства по времени гибели при использовании синтетических катионных полипептидов KL-160/3.2 против различных микроорганизмов. Анализ зависимости гибели клеток от времени в течение шестидесяти минут выполняли с применением концентрации синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов), равной 100 мкг/мл (партия ВАС003). Термин «100%» снижение количества КОЕ означает отсутствие обнаруженных микроорганизмов. MDR = обладающий множественной лекарственной устойчивостью; ESBL = β-лактамаза расширенного спектра; KPC = карбапенемаза K. pneumoniae. Полужирный шрифт = «максимальные угрозы» центра по контролю заболеваемости (CDC); ^*Клинические изоляты, R.M. Alden Research Laboratory.

[0025] Фигура 7. Пример синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов) с катионно-гидрофобной блочной конфигурацией последовательности на основе аминокислотных остатков лизина и рацемического D, L-лейцина. Средняя общая длина цепи полипептидного препарата составляет приблизительно 100 аминокислотных остатков. Обнаружено, что отношение лизина к лейцину, или отношение K:L составляло 5,7. Этот синтетический катионный полипептид обозначен как KrL-100/5.7. Анализ посредством эксклюзионной хроматографии демонстрирует две перекрывающиеся кривые на основе двух инъекций. Дисперсность = средневзвешенная молярная масса (Mw)/среднечисловая молярная масса (Mn).

[0026] Фигура 8. Антимикробный анализ примера синтетического катионного полипептида группы 3 (с коротким катионным сегментом) с архитектурой на основе блоков из лизина и рацемического лейцина, общей длиной цепи приблизительно 100 и соотношением K:(рац-L), равным 5,7. Это вещество обозначено как KrL-100/5.7. Анализ зависимости гибели клеток от времени in vitro в течение шестидесяти минут использовали для определения микробицидной активности (снижения lg КОЕ) против важнейших патогенов при различных концентрациях в образце от 1,6 мкг/мл до 100 мкг/мл (партия ВАС002).

[0027] Фигура 9. Сводная информация по нескольким анализам активности антимикробного средства по времени гибели при использовании синтетического катионного полипептида KrL-100/5.7 против различных микроорганизмов. Анализ зависимости гибели клеток от времени в течение шестидесяти минут выполняли с применением концентрации синтетического катионного полипептида, равной 100 мкг/мл (партия ВАС002). Термин «100%» снижение количества КОЕ означает отсутствие обнаруженных микроорганизмов. MDR = обладающий множественной лекарственной устойчивостью; ESBL = β-лактамаза расширенного спектра; КРС = карбапенемаза К. pneumoniae. Полужирный шрифт = «максимальные угрозы» центра по контролю заболеваемости (CDC); ^Клинические изоляты, R.M. Alden Research Laboratory.

[0028] Фигура 10. Можно сконструировать и составить синтетические катионные полипептиды с блочной конфигурацией последовательности с возможностью их самосборки в мультимерные структуры. В настоящем документе описаны два примера: KL-160/3.2 сконструировали с возможностью самосборки в фибриллярные структуры и образования барьерных гидрогелей, a KrL-100/5.7 сконструировали с возможностью самосборки в мицеллярные структуры и наличия поверхностно-активных свойств.

[0029] Фигура 11. Критическая концентрация агрегации (САС) различных синтетических катионных полипептидов согласно измерению по флуоресценции пирена.

[0030] Фигура 12. Критическая концентрация агрегации (САС) синтетического катионного полипептида KrL-100/5.7 (партия ВАС002) согласно измерению по поверхностному натяжению. Серым показано поверхностное натяжение в зависимости от концентрации; черным показана линия, наилучшим образом аппроксимирующая два набора значений. САС определяли в данном анализе по пересечению двух линий наилучшей аппроксимации, показанному на этой фигуре в области значения -100 мкг/мл.

[0031] Фигуры 13А-В. (а) Кинематическая вязкость различных синтетических катионных полипептидов в воде при концентрации 1 масс. %, измеренная с помощью стеклянных капиллярных вискозиметров (вискозиметров Уббелоде) при температуре 37°С. (b) Кинематическая вязкость KrL-100/5.7 (партия ВАС002) по сравнению с бычьим сывороточным альбумином; вода приведена в качестве эталона. Эти данные указывают, что при этих концентрациях альбумин оказывает незначительное влияние на вязкость водных препаратов.

[0032] Фигура 14. Кинематическая вязкость синтетических катионных полипептидов с конфигурацией последовательности из блоков лизина-Ь-лейцина в воде при концентрации 0,5 масс. %, измеренная с помощью стеклянных капиллярных вискозиметров (вискозиметров Уббелоде) при температуре 37°С.

[0033] Фигура 15. Кинематическая вязкость различных синтетических катионных полипептидов с конфигурацией последовательности из блоков лизина-L-лейцина (KL) и лизина-L-лейцина (KrL) в воде при концентрации 1 масс. % и 2 масс. %, измеренная с помощью стеклянных капиллярных вискозиметров (вискозиметров Уббелоде) при температуре 40°С.

[0034] Фигура 16. Динамическая вязкость синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов) KL-120/2.5 при концентрациях 1,5 масс. %, 2,0 масс. % и 3,0 масс. % в воде, оцениваемая на фоне растущей силы сдвига. Измерение выполняли в течение 2 мин с помощью ротационного вискозиметра Brookfield RVDV (EQ-AL-2014-16) со шпинделем 14 размера и камерой размера 6R при комнатной температуре.

[0035] Фигуры 17A-D. Типичный синтетический катионный полипептид KL-120/2.5 образует(ют) вязкие растворы и гидрогели в воде. KL-120/2.5 получали в ДИ-воде при концентрациях 0,5 масс. %, 1,0 масс. %, 1,5 масс. %, 2,0 масс. % и 3,0 масс. % и оценивали на предмет гелеобразования с помощью анализа в наклонной пробирке, на предмет твердости с помощью анализа текстуры и на предмет вязкости, (а) Визуальное исследование гелеобразования с помощью анализа в наклонной пробирке. (b) Твердость в зависимости от концентрации в воде, измеряемая с помощью анализа текстуры. Значения твердости получали при глубине зонда 8 мм. На изображении-вставке показан 2 масс. % KL-120/2.5 в воде, нанесенный на подложку из искусственной кожи (VTTRO-SKTN; IMS Inc.). (с) Графическое представление, демонстрирующее изменения физических свойств при увеличении концентрации KL-120/2.5 (белый цвет = жидкость; черный цвет = твердый гель); на основе данных вискозиметрии для концентраций 0,5 масс. % и 1,0 масс. % и данных анализа текстуры и анализа в наклонной пробирке для более высоких концентраций, (d) KL-120/2.5 при концентрации 1,5 масс. % в воде устойчив к проникновению двух различных шариков из нержавеющей стали (ВВ).

[0036] Фигура 18. Частичный список фармацевтически приемлемых неионогенных вспомогательных веществ (добавок), которые можно использовать при получении синтетических катионных полипептидов и антимикробных фармацевтических композиций, содержащих их.

[0037] Фигура 19. Динамическая вязкость синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов) KL-120/2.5 (ВАС004) при концентрации 2,0 масс. % в воде, 4,5% водном манните, 2,33% водном глицерине или 2,8% водном гистидине при оценке на фоне растущей силы сдвига. Измерение выполняли в течение 2 минут с помощью ротационного вискозиметра Brookfield RVDV (EQ-AL-2014-16) со шпинделем 14 размера и камерой размера 6R при комнатной температуре.

[0038] Фигура 20. Кинематическая вязкость двух примеров синтетических катионных полипептидов с конфигурацией последовательности из блоков лизина-L-лейцина (KL) и лизина-D,L-лейцина (KrL) в воде при концентрации 1 масс. % в чистой воде, 0,9% физиологическом растворе или 4,4% водном ксилите. Измерено с помощью стеклянных капиллярных вискозиметров (вискозиметров Уббелоде) при температуре 40°С.

[0039] Фигура 21. Динамическая вязкость синтетического катионного полипептида KL-120/2.5 (ВАС004) при концентрации 2,0 масс. % в 4,5% манните и воде, оцениваемая на фоне растущей силы сдвига. Измерение выполняли в течение 2 минут с помощью ротационного вискозиметра Brookfield RVDV (EQ-AL-2014-16) со шпинделем 14 размера и камерой размера 6R при комнатной температуре.

[0040] Фигура 22. Показано, что типичный препарат синтетического катионного полипептида KrL-120/5.0 снижает поверхностное натяжение по сравнению с двумя другими катионными антимикробными средствами - глюконатом хлоргексидина (CHG) и полигексаметиленбигуанидом (ПГМБ). Образцы получали в концентрации 0,1 мм и оценивали с помощью ТА.ХТ2 Texture Analyzer с загрузочной ячейкой на 500 г, кольцом дю Нуи диаметром 4 см и скоростью зонда 0,2 мм/с при комнатной температуре.

[0041] Фигура 23. Поверхностное натяжение различных препаратов синтетических катионных полипептидов в воде. Образцы получали в концентрации 0,1 мм и оценивали с помощью ТА.ХТ2 Texture Analyzer с загрузочной ячейкой на 500 г, кольцом дю Нуи диаметром 4 см и скоростью зонда 0,2 мм/с при комнатной температуре.

[0042] Фигуры 24А-В. Поверхностно-активные свойства KrL-100/5.7. (а) Поверхностное натяжение водного KrL-100/5.7 (партия ВАС002) 10 мг/мл (1 масс. %) посредством тензиометра, оснащенного кольцом дю Нуи, по сравнению с водой. (b) Межфазное натяжение KrL-100/5.7 при концентрации 1 масс. % в воде с n-гексаном в течение 10 минут.

[0043] Фигура 25. Поверхностное натяжение: влияние уксусной кислоты как добавки. Типичные синтетические катионные полипептиды KrL-130/3.3 (партия 77) и KL-130/3.3 (партия 72) снижают поверхностное натяжение в препарате на основе воды или воды с 0,25% или 1,0% уксусной кислотой. Добавление уксусной кислоты оказывает аддитивный эффект.

[0044] Фигура 26. Межфазное натяжение: влияние уксусной кислоты как добавки. Типичные синтетические катионные полипептиды KrL-130/З.З (партия 77) и KL-130/3.3 (партия 72) снижают межфазное натяжение в препарате на основе воды или воды с 0,25% или 1,0% уксусной кислотой. Добавление уксусной кислоты оказывает аддитивный эффект.

[0045] Фигуры 27А-В. Эмульгирующие свойства. Типичные синтетические катионные полипептиды KrL-100/5.0 и KrL-160/3.2 образуют стабильные эмульсии в воде при смешивании с соевым маслом, (а) Фотография анализа, на которой продемонстрированы границы раздела эмульсия/жидкость (белые стрелки); b) показатель эмульсии (Е₂₄; % эмульсии на момент времени 24 часа).

[0046] Фигура 28. Эмульгирующие свойства в воде, физиологическом растворе и ксилите. Типичные синтетические катионные полипептиды KrL-110/4.0 (партия D-301-37-05) и KL-100/5.7 (партия D-301-67-03), полученные в воде, физиологическом растворе (0,9%) или ксилите (4,4%), образуют стабильные эмульсии при смешивании с соевым маслом.

[0047] Фигура 29. Оценка результатов, полученных на модели кожного раздражения у кроликов. После нанесения различных составов и концентраций синтетических катионных полипептидов KL-140/2.5 или KrL-120/5.0 наблюдали незначительные реакции интактной и стертой кожи. У каждого кролика (новозеландской белой породы, N=3 на тестируемое соединение) было в общей сложности 8 участков: 2 интактных контрольных, 2 интактных для тестируемого соединения, 2 контрольных участка со стертой кожей и 2 участка со стертой кожей для тестируемого соединения. Размер каждого участка составлял приблизительно 2,5×2,5 см; на каждый участок наносили 0,5 мл тестируемого соединения на 24 ч. Участки оценивали через 1 ч, 24 ч, 48 ч и 72 ч на пример эритемы, отека и формирования струпьев.

[0048] Фигура 30. Оценка результатов сенсибилизации кожи морских свинок. После нанесения KL-140/2.5 (партия 73) или KrL-120/5.0 (партия 93) при концентрации 1 масс. % в воде видимых изменений не наблюдали. Морских свинок линии Hartley Albino (n=11 в экспериментальных группах, n=6 для положительного контроля, n=6 для отрицательного контроля) подвергали воздействию 0,3 мл тестируемого соединения на 6 ч/день в течение 3 дней подряд в неделю в течение 3 недель. Контрольное воздействие выполняли на 14+/- 1 день после последнего индукционного воздействия. Участки с нанесенными дозами оценивали через 24 и 48 ч после удаления пластыря для контрольного воздействия.

[0049] Фигура 31. Оценка результатов токсичности при пероральном воздействии у крыс. После введения KL-140/2.5 в воде или KrL-120/5.0 в воде крысам в диапазоне доз от 0,625 мг/кг до 160 мг/кг через желудочный зонд аномалий не отмечено. Самцам молодых крыс Sprague Dawley (N=5 на группу) вводили по 2 мл. Клинические наблюдения выполняли в течение трех дней.

[0050] Фигура 32. Оценка системной токсичности после внутрибрюшинного введения у мышей. Мыши CD-1 получали внутрибрюшинную инъекцию 40 мл/кг воды или тестируемых соединений K-100, KL-140/2.5-RAN или KrL-120/5.0, разбавленных водой до концентрации 2 масс. %. Конечная доза на животное составляла 800 мг/кг. N=5 мышей CD-1 на группу. Клинические наблюдения выполняли в течение трех дней.

[0051] Фигура 33. Оценка системной токсичности после внутрибрюшинного введения у мышей. Мыши CD-1 получали внутрибрюшинную инъекцию 40 мл/кг физиологического раствора или KrL-130/3.3, разбавленного водой в различных концентрациях. Конечные дозы варьировали от 12,5 мг/кг до 800 мг/кг на животное. N=5 мышей CD-1 на группу. Клинические наблюдения выполняли в течение трех дней.

[0052] Фигура 34. Оценка системной токсичности после внутрибрюшинного введения у мышей. Мыши CD-1 получали внутрибрюшинную инъекцию 40 мл/кг воды или KrL-120/5.0 партии 93 или 94, разбавленного водой в различных концентрациях. Конечные дозы варьировали от 50 мг/кг до 800 мг/кг на животное. N=5 мышей CD-1 на группу. Клинические наблюдения выполняли в течение трех дней.

[0053] Фигура 35. Оценка системной токсичности после внутрибрюшинного введения у мышей. Мыши CD-I получали внутрибрюшинную инъекцию 40 мл/кг физиологического раствора или KL-170/3.3 или KL-140/2.5, разбавленных водой в различных концентрациях. Конечные дозы варьировали от 6,25 мг/кг до 400 мг/кг на животное. N=5 мышей CD-1 на группу. Клинические наблюдения выполняли в течение трех дней.

[0054] Фигура 36. Оценка системной токсичности после внутрибрюшинного введения у мышей. Мыши CD-1 получали внутрибрюшинную инъекцию 40 мл/кг воды или KL-140/2.5 в виде различных составов и в различных концентрациях. Конечные дозы варьировали от 1,25 мг/кг до 400 мг/кг на животное. N=5 мышей CD-1 на группу. Клинические наблюдения выполняли в течение трех дней.

[0055] Фигура 37. Оценка системной токсичности после внутрибрюшинного введения у мышей. Мыши CD-1 получали внутрибрюшинную инъекцию 40 мл/кг физиологического раствора или KrL-120/5.0 в виде различных составов в нескольких концентрациях. Конечные дозы варьировали от 50 мг/кг до 800 мг/кг на животное. N=5 мышей CD-1 на группу. Клинические наблюдения выполняли в течение трех дней.

[0056] Фигура 38. ЭХ-хроматограммы KL-140/2.5 (партия 73) до и после гамма-стерилизации в дозе 25-40 кГр. Данные указывают на разрыв молекулярной структуры после гамма-облучения.

[0057] Фигура 39. ЭХ-хроматограммы KL-120/5.0 (партия 94) до и после гамма-стерилизации в дозе 25-40 кГр. Данные указывают на разрыв молекулярной структуры после гамма-облучения.

[0058] Фигура 40. ЭХ-хроматограммы KL-160/3.2 (партия ВАС003) перед и после электронно-лучевой стерилизации в дозе 25 кГр. Данные указывают на разрыв молекулярной структуры после электронно-лучевой стерилизации.

[0059] Фигура 41. Анализ текстуры двух партий KL-140/2.5 (73 и 95) до и после гамма-стерилизации в дозе 25-40 кГр. Измерения выполняли с использованием анализатора текстуры ТА.ХТ2 при скорости зонда 0,5 мм/с. Данные указывают на снижение твердости большинства из этих композиций после гамма-облучения.

[0060] Фигура 42. ЭХ-хроматограммы KL-140/2.5 (партия 73) в виде препарата в воде до и после стерилизации автоклавированием. Данные указывают на сохранение молекулярной структуры после стерилизации автоклавированием.

[0061] Фигура 43. ЭХ-хроматограммы KL-120/5.0 (партия 94) в виде препарата в воде до и после стерилизации автоклавированием. Данные указывают на сохранение молекулярной структуры после стерилизации автоклавированием.

[0062] Фигура 44. ЭХ-хроматограммы KL-160/3.2 (партия ВАС003) в концентрации 2 масс. % в воде до и после стерилизации автоклавированием. Данные указывают на сохранение молекулярной структуры после стерилизации автоклавированием.

[00631 Фигура 45. ЭХ-хроматограммы KL-160/3.2 (партия ВАС003) в концентрации 2 масс. % в воде с 2% пропиленгликоля до стерилизации, после стерилизации автоклавированием и после стерилизации фильтрованием. Данные указывают на сохранение молекулярной структуры после стерилизации автоклавированием и стерилизации фильтрованием.

[00641 Фигура 46. ЭХ-хроматограммы KL-160/3.2 (партия ВАС003) в концентрации 2 масс. % в воде с 2,33% глицерином до стерилизации, после стерилизации автоклавированием и после стерилизации фильтрованием. Данные указывают на сохранение молекулярной структуры после стерилизации автоклавированием и стерилизации фильтрованием.

[00651 Фигура 47. Динамическая вязкость синтетического катионного полипептида KL-120/2.5 (партия ВАС004) при концентрации 2,0 масс. % в воде с 2,1% пропиленгликоля до и после стерилизации фильтрованием. Измерение выполняли в течение 2 минут с помощью ротационного вискозиметра Brookfield RVDV (EQ-AL-2014-16) со шпинделем 21 размера и камерой размера 13R при комнатной температуре.

[00661 Фигура 48. Динамическая вязкость синтетического катионного полипептида KL-160/3.2 (партия ВАС003) при концентрации 2,0 масс. % в воде до и после стерилизации автоклавированием. Измерение выполняли в течение 2 минут с помощью ротационного вискозиметра Brookfield RVDV (EQ-AL-2014-16).

[00671 Фигура 49. Динамическая вязкость синтетического катионного полипептида KL-160/3.2 (партия ВАС003) при концентрации 2,0 масс. % в воде с 2,33% глицерина до и после стерилизации автоклавированием. Измерение выполняли в течение 2 минут с помощью ротационного вискозиметра Brookfield RVDV (EQ-AL-2014-16).

[0068] Фигура 50. Анализ текстуры двух партий синтетического катионного полипептида KL-140/2.5 (98 и 99) при концентрациях 1 и 2 масс. % в воде с 1% гидроксиэтилцеллюлозой (ГЭЦ) и без нее до и после стерилизации автоклавированием. Измерения выполняли с использованием анализатора текстуры ТА.ХТ2 при скорости зонда 2 мм/с. Данные указывают на сохранение благоприятных свойств твердости после автоклавирования. Некоторое общее снижение твердости наблюдали при повышенной концентрации препаратов и в препаратах, составленных с ГЭЦ.

[0069] Фигура 51. Анализ текстуры синтетического катионного полипептида KL-140/2.5 (партия 99) при концентрациях 1 масс. % в воде с 1 масс. % гидроксипропилцеллюлозой (НРС), гидроксипропилметилцеллюлозой (НРМС) или метилцеллюлозой (МС) до и после стерилизации автоклавированием. Измерения выполняли с использованием анализатора текстуры ТА.ХТ2 при скорости зонда 2 мм/с.

[0070] Фигура 52. Снижение поверхностного натяжения за счет препаратов синтетического катионного полипептида KrL-120/5.0 (партия 94) в воде до и после стерилизации автоклавированием. Образцы получали в концентрации 0,1 мм и оценивали с помощью ТА.ХТ2 Texture Analyzer с загрузочной ячейкой на 500 г, кольцом дю Нуи диаметром 4 см и скоростью зонда 0,2 мм/с при комнатной температуре.

[0071] Фигура 53. Графическое представление классификации ран.

[0072] Фигура 54А-В. Результаты обработки на модели кожи свиньи ex vivo до инокуляции микроорганизмов. Антимикробные барьерные свойства препаратов KL-120/2.5 (партия ВАС003) и KL-160/3.2 (партия ВАС004) продемонстрировали на коже свиньи ex vivo. Данные показывают lg КОЕ выживших P. aeruginosa через 3 часа после инокуляции эксплантатов кожи, предварительно обработанных в течение 30 минут водой (контроль; N=8) или (а) 0,5-2,0 масс. % KL-120/2.5 (N=8) или (b) 0,5-2,0 масс. % KL-160/3.2 (N=8). В группе "без наклона" эксплантаты оставались горизонтальными в течение всей предварительной обработки препаратами синтетических катионных полипептидов; в группе "с наклоном" эксплантаты были наклонены под углом 90° к вертикальному положению в течение 15 минут для стимуляции отвода покрытия из препарата синтетического катионного полипептида перед инокуляцией. *микроорганизмы не обнаружены. Показатели разброса представляют собой SEM.

[0073] Фигуры 55А-В. Результаты обработки в модели открытой раны у свиней до инокуляции микроорганизмов. Препараты синтетического катионного полипептида KL-160/3.2 (партия ВАС003) предотвращают микробное заражение на модели свиньи (N=5 ран; 4 для "N.I."). a) S. epidermidis b) P. aeruginosa. N.I. = без инокуляции. Раны на всю толщину кожи предварительно обрабатывали 1,0 мл KL-160/3.2 в указанных концентрациях или водой за 15 мин до инокуляции смешанной культурой S. epidermidis и P. aeruginosa. Общее количество микроорганизмов, а также селективное количество S. epidermidis и P. aeruginosa оценивали через 4 часа. Во всех случаях различия между контролем и KL-160/3.2 были значимы при р<0,01. *Микроорганизмы не обнаружены.

[0074] Фигуры 56А-В. Результаты обработки модельной открытой раной у свиньи до инокуляции микроорганизмов. KL-160/3.2 (партия ВАС003) предотвращает микробное заражение на модели свиньи (N=4 раны на группу), a) S. epidermidis b) P. aeruginosa. Раны на всю толщину кожи предварительно обрабатывали 1,0 мл KL-160/3.2 в указанных концентрациях или водой за 24 ч, 4 ч или 1 ч до инокуляции смешанной культурой S. epidermidis и P. aeruginosa. Общее количество микроорганизмов, а также селективное количество S. epidermidis и P. aeruginosa оценивали через 4 часа после инокуляции.

[0075] Фигуры 57А-В. Результаты обработки на модели закрытой раны с хирургической сеткой у грызунов до инокуляции микроорганизмов. KL-160/3.2 (партия ВАС003) (1 масс. % в воде) демонстрировал активность против (a) MRSA (АТСС 33593) и (b) P. aeruginosa (АТСС 27317) на модели закрытой раны с инородным телом у грызунов (KL-160/3.2 N=6; контроль N=8; крысы Sprague-Dawley). Lg КОЕ показан на грамм ткани для образцов биоптатов и на имплантированную полипропиленовую сетку. Препараты KL-160/3.2 наносили за 15 мин до инокуляции микроорганизмов; микробную нагрузку оценивали через 48 ч. Различия между группами контроля и KL-160/3.2 для обоих микроорганизмов были значимы при р<0,0001. Микроорганизмы не обнаружены.

[0076] Фигура 58. Активность против биопленок. Анализ минимальной концентрации для уничтожения биопленки (МВЕС) препарата синтетического катионного полипептида KrL-100/5.7 (партия ВАС002). Активность против Р. aeruginosa (АТСС ВАА-47) в биопленках. Биопленки P. aeruginosa подвергали воздействию различных концентраций синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов) (0,001%, 0,01%, 0,1%, и 1,0% в воде) в течение 20 мин или 3 ч; образцы обрабатывали для измерения колониеобразующих единиц (КОЕ). * = микроорганизмы не обнаружены.

[0077] Фигура 59. Активность против биопленок. Анализ минимальной концентрации для уничтожения биопленки (МВЕС) препарата синтетических катионных полипептидов KrL-100/5.7 (партия ВАС002) и KL-100/5.7 (партия D-301-67-03). Активность против P. aeruginosa (АТСС ВАА-47) в биопленках. Биопленки Р. aeruginosa подвергали воздействию различных концентраций препаратов синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов) (0,01%, 0,1%, и 1,0%) в течение 3 ч; образцы обрабатывали для измерения колониеобразующих единиц (КОЕ).

[0078] Фигура 60. Результаты обработки на модели закрытой раны с хирургической сеткой у грызунов после инокуляции микроорганизмов. Препараты синтетического катионного полипептида KL-160/5.7 (партия ВАС002) демонстрировали активность против MRS А (АТСС 33593) на модели закрытой раны с инородным телом у грызунов (KrL-100/5.7 N=6; контроль N=8; крысы Sprague-Dawley). Lg выживших КОЕ показан на грамм ткани для образцов биоптатов и на имплантированную полипропиленовую сетку. Препараты KrL-100/5.7 (0,01%, 0,1%, и 1,0%) наносили через 15 минут после инокуляции микроорганизмов, микробную нагрузку оценивали через 48 часов. Данные представлены как среднее значение + SEM. *Микроорганизмы не обнаружены.

[0079] Фигуры 61А-В. Результаты обработки на модели закрытой раны с хирургической сеткой у грызунов после инокуляции микроорганизмов, (а) Гистопатология тканевых биоптатов и сетки с инокулированным MRSA. Образцы обрабатывали для гистологического анализа и окрашивали гематоксилином-эозином. (b) Балльные показатели воспаления определял опытный ветеринар-патолог посредством микроскопического анализа.

[0080] Фигура 62. Результаты обработки на модели закрытой раны с хирургической сеткой у грызунов после инокуляции микроорганизмов. Препараты синтетического катионного полипептида KL-160/5.7 (партия ВАС002) демонстрировали активность против P. aeruginosa (АТСС 27317) на модели закрытой раны с инородным телом у грызунов (KrL-100/5.7 N=6; контроль N=8; крысы Sprague-Dawley). Lg выживших КОЕ показан на грамм ткани для образцов биоптатов и на имплантированную полипропиленовую сетку. Препараты KrL-100/5.7 (0,01%, 0,1%, и 1,0%) наносили через 15 минут после инокуляции микроорганизмов, микробную нагрузку оценивали через 48 часов. Данные представлены как среднее значение + SEM. *Микроорганизмы не обнаружены.

[0081] Фигуры 63А-В. Результаты обработки на модели закрытой раны с хирургической сеткой у грызунов после инокуляции микроорганизмов, (а) Гистопатология тканевых биоптатов и сетки с инокулированным P. aeruginosa. Образцы обрабатывали для гистологического анализа и окрашивали гематоксилином-эозином. (b) Балльные показатели воспаления определял опытный ветеринар-патолог посредством микроскопического анализа.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Определения

[0082] В настоящем документе в контексте описания антимикробных синтетических катионных полипептидов термин «антимикробный» имеет свое обычное значение, понятное специалистам в данной области техники, и, таким образом, включает полипептид, проявляющий микробиоцидную активность, определяемую путем анализа зависимости гибели клеток от времени в течение 60 минут, против по меньшей мере одной бактерии, выбранной из группы, состоящей из S. aureus, S. epidermidis, P. aeruginosa и E.coli.

[0083] В настоящем документе в контексте описания антимикробных синтетических катионных полипептидов термин «полипептид» имеет свое обычное значение, понятное специалистам в данной области техники, и, таким образом, включает полимер, содержащий два или более повторяющихся аминокислотных остатков (также называемых аминокислотными группами, или, проще, остатками или группами), соединенных друг с другом пептидными связями. Сополимерный полипептид представляет собой вид полипептидов, содержащий два или более различных аминокислотных повторяющихся остатка. Молекулярные массы полимеров являются средневзвешенными и определяются с помощью эксклюзионной хроматографии (ЭХ) со стандартами молекулярной массы или с использованием обнаружения светорассеяния.

[0084] Термин «блок» или «блочный» сополимерный полипептид имеет свое обычное значение, понятное специалистам в данной области техники, и, таким образом, включает конфигурацию последовательности аминокислотных остатков, содержащую сегмент («блок») или сегменты длиной по меньшей мере 10 аминокислотных остатков, в котором сополимер полипептида относительно обогащен одним или более аминокислотными остатками по сравнению с общим составом сополимера полипептида. Как правило, синтетические блок-сополимерные полипептиды содержат конфигурацию последовательности, отражающую преднамеренный контроль над процессом сополимеризации. Аналогичным образом, термин «случайный» сополимерный полипептид имеет свое обычное значение, понятное специалистам в данной области, и, таким образом, включает конфигурацию последовательности аминокислотных остатков, представляющую собой статистическое распределение, отражающее концентрацию соответствующих аминокислотных мономеров в полимеризационной смеси.

[0085] В настоящем документе в контексте описания антимикробных синтетических катионных блок-сополимерных полипептидов термин «гидрофобный» имеет свое обычное значение, понятное специалистам в данной области техники, и, таким образом, включает конфигурацию последовательности, в которой блок или сегмент содержит множество гидрофобных аминокислотных остатков. Примеры гидрофобных аминокислотных остатков известны специалистам в данной области техники и включают глицин (G), лейцин (L), изолейцин (I), валин (V), пролин (Р), триптофан (W), цистеин (С), метионин (М), фенилаланин (F) и аланин (А). Аналогичным образом, термин «гидрофильный» блок имеет свое обычное значение, понятное специалистам в данной области техники, и, таким образом, включает конфигурацию последовательности, в которой блок или сегмент содержит множество гидрофильных аминокислотных остатков. Примеры гидрофильных аминокислотных остатков известны специалистам в данной области техники и включают серии (S), треонин (Т), аспарагиновую кислоту (D) и глутаминовую кислоту (Е), а также положительно заряженные аминокислоты лизин (K), аргинин (R), гистидин (Н) и орнитин (О).

[0086] В настоящем документе в контексте описания антимикробных синтетических катионных полипептидов термины «положительно заряженный» и «катионный» имеют свое обычное значение, понятное специалистам в данной области техники, и, таким образом, включает аминокислотный остаток или полипептид, положительно заряженные при нейтральном рН. Примеры аминокислотных остатков, положительно заряженных при нейтральном рН, включают лизин, аргинин, гистидин и орнитин, и, таким образом, присутствие одного или нескольких из этих положительно заряженных остатков в полипептиде (в количестве, превышающем любые анионные остатки) может сделать полипептид катионным.

[0087] В настоящем документе в контексте описания стерилизованной антимикробной фармацевтической композиции термин «стерилизованный» имеет свое обычное значение, понятное специалистам в данной области, и, таким образом, включает композицию, подвергнутую процессу или процессам стерилизации, обеспечивающим отсутствие или снижение количества известных патогенов в композиции до такой степени, которая делает стерилизованную композицию клинически приемлемой для местного введения в отверстие тела (например, интраназального введения) или на открытую кожу, например, для введения в открытую рану, например, в область хирургического вмешательства. Неограничивающие примеры таких процессов стерилизации включают тепловую стерилизацию (например, автоклавирование), стерильную фильтрацию, облучение и/или обработку химическими агентами, например, оксидом этилена.

[0088] В настоящем документе в контексте описания самосборного полипептида, термин «самосборный» имеет свое обычное значение, понятное специалистам в данной области, и, таким образом, включает конфигурации полипептидов при их диспергировании в среде (например, других ингредиентах фармацевтической композиции), в которой межмолекулярные силы притяжения между определенными сегментами или блоками полипептида вызывают слабое связывание этих сегментов или блоков друг с другом. Например, как отмечено в патенте США №9,017,730, в водном растворе наблюдается самосборка катионных блок-сополимерных полипептидов, что приводит к образованию различных иерархических структур в зависимости от конфигурации гидрофобных доменов и их влияния на межмолекулярные взаимодействия притяжения между полимерными цепями. И наоборот, в патенте США №9,017,730 указано, что случайные сополимерные полипептиды не проявляют способности к самосборке. Специалистам в данной области техники известны различные методики для определения того, является ли синтетический катионный полипептид самосборным (см., например, патент США №9,017,730). По сравнению с аналогичным синтетическим катионным полипептидом, обладающим случайной конфигурацией последовательности в разбавленном растворе и не проявляющим способности к самосборке, самосборный синтетический катионный полипептид, как правило, обладает более высокой вязкостью.

[0089] В настоящем документе в контексте описания молекулярного признака или параметра, способствующего самосборке полипептидов, термины «способствует» и «способствующий» имеют свое обычное значение, понятное специалистам в данной области, и, таким образом, включают возможность или усиление такой самосборки. Например, в патентах США №9,017,730 и 9,446,090 описаны различные конфигурации последовательностей гидрофобных аминокислотных остатков и гидрофильных аминокислотных остатков, сконфигурированные с целью содействия самосборке сополимерного полипептида в воде. Аналогичным образом, способ стерилизации, сконфигурированный для получения состояния стерилизации, способствующего самосборке полипептида, представляет собой способ, обеспечивающий возможность самосборки или усиливающий самосборку при применении к такому полипептиду или к композиции полипептида, диспергированного в водном носителе. Аналогичным образом, композиция водного носителя, выбранная для обеспечения самосборки полипептида, представляет собой композицию, обеспечивающую возможность самосборки или усиливающую самосборку при диспергировании такого полипептида в водном носителе.

[0090] В настоящем документе в контексте описания самосборного синтетического катионного блок-сополимерного полипептида по сравнению с другим сопоставимым случайным синтетическим катионным сополимерным полипептидом термин «в остальном сопоставимый случайный синтетический катионный сополимерный полипептид» имеет свое обычное значение, понятное специалистам в данной области техники, и, следовательно, включает сополимерные полипептиды, обладающие приблизительно одинаковой молекулярной массой и относительным количеством таких же гидрофобных и гидрофильных аминокислотных повторяющихся остатков, что и самосборный синтетический катионный блок-сополимерный полипептид, за исключением того, что конфигурация в последовательности этих повторяющихся аминокислотных остатков в сопоставимом сополимерном полипептиде является случайной, а не блочной. Например, в отношении самосборного блок-сополимерного полипептида, содержащего гидрофильный (положительно заряженный) лизиновый блок со средней длиной приблизительно 120 остатков и гидрофобный лейциновый блок со средней длиной приблизительно 30 остатков, в остальном сопоставимый случайный синтетический катионный сополимерный полипептид представляет собой сополимер, содержащий в среднем приблизительно 120 лизиновых остатков и приблизительно 30 лейциновых остатков на цепь сополимерного полипептида, за исключением того, что конфигурация в последовательности этих остатков в цепи случайного сополимерного полипептида представляет собой статистическое распределение, отражающее концентрацию мономеров лизина и лейцина в полимеризационной смеси.

[0091] В настоящем документе в контексте описания введения стерилизованной антимикробной фармацевтической композиции в участок на теле млекопитающего в избыточном количестве, эффективном по меньшей мере для частичной профилактики и/или лечения инфекции, термины «избыточный» и «избыточность» имеют свое обычное значение, понятное специалистам в данной области, и, таким образом, включают введение количества сополимерного полипептида, которое по меньшей мере в 10 раз превышает дозу, необходимую для достижения желательного эффекта профилактики и/или лечения. Обычно полная лечебная доза антимикробной фармацевтической композиции, включающая введение 1 г синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов) или более человеку с массой тела 70 кг, что составляет 14,3 мг/кг, считается избыточным введением. Специалистам в данной области понятно, что биологически активные соединения обычно вводят в количестве, соответствующем «терапевтическому окну», что включает диапазон доз, при которых достигается желательный терапевтический ответ без значительных нежелательных эффектов у субъектов, которым их вводят. Этот диапазон доз обычно находится между минимальной эффективной концентрацией (МЕС) и минимальной токсической концентрацией (МТС); обычно его заранее определяют для каждого биологически активного соединения и сообщают субъекту и/или лицу, осуществляющему уход, в форме рекомендации по дозировке. Однако в некоторых ситуациях, например, при местном нанесении антимикробной композиции на отверстия тела и/или открытые раны субъектов-млекопитающих, определение МЕС может быть нецелесообразным и, таким образом, очень выгодной является возможность гибкого введения антимикробного средства в избыточном количестве. Например, при лечении открытой раны в экстренной ситуации, когда все может зависеть от времени, для лица, осуществляющего уход, очень полезно иметь возможность гибкого нанесения антимикробного средства на открытую рану (например, в количестве, превышающем МЕС по меньшей мере в десять раз), не опасаясь ввести количество, превышающее МТС. МЕС для конкретной стерилизованной антимикробной фармацевтической композиции можно определить способами, известными специалистам в данной области, например, описанными в приведенных ниже примерах (например, количество, позволяющее эффективно уничтожать 3-lg КОЕ при анализе зависимости гибели клеток от времени in vitro).

[0092] В настоящем документе в контексте описания антимикробной фармацевтической композиции, содержащей или состоящей из водного носителя и антимикробного(ых) синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов), диспергированного(ых) в водном носителе, термин «водный носитель» имеет свое обычное значение, понятное специалистам в данной области техники, и, таким образом, включает различные системы носителей на водной основе, которые необязательно могут содержать дисперсное вещество, например, ионогенную добавку (например, соль) или неионогенную добавку (например, полимер, спирт, сахар и/или поверхностно-активное вещество). Вещества, диспергированные в водном носителе, могут растворяться в нем и/или быть диспергированы в форме мелких частиц. Антимикробные фармацевтические композиции

[0093] В различных вариантах реализации предложены антимикробные фармацевтические композиции, содержащие или состоящие из водного носителя и антимикробного(ых) синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов), диспергированных в водном носителе. Количество катионного(ых) полипептида(ов), диспергированного(ых) в водном носителе, может варьироваться в широком диапазоне, который зависит прежде всего от желательной вязкости антимикробной фармацевтической композиции. Например, в различных вариантах реализации количество синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов) в антимикробной фармацевтической композиции находится в диапазоне от приблизительно 0,001 масс. % до приблизительно 10 масс. % в пересчете на общую массу антимикробной фармацевтической композиции. В некоторых вариантах реализации количество синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов), диспергированного(ых) в водном носителе, находится в диапазоне от приблизительно 0,01 масс. % до приблизительно 5 масс. % в пересчете на общую массу антимикробной фармацевтической композиции.

[0094] В различных вариантах реализации антимикробный(е) синтетический(е) катионный(е) полипептид(ы), диспергированный(е) в водном носителе, содержит(ат) множество положительно заряженных аминокислотных остатков (при нейтральном рН). В одном варианте реализации синтетический(е) катионный(е) полипептид(ы) содержит(ат) по меньшей мере 40 аминокислотных остатков, из которых по меньшей мере некоторые являются положительно заряженными. В одном варианте реализации количество положительно заряженных аминокислотных остатков в синтетическом(их) катионном(ых) полипептиде(ах) составляет по меньшей мере 10, по меньшей мере 15 или по меньшей мере 20. Примерами подходящих аминокислотных остатков, которые положительно заряжены при нейтральном рН, являются лизин, аргинин, гистидин и их комбинации. В одном варианте реализации множество положительно заряженных аминокислотных остатков в синтетическом(их) катионном(ых) полипептиде(ах) содержит положительно заряженные лизиновые остатки.

[0095] В различных вариантах реализации антимикробный(е) синтетический(е) катионный(е) полипептид(ы) обладает вязкостью 2 сантистокса (сСт) или выше, измеренной при концентрации 2 масс. % в деионизованной воде и при температуре 37°С. Подходящий синтетический(е) катионный(е) полипептид(ы), обладающие более высокой и более низкой вязкостью (например, от приблизительно 1,5 сСт до приблизительно 16000 сСт или от приблизительно 2,0 сСт до приблизительно 16000 сСт), можно получить путем регулировки молекулярной массы полипептида, уровня положительно заряженных аминокислотных остатков и/или степени самосборки полипептида. В одном варианте реализации антимикробный(е) синтетический(е) катионный(е) полипептид(ы) обладает вязкостью, превышающей вязкость бычьего сывороточного альбумина, при концентрации 2 масс. % в деионизованной воде и при температуре 37°С.

[0096] Антимикробный(е) синтетический(е) катионный(е) полипептид(ы) может представлять собой сополимерный полипептид, содержащий другие мономерные остатки в дополнение к положительно заряженным аминокислотным остаткам. Например, в различных вариантах реализации антимикробный(е) синтетический(е) катионный(е) полипептид(ы) может дополнительно содержать множество гидрофобных аминокислотных остатков. В различных вариантах реализации количество гидрофобных аминокислотных остатков в катионном сополимерном полипептиде составляет по меньшей мере 5, по меньшей мере 10 или по меньшей мере 15. Примеры подходящих гидрофобных аминокислотных остатков включают лейцин (L), изолейцин (I), валин (V), фенилаланин (F), аланин (А) и их комбинации. В одном варианте реализации множество гидрофобных аминокислотных остатков в синтетическом(их) катионном(ых) полипептиде(ах) содержит лейциновые остатки.

[0097] Конфигурация аминокислотных остатков в последовательности в синтетическом(их) катионном(ых) полипептиде(ах) может быть случайной, блочной или их комбинацией. Например, в одном варианте реализации конфигурация в последовательность гидрофобных аминокислотных остатков и положительно заряженных аминокислотных остатков в синтетическом(их) катионном(ых) полипептиде(ах) является блочной. В ряде вариантов реализации такой блок-сополимерный полипептид может содержать различные гидрофобные и гидрофильные аминокислотные остатки. Например, в одном варианте реализации синтетический(е) катионный(е) полипептид(ы) представляет(ют) собой блок-сополимерный полипептид, содержащий гидрофобные лейциновые остатки и положительно заряженные лизиновые остатки.

[0098] В различных вариантах реализации антимикробный(е) синтетический(е) катионный(е) полипептид(ы) самособирае(ю)тся в мультимерные структуры в воде и других водных носителях. Примеры мультимерных структур включают мицеллы, листы, везикулы и фибриллы (см. патент США №9,017,730). В одном варианте реализации антимикробный(е) синтетический(е) катионный(е) полипептид(ы) при 37°С в концентрации 3 масс. % в деионизованной воде образует(ют) самоподдерживающийся гидрогель. В одном варианте реализации антимикробный(е) синтетический(е) катионный(е) полипептид(ы) проявляет(ют) активность поверхностно-активного вещества в деионизованной воде при 37°С, что измеряется по снижению поверхностного натяжения по меньшей мере на 10% или по меньшей мере на 20% по сравнению с чистой деионизованной водой. В одном варианте реализации самосборку антимикробного(ых) синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов) подтверждают по критической концентрации агрегации полипептида, составляющей менее 1000 мкг/мл при 37°С в деионизованной воде. В одном варианте реализации самосборку антимикробного(ых) синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов) подтверждают по критической концентрации агрегации полипептида, составляющей менее 100 мкг/мл при 37°С в деионизованной воде.

[0099] Самосборку антимикробного(ых) синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов) можно контролировать различными способами. Например, в варианте реализации антимикробный(е) синтетический(е) катионный(е) полипептид(ы) содержит(ат) конфигурацию последовательности гидрофобных аминокислотных остатков и положительно заряженных аминокислотных остатков, обеспечивающую содействие самосборке антимикробного(ых) синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов) в мультимерные структуры. Например, самосборка полипептида усиливается благодаря блочной конфигурации последовательности гидрофобных аминокислотных остатков и положительно заряженных аминокислотных остатков. Более высокое содержание гидрофобных аминокислотных остатков и/или более длинные блоки гидрофобных аминокислотных остатков в полипептиде имеют тенденцию усиливать самосборку в водных носителях.

[0100] Описанный в настоящем документе антимикробный(е) синтетический(е) катионный(е) полипептид(ы) можно диспергировать в водном носителе с образованием антимикробных фармацевтических композиций. В различных вариантах реализации водный носитель представляет собой воду. В других вариантах реализации водный носитель представляет собой водный раствор, который содержит фармацевтически приемлемую соль, неионогенную(ые) добавку(и) или их комбинацию. Соль имеет тенденцию ингибировать самосборку полипептида, и поэтому следует избегать избытка соли. Нормальный физиологический раствор, полунормальный физиологический раствор, четверть-нормальный физиологический раствор и физиологический раствор с фосфатным буфером являются примерами подходящих водных носителей, содержащих фармацевтически приемлемую соль. В одном варианте реализации водный носитель содержит хлорид натрия. В различных вариантах реализации водный носитель представляет собой водный раствор, содержащий неионогенную добавку. Примеры подходящих неионогенных добавок включают декстрозу, маннит, глицерин, ксилит, сорбит, поверхностно-активное(ые) вещество(а) и их комбинации.

[0101] Водный носитель может содержать различные количества добавки, например, фармацевтически приемлемой соли, неионогенной добавки или их комбинации. В различных вариантах реализации водный носитель содержит количество фармацевтически приемлемой соли, составляющее 9,0 г/л или менее; или 8,0 г/л или менее; или 7,0 г/л или менее; или 6,0 г/л или менее; или 5,0 г/л или менее; или 4,5 г/л или менее; или 4,0 г/л или менее; или 3,0 г/л или менее. В одном варианте реализации количество добавки(добавок) в водном носителе выбирают для контроля вязкости антимикробной фармацевтической композиции. В одном варианте реализации водный носитель содержит добавку в количестве, увеличивающем вязкость антимикробной фармацевтической композиции. В одном варианте реализации водный носитель содержит добавку в количестве, уменьшающем вязкость антимикробной фармацевтической композиции. В одном варианте реализации неионогенная(ые) добавка(и) присутствует(ют) в количестве, эффективно увеличивающем осмотическую концентрацию антимикробной фармацевтической композиции до значения, по меньшей мере на 10% превышающего таковое у антимикробной фармацевтической композиции без указанной добавки(добавок). В различных вариантах реализации концентрация добавки в антимикробной фармацевтической композиции находится в диапазоне от приблизительно 0,1 масс. % до приблизительно 10 масс. % в перерасчете на общую массу. В различных вариантах реализации концентрация неионогенной добавки в антимикробной фармацевтической композиции находится в диапазоне от приблизительно 0,01 до приблизительно 2 масс. % или в диапазоне от приблизительно 0,05 до приблизительно 5 масс. % в перерасчете на общую массу.

[0102] В различных вариантах реализации антимикробную фармацевтическую композицию, описанную в настоящем документе, стерилизуют с помощью способа(ов) стерилизации, позволяющих получить стерилизованную антимикробную фармацевтическую композицию. В одном варианте реализации способ(ы) стерилизации оказывает(ют) минимальное влияние на химическую структуру синтетического катионного полипептида и/или склонность синтетического катионного полипептида к самосборке. Примеры таких способов стерилизации показаны на фиг. 42-52. В одном варианте реализации антимикробную фармацевтическую композицию, описанную в настоящем документе, стерилизуют с помощью способа(ов) стерилизации, позволяющего(их) получить стерилизованную антимикробную фармацевтическую композицию с антимикробным(и) синтетическим(и) катионным(и) полипептидом(ами), обладающим(и) средневесовой молекулярной массой и/или дисперсностью, сопоставимыми (например, в пределах приблизительно 10%) с таковыми антимикробного(ых) синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов) антимикробной фармацевтической композиции, не подвергавшимися стерилизации указанным(и) способом(ами) стерилизации. В одном варианте реализации антимикробную фармацевтическую композицию стерилизуют с помощью способа(ов) стерилизации, позволяющих получить стерилизованную антимикробную фармацевтическую композицию, обладающую уровнем вязкости при 37°С, сопоставимым с таковым у антимикробной фармацевтической композиции, не подвергавшейся стерилизации с помощью этого(их) способа(ов) стерилизации. В одном варианте реализации вязкость стерилизованной антимикробной фармацевтической композиции при 37°С находится в диапазоне от 20% до 200% от вязкости сопоставимой в других отношениях нестерилизованной антимикробной фармацевтической композиции.

[0103] В одном варианте реализации антимикробная фармацевтическая композиция обладает низкой токсичностью после вливания в брюшную полость множества мышей в дозе 10 мл/кг, согласно измерению выживаемости мышей, составляющей 50% или более через 72 часа после вливания. В одном варианте реализации антимикробная фармацевтическая композиция обладает низкой токсичностью после вливания в брюшную полость множества мышей в дозе 20 мл/кг, согласно измерению выживаемости мышей, составляющей 50% или более через 72 часа после вливания. В одном варианте реализации антимикробная фармацевтическая композиция обладает низкой токсичностью после вливания в брюшную полость множества мышей в дозе 40 мл/кг, согласно измерению выживаемости мышей, составляющей 50% или более через 72 часа после вливания. В одном варианте реализации антимикробная фармацевтическая композиция обладает микробиоцидной активностью, сопоставимой с таковой у сопоставимой в других отношениях нестерилизованной антимикробной фармацевтической композиции, причем микробиоцидную активность определяют с помощью анализа зависимости гибели клеток от времени в течение 60 минут по меньшей мере против одной бактерии, выбранной из группы, состоящей из S. aureus, S. epidermidis, P. aeruginosa и E. coli.

[0104] Включение других активных фармацевтических ингредиентов в антимикробные фармацевтические композиции, описанные в настоящем документе, может усиливать антимикробные характеристики и/или уменьшать риск как местной, так и системной токсичности. В частности, включение других антимикробных агентов, в том числе антибиотиков, антисептиков, соединений иода и/или серебра, может оказывать совместное действие с синтетическим(и) катионным(и) полипептидом(ами), помогающее предотвратить и/или лечить инфекцию. Кроме того, включение одного или более из противовоспалительных агентов может улучшить характеристики и/или снизить риск как местной, так и системной токсичности. Местное воспаление может способствовать патогенезу различных заболеваний, которые также включают микробное заражение или инфекцию. Примеры включают наружный отит, хронический синусит, легочные состояния и некоторые раневые состояния. Такие состояния можно лечить комбинацией синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов) и противовоспалительных агентов, например, кортикостероидов, антигистаминных и/или антицитокиновых средств. Таким образом, включение противовоспалительных агентов в антимикробную композицию, содержащую синтетический(е) катионный(е) полипептид(ы), может быть полезным.

[0105] В варианте реализации антимикробная фармацевтическая композиция содержит противовоспалительное соединение. Например, в одном варианте реализации воспалительное соединение выбрано из группы, состоящей из кортикостероида, ингибитора гистамина и ингибитора цитокина. Примеры кортикостероидов включают дипропионат бетаметазона, пропионат клобетазола, диацетат дифлоразона, флуоцинонид и пропионат галобетазола. Примеры ингибиторов гистамина включают соединения, ингибирующие рецепторы гистамина H1, Н2, Н3 и Н4. Примеры ингибиторов цитокинов включают глюкокортикоиды и пентоксифиллин.

[0106] Описанные в настоящем документе антимикробные фармацевтические композиции можно получать различными способами. В одном варианте реализации антимикробный синтетический катионный полипептид получают способами, описанными в патентах США №9,017,730 и/или 9,446,090, специально включенных в настоящий документ посредством ссылки для всех целей, включая описание таких способов получения катионных полипептидов. Антимикробную фармацевтическую композицию можно изготовить путем объединения антимикробного синтетического катионного полипептида с водным носителем, тем самым диспергируя (например, растворяя) полипептид в водном носителе. Например, такое объединение можно выполнить путем смешивания ингредиентов (катионного(ых) полипептида(ов), водного носителя и необязательных ингредиентов, например, воспалительного соединения) с перемешиванием при температуре в диапазоне от приблизительно 20°С до 90°С в течение продолжительного времени, обеспечивающего эффективное диспергирование (например, растворение) полипептида. Ингредиенты можно смешивать друг с другом в любом порядке, хотя специалисты в данной области техники в отдельных случаях могут предпочесть конкретный порядок.

Способы профилактики микробного заражения

[0107] В различных вариантах реализации предложены способы профилактики микробного заражения тканей, которые особенно подходят для тканей, не являющихся неповрежденной, здоровой кожей. Например, в варианте реализации такой способ включает выявление субъекта-млекопитающего, у которого есть участок ткани, отличный от неповрежденной здоровой кожи и подверженный риску микробного заражения. Примеры таких участков ткани включают пораженную заболеванием кожу, область хирургического вмешательства, травматическую рану, очищенные от омертвевших участков ткани, брюшную полость, легочные дыхательные пути, пазухи и мочевыводящие пути. В одном варианте реализации способ включает введение антимикробной фармацевтической композиции, описанной в настоящем документе, в участок ткани в количестве, эффективном по меньшей мере для частичной защиты участка ткани от микробного заражения. Например, в некоторых вариантах реализации указанный способ по меньшей мере частично защищает участок ткани от заражения по меньшей мере одной бактерией, выбранной из группы, состоящей из S. aureus, S. epidermidis, P. aeruginosa и E. coli. Способ может дополнительно включать отбор образцов участка ткани для оценки микробной нагрузки, например, нагрузки за счет по меньшей мере одной бактерии, выбранной из группы, состоящей из S. aureus, S. epidermidis, P. aeruginosa и E. coli. В одном варианте реализации антимикробную фармацевтическую композицию вводят во время операции в область хирургического вмешательства. Введение антимикробной фармацевтической композиции в участок ткани можно выполнить путем непосредственного местного нанесения.

[0108] Специалисты в данной области техники могут определить количество антимикробной фармацевтической композиции, эффективное по меньшей мере для частичной защиты участка ткани от микробного заражения, используя обычные эксперименты, основанные на представленных в настоящем документе руководствах. В различных вариантах реализации антимикробная фармацевтическая композиция характеризуется широким терапевтическим окном, и, таким образом, предложен относительно широкий диапазон доз, в котором достигается желательная защита от инфекции. В некоторых вариантах реализации это широкое терапевтическое окно облегчает избыточное введение антимикробной фармацевтической композиции в участок ткани.

Способы снижения микробной нагрузки

[0109] В различных вариантах реализации предложены способы снижения микробной нагрузки в тканях или на тканях, особенно подходящие для тканей, отличных от неповрежденной здоровой кожи. Например, в варианте реализации такой способ включает выявление субъекта-млекопитающего, у которого есть участок ткани, отличный от неповрежденной здоровой кожи и содержащий микробную нагрузку. Примеры таких участков ткани включают пораженную заболеванием кожу, область хирургического вмешательства, травматическую рану, очищенные от омертвевших участков ткани, брюшную полость, легочные дыхательные пути, пазухи и мочевыводящие пути. В одном варианте реализации указанный участок ткани заражен микроорганизмами и/или инфицирован. В варианте реализации указанный способ включает введение антимикробной фармацевтической композиции, описанной в настоящем документе, в участок ткани в количестве, эффективном по меньшей мере для частичного снижения микробной нагрузки. Например, в некоторых вариантах реализации указанный способ по меньшей мере частично снижать в участке ткани микробную нагрузку за счет по меньшей мере одной бактерии, выбранной из группы, состоящей из S. aureus, S. epidermidis, P. aeruginosa и E. coli. Способ может дополнительно включать отбор образцов участка ткани для оценки микробной нагрузки, например, нагрузки за счет по меньшей мере одной бактерии, выбранной из группы, состоящей из S. aureus, S. epidermidis, P. aeruginosa и E. coli. В одном варианте реализации антимикробную фармацевтическую композицию вводят во время операции в зараженный микроорганизмами и/или инфицированный участок ткани.

[0110] Количество антимикробной фармацевтической композиции, эффективное по меньшей мере для частичного снижения микробной нагрузки, могут определить специалисты в данной области техники с использованием обычных экспериментов, основанных на указаниях, приведенных в настоящем документе. В различных вариантах реализации антимикробная фармацевтическая композиция характеризуется широким терапевтическим окном, и, таким образом, предложен относительно широкий диапазон доз, в котором достигается желательное снижение микробной нагрузки. В некоторых вариантах реализации это широкое терапевтическое окно облегчает избыточное введение антимикробной фармацевтической композиции в участок ткани. Введение антимикробной фармацевтической композиции в участок ткани можно выполнить путем непосредственного местного нанесения.

ПРИМЕРЫ

[0111] Можно получать синтетический(е) катионный(е) полипептид(ы) с различными конфигурациями аминокислотной последовательности, некоторые из которых схематически показаны на фиг. 1. Некоторые конфигурации могут называться блоками или сегментами. Как правило, они представляют собой протяженные участки из аминокислотных остатков, содержащие множество аминокислот одного типа (например, катионных, анионных, гидрофобных). Синтетический(е) катионный(е) полипептид(ы), описанный(е) в настоящем документе, получили в соответствии со способами синтеза, описанными в патентах США №9,017,730 и 9,446,090, полностью включенных в настоящий документ посредством ссылки для всех целей, в том числе для описания синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов) и способов их получения.

[0112] Катионные блоки несут множество положительных зарядов при нейтральном рН и могут существенно различаться по длине - от приблизительно 10 аминокислотных остатков до более 300 аминокислотных остатков. Положительно заряженные аминокислотные остатки можно выбрать из лизина (K), аргинина (R), гистидина (Н) и орнитина (О). Катионные блоки не обязательно должны состоять исключительно из катионных аминокислот. В дополнение к множеству катионных аминокислот, блок-сегмент может включать и другие аминокислоты, в том числе полярные аминокислоты, например, серии (S) и треонин (Т), помогающие поддерживать гидрофильность. В катионный блок также можно включить небольшой процент отрицательно заряженных аминокислот и/или гидрофобных аминокислот, при условии, что блок содержит больше катионных, чем анионных остатков.

[0113] Гидрофобные блоки содержат множество гидрофобных аминокислот и могут существенно различаться по длине, которая обычно составляет от приблизительно 5 аминокислотных остатков до приблизительно 60 аминокислотных остатков. Гидрофобные блоки также могут обладать вторичной структурой (например, альфа-спиральной или неупорядоченной). Гидрофобные аминокислоты не несут заряда при рН 7,0. Кроме того, они несут боковые цепи, состоящие в основном из углерода и водорода, обладают очень маленькими дипольными моментами и имеют тенденцию к водоотталкиванию. Гидрофобные аминокислотные остатки можно выбрать из списка, включающего глицин (G), аланин (А), валин (V), лейцин (L), изолейцин (I), пролин (Р), фенилаланин (F) и метионин (М). Гидрофобные блоки не обязательно должны состоять исключительно из гидрофобных аминокислотных остатков. В дополнение к множеству гидрофобных аминокислот, блок-сегмент может включать и другие аминокислоты, в том числе полярные аминокислоты, например, серии (S) и треонин (Т), помогающие поддерживать гидрофильность. Гидрофобный блок может также содержать небольшой процент заряженных аминокислот.

[0114] Синтетический(е) катионный(е) полипептид(ы), обладающий(е) катионно-гидрофобной блочной архитектурой, можно получить в широком диапазоне общей длины цепи, обычно в диапазоне от приблизительно 20 аминокислотных остатков или менее (нижняя граница) до приблизительно 400 аминокислотных остатков или более (верхняя граница). Как показано на фиг. 2, при описании катионных полипептидов с блочной архитектурой, их можно разделить на три группы: (I) с длинным катионным сегментом (>200 аминокислотных блоков); (II) со средним катионным сегментом (100-199 аминокислотных блоков); и (II) с коротким катионным сегментом (10-99 аминокислотных блоков). Отношение длины катионного блока к длине гидрофобного блока может меняться в широком диапазоне, обычно от приблизительно 1,5 (нижняя граница) до приблизительно 15 или более (верхняя граница). Средняя молекулярная масса этих синтетических катионных полипептидов может меняться в широком диапазоне, обычно от приблизительно 3000 Да (нижняя граница) до приблизительно 70000 Да или более (верхняя граница). На фиг. 3 более подробно показан состав такого(их) синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов) с сегментной архитектурой.

[0115] Как подробнее описано ниже, авторы настоящего изобретения синтезировали и протестировали многочисленные различные синтетические катионные полипептиды с блочной конфигурацией последовательности. Для сравнения авторы настоящего изобретения также синтезировали катионные полипептиды с сопоставимой аминокислотной последовательностью, но без блочной или сегментной конфигурации последовательности. Обнаружено, что эти синтетические катионные полипептиды различались по большому количеству функциональных свойств, в том числе антимикробной активности, кровоостанавливающим свойствам, барьерным свойствам и поверхностно-активным свойствам. Кроме того, продемонстрировано, что на эти функциональные свойства могут влиять как конструкция молекулы, так и состав, в котором она находится. Касательно свойств, связанных с конструцией молекулы, авторы настоящего изобретения наблюдали, что общая длина цепи и отношение длины катионного/гидрофильного и гидрофобного блоков представляют собой характеристики, влияющие на функциональность. Кроме того, свой вклад вносят специфические особенности каждого блока, в том числе выбор аминокислот и энантиомерная чистота.

[0116] В настоящей заявке авторы настоящего изобретения используют номенклатуру, основанную на двух ключевых характеристиках синтетического (их) катионного(ых) полипептида(ов): общей длины цепи и отношения длины катионного блока к длине гидрофобного блока. Например, приблизительная средняя длина цепи KL-140/2.5 составляет 140 аминокислотных остатков, а приблизительное отношение катионного сегмента и гидрофобного сегмента составляет 2,5. В данном полимере катионные аминокислотные остатки представляют собой остатки лизина (K), а гидрофобные аминокислотные остатки представляют собой энантиомерно чистый L-лейцин (L). В другом примере приблизительная средняя длина цепи KrL-100/5.7 составляет 100 аминокислотных остатков, а приблизительное отношение катионного сегмента и гидрофобного сегмента составляет 5,7. В данном полимере катионные аминокислотные остатки представляют собой остатки лизина (K), а гидрофобные аминокислотные остатки представляют собой рацемический D,L-лейцин (rL). В еще одном примере приблизительная средняя длина цепи RrL-75/2.8 составляет 75 аминокислотных остатков. В данном полимере катионные аминокислотные остатки представляют собой аргинин (R), а гидрофобные аминокислотные остатки представляют собой рацемический D,L-лейцин (rL).

[0117] Синтетические катионные полипептиды, описанные (с использованием другой номенклатуры) в патентах США №9,017,730 и 9,446,090, включают K₅₅, K₅₅L₅, K₅₅L₁₀, K₅₅L₁₅, K₅₅L₂₀, K₅₅L₂₀-RAN, K₅₅L₂₅, K₅₅L₃₀, K₅₅(рац-L)₅, K₅₅(рац-L)₅-RAN, K₅₅(рац-L)₁₀, K₅₅(рац-L)₁₀-RAN, K₅₅(рац-L)₂₀, R^H₅₅(рац--L)₂₀, K₅₅(рац-L)₂₀-RAN, K₅₅(рац-L)₃₀, K₅₅(рац-I)₂₀, K₅₅(рац-L/F)₂₀, K₅₅(рац-V)₂₀, K₅₅(рац-A)₂₀, [K₆₅(рац--L)₁₅-RAN](рац-L)₂₀, K₈₀, K₈₀(рац-L)₂₀, K₉₀(рац-L)₃₀, K₉₀(рац-L)₃₀-RAN, K₉₉L₃₆, K₉₉(рац-L)₃₆, K₉₉(рац-L)₃₆-RAN, K₁₀₀, K₁₀₀L₂₀, K₁₀₀L₃₀, K₁₀₀L₄₀, K₁₀₀L₄₀-RAN, K₁₀₀L₅₀, K₁₀₀L₆₀, K₁₀₀(рац-L)₂₀, K₁₀₀(рац-L)₂₀-RAN, K₁₀₀(рац-L)₃₀, K₁₀₀(рац-L)₄₀, K₁₀₀(рац-L)₆₀, K₁₂₀(рац-L)₁₀, K₁₂₀(рац-L)₄₀, K₁₂₀(рац-L)₄₀-RAN, K₁₂₀(рац-L)₅₀, K₁₂₀(рац-L)₅₀-RAN, K₁₃₀L₂₀, K₁₃₀L₃₀, K₁₃₀L₄₀, K₁₃₀L₄₀-RAN, K₁₃₀L₆₀, K₁₃₀(рац-L)₂₀, K₁₃₀(рац-L)₃₀, K₁₃₀(рац-L)₄₀, K₁₃₀(рац-L)₆₀, K₁₅₀L₃₀, K₁₆₀(рац-L)₂₀, K₁₈₀, K₁₈₀L₁₈, K₁₈₀L₂₀, K₁₈₀L₃₆, K₁₈₀L₅₄, K₁₈₀(рац-L)₁₈, K₁₈₀(рац-L)₂₀, K₁₈₀(рац-L)₃₆, K₁₈₀(рац-L)₅₄, K₁₉₀L₁₀, K₂₀₀L₅₀, ПЭГ₂₀₅(рац--L)₂₀, K₂₅₆, K₃₂₄L₃₆, K₃₆₀ K₃₆₀L₃₆, K₃₆₀L₃₆-RAN, K₃₆₀L₅₄, K₃₆₀L₇₂, K₃₆₀(рац-L)₃₆, K₃₆₀(рац-L)₅₄ и K₃₆₀(рац-L)₇₂.

Пример 1

[0118] Можно сконструировать синтетический(е) катионный(е) полипептид(ы), обеспечивающие возможность получения препаратов с сильной микробицидной активностью и с барьерными эффектами, как показано на фиг. 4-6. На фиг. 4 описан пример синтетического катионного полипептида с конфигурацией последовательности катионно-гидрофобных блоков на основе аминокислотных остатков лизина и энантиомерно чистого L-лейцина. Средняя общая длина цепи препарата полипептида составляет приблизительно 160 аминокислотных остатков; установлено, что отношение лизина к лейцину (или K:L) составляет 3,2. Этот синтетический катионный полипептид обозначен как KL-160/3.2, и на ЭХ-хроматограмме данного полимера показан один пик с относительно низкой дисперсностью равной 1,1.

[0119] На фиг. 5 показана антимикробная активность KL-160/3.2 в зависимости от его концентрации в воде. Существует явный зависимый от концентрации эффект в отношении активности против S. aureus, P. aeruginosa и С. albicans при концентрациях всего 1,6 мкг/мл. Сводная информация об антимикробной активности KL-160/3.2, наблюдавшейся в нескольких экспериментах, представлена на фиг. 6. Как отмечено ниже, KL-160/3.2 в виде препарата в воде при более высоких концентрациях (т.е. > 2 масс. %) образует самоподдерживающиеся гидрогели. Эти свойства синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов) обеспечивают желательную комбинацию антимикробной активности и барьерной функции. Важно признать, что функциональные свойства этих антимикробных препаратов зависят от состава (например, наличия и концентрации добавок), а также от наличия, отсутствия или объема определенных процессов и/или процедур обработки, в том числе методов стерилизации.

Пример 2

[0120] Можно сконструировать синтетический(е) катионный(е) полипептид(ы), обеспечивающие возможность получения препаратов с сильной микробицидной активностью и поверхностной активностью, как показано на фиг. 7-9. На фиг. 7 описан пример синтетического катионного полипептида с катионно-гидрофобной блочной конфигурацией последовательности на основе аминокислотных остатков лизина и рацемического D, L-лейцина. Средняя общая длина цепи препарата полипептида составляет приблизительно 100 аминокислотных остатков; установлено, что отношение лизина к рацемическому лейцину (или K:rL) составляет 5,7. Этот синтетический катионный полипептид обозначен как KrL-100/5.7, и на ЭХ-хроматограмме данного полимера показан один пик с относительно низкой дисперсностью равной 1,1.

[0121] На фиг. 8 показана антимикробная активность KrL-100/5.7 в зависимости от его концентрации в воде. Существует явный зависимый от концентрации эффект в отношении активности против S. aureus, S. epidermidis, Е. coli, P. aeruginosa и С. albicans при концентрациях всего 1,6 мкг/мл. Сводная информация об антимикробной активности KrL-100/5.7, наблюдавшейся в нескольких экспериментах, представлена на фиг. 9. Как указано ниже, KrL-100/5.7 в виде препарата в воде демонстрирует поверхностную активность. Эти свойства синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов) обеспечивают желательную комбинацию антимикробной активности и поверхностно-активной функции, что может улучшить характеристики (эффективность) в отношении биопленок и/или при очистке тканей в ранах. Важно признать, что функциональные свойства этих антимикробных препаратов зависят от состава (например, наличия и концентрации добавок), а также от наличия, отсутствия или объема определенных процессов и/или процедур обработки, в том числе методов стерилизации.

Пример 3

[0122] Самосборка катионных антимикробных пептидов в мультимерные комплексы может быть полезным свойством. Можно сконструировать и составить синтетический(е) катионный(е) полипептид(ы) с блочной конфигурацией последовательности с учетом возможности их самосборки в мультимерные структуры. Два примера описаны на фиг. 10: KL-160/3.2 сконструировали с учетом самосборки в фибриллярные структуры и образования барьерных гидрогелей, a KrL-100/5.7 сконструировали с учетом самосборки в мицеллярные структуры и наличия поверхностно-активных свойств. Обратите внимание, что эти два синтетических катионных полипептида также описаны на фиг. 4-6 и фиг. 7-9, как указано выше.

[0123] Различные варианты реализации настоящего изобретения включают антимикробные композиции, содержащие по меньшей мере один антимикробный агент, образующий мультимолекулярные комплексы с самим собой и/или с одним или более другими компонентами композиции. Это можно объяснить тем, что развитие таких мультимолекулярных комплексов усиливается за счет межмолекулярного связывания. Такое связывание может быть обратимым. Такое связывание может быть полностью или частично обусловлено эффектами гидрофобного притяжения. Такое связывание может быть ковалентным или нековалентным. Такое связывание может снижать или задерживать системное поглощение. Такое связывание может снизить риск местной и/или системной токсичности.

[0124] Критическая концентрация агрегации (САС) является одним из показателей самосборки молекул в водных средах. САС можно измерить несколькими способами, в том числе по флуоресценции пирена и по поверхностному натяжению. На фиг. 11 показаны значения САС различных синтетических катионных полипептидов, измеренные по флуоресценции пирена. Следует отметить, что как полилизиновая цепь (К-100), так и лизин-лейциновый синтетический катионный полипептид без блочной конфигурации последовательности (KL-13 0/3.3-RAN) продемонстрировали очень высокие значения САС - 1600 и 2700 мкг/мл, соответственно. Для сравнения, многочисленные лизин-лейциновые синтетические катионные полипептиды, обладающие блочной конфигурацией последовательности, демонстрировали значительно более низкие значения САС в диапазоне от 1 мкг/мл до 160 мкг/мл при измерении этим способом, как показано в остальных записях на фиг. 11. На фиг. 12 показано измерение САС по поверхностному натяжению с использованием синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов) KrL-100/5.7.

[0125] Различные варианты реализации настоящего изобретения могут включать антимикробные композиции, содержащие по меньшей мере один антимикробный агент, при растворении в воде обладающий критической концентрацией агрегации (САС), меньшей или равной 500 мкг/мл. Эту САС можно измерить с помощью общепринятых в данной области техники способов, например, по флуоресценции пирена. Другие антимикробные агенты могут обладать более низкими САС. Например, САС антимикробных агентов может быть меньшей или равной 200 мкг/мл, 100 мкг/мл, 50 мкг/мл и/или 20 мкг/мл.

Пример 4

[0126] Вязкость - это важный показатель молекулярных свойств, а также свойств фармацевтической композиции. Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что повышенная вязкость может являться маркером улучшенных антимикробных характеристик в ране, а также маркером повышенной безопасности. Множественные особенности конструкции молекул влияют на вязкость синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов). Они включают общую длину цепи, аминокислотный состав, отношение катионных и гидрофобных остатков и конфигурацию последовательности аминокислотных остатков (например, блочную или случайную). Кроме того, следует отметить, что другие компоненты, которые могут находиться в синтетических катионных полипептидных препаратах (например, противоионы, другие соли и остаточные растворители), могут влиять на вязкость водных препаратов. Кроме того, различные добавки, которые можно применять при получении фармацевтических композиций (например, соли, неионогенные модификаторы тоничности, поверхностно-активные вещества) могут использоваться в количестве, эффективно влияющем на вязкость. Как описано ниже, на вязкость также могут оказывать существенное влияние способы стерилизации.

[0127] На фиг. 13А показаны значения кинематической вязкости различных синтетических катионных полипептидов в воде в концентрации 1 масс. %, измеренные с использованием стеклянных капиллярных вискозиметров (вискозиметров Уббелоде). Как показывают эти данные, присутствие полилизиновых цепей длиной приблизительно 100 аминокислотных остатков (К-100) или приблизительно 200 аминокислотных остатков (К-200) оказывает лишь умеренное влияние на вязкость при этой концентрации. Аналогичным образом, присутствие лизин-лейцинового(ых) синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов) со случайной/статистической конфигурацией (т.е. не блочной) последовательности KL-170/3.3 -RAN также оказывало умеренное влияние на вязкость (значение 1,1 сСт). Напротив, различные синтетические катионно-гидрофобные полипептиды с сегментированной или блочной конфигурацией последовательности демонстрировали повышенную вязкость в диапазоне от максимального в этом наборе данных значения 290 сСт до 1,4 сСт. Показано, что общая длина цепи увеличивает вязкость; показано, что увеличение длины гидрофобного блока увеличивает вязкость; и показано, что энантиомерная чистота гидрофобных аминокислот (лейцина) увеличивает вязкость. Для сравнения, на фиг. 13В показано, что бычий сывороточный альбумин оказывает незначительное влияние или не оказывает влияния на вязкость водных препаратов при концентрациях 1 и 2 масс. % в этих условиях. Альбумин является распространенным белком крови, его молекулярная масса составляет приблизительно 66,5 кДа, а общая длина цепи -приблизительно 583 аминокислотных остатков. Эти данные указывают на то, что размер молекулы сам по себе недостаточен для объяснения эффектов вязкости.

[0128] На фиг. 14 показаны данные по вязкости для двух синтетических катионно-гидрофобных полипептидов при концентрации 0,5 масс. % в воде при 37°С. В этом случае оба синтетических катионных полипептида (KL-160/3.3 и KL-120/2.5) имели одинаковую длину и конструкцию гидрофобного сегмента (~ 35-40 остатков энантиомерно чистого L-лейцина). Более высокую вязкость обнаружили у KL-160/3.3, который характеризовался более длинной структурой катионного блока и, следовательно, более длинной общей структурой. При этом также важно отметить, что KL-120/2.5 обладал более высокой вязкостью при концентрации 0,5 масс. % (фиг. 14), чем KrL-160/3.3 (фиг. 13) при концентрации 1,0 масс. %. Последний полипептид характеризовался большей общей длиной цепи, гидрофобным блоком аналогичного размера, но отличался составом гидрофобных аминокислотных остатков (рацемический D, L-лейцин по сравнению с энантиомерно чистым L-лейцином). На фиг. 15 дополнительно продемонстрировано, что на вязкость влияют как конструкция молекулы, так и ее концентрация. Эти данные были получены при 40°С на стеклянных капиллярных вискозиметрах и включали четыре синтетических катионных полипептида из производственных партий, отличающихся от вышеописанных.

[0129] Вязкость синтетического катионного полипептида также можно измерить под действием силы сдвига (динамическая вязкость). Этот подход позволяет оценить свойства псевдопластичности или загущения при сдвиге. Эти свойства псевдопластичности или загущения при сдвиге могут быть важны как для упрощения нанесения на ткани, так и для общей эффективности in vivo. Примечательно, что авторы настоящего изобретения обнаружили, что свойства псевдопластичности могут облегчить распространение на ткани за счет ручных манипуляций, которое может происходить в различной медицинской и хирургической обстановке. Как показано на фиг.16, динамическая вязкость синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов) KL-120/2,5 при 1,5 масс. %, 2,0 масс. % и 3,0 масс. % в воде оценивали в отношении увеличения силы сдвига с использованием ротационного вискозиметра. Наблюдали снижение вязкости в зависимости от сдвига (увеличение скорости вращения шпинделя, измеряемое в сантипуазах (сП)). Этот эффект «псевдопластичности» наблюдали при трех протестированных концентрациях. Кроме того, наблюдали увеличение вязкости в зависимости от концентрации, показанное на фиг. 16.

[0130] Различные варианты реализации изобретения включают антимикробные композиции, содержащие по меньшей мере один антимикробный синтетический катионный полипептид, при растворении в воде вызывающий значительное увеличение вязкости. Например, в варианте реализации, в котором синтетический(е) катионный(е) полипептид(ы) представляет(ют) собой блок-сополимер, наблюдаемое увеличение вязкости превышает увеличение, наблюдаемое для сопоставимого(ых) в остальных отношениях случайного(ых) синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов). Увеличение вязкости можно измерить способами, известными в данной области техники, с использованием вискозиметра(ов) одного или нескольких типов.

[0131] Например, препарат по меньшей мере одного антимикробного синтетического катионного полипептида в концентрации 10 мг/мл или 1 масс. % в воде может обладать кинематической вязкостью в диапазоне от 1,25 сантистокс до 500 сантистокс (сСт). мм²/с) при 37°С, измеренной с использованием стеклянного(ых) капиллярного(ых) вискозиметра(ов), например, вискозиметра(ов) Уббелоде, в анализе, в котором значение вязкости чистой воды ниже 0,9 сСт. В различных вариантах реализации вязкость указанных препаратов по меньшей мере одного антимикробного агента превышает 500 сСт.

[0132] Синтетический(е) катионный(е) полипептид(ы) можно сконструировать и изготовить таким образом, что они образуют самоподдерживающиеся гидрогели при диспергировании в воде. Как показано на фиг. 17A-D, пример синтетического сополимерного полипептида (KL-120/2.5) образует вязкие растворы и гидрогели в воде в зависимости от концентрации. KL-120/2.5 получали в ДИ-воде при концентрациях 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 и 3,0 масс. % и оценивали на предмет гелеобразования с помощью анализа в наклонной пробирке, на предмет твердости с помощью анализа текстуры и на предмет вязкости. Явно наблюдается влияние концентрации на физические свойства. Например, при увеличении концентрации до 2 масс. % в воде этот препарат синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов) образовывал самоподдерживающийся гидрогель. При концентрации 1,5 масс. % препарат действовал как барьер и демонстрировал устойчивость к проникновению двух разных шаров из нержавеющей стали или ВВ. Количественные показатели твердости с использованием текстурного анализа также четко продемонстрировали увеличение в зависимости от концентрации. Этот последний способ также демонстрирует барьерные свойства и устойчивость к проникновению.

Пример 5

[0133] Различные добавки могут изменять вязкость водных препаратов синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов). Авторы настоящего изобретения обнаружили, что различные добавки можно использовать для изменения определенных свойств фармацевтических композиций, описанных в настоящем документе, в том числе рН и тоничности. В ходе оценки авторы настоящего изобретения обнаружили, что определенные добавки оказывали неожиданно высокое влияние на вязкость. Кроме того, обнаружено, что это влияние зависит от конструкции молекул синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов). Например, в многочисленных исследованиях продемонстрировано, что добавление NaCl (~ 0,9%) к водным препаратам лизина-L-лейцинового(ых) (KL) полипептида(ов) группы П со средней длиной сегмента и блочной конфигурацией аминокислотной последовательности значительно снижало вязкость. Аналогичный, но менее выраженный эффект наблюдался с лизин-D,L-лейциновым(и) (KrL) полипептидом(ами). Эти данные показали, что при получении фармацевтических композиций с целевыми параметрами вязкости следует совместно учитывать как конструкцию молекул, так и природу добавок. Эти наблюдения также напоминают о том, что определенные вещества, в том числе соли, которые могут находиться в готовых препаратах синтетических катионных полипептидов, могут оказывать сильное влияние на их функциональность и характеристики.

[0134] На фиг. 18 показан частичный список фармацевтически приемлемых неионогенных вспомогательных веществ (добавок), которые можно применять для получения фармацевтических композиций, содержащих синтетический(е) катионный(е) полипептид(ы). На фиг.19 показана динамическая вязкость синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов) KL-120/2,5 (ВАС004) в концентрации 2,0 масс. % в воде, 4,5% водном манните, 2,33% водном глицерине или 2,8% водном гистидине при повышенной силе сдвига. Препарат гистидина демонстрировал очень низкую вязкость при всех скоростях вращения шпинделя. Препараты в манните и глицерине демонстрировали относительно высокие и зависимые от сдвига профили вязкости, хотя их уровни были несколько ниже, чем в препарате чистой воды.

[0135] На фиг. 20 показана кинематическая вязкость двух примеров синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов) с конфигурацией в последовательности лизин-L-лейциновых (KL) и лизин-D,L-лейциновых (KrL) блоков, растворенных в концентрации 1 масс. % в чистой воде, 0,9% водном физиологическом растворе или 4,4% водном ксилите. Примечательно, что препарат KL-100/5.7 в 0,9% физиологическом растворе демонстрировал приблизительно 70% снижение вязкости по сравнению с препаратом в воде. Для сравнения, препарат KrL-110/4,0 в 0,9% физиологическом растворе демонстрировал приблизительно 40% снижение вязкости по сравнению с препаратом в воде. Кроме того, эти исследования продемонстрировали, что оба синтетических катионных полипептида в водных растворах ксилита (неионогенной добавки) приводили к неожиданному увеличению вязкости по сравнению с чистой водой. Таким образом, ксилит является потенциально полезной добавкой для фармацевтических композиций, в которых желательно поддерживать более высокую вязкость при одновременном повышении тоничности и/или осмолярности. Кроме того, в некоторых вариантах реализации ксилит является неожиданно предпочтительной фармацевтически приемлемой добавкой для антимикробных композиций, поскольку в сочетании с влиянием на вязкость он не поддерживает метаболизм и рост большинства микроорганизмов.

[0136] На фиг. 21 показана динамическая вязкость синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов) KL-120/2.5 (ВАС004) при концентрации 2,0 масс. % в 4,5% водном манните при повышенной силе сдвига. Кроме того, показано, что эти препараты стабильны при термообработке, в том числе при температуре 50°С и 94°С. Устойчивость к термообработке может быть полезна на определенных стадиях производства, растворения и отжига синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов) в водных носителях, а также для уменьшения количества или устранения микробного заражения путем стерилизации.

[0137] Различные варианты реализации настоящего изобретения включают фармацевтические композиции, содержащие по меньшей мере один антимикробный синтетический катионный полипептид в водном носителе и по меньшей мере одну добавку или вспомогательное вещество в комбинациях и количествах, эффективно обеспечивающих вязкость фармацевтической композиции в диапазоне от приблизительно 1,25 до 500 сантистокс (сСт; мм²/с) при 37°С, измеряемую с помощью стеклянного(ых) капиллярного(ых) вискозиметра(ов), например, вискозиметра(ов) Уббелоде, в анализе, где значение вязкости для чистой воды было ниже 0,9 сСт. В различных вариантах реализации вязкость этих фармацевтических композиций превышает 500 сСт.

[0138] Различные варианты реализации изобретения включают фармацевтические композиции, содержащие по меньшей мере один антимикробный синтетический катионный полипептид в водном носителе и по меньшей мере одну добавку или вспомогательное вещество в количестве, эффективно обеспечивающем эффект псевдопластичности композиции при 37°С, измеряемый с помощью ротационного(ых) вискозиметра(ов).

[0139] Различные варианты реализации изобретения включают фармацевтические композиции, содержащие по меньшей мере один антимикробный синтетический катионный полипептид в водном носителе и по меньшей мере одну добавку или вспомогательное вещество в количестве, эффективно обеспечивающем вязкость композиции, превышающую вязкость сопоставимого препарата в водном носителе без указанной добавки или вспомогательного вещества. Например, в варианте реализации добавление эффективного количества ксилита или глицерина к фармацевтической композиции, включая композиции, которые также могут содержать различные соли, например, NaCl, повышает вязкость препарата по сравнению с сопоставимой фармацевтической композицией без ксилита или глицерина.

[0140] В соответствии с настоящим изобретением, для достижения эффективного уровня антимикробной активности у определенных пациентов (например, пациентов с обширными ранами и/или высокими уровнями микроорганизмов) могут потребоваться значительные дозы фармацевтических композиций, описанных в настоящем документе. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что антимикробный агент, разработанный в соответствии с указаниями, приведенными в настоящем документе, может повысить как эффективность, так и безопасность антимикробных композиций для местного применения. Антимикробный агент, образующий мультимолекулярные комплексы с самим собой или с одним или более их других компонентов композиции, может повышать местную концентрацию антимикробного агента и обволакивание им ткани, тем самым обеспечивая повышенную эффективность при более низкой дозе. Кроме того, эта характеристика может уменьшать или замедлять потенциальное системное поглощение и распределение и снижать системную токсичность. Она также может снижать местную токсичность. Конструкция самого антимикробного агента, а также состав антимикробной композиции могут влиять на межмолекулярные взаимодействия, обеспечивающие образование мультимолекулярных комплексов.

[0141] Авторы настоящего изобретения обнаружили, что на эффективность и безопасность антимикробных средств для местного применения влияют физические свойства, в том числе вязкость. Например, повышенная вязкость может привести к увеличению времени удерживания антимикробного средства для местного применения на ткани и, таким образом, повысить эффективность. Этот эффект может также уменьшить общее требуемое количество антимикробной композиции и тем самым снизить риск токсичности, ограничивающей дозу. Межмолекулярные взаимодействия антимикробного агента с самим собой или с другими компонентами композиции способствуют увеличению вязкости антимикробной композиции. Пример 6

[0142] Конструкция синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов) может предусматривать демонстрацию поверхностной активности. Определенные особенности конструкции усиливают поверхностную активность; другие снижают ее. Поверхностную активность можно продемонстрировать в нескольких анализах. Например, можно показать, что поверхностно-активные вещества снижают поверхностное натяжение на границе раздела жидкость-воздух. Как показано на фиг. 22, синтетический катионный полипептид KrL-120/5.0 существенно снижал поверхностное натяжение воды по сравнению с другими катионными антимикробными агентами, не являвшимися синтетическими катионными полипептидами; хлоргексидин и ПГМБ, по-видимому, оказывали незначительное влияние или не оказывали влияния.

[0143] Выполнили оценку способности различных препаратов синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов) снижать поверхностное натяжение (фиг. 23). Было сделано несколько наблюдений. Как ни странно, лизин-лейциновые диблок-сополимерные полипептиды, полученные с использованием энантиомерно чистого L-лейцинома, демонстрировали небольшую поверхностную активность при длине гидрофобного блока 30 аминокислотных остатков или более. Поверхностную активность наблюдали для полимеров с более короткими блоками из энантиомерно чистого L-лейцина (например, длиной приблизительно 20 лейциновых остатков или менее). Кроме того, лизин-лейциновые диблок-сополимерные полипептиды, полученные с использованием рацемического D,L-лейцина, демонстрировали относительно высокую поверхностную активность по сравнению с полимерами, полученными с использованием энантиомерно чистого L-лейцина при длине лейциновых блоков приблизительно 20 остатков или более. В целом, данные показывают, что на поверхностную активность сильно влияет как аминокислотный состав (включая использование энантиомерно чистых или рацемических аминокислот), так и длина гидрофобного блока. Таким образом, элементы конструкции можно применять для получения желательных поверхностно-активных свойств синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов).

[0144] Поверхностную активность также можно демонстрировать с помощью других анализов. Одним из примеров является снижение межфазного натяжения в системе вода/масло. Как показано на фиг. 24А и 24В, синтетический(е) катионный(е) полипептид(ы) KrL-100/5.7 снижал межфазное натяжение.

[0145] Некоторые добавки также могут оказывать влияние на поверхностное и межфазное натяжение. Например, данные на фиг. 25 показывает, что препараты синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов) KrL-130/3.3 (партия 77) и KL-130/3.3 (партия 72) снижают поверхностное натяжение при получении их составов в чистой воде или в воде с 0,25% или 1,0% уксусной кислотой. Присутствие уксусной кислоты оказывает аддитивное действие. Аналогичный эффект наблюдали в отношении межфазного натяжения (фиг. 26).

[0146] Синтетический(е) катионный(е) полипептид(ы) могут являться эффективными эмульгаторами. Как показано на фиг. 27, авторы настоящего изобретения продемонстрировали, что водные препараты двух типичных синтетических катионных полипептидов с гидрофобным сегментом из рацемического D,L-лейцина (KrL-100/5.0 и KrL-160/3.2) эффективно эмульгировали соевое масло. Этот эффект эмульгирования также наблюдали при использовании синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов), содержащего(их) гидрофобный блок из энантиомерно чистого лейцина (фиг. 28). Данные на фиг. 28 также демонстрируют, что можно продемонстрировать эмульгирующую активность составов синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов), полученных в физиологическом растворе или водном ксилите, а также в чистой воде.

[0147] Конструкция синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов) и состав, в котором они содержатся, может предусматривать демонстрацию поверхностной активности. Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что препараты синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов), сочетающие прямую микробицидную активность и поверхностно-активные свойства, являются высокоэффективными средствами против биопленок. В дальнейшем авторы настоящего изобретения продемонстрировали, что такие препараты очень эффективны in vivo на тканях, сильно зараженных как грамположительными, так и грамотрицательными бактериями.

Пример 7

[0148] Важно понимать потенциальное значение как местной, так и системной токсичности. Местная совместимость с тканями и безопасность являются крайне желательными свойствами для эффективного применения антимикробной композиции для местного нанесения. В целом, авторы настоящего изобретения обнаружили, что препараты синтетических катионных полипептидов с блочной или сегментированной конфигурацией последовательности демонстрируют относительно высокую совместимость с тканями и местную безопасность. Кроме того, для минимизации повреждения тканей и поддержки заживления можно применять надлежащие составы, дозы и способы применения, описанные в настоящем документе.

[0149] Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили существенную вариабельность различных препаратов синтетических катионных полипептидов по отношению к системной безопасности. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что конструкция молекул и состав, в котором они находятся, оказывают сильное влияние на риск системной токсичности при внутрибрюшинном введении препаратов синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов). Хотя внутрибрюшинное введение является видом местного применения, оно способствует значительному системному поглощению и распределению терапевтических агентов и вспомогательных веществ. Таким образом, внутрибрюшинное введение создает более высокий риск системной токсичности, чем большинство вариантов местного применения антимикробных фармацевтических композиций. В этой связи важно отметить несколько аспектов. Во-первых, местное нанесение на различные ткани, помимо неповрежденной здоровой кожи, может увеличить системное поглощение. Во-вторых, внутрибрюшинные инфекции носят очень серьезный характер, и существует потребность в более эффективных и безопасных антимикробных средствах, которые можно вводить внутрибрюшинно. В-третьих, возможно непреднамеренное применение фармацевтических композиций путем внутрибрюшинного, внутривенного введения или нанесения на другие области, что может значительно увеличить системное поглощение. В настоящее время авторы настоящего изобретения разработали антимикробные фармацевтические композиции для местного применения, которые характеризуются высокой эффективностью и низким риском как местной, так и системной токсичности, даже при нанесении на участки, отличные от здоровой неповрежденной кожи.

[0150] На фиг. 29 изображены результаты, полученные на модели кожного раздражения у кроликов, в которой композиции синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов) наносили как на неповрежденную, так и на стертую кожу. После применения синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов) KL-140/2.5 или KrL-120/5.0 в различных концентрациях и различных составах наблюдались незначительные реакции. На фиг. 30 показаны результаты исследования кожной сенсибилизации у морских свинок. Видимых изменений после применения KL-140/2.5 (партия 73) или KrL-120/5.0 (партия 93) при концентрации 1 масс. % в воде не наблюдали, что указывает специалистам в данной области техники, что синтетический(е) катионный(е) полипептид(ы) демонстрировал(и) отсутствие сенсибилизирующего потенциала. На фиг. 31 показаны результаты исследования пероральной токсичности на крысах. Отклонений в течение трех дней после введения KL-140/2.5 в воде или KrL-120/5.0 в воде крысам в дозах от 0,625 мг/кг до 160 мг/кг через пероральный зонд не наблюдали.

[0151] Исследования системной токсичности после внутрибрюшинного введения дали неожиданные результаты. Как показано на фиг. 32, внутрибрюшинное введение полилизина длиной приблизительно 100 аминокислотных остатков (К-100) в концентрации 20 мг/мл и общей дозе 800/мг/кг являлось весьма токсичным, при этом выжило 0 из 5 животных. Аналогичным образом, обнаружено, что препарат синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов) KL-140/2.5-RAN без блочной конфигурации последовательности аминокислотных остатков являлся токсичным, причем выжило 0 из 5 животных. Напротив, после введения сопоставимой концентрации и дозы KrL-120/5.0 в воде выжили все животные (5/5). Как показано на фиг. 33, водные препараты другого катионного полипептида с сегментированной или блочной конфигурацией последовательности лизина и D,L-лейцина (KrL-130/3.3) также демонстрировали высокий уровень безопасности с полной выживаемостью (5/5) в концентрациях до 20 мг/мл (доза 800 мг/кг).

Дальнейшие исследования выявили неожиданную изменчивость при исследовании двух разных партий (93 и 94) полимеров с такой же целевой молекулярной структурой (KrL-120/5.0). Как показано на фиг.34, партия 93 вызывала значительные токсические явления и системную летальность после внутрибрюшинного введения по сравнению с партией 94. Это было особенно странно, поскольку безопасность партии 93 для местного применения была продемонстрирована в исследовании сенсибилизации морской свинки, описанном выше на фиг. 30. Кроме того, показано, что партия 93 являлась эффективным микробицидным средством in vitro против грамположительных и грамотрицательных бактерий. Кроме того, обнаружено, что она была безопасна и эффективна при применении in vivo как на моделях открытых ран у свиней, так и на моделях закрытых ран с заражением микробами у грызунов.

[0153] При дальнейшем анализе партий 93 и 94 наблюдалось заметное различие при самосборке мультимерных структур, оцениваемой по критической концентрации агрегации (САС). Обнаружено, что партия 93 (отличавшаяся большей токсичностью) характеризуется более высокой критической концентрацией агрегации (130 мкг/мл), что указывает на более слабый потенциал самосборки мультимерных структур, чем партия 94 (САС: 51 мкг/мл).

[0154] Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что синтетический(е) катионный(е) полипептид(ы), демонстрирующий(е) низкие значения САС и/или высокую вязкость в виде препарата в воде, был(и) относительно безопасным(и) при введении в брюшную полость. Как показано в данных на фиг. 35, два препарата лизин-L-лейциновых (KL) синтетических катионных полипептидов с блочной конфигурацией последовательности аминокислотных остатков (KL-170/3.3 и KL-140/2.5), демонстрировали высокую безопасность при внутрибрюшинном введении. Эти синтетические катионные полипептиды и полипептиды с близкородственной структурой демонстрировали высокий уровень самосборки, согласно низким значениям САС (обычно составлявшим от одного до десяти мкг/мл; см. также фиг. 11 выше). Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что синтетический(е) катионный(е) полипептид(ы), демонстрировавший(е) более высокие профили безопасности после внутрибрюшинного введения, также демонстрировал(и) относительно высокую вязкость и/или твердость при анализе текстуры в водных препаратах (см. фиг. 13 - фиг. 17). Таким образом, авторы настоящего изобретения разработали общие принципы, описанные в настоящем документе, для указаний специалистам в области разработки синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов) с пониженным риском системной токсичности.

[0155] Кроме того, обнаружено, что добавки состава влияют на профиль безопасности композиций синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов) при внутрибрюшинном введении. Как показано на фиг. 36, препараты KL-140/2.5 в воде или воде и гидроксиэтилцеллюлозе (ГЭЦ) демонстрировали некоторые различия в безопасности. Примечательно, что препараты с более высоким содержанием ГЭЦ оказались более токсичными, несмотря на то, что эта добавка считается безопасной. На фиг. 37 показаны дополнительные примеры изменений в составе, способные усиливать токсичность при внутрибрюшинном введении.

[0156] Совместно эти результаты указывают на то, что местная совместимость с тканями и системная безопасность являются разными аспектами, и что важно учитывать и то, и другое. Примечательно, что как особенности конструкции полимера, так и параметры состава, в котором он находится, могут повышать или снижать риск системной токсичности. В отношении особенностей конструкции полимеров наши данные показывают, что можно получить более безопасный(е) синтетический(е) катионный(е) полипептид(ы) за счет особенностей конструкции, способствующих самосборке и сопровождающихся пониженными критическими концентрациями агрегации, и/или способствующих повышению вязкости. Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что добавки для состава следует выбирать с учетом поддержания или усиления самосборки синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов) в мультимерные структуры и/или поддержания или повышения вязкости полимера.

[0157] Отношение системной токсичности, ограничивающей дозу, и эффективной дозы для местного нанесения может зависеть от участков ткани и/или патофизиологических условий. Как эффективную, так и токсическую дозу можно определить после применения в конкретной области или конкретных патофизиологических условиях. В качестве альтернативы, тип «верхнего барьера» можно установить путем определения системной токсической дозы после применения в области с прогнозируемо высоким системным всасыванием (например, брюшной полости). Местную эффективную дозу также можно определить после применения в конкретной области или конкретных патофизиологических условиях (например, при травме конечности, инфекции мягких тканей, инфекции пазух).

[0158] В одном варианте реализации выбор антимикробных агентов или антимикробных композиций может быть частично основан на показателях местной или системной токсичности in vivo.

[0159] В одном варианте реализации выбор антимикробных агентов или антимикробных композиций может быть частично основан на показателях токсичности in vivo после внутрибрюшинного введения.

[0160] Конкретные варианты реализации настоящего изобретения могут включать антимикробные агенты или антимикробные композиции, безопасные при вливании в брюшную полость мышей в дозах, превышающих прогнозируемую эффективную дозу для снижения микробной нагрузки после местного нанесения на ткани, отличные от брюшной полости.

Пример 8

[0161] Способ стерилизации имеет важное значение, авторы настоящего изобретения обнаружили, что безопасность антимикробных фармацевтических композиций на основе синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов) зависит от конструкции молекул (особенно от конфигурации в последовательности катионно-гидрофобных блоков), самосборки полимера в мультимерные структуры и вязкости. В одном варианте реализации антимикробные фармацевтические композиции стерилизуют способами, сохраняющими молекулярную целостность, мультимерные структуры и вязкость.

[0162] На фиг. 38-41 продемонстрировано, что традиционные методики радиационной стерилизации могут нарушать молекулярную структуру синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов) и приводить к потере твердости композиции при оценке посредством анализа текстуры. Кроме того, показано, что стерилизация водных препаратов синтетических катионных полипептидов электронным пучком вызывает значительную потерю вязкости. Обнаружено, что образцы были столь же жидкими, как вода. Способы радиационной стерилизации сами по себе требуют тщательного контроля и/или модификации для применения при стерилизации антимикробных фармацевтических композиций синтетических катионных полипептидов.

[0163] В отличие от способов на основе облучения, как стерильная фильтрация, так и термическая стерилизация (автоклавирование) обеспечивают эффективную стерилизацию антимикробных фармацевтических композиций при сохранении молекулярной структуры синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов) и желательных физических свойств водных композиций, содержащих их. На фиг. 42-46 показаны ЭХ-хроматограммы, на которых продемонстрировано сохранение молекулярной целостности после стерилизации фильтрацией и автоклавированием.

[0164] Стерилизация фильтрацией и автоклавированием также сохраняет ключевые полезные физические свойства водных препаратов и композиций, содержащих синтетический(е) катионный(е) полипептид(ы). На фиг. 47 продемонстрировано, что водный препарат синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов) KL-120/2.5 (партия ВАС004) в концентрации 1,25 масс. % в воде с 4,5 масс. % маннита обладал почти идентичной динамической вязкостью до и после стерильной фильтрации. На фиг. 48 и фиг. 49 продемонстрировано, что водные препараты синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов) KL-160/3.2 (партия ВАС003) в существенной степени сохраняют уровень псевдопластичности после автоклавирования, хотя общий уровень несколько снижается по сравнению с заранее автоклавированными образцами. Кроме того, стерилизация различных водных препаратов и композиций автоклавированием сохраняла полезные свойства твердости, оцениваемые с помощью анализа текстуры, хотя отмечали некоторое снижение твердости (фиг. 50 и 51). Данные также указывают на снижение твердости при более высоких концентрациях синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов) и в присутствии определенных добавок, например, ГЭЦ. В качестве объяснения наблюдаемое снижение вязкости и жесткости может быть вызвано процессом дальнейшего растворения и повторного отжига мультимерных структур, которые могут иметь место в процессе автоклавирования. При этом считается, что эти препараты сохраняют полезные свойства вязкости и твердости. На фиг. 52 показано, что поверхностная активность синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов) KrL-120/5.0 сохранялась после стерилизации автоклавированием.

Пример 9

[0165] Для обеспечения эффективного ингибирования и уничтожения микроорганизмов, а также низкого риска местной и системной токсичности, варианты реализации антимикробной фармацевтической композиции, описанные в настоящем документе, обладают как антимикробной активностью, так и полезными физико-химическими свойствами. Эти свойства связаны с улучшением самосборки синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов) в мультимерные структуры и/или вязкостью, превышающей вязкость водных препаратов многих белков, например, альбумина. В различных вариантах реализации дальнейшее снижение риска как местной, так и системной токсичности достигалось путем стерилизации антимикробной фармацевтической композиции, при условии, что процесс стерилизации не оказывал существенного нежелательного влияния на молекулярную целостность синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов) или полезные физико-химические свойства антимикробной фармацевтической композиции. Наконец, для достижения как эффективности, так и низкого риска местной и системной токсичности in vivo важно учитывать способ применения (включая количество и частоту нанесений), особенно при нанесении антимикробной фармацевтической композиции на ткани, отличающиеся от здоровой неповрежденной кожи.

[0166] Без ограничения сущности изобретения, в некоторых клинических условиях, например, при наличии обширных хирургических или травматических ран, для достижения антимикробной эффективности может быть важным «избыточное» нанесение антимикробной фармацевтической композиции, описанной в настоящем документе. Как обсуждалось выше, термин «избыточное» относится к общей терапевтической дозе антимикробной фармацевтической композиции, содержащей 1 г синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов) или более для человека весом 70 кг, что составляет 14,3 мг/кг. При избыточном нанесении антимикробной фармацевтической композиции следует совместно учитывать антимикробную эффективность, физико-химические свойства и способ применения с целью минимизации риска местной и системной токсичности для пациента (человека или животного). Описанные в настоящем документе антимикробные фармацевтические композиции можно применять в многочисленных и разнообразных клинических условиях. В некоторых вариантах реализации прямое нанесение на открытые ткани при операции и травме относится к наиболее важным вариантам применения. На фиг. 53 представлено графическое изображение классификации ран, обычно используемой в хирургии. Раны классифицируются как раны I класса (чистые), II класса (чистые/зараженные), Ш класса (зараженные) и IV класса (грязные/инфицированные). При рассмотрении способов применения при ранах I и II класса антимикробные фармацевтические композиции, описанные в настоящем документе, можно наносить на ткани до существенного микробного заражения. В некоторых вариантах реализации комбинация прямой микробицидной активности и барьерных свойств в отношении микробов является полезной в таких условиях. Кроме того, при ранах III и IV класса антимикробные фармацевтические композиции, описанные в настоящем документе, можно наносить на ткани после значительного микробного заражения, образования биопленки или явной инфекции. В некоторых вариантах реализации комбинация прямой микробицидной активности и поверхностно-активных свойств является полезной в таких условиях.

[0167] Благоприятное действие комбинации прямой микробицидной активности и барьерных свойств против микробов можно проиллюстрировать в различных тестовых условиях. На фиг. 54 показаны результаты, полученные на модели микробного заражения кожи свиньи ex vivo. В этой модели кожные эксплантаты можно размещать горизонтально и предварительно обрабатывать препаратами синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов) или наклонять в вертикальном положении на некоторое время с целью стимуляции вытекания антимикробного препарата. Этот способ разработан для улучшенной имитации нанесения на ткани in vivo. Как показывают данные, препараты как KL-120/2.5, так и KL-160/3.2 были достаточно эффективны при концентрации как 1, так и 2 масс. % на горизонтальных образцах ткани. Однако при наклоне образцов в вертикальном положении на некоторое время более эффективными оказываются препараты с более высокой концентрацией, обладающие повышенной вязкостью. Оба препарата обладают значительно большей антимикробной активностью, чем требуется для лечения микробной нагрузки такого размера.

[0168] На фиг. 55 показаны результаты, полученные на модели открытой раны у свиней in vivo, в которой препараты синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов) KL-160/3.2 наносили на раны на всю толщину кожи за 15 минут до бактериального заражения. При оценке через 4 часа после инокуляции смешанной культурой S. epidermidis и P. aeruginosa с высокой плотностью обработанные раны демонстрировали небольшое микробное заражение ткани или его отсутствие по сравнению с контролем. На фиг.56 продемонстрировано, что эффект предварительной обработки тканей до микробного заражения зависит как от концентрации, так и от времени. Таким образом, в клинических условиях предпочтительные варианты реализации включают введение эффективного количества композиций синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов) и повторное нанесение на ткани, подвергающиеся воздействию в течение продолжительного времени (например, при длительных операциях или ранах, подразумевающих отложенное закрытие). На фиг. 57 показаны результаты предварительной обработки раны грызуна с имплантированной хирургической сеткой (действующей как инородное тело) перед инокуляцией микроорганизмов. В этой модели рану закрывали вскоре после инокуляции. Как показывают данные, однократное нанесение антимикробной фармацевтической композиции с синтетическим(и) катионным(и) полипептидом(ами) KL-160/3.2 привело к очень значительному (на несколько порядков) снижению КОЕ через 48 часов.

[0169] Совместно эти данные демонстрируют: (1) благоприятное действие прямой микробицидной активности и барьерных свойств в отношении микробов; (2) значение раннего лечения до существенного микробного заражения; и (3) важность схем лечения, учитывающих как продолжительность воздействия на ткани, так и потенциальные сроки микробного заражения.

[0170] Благоприятное действие комбинации прямой микробицидной активности и поверхностно-активных свойств также можно проиллюстрировать в различных тестовых условиях. Как показано на фиг. 53, антимикробные композиции, описанные в настоящем документе, можно применять в многочисленных и разнообразных клинических условиях, при наличии значительного микробного заражения тканей, биопленок или явной инфекции, или комбинации двух или более из этих факторов. Такие условия могут включать хирургические процедуры с ранами III и IV класса. Они включают лечение инфекций в области хирургического вмешательства, в том числе с участием инородных тел (например, инфекции в области протеза сустава, инфекции грыжевой сетки, инфекции имплантатов молочной железы и т.д.). Эти параметры также включают большинство травматических ран, а также хирургическое и нехирургическое лечение областей, подверженных частому заражению, например, головных пазух (особенно у пациентов с хроническим синуситом). При лечении после операций с инородными телами, даже при отсутствии явной инфекции, также следует учитывать высокий риск образования биопленок. Как отмечалось выше, в этих условиях антимикробные фармацевтические композиции, описанные в настоящем документе, вероятно, следует наносить на области с существующим микробным заражением. Комбинация прямой микробицидной активности и поверхностно-активных свойств может быть особенно благоприятной.

[0171] На фиг. 58 и фиг. 59 продемонстрирована выраженная активность против P. aeruginosa, растущего в биопленках, с использованием препаратов синтетического(их) антимикробного(ых) полипептида(ов), обладающих как прямой микробицидной активностью, так и поверхностной активностью. На фиг. 60-63 показаны результаты исследований, демонстрирующие эти же принципы in vivo. Описанные в настоящем документе антимикробные композиции, демонстрирующие прямую микробицидную активность и поверхностно-активные свойства, обладают высокой эффективностью при нанесении на участки тканей, сильно зараженные как грамположительными (например, S. aureus, устойчивым к метициллину), так и грамотрицательными (например, P. aeruginosa) микроорганизмами.

[0172] В дополнение к существенному снижению количества микроорганизмов в различных вариантах реализации эти способы лечения, по-видимому, обладают протективным действием по отношению к ткани, что может быть отчасти связано с подавлением тканевого воспаления, которое является общепризнанным источником повреждения тканей. В различных вариантах реализации подавление воспаления может достигаться или усиливаться за счет комбинаций антимикробных композиций, описанных в настоящем документе, с противовоспалительным агентом.

[0173] В этом примере показаны преимущества комбинации прямой микробицидной активности с барьерными свойствами и преимущества комбинации прямой микробицидной активности с поверхностной активностью. В частности, специалисты в данной области техники могут использовать приведенные в настоящем документе рекомендации для конструирования синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов), обладающего(их) всеми тремя функциональными качествами: прямой микробицидной активностью, барьерными свойствами и поверхностной активностью. При производстве фармацевтической композиции этого(их) многофункционального(ых) синтетического(их) катионного(ых) полипептида(ов) важно, чтобы состав композиции и стерилизация сохраняли эти функциональные качества.

[0174] В различных вариантах реализации предпочтительными являются антимикробные композиции, содержащие синтетические катионные полипептиды, описанные в настоящем документе, в которых полипептид(ы) и общая композиция обеспечивают высокий уровень антимикробной активности в сочетании с низким риском местной и системной токсичности. Желательны некоторые физико-химические свойства, включая самосборку в мультимерные структуры и/или вязкость.

Группа изобретений относится к антимикробным фармацевтическим композициям, содержащим катионные антимикробные средства и способам их применения для профилактики и/или лечения инфекций. Предлагаемая композиция содержит: водный носитель и по меньшей мере один антимикробный синтетический катионный полипептид, диспергированный в указанном водном носителе в диапазоне концентраций 0,01-5 масс.% в пересчете на общую массу указанной композиции. При этом указанный выше синтетический катионный полипептид содержит: по меньшей мере 40 аминокислотных остатков; множество положительно заряженных аминокислотных остатков при нейтральном pH, где указанное множество аминокислотных остатков при нейтральном pH составляет по меньшей мере 10; дополнительно содержит множество гидрофобных аминокислотных остатков; характеризуется вязкостью в концентрации 2 масс.% в деионизованной воде при 37°С, равной 2 сантистокса (сСт) или более; содержит конфигурацию гидрофобных аминокислотных остатков и положительно заряженных аминокислотных остатков в последовательности, выполненной с возможностью способствовать самосборке указанного антимикробного синтетического катионного полипептида в мультимерные структуры. При этом водный носитель, содержащий указанный выше антимикробный синтетический катионный полипептид в количестве 2 масс.%, характеризуется вязкостью при 37°С, превышающей вязкость водного носителя, содержащего 2 масс.% альбумина вместо указанного синтетического катионного полипептида. Предлагаемая композиция стерилизована с помощью способа стерилизации, позволяющего получить стерилизованную композицию с указанным выше антимикробным синтетическим катионным полипептидом, обладающим средневесовой молекулярной массой и необязательно дисперсностью, сопоставимыми с таковыми для антимикробного синтетического катионного полипептида антимикробной фармацевтической композиции, не подвергавшейся стерилизации указанным способом стерилизации, и обладает низкой токсичностью после инфузии в брюшную полость множества здоровых молодых взрослых мышей в дозе 50 мг/кг, согласно измерению уровня выживаемости мышей, составляющего 50% или более через 72 часа. Предлагаются также способ профилактики микробного заражения тканей, отличных от неповрежденной здоровой кожи, и способ снижения микробной нагрузки в тканях или на тканях, отличных от неповрежденной здоровой кожи, включающие введение указанной выше композиции. Композиция сохраняет молекулярную целостность и антимикробную эффективность после стерилизации. Использование группы изобретений обеспечивает безопасное внутрибрюшинное введение. 3 н. и 33 з.п. ф-лы, 63 ил., 9 пр.

1. Антимикробная фармацевтическая композиция, содержащая:

водный носитель; и

по меньшей мере один антимикробный синтетический катионный полипептид, диспергированный в указанном водном носителе в диапазоне концентраций от приблизительно 0,01 масс.% до приблизительно 5 масс.% в пересчете на общую массу указанной антимикробной фармацевтической композиции;

причем:

указанный по меньшей мере один антимикробный синтетический катионный полипептид содержит множество положительно заряженных аминокислотных остатков при нейтральном pH;

указанное множество положительно заряженных аминокислотных остатков при нейтральном pH составляет по меньшей мере 10;

указанный по меньшей мере один антимикробный синтетический катионный полипептид содержит по меньшей мере 40 аминокислотных остатков;

указанный по меньшей мере один антимикробный синтетический катионный полипептид дополнительно содержит множество гидрофобных аминокислотных остатков;

указанный по меньшей мере один антимикробный синтетический катионный полипептид в концентрации 2 масс.% в деионизованной воде характеризуется вязкостью при 37°С, равной 2 сантистокса (сСт) или более;

указанный водный носитель, содержащий указанный по меньшей мере один антимикробный синтетический катионный полипептид в количестве 2 масс.%, характеризуется вязкостью при 37°С, превышающей вязкость водного носителя, содержащего 2 масс.% альбумина вместо указанного антимикробного синтетического катионного полипептида; и

указанная антимикробная фармацевтическая композиция стерилизована с помощью способа стерилизации, позволяющего получить стерилизованную антимикробную фармацевтическую композицию с указанным по меньшей мере одним антимикробным синтетическим катионным полипептидом, обладающим средневесовой молекулярной массой и необязательно дисперсностью, сопоставимыми с таковыми для по меньшей мере одного антимикробного синтетического катионного полипептида антимикробной фармацевтической композиции, не подвергавшейся стерилизации указанным способом стерилизации;

при этом указанный по меньшей мере один антимикробный синтетический катионный полипептид содержит конфигурацию гидрофобных аминокислотных остатков и положительно заряженных аминокислотных остатков в последовательности, выполненную с возможностью способствовать самосборке указанного по меньшей мере одного антимикробного синтетического катионного полипептида в мультимерные структуры; и

указанная антимикробная фармацевтическая композиция обладает низкой токсичностью после инфузии в брюшную полость множества здоровых молодых взрослых мышей в дозе 50 мг/кг, согласно измерению уровня выживаемости мышей, составляющего 50% или более через 72 часа.

2. Антимикробная фармацевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что указанный водный носитель представляет собой воду или водный раствор фармацевтически приемлемой соли.

3. Антимикробная фармацевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что указанный водный носитель дополнительно содержит по меньшей мере одну неионогенную добавку.

4. Антимикробная фармацевтическая композиция по п. 3, отличающаяся тем, что указанная по меньшей мере одна неионогенная добавка присутствует в количестве, которое является эффективным для увеличения осмотической концентрации указанной антимикробной фармацевтической композиции до значения, по меньшей мере на 10% превышающего таковое у указанной антимикробной фармацевтической композиции без указанной добавки(добавок).

5. Антимикробная фармацевтическая композиция по п. 3, отличающаяся тем, что указанная неионогенная добавка выбрана из группы, состоящей из декстрозы, маннита, глицерина, ксилита, сорбита, по меньшей мере одного поверхностно-активного вещества и их комбинаций.

6. Антимикробная фармацевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что указанный водный носитель дополнительно содержит добавку в количестве, повышающем вязкость указанной антимикробной фармацевтической композиции.

7. Антимикробная фармацевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что указанный водный носитель дополнительно содержит добавку в количестве, снижающем вязкость указанной антимикробной фармацевтической композиции.

8. Антимикробная фармацевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что указанный способ стерилизации представляет собой тепловую стерилизацию и/или стерильную фильтрацию.

9. Антимикробная фармацевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что указанная антимикробная фармацевтическая композиция стерилизована с помощью способа стерилизации, позволяющего(их) получить стерилизованную антимикробную фармацевтическую композицию, обладающую уровнем вязкости при 37°С, сопоставимым с таковым у антимикробной фармацевтической композиции, не подвергавшейся стерилизации с помощью указанного способа стерилизации.

10. Антимикробная фармацевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что вязкость стерилизованной антимикробной фармацевтической композиции при 37°С находится в диапазоне от 20% до 200% от вязкости сопоставимой в других отношениях нестерилизованной антимикробной фармацевтической композиции.

11. Антимикробная фармацевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что указанная антимикробная фармацевтическая композиция обладает микробиоцидной активностью, сопоставимой с таковой у сопоставимой в других отношениях нестерилизованной антимикробной фармацевтической композиции, причем микробиоцидную активность определяют с помощью анализа зависимости гибели клеток от времени в течение 60 минут по меньшей мере против одной бактерии, выбранной из группы, состоящей из S. aureus, S. epidermidis, P. aeruginosa и E. coli.

12. Антимикробная фармацевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что указанное множество гидрофобных аминокислотных остатков содержит по меньшей мере 5 гидрофобных аминокислотных остатков, выбранных из лейцина (L), изолейцина (I), валина (V), фенилаланина (F) или аланина (A).

13. Антимикробная фармацевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что указанное множество гидрофобных аминокислотных остатков содержит по меньшей мере 10 гидрофобных аминокислотных остатков, выбранных из лейцина (L), изолейцина (I), валина (V), фенилаланина (F) или аланина (A).

14. Антимикробная фармацевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что указанное множество гидрофобных аминокислотных остатков содержит по меньшей мере 15 гидрофобных аминокислотных остатков, выбранных из лейцина (L), изолейцина (I), валина (V), фенилаланина (F) или аланина (A).

15. Антимикробная фармацевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что указанные гидрофобные аминокислотные остатки содержат остатки лейцина.

16. Антимикробная фармацевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что указанное множество положительно заряженных аминокислотных остатков содержат остатки лизина.

17. Антимикробная фармацевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что указанный по меньшей мере один антимикробный синтетический катионный полипептид представляет собой блок-сополимерный полипептид, содержащий гидрофобные остатки лейцина и положительно заряженные остатки лизина.

18. Антимикробная фармацевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что указанный по меньшей мере один антимикробный синтетический катионный полипептид самособирается в мультимерные структуры, что измеряют по критической концентрации агрегации, составляющей менее 1000 мкг/мл при 37°C в деионизованной воде.

19. Антимикробная фармацевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что указанный по меньшей мере один антимикробный синтетический катионный полипептид при концентрации 3 масс.% в деионизованной воде при 37°C образует самоподдерживающийся гидрогель.

20. Антимикробная фармацевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что указанный по меньшей мере один антимикробный синтетический катионный полипептид проявляет поверхностную активность в деионизованной воде при 37°С при концентрации 1 масс.%, измеряемую по снижению поверхностного натяжения по меньшей мере на 10% по сравнению с деионизованной водой самой по себе.

21. Антимикробная фармацевтическая композиция по п. 1, дополнительно содержащая противовоспалительное соединение.

22. Антимикробная фармацевтическая композиция по п. 21, отличающаяся тем, что указанное противовоспалительное соединение выбрано из группы, состоящей из кортикостероида, ингибитора гистамина и ингибитора цитокина.

23. Антимикробная фармацевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что указанный водный носитель, содержащий указанный по меньшей мере один антимикробный синтетический катионный полипептид в количестве 2 масс.%, характеризуется вязкостью при 40°С, составляющей приблизительно 15.17 сСт.

24. Антимикробная фармацевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что указанный водный носитель, содержащий указанный по меньшей мере один антимикробный синтетический катионный полипептид в количестве 2 масс.%, характеризуется вязкостью при 40°С, составляющей приблизительно 20.7 сСт.

25. Антимикробная фармацевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что указанный водный носитель, содержащий указанный по меньшей мере один антимикробный синтетический катионный полипептид в количестве 1 масс.%, характеризуется вязкостью при 40°С, составляющей приблизительно 24.8 сСт.

26. Антимикробная фармацевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что указанный водный носитель, содержащий указанный по меньшей мере один антимикробный синтетический катионный полипептид в количестве 2 масс.%, характеризуется вязкостью при 40°С, составляющей приблизительно 6.45 сСт.

27. Способ профилактики микробного заражения тканей, отличных от неповрежденной здоровой кожи, включающий:

выявление субъекта-млекопитающего, у которого присутствует участок ткани, отличный от неповрежденной здоровой кожи и подверженный риску микробного заражения; и

введение антимикробной фармацевтической композиции по любому из пп. 1-26 в указанный участок в количестве, эффективном по меньшей мере для частичной защиты указанного участка ткани от заражения микробами.

28. Способ по п. 27, отличающийся тем, что указанный участок ткани выбран из пораженной заболеванием кожи, области хирургического вмешательства, травматической раны, тканей, очищенных от омертвевших участков, брюшной полости, легочных дыхательных путей, пазухи и мочевыводящих путей.

29. Способ по п. 27, дополнительно включающий взятие пробы из указанного участка ткани для оценки микробной нагрузки.

30. Способ по п. 27, отличающийся тем, что указанную антимикробную фармацевтическую композицию вводят в ходе операции в область хирургического вмешательства.

31. Способ по п. 27, отличающийся тем, что указанную антимикробную фармацевтическую композицию вводят в участок ткани в избыточном количестве.

32. Способ снижения микробной нагрузки в тканях или на тканях, отличных от неповрежденной здоровой кожи, включающий:

выявление субъекта-млекопитающего, у которого присутствует участок ткани, отличный от неповрежденной здоровой кожи и содержащий микробную нагрузку; и

введение антимикробной фармацевтической композиции по любому из пп. 1-26 в указанный участок ткани в количестве, эффективном по меньшей мере для частичного снижения микробной нагрузки.

33. Способ по п. 32, отличающийся тем, что указанный участок ткани выбран из пораженной заболеванием кожи, области хирургического вмешательства, травматической раны, ткани, очищенной от омертвевших участков, абсцесса, брюшной полости, легочных дыхательных путей, пазухи и мочевыводящих путей.

34. Способ по п. 32, дополнительно включающий взятие пробы из указанного участка ткани для оценки микробной нагрузки.

35. Способ по п. 32, отличающийся тем, что указанную антимикробную фармацевтическую композицию вводят в ходе операции в участок ткани, который является зараженным и/или инфицированным микробами.

36. Способ по п. 32, отличающийся тем, что указанную антимикробную фармацевтическую композицию вводят в участок ткани в избыточном количестве.