ПРОИСХОДЯЩИЕ ИЗ БАКТЕРИОФАГОВ ПРОТИВОМИКРОБНЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ПРОТИВ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ Российский патент 2023 года по МПК C07K14/05 C07K14/47 C12N9/24 C07K19/00 C12N15/62 A61K38/16 A61K38/47 A61K45/06 A61P31/04 

ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[001] Настоящая заявка опирается на дату подачи и испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США №62/650235, поданной 29 марта 2018 г., описание которой полностью включено в данную заявку посредством ссылки.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[002] Настоящая заявка содержит Перечень последовательностей, который был подан в электронном виде в формате ASCII и настоящим полностью включен в данную заявку посредством ссылки. Указанная копия ASCII, созданная 28 марта 2019 г., названа 0341_0002-PCT_SL.txt и имеет размер 28097 байт.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[003] Настоящее изобретение относится к области противомикробных агентов и, в частности, к полученным из фагов противомикробным пептидам амуринам, которые инфицируют грамотрицательные бактерии, и применению данных пептидов для уничтожения грамотрицательных бактерий и борьбы с бактериальной инфекцией и контаминацией.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[004] Грамотрицательные бактерии, в частности, представители рода Pseudomonas и развивающийся патоген с множественной лекарственной устойчивостью акинетобактерия Баумана (Acinetobacter baumannii), являются важной причиной серьезных и потенциально угрожающих жизни инвазивных инфекций. Инфекция Pseudomonas является главной проблемой при ожоговых ранах, хронических ранах, хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ), муковисцидозе, бактериального роста на поверхностях имплантированных биоматериалов и внутрибольничных поверхностях и в системе водоснабжения, где она представляет множество угроз для уязвимых пациентов.

[005] После того, как P. aeruginosa прижилась у пациента, данную инфекцию может быть особенно трудно лечить. Геном P. aeruginosa кодирует множество генов устойчивости, включая эффлюксные насосы, обеспечивающие множественную лекарственную устойчивость, и ферменты, придающие устойчивость к антибиотикам бета-лактамам и аминогликозидам, что делает терапию данного грамотрицательного патогена особенно проблематичной вследствие отсутствия новых противомикробных лекарств. В данную проблему вносит вклад способность P. aeruginosa расти в биопленке, что может повысить его способность вызывать инфекции, защищая бактерии от иммунной защиты хозяев и химиотерапии.

[006] В медицинских учреждениях частота встречаемости устойчивых к лекарственным средствам штаммов Pseudomonas aeruginosa возрастает.В наблюдательном исследовании инфекций кровотока (BSI), связанных с оказанием медицинской помощи в общественных больницах, P. aeruginosa представлял собой один из четырех наиболее частых патогенов с множественной лекарственной устойчивостью (MDR), вносящих вклад 18% в общую больничную смертность. Кроме того, вспышки MDR-P. aeruginosa подтверждаются многочисленными документами. Неблагоприятные исходы связаны с MDR-штаммами P. aeruginosa, которые часто требуют лечения лекарственными средствами крайней меры, такими как колистин.

[007] Другие устойчивые к лекарственным средствам бактерии, которые Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) и Центры по контролю заболеваемости (ЦКЗ, CDC) считают значительной угрозой, включают следующие грамотрицательные бактерии: Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, энтеробактерии (включая Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae и Enterobacter cloacae), виды Salmonella, Neisseria gonorrhoeae и виды Shigella (Tillotson G. 2018. A crucial list of pathogenes. Lancet Infect Dis 18:234-236).

[008] Для того чтобы удовлетворить потребность в новых противомикробных средствах с новыми механизмами, исследователи изучают различные лекарственные средства и биологические препараты. Один такой класс противомикробных агентов включает лизины. Лизины представляют собой гидролазы пептидогликанов клеточной стенки, которые действуют как "молекулярные ножницы", чтобы разрушить сетчатую структуру пептидогликанов, ответственную за поддержание формы клетки и за сопротивление внутреннему осмотическому давлению. Разрушение пептидогликана приводит к осмотическому лизису. Тем не менее, некоторые лизины оказались неэффективны против грамотрицательных бактерий, по меньшей мере отчасти, вследствие наличия наружной мембраны (НМ), которая отсутствует у грамположительных бактерий и которая ограничивает доступ к подлежащему пептидогликану. Также были разработаны модифицированные лизины ("артилизины"). Данные агенты, которые содержат лизины, слитые со специальными α-спиральными доменами с поликатионными, амфипатическими и гидрофобными свойствами, способны перемещаться через НМ. Тем не менее, некоторые артилизины проявляют низкую активность in vivo. Причиной этому могут служить компоненты сыворотки человека и, в частности, физиологическая соль и двухвалентные катионы. Данные компоненты конкурируют за сайты связывания липополисахаридов и могут мешать α-спиральным доменам транслокации лизинов, тем самым ограничивая активность в крови и ограничивая эффективность некоторых лизинов и артилизинов для лечения инвазивных инфекций. Об аналогичном отсутствии активности в крови сообщали для множества различных проникающих через наружную мембрану и дестабилизирующих ее противомикробных пептидов.

[009] Дополнительно клизинам и артилизинам были обнаружены другие кодируемые фагами системы лизиса хозяина, включая "амурины" (Chamakura KR и др., 2017. Mutational analysis of the MS2 lysis protein L. Microbiology 163:961-969). Термин амурин описывает ограниченный набор немуралитических (не "уничтожающих стенку", т.е. не основанных на гидролизе пептидогликанов клеточной стенки) лизирующих активностей как из оцДНК-, так и из оцРНК-фагов (Microviridae и Leviviridae, соответственно). Например, амурин белок Е фага ϕХ174 (семейства Microviridae, рода Microvirus) представляет собой мембранный белок из 91 аминокислоты, который вызывает лизис путем ингибирования бактериальной транслоказы MraY - важного заключенного в мембрану фермента, который катализирует образование предшественника муреина - липида I (Zheng Y и др., 2009. Purification and functional characterization of phiX174 lysis protein E. Biochemistry 48:4999-5006). Кроме того, капсидный белок А2 фага Qβ (семейства Leviviridae, рода Allolevivirus) представляет собой структурный белок (и амурин) из 420 аминокислот, который вызывает лизис, препятствуя активности MurA и нарушая регуляцию процесса биосинтеза пептидогликанов (Gorzelnik KV и др., 2016. Proc Natl Acad Sci USA 113:11519-11524). Другие неограничивающие примеры включают амурин LysM фага М, который является специфическим ингибитором MurJ -флиппазы липида II Е. coli, и амурин белок L фага MS2 (семейства Levivirdae, рода Levivirus), который представляет собой интегральный мембранный белок из 75 аминокислот и вызывает лизис способом, требующим активности шаперона DnaJ хозяина (Chamakura KR и др., 2017. J Bacterid 199). Предположительная структура доменов L-подобных амуринов была определена и содержит внутренний дипептид лейцилсерин, которому непосредственно предшествует участок из 10-17 гидрофобных остатков. Данные амурины представляют собой интегральные мембранные белки, и их до сих пор не очищали и не использовали как лизины. Кроме того, их мишени находятся в цитоплазме. Их не исследовали в качестве литических агентов. Некоторые амурины были подробно описаны, например, в опубликованной заявке РСТ №WO 2001/009382, но, в лучшем случае, они являются основой для разработки лекарств, и из них не разрабатывали антибактериальные лекарства.

[0010] Несмотря на то, что в недавних публикациях были описаны лизины/артилизины и другие системы лизиса хозяина (например, амурины), которые можно использовать против грамотрицательных бактерий с различной степенью эффективности in vivo, остается потребность в дополнительных антибактериальных соединениях, которые нацелены на P. Aeruginosa, обладающей множественной лекарственной устойчивостью, и другие грамотрицательные бактерии для лечения инвазивных инфекций, и особенно антибактериальных соединениях, которые обладают высокой растворимостью, остаются активными in vivo в присутствии сыворотки и/или не обладают гемолитической активностью.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0011] На фигуре 1А представлены трехмерные модели, предсказанные I-Tasser, структур представителей семейства пептидов фага хламидий (Chp) Chp1, Chp 2, Chp4, Chp5, Спр6, Спр7, Еср1, Еср2 и Osp1. Эффекторный пептид врожденного иммунитета человека LL-37 включен для сравнения. Явно видны альфа-спиральные структуры, и верхний конец, как правило, представляет собой N-конец.

[0012] На фигуре 1В представлено предсказание консенсусной вторичной структуры Chp2 (SEQ ID NO: 2) с применением JPRED4. Альфа-спирали обозначены утолщенными заштрихованными полосами.

[0013] На фигуре 1С представлено предсказание консенсусной вторичной структуры Chp4 (SEQ ID NO: 4) с применением JPRED4. Альфа-спирали обозначены утолщенными заштрихованными полосами.

[0014] На фигуре 2А представлено укорененное (кластеризация методом попарного внутригруппового невзвешенного среднего (UPGMA)) филогенетическое дерево некоторых представителей семейства Chp, полученное в результате выравнивания ClustalW.

[0015] На фигуре 2В представлено неукорененное (кластеризация методом присоединения соседей) филогенетическое дерево некоторых представителей семейства Chp, полученное в результате выравнивания ClustalW.

[0016] На фигуре 3 представлена серия микрофотографий, на которых показан микроскопический анализ (увеличение в 2000 раз) штамма 1292 Pseudomonas aeruginosa, обработанного в течение 15 минут Chp2 (10 мкг/мл) или буфером в качестве контроля ("необработанный"), в 100% сыворотке человека. Образцы окрашивали, применяя набор для определения жизнеспособности клеток Live/Dead (ThermoFisher), и исследовали с помощью как дифференциальной интерференционно-контрастной (ДИК), так и флуоресцентной микроскопии. На микрофотографиях показано отсутствие мертвых бактерий в ряду необработанных и уменьшение количества живых бактерий в ряду обработанных.

[0017] В настоящей заявке описан новый класс происходящих из фагов литических агентов, которые получены, например, на основе геномных последовательностей Microviridae и отличаются от других подобных агентов, включая известные лизины/артилизины и амурины. Происходящие из фагов литические агенты, описанные в данной заявке, называют пептидами фага хламидий (Chp), также называют "пептидами амуринов" (функциональное определение, не подразумевающее подобия последовательностей с амуринами). В данной заявке описано 40 пептидов Chp, которые были идентифицированы, составляющих семейство специфических бактериолитических белков. У нескольких из пептидов Chp, описанных в данной заявке, выявили заметное сходство друг с другом по последовательности, но они отличны от других известных пептидов, представленных в базах данных последовательностей. Несмотря на уникальные последовательности пептидов Chp, предсказано, что все они образуют альфа-спиральные структуры, сходные с таковыми у некоторых описанных ранее противомикробных пептидов (AMP) врожденных иммунных систем позвоночных (E.F. Haney и др., 2017, in Hansen PR (ред.), Antimicrobial Peptides: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, том 1548), но не имеющие подобия последовательностей с такими AMP. В соответствии с антибактериальной функцией класса Chp, в данной заявке описана сильная бактерицидная активность широкого спектра действия против грамотрицательных патогенов для нескольких различных очищенных пептидов Chp. В отличие от ранее описанных амуринов Microviridae, у которых есть цитоплазматические мишени в биосинтетическом аппарате клеточной стенки, которые могут быть ограниченно доступны для внесенных извне белков, пептиды Chp, описанные в данной заявке, можно применять, в очищенных формах, для проявления бактерицидной активности "извне", т.е., путем действия снаружи на клеточную стенку. Пептиды Chp, идентифицированные в данной заявке, представляют собой новый класс противомикробных агентов, обладающих активностью широкого спектра против грамотрицательных патогенов и способностью сохраняться в присутствии сыворотки.

[0018] В одном аспекте настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая фармацевтически приемлемый носитель и эффективное количество (i) выделенного пептида Chp, имеющего последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 1 - 4, 6 - 26 и 54 - 66, или их активных фрагментов, или (ii) модифицированного пептида Chp, последовательность которого по меньшей мере на 80%, например, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 92,5%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% идентична по меньшей мере одной из последовательностей SEQ ID NO: 1 - 4, 6 - 26 и 54 - 66, причем модифицированный пептид Chp ингибирует рост, сокращает популяцию и/или уничтожает по меньшей мере один вид грамотрицательных бактерий, необязательно в присутствии сыворотки человека. В некоторых вариантах реализации указанный по меньшей мере один вид грамотрицательных бактерий включает Pseudomonas aeruginosa.

[0019] В другом варианте реализации, описанном в данной заявке, фармацевтическая композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель и эффективное количество выделенного пептида Chp, выбранного из группы, состоящей из пептидов Chp1, Chp 2, Chp3, Chp4, Chp6, Chp7, Chp8, Chp9, Chp10, Chp11, Chp12, CPAR39, Gkh1, Gkh2, Unp1, Ecp1, Tma1, Ecp2, Osp1, Unp2, Unp3, Gkh3, Unp5, Unp6, Spi1, Spi2, Еср3, Ecp4, Lvp1, Lvp2, ALCES1, AVQ206, AVQ244, CDL907, AGT915, HH3930, Fen7875 и SBR77, или их активных фрагментов.

[0020] В некоторых вариантах реализации пептид Chp представляет собой Chp2, Chp4, Chp6, Еср1 или Еср2.

[0021] В различных вариантах реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель и эффективное количество (i) выделенного пептида Chp, имеющего последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; SEQ ID NO: 57; SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO: 63; SEQ ID NO: 64; SEQ ID NO: 65 и SEQ ID NO: 66, или их активных фрагментов.

[0022] В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель и эффективное количество (i) выделенного пептида Chp, имеющего последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 18; и SEQ ID NO: 54, или их активных фрагментов.

[0023] В некоторых вариантах реализации пептид Chp, предложенный в данной заявке, или его активные фрагменты содержат по меньшей мере одну не встречающуюся в природе модификацию относительно любой из последовательностей аминокислот SEQ ID NO: 1 - 4, 6 - 26 и 54 - 66, и в некоторых вариантах реализации указанная не встречающаяся в природе модификация выбрана из группы, состоящей из модификации путем замены, такой как замена аминокислоты; модификации путем N-концевого ацетилирования и модификации путем С-концевого амидирования. В некоторых вариантах реализации модифицированный пептид Chp содержит по меньшей мере одну замену, вставку или делецию аминокислоты относительно любой из последовательностей аминокислот SEQ ID NO: 1 - 4, 6 - 26 и 54 - 66, причем модифицированный пептид Chp ингибирует рост, сокращает популяцию и/или уничтожает по меньшей мере один вид грамотрицательных бактерий, необязательно в присутствии сыворотки человека. В некоторых вариантах реализации указанный по меньшей мере один вид грамотрицательных бактерий включает Pseudomonas aeruginosa. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере одна замена аминокислоты представляет собой консервативную замену аминокислоты. В некоторых вариантах реализации модифицированный пептид Chp, содержащий по меньшей мере одну замену аминокислоты относительно любой из последовательностей аминокислот SEQ ID NO: 1 - 4, 6 - 26 и 54 - 66, представляет собой катионный пептид, содержащий по меньшей мере один альфа-спиральный домен.

[0024] Фармацевтическая композиция в некоторых вариантах реализации может представлять собой раствор, суспензию, эмульсию, ингаляционный порошок, аэрозоль или спрей. В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция может также содержать один или более антибиотиков, подходящих для лечения грамотрицательных бактерий. Необязательно пептид Chp1 исключен, так что фармацевтическая композиция не содержит Chp1.

[0025] В некоторых вариантах реализации в данной заявке предложен вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует (i) пептид Chp, имеющий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 1 - 4, 6 - 26 и 54 - 66, или их активных фрагментов, или (ii) пептид Chp, последовательность которого по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 92,5%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична по меньшей мере одной из последовательностей SEQ ID NO: 1 - 4, 6 - 26 и 54 - 66, причем модифицированный пептид Chp ингибирует рост, сокращает популяцию и/или уничтожает по меньшей мере один вид грамотрицательных бактерий, необязательно в присутствии сыворотки человека. В некоторых вариантах реализации указанный по меньшей мере один вид грамотрицательных бактерий включает Pseudomonas aeruginosa.

[0026] Также в данной заявке предложены рекомбинантные векторы экспрессии, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую (i) пептид Chp, содержащий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 1 - 4, 6 - 26 и 54 - 66, или их активных фрагментов, или (ii) модифицированный пептид Chp, последовательность которого по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 92,5%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична по меньшей мере одной из последовательностей SEQ ID NO: 1 - 4, 6 - 26 и 54 - 66, причем модифицированный пептид Chp ингибирует рост, сокращает популяцию и/или уничтожает по меньшей мере один вид грамотрицательных бактерий, необязательно в присутствии сыворотки человека. В некоторых вариантах реализации указанный по меньшей мере один вид грамотрицательных бактерий включает Pseudomonas aeruginosa. В некоторых вариантах реализации нуклеиновая кислота функционально связана с гетерологичным промотором. В некоторых вариантах реализации нуклеиновая кислота кодирует пептид Chp, содержащий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; SEQ ID NO: 57; SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO: 63 и SEQ ID NO: 66, или их активных фрагментов, и в некоторых вариантах реализации нуклеиновая кислота кодирует пептид Chp, содержащий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 54, или их активных фрагментов.

[0027] Дополнительные варианты реализации, описанные в данной заявке, включают выделенную клетку-хозяина, содержащую упомянутые выше векторы. В некоторых вариантах реализации последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой последовательность кДНК.

[0028] В другом дополнительном аспекте настоящего изобретения предложена выделенная очищенная нуклеиновая кислота, кодирующая пептид Chp, содержащий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 1-26 и 54 - 66, или их активных фрагментов. В некоторых вариантах реализации нуклеиновая кислота кодирует пептид Chp, содержащий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 1 - 4, 6 - 26 и 54 - 66, или их активных фрагментов. В альтернативном варианте реализации выделенная очищенная ДНК содержит последовательность нуклеотидов, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 27 - 53 и 68 - 80, и в некоторых вариантах реализации выделенная очищенная ДНК содержит последовательность нуклеотидов, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 27 - 30, 32 - 53 и 68 - 79. Необязательно нуклеиновая кислота представляет собой кДНК. В некоторых вариантах реализации последовательность нуклеотидов содержит по меньшей мере одну не встречающуюся в природе модификацию, такую как мутация (например, замена, вставка или делеция), или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую N-концевую модификацию или С-концевую модификацию.

[0029] В других аспектах настоящего изобретения предложены различные способы/применения. Одно такое применение представляет собой способ ингибирования роста, сокращения популяции и/или уничтожения по меньшей мере одного вида грамотрицательных бактерий, указанный способ включает приведение в контакт бактерий с композицией, содержащей эффективное количество (i) пептида Chp, содержащего последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 1 - 4, 6 - 26 и 54 - 66, или их активных фрагментов, или (ii) модифицированного пептида Chp, последовательность которого по меньшей мере на 80%, например, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 92,5%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% идентична ему, причем модифицированный пептид Chp ингибирует указанный рост, сокращает указанную популяцию и/или уничтожает указанный по меньшей мере один вид грамотрицательных бактерий. В некоторых вариантах реализации пептид Chp содержит последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; SEQ ID NO: 57; SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO: 63 и SEQ ID NO: 66, или их активных фрагментов, и в некоторых вариантах реализации пептид Chp содержит последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 54, или их активных фрагментов.

[0030] Также в данной заявке предложен способ ингибирования роста, сокращения популяции и/или уничтожения по меньшей мере одного вида грамотрицательных бактерий, указанный способ включает приведение в контакт бактерий с композицией, содержащей эффективное количество пептида Chp, выбранного из группы, состоящей из Chp1, Chp 2, Chp3, Chp4, Chp6, Chp7, Chp8, Chp9, Chp10, Chp11, Chp12, CPAR39, Gkh1, Gkh2, Unp1, Ecp1, Tma1, Ecp2, Osp1, Unp2, Unp3, Gkh3, Unp5, Unp6, Spi1, Spi2, Еср3, Ecp4, Lvp1, Lvp2, ALCES1, AVQ206, AVQ244, CDL907, AGT915, HH3930, Fen7875 и SBR77, или его активных фрагментов, причем указанный пептид Chp или его активные фрагменты обладают способностью ингибировать рост, сокращать популяцию и/или уничтожать по меньшей мере один вид грамотрицательных бактерий.

[0031] В некоторых вариантах реализации указанный по меньшей мере один вид грамотрицательных бактерий представляет собой Pseudomonas aeruginosa, и в некоторых вариантах реализации указанный способ дополнительно включает уничтожение по меньшей мере одного другого вида грамотрицательных бактерий дополнительно к Pseudomonas aeruginosa.

[0032] Также в данной заявке предложен способ лечения бактериальной инфекции, вызванной грамотрицательными бактериями, включающий введение фармацевтической композиции, описанной в данной заявке, субъекту, у которого диагностирована, есть риск развития или проявляются симптомы бактериальной инфекции.

[0033] В любом из предшествующих способов/применений указанные грамотрицательные бактерии могут представлять собой по меньшей мере одну грамотрицательную бактерию, выбранную из группы, состоящей из Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, видов Salmonella, Neisseria gonorrhoeae и видов Shigella. В некоторых вариантах реализации грамотрицательная бактерия представляет собой Pseudomonas aeruginosa.

[0034] Также в данной заявке предложен способ лечения или предотвращения топической или системной патогенной бактериальной инфекции, вызванной грамотрицательными бактериями, включающий введение фармацевтической композиции, описанной в данной заявке, субъекту, нуждающемуся в таком лечении или предотвращении.

[0035] Дополнительно в данной заявке предложен способ предотвращения или лечения бактериальной инфекции, включающий совместное введение субъекту, у которого диагностирована, есть риск развития или проявляются симптомы бактериальной инфекции, комбинации первого количества фармацевтической композиции, описанной в данной заявке, и второго количества антибиотика, подходящего для лечения грамотрицательной бактериальной инфекции, причем указанное первое и указанное второе количества вместе эффективны для предотвращения или лечения грамотрицательной бактериальной инфекции.

[0036] В некоторых вариантах реализации антибиотик, подходящий для лечения грамотрицательной бактериальной инфекции, выбран из одного или более из перечисленных: цефтазидим, цефепим, цефоперазон, цефтобипрол, ципрофлоксацин, левофлоксацин, аминогликозиды, имипенем, меропенем, дорипенем, гентамицин, тобрамицин, амикацин, пиперациллин, тикарциллин, пенициллин, рифампицин, полимиксин В и колистин. В некоторых вариантах реализации антибиотик выбран из одного или более из перечисленных: амикацин, азитромицин, азтреонам, ципрофлоксацин, колистин, фосфомицин, гентамицин, имипенем, пиперациллин, рифампицин и тобрамицин.

[0037] В еще одном варианте реализации предложен способ повышения эффективности антибиотика, подходящего для лечения грамотрицательной бактериальной инфекции, включающий совместное введение антибиотика в комбинации с фармацевтической композицией, описанной в данной заявке, причем введение такой комбинации более эффективно ингибирует рост, сокращает популяцию или уничтожает грамотрицательные бактерии, чем введение либо антибиотика, либо фармацевтической композиции по отдельности.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Определения

[0038] В данной заявке следующие термины и однокоренные с ними термины должны иметь следующие значения, если контекст явно не указывает на иное.

[0039] "Носитель" относится к растворителю, наполнителю, вспомогательному веществу, дисперсионной среде, солюбилизирующему агенту, покрытию, консерванту, изотоническому и замедляющему всасывание агенту, поверхностно-активному веществу, пропелленту, разбавителю, среде и тому подобным агентам, с которыми вводят активное соединение. Такие носители могут представлять собой стерильные жидкости, такие как вода, солевые растворы, водные растворы декстрозы, водные растворы глицерина и масла, включая масла нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и тому подобные масла.

[0040] "Фармацевтически приемлемый носитель" относится к любому и всем растворителям, наполнителям, вспомогательным веществам, дисперсионным средам, солюбилизирующим агентам, покрытиям, консервантам, изотоническим и замедляющим всасывание агентам, поверхностно-активным веществам, пропеллентам, разбавителям, средам и тому подобным агентам, которые физиологически совместимы. Носитель(-и) должен(-ны) быть "приемлемым(и)" в том смысле, что он не вреден субъекту, которого будут лечить, в количествах, обычно используемых в лекарственных средствах. Фармацевтически приемлемые носители совместимы с другими ингредиентами композиции, при этом не делают композицию непригодной для ее предполагаемого назначения. Более того, фармацевтически приемлемые носители подходят для применения у субъектов, предложенных в данной заявке, без неоправданных нежелательных побочных действий (таких как токсичность, раздражение и аллергический ответ). Побочные действия являются "неоправданными", когда их риск превосходит пользу, которую приносит композиция. Неограничивающие примеры фармацевтически приемлемых носителей или вспомогательных веществ включают любой из стандартных фармацевтических носителей, таких как фосфатно-солевые буферные растворы, вода и эмульсии, такие как эмульсии масло/вода и микроэмульсии. Подходящие фармацевтические носители описаны, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences, E.W. Martin, 18oe издание. Фармацевтически приемлемый носитель может представлять собой носитель, который не существует в природе.

[0041] "Бактерицидный" или "бактерицидная активность" относится к способности вызывать гибель бактерий или способности уничтожать бактерии до степени уменьшения их количества по меньшей мере на 3 порядка (99,9%) или до большего уменьшения от числа исходной популяции бактерий в течение периода 18-24 часов.

[0042] "Бактериостатический" или "бактериостатическая активность" относится к способности ингибировать рост бактерий, включая ингибирование растущих бактериальных клеток, таким образом, вызывая уменьшение их количества на 2 порядка (99%) или большее уменьшение, и вплоть до уменьшения без малого на 3 порядка от числа исходной популяции бактерий в течение периода 18-24 часов.

[0043] "Антибактериальный" относится как к бактериостатическим, так и к бактерицидным агентам.

[0044] "Антибиотик" относится к соединению, обладающему свойствами, которые оказывают отрицательное влияние на бактерии, такое как способность вызывать их гибель или сокращать рост. Антибиотик может оказывать отрицательное влияние на грамположительные бактерии, грамотрицательные бактерии или оба вида бактерий. В качестве примера, антибиотик может влиять на биосинтез пептидогликанов клеточной стенки, целостность клеточной мембраны или синтез ДНК или белка в бактериях. Неограничивающие примеры антибиотиков, активных против грамотрицательных бактерий, включают цефалоспорины, такие как цефтриаксон-цефотаксим, цефтазидим, цефепим, цефоперазон и цефтобипрол; фторхинолоны, такие как ципрофлоксацин и левофлоксацин; аминогликозиды, такие как гентамицин, тобрамицин и амикацин; пиперациллин, тикарциллин, имипенем, меропенем, дорипенем, пенициллины широкого спектра действия с ингибиторами бета-лактамазы или без них, рифампицин, полимиксин В и колистин.

[0045] "Устойчивый клекарственным средствам", как правило, относится к бактерии, которая устойчива к антибактериальной активности лекарственного средства. В некоторых случаях, «устойчивый к лекарственным средствам» может, в частности, относиться к устойчивости к антибиотику. В некоторых случаях у бактерии, которая, как правило, чувствительна к конкретному антибиотику, может развиться устойчивость к данному антибиотику, вследствие чего она становится устойчивым к лекарственным средствам микробом или штаммом. "Обладающий множественной лекарственной устойчивостью" ("MDR") патоген представляет собой патоген, у которого развилась устойчивость к по меньшей мере двум классам противомикробных лекарственных средств, каждый из которых используют в качестве монотерапии. Например, обнаружили, что некоторые штаммы S. aureus устойчивы к нескольким антибиотикам, включая метициллин и/или ванкомицин (Antibiotic Resistant Threats in the United States, 2013, Министерство здравоохранения и социальных служб США, Центры по контролю и профилактике заболеваний). Специалист в данной области техники может легко определить, устойчива ли бактерия к лекарственным средствам, применяя обычные лабораторные методики, которые позволяют определить чувствительность или устойчивость бактерии к лекарственному средству или антибиотику.

[0046] "Эффективное количество" относится к количеству, которого, когда его применяют или вводят с подходящей частотой или при подходящей схеме введения доз, достаточно для предотвращения, сокращения, ингибирования или уничтожения бактериального роста или бактериальной нагрузки или для предотвращения, сокращения или снижения выраженности начала, тяжести, продолжительности или прогрессирования расстройства, которое лечат (например, роста грамотрицательного бактериального патогена или вызванной им инфекции), предотвращения прогрессирования расстройства, которое лечат, для того чтобы вызвать регрессию расстройства, которое лечат, или повысить или улучшить профилактическое(-ие) или терапевтическое(-ие) действие(-я) другой терапии, такой как терапия антибиотиком или бактериостатиком.

[0047] "Совместно вводить" относится к введению двух агентов, таких как пептид Chp и антибиотик или любой другой антибактериальный агент, последовательным способом, а также к введению данных агентов по существу одновременным способом, например, в одной смеси/композиции или в дозах, которые дают отдельно, но, тем не менее, вводят по существу одновременно субъекту, например, в различное время в один день или 24-часовой период. Такое совместное введение пептидов Chp с одним или более дополнительными антибактериальными агентами может осуществляться в виде непрерывного лечения, продолжающегося в течение дней, недель или месяцев. Кроме того, в зависимости от применения, совместное введение не обязательно должно быть непрерывным или одинаковым по продолжительности. Например, если применение осуществляют в качестве топического антибактериального агента для лечения, например, бактериальной язвы или инфицированной диабетической язвы, пептид Chp можно вводить только вначале в течение 24 часов от введения дополнительного антибиотика, а затем применение дополнительного антибиотика можно продолжать без дополнительного введения пептида Chp.

[0048] "Субъект" относится к млекопитающему, растению, низшему животному, одноклеточному организму или культуре клеток. Например, предполагают, что термин "субъект" включает организмы, например, прокариоты и эукариоты, которые поражены бактериальной инфекцией или восприимчивы к инфекции, например, грамположительным или грамотрицательным бактериальным инфекциям. Примеры субъектов включают млекопитающих, например, людей, собак, коров, лошадей, свиней, овец, коз, кошек, мышей, кроликов, крыс и трансгенных не относящихся к человеку животных. В некоторых вариантах реализации субъект представляет собой человека, например, человека, страдающего, имеющего риск пострадать или восприимчивого к инфекции грамотрицательными бактериями, причем такая инфекция может быть системной, топической или другим образом сконцентрированной или ограниченной конкретным органом или тканью.

[0049] "Полипептид" используют в данной заявке взаимозаменяемо с термином "пептид", и он относится к полимеру, состоящему из аминокислотных остатков и, как правило, содержащему по меньшей мере приблизительно 30 аминокислотных остатков. Термин включает не только полипептиды в выделенной форме, но также их активные фрагменты и производные. В объем термина "полипептид" также входят слитые белки или слитые полипептиды, содержащие пептид Chp, описанный в данной заявке, и сохранившие, например, литическую функцию. В зависимости от контекста, полипептид может представлять собой встречающийся в природе полипептид или рекомбинантный, сконструированный или полученный синтетическим способом полипептид. Конкретный пептид Chp, например, можно получить или отделить от нативного белка путем ферментативного или химического расщепления или можно получить, применяя обычные методики синтеза пептидов (например, твердофазный синтез) или методики молекулярной биологии (такие как методики, описанные в Sambrook, J. и др., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Колд Спринг Харбор, Нью-Йорк (1989)), или можно, следуя определенной стратегии, укоротить или фрагментировать с получением активных фрагментов, сохранивших, например, литическую активность против той же или по меньшей мере одной имеющей общее происхождение целевой бактерии.

[0050] "Слитый полипептид" относится к продукту экспрессии, полученному в результате соединения двух или более фрагментов нуклеиновых кислот, что приводит к получению слитого продукта экспрессии, как правило, содержащего два или более доменов или фрагментов, которые обычно обладают различными свойствами или совокупностью функциональных характеристик. В более конкретном смысле термин "слитый полипептид" также может относиться к полипептиду или пептиду, содержащему два или более гетерологичных полипептидов или пептидов, связанных ковалентной связью либо напрямую, либо через аминокислотный или пептидный линкер. Полипептиды, образующие слитый полипептид, обычно связаны С-концом с N-концом, хотя они также могут быть связаны С-концом с С-концом, N-концом с N-концом, или N-концом с С-концом. Термин "слитый полипептид" можно применять взаимозаменяемо с термином "слитый белок." Неограничивающая формулировка "полипептид, содержащий" некоторую структуру, включает большие молекулы, чем указанная структура, такие как слитые полипептиды.

[0051] "Гетерологичный" относится к последовательностям нуклеотидов, пептидов или полипептидов, которые в природе не смежны. Например, в контексте настоящего изобретения термин "гетерологичный" можно применять для описания комбинации или слияния двух или более пептидов и/или полипептидов, причем слитый пептид или полипептид обычно не встречается в природе, такой как, например, пептид Chp или его активный фрагмент и катионный и/или поликатионный пептид, амфипатический пептид, пептид суши (sushi) (Ding и др. Cell Mol Life Sci., 65(7-8): 1202-19 (2008)), пептид дефензин (Ganz, Т. Nature Reviews Immunology 3, 710-720 (2003)), гидрофобный пептид и/или противомикробный пептид, который может обладать повышенной литической активностью. В объем данного определения входят два или более пептидов Chp или их активных фрагментов. Их можно применять для получения слитого полипептида с литической активностью.

[0052] "Активный фрагмент" относится к части полипептида, которая сохраняет одну или более функций или биологических активностей выделенного полипептида, из которого указанный фрагмент был получен, например, бактерицидную активность против одной или более грамотрицательных бактерий.

[0053] "Амфипатический пептид" относится к пептиду, содержащему как гидрофильные, так и гидрофобные функциональные группы. В некоторых вариантах реализации вторичная структура может расположить гидрофобные и гидрофильные аминокислотные остатки с противоположных сторон (например, на внутренней стороне и на наружной стороне, когда пептид находится в растворителе, таком как вода) амфипатического пептида. Данные пептиды в некоторых вариантах реализации могут принимать спиральную вторичную структуру, такую как альфа-спиральная вторичная структура.

[0054] "Катионный пептид" относится к пептиду, содержащему высокий процент положительно заряженных аминокислотных остатков. В некоторых вариантах реализации значение pKa катионного пептида составляет 8,0 или более. Также в объем термина "катионный пептид" в контексте настоящего изобретения входят поликатионные пептиды, которые представляют собой полученные синтетическим способом пептиды, преимущественно состоящие из положительно заряженных аминокислотных остатков, таких как остатки лизина (Lys) и/или аргинина (Arg). Аминокислотные остатки, которые не являются положительно заряженными, могут представлять собой нейтрально заряженные аминокислотные остатки, отрицательно заряженные аминокислотные остатки и/или гидрофобные аминокислотные остатки.

[0055] "Гидрофобная группа" относится к химической группе, такой как боковая цепь аминокислоты, которая обладает низкой аффинностью или не обладает аффинностью к молекулам воды, но обладает большей аффинностью к молекулам масла. Гидрофобные вещества имеют склонность к низкой растворимости или отсутствию растворимости в воде или водных фазах и обычно неполярны, но имеют склонность к большей растворимости в масляных фазах. Примеры гидрофобных аминокислот включают глицин (Gly), аланин (Ala), валин (Val), лейцин (Leu), изолейцин (Ile), пролин (Pro), фенилаланин (Phe), метионин (Met) и триптофан (Trp).

[0056] "Повышение" относится к степени активности агента, такой как противомикробная активность, которая выше, чем она могла бы быть в противном случае. В объем термина "повышение" входят аддитивные, а также синергичные (супераддитивные) эффекты.

[0057] "Синергичный" или "супераддитивный" относится к полезному эффекту, осуществляемому двумя веществами в комбинации, который превышает сумму эффектов указанных двух агентов, действующих независимо. В некоторых вариантах реализации синергичный или супераддитивный эффект значимо, т.е., статистически значимо, превышает сумму эффектов указанных двух агентов, действующих независимо. Один или оба активных ингредиента можно применять на подпороговом уровне, т.е., уровне, при котором активное вещество, когда оно применяется отдельно, не вызывает или вызывает очень ограниченный эффект.Указанный эффект можно измерить с помощью анализа, такого как анализ методом «шахматной доски», описанный в данной заявке.

[0058] "Лечение" относится к любому процессу, действию, применению, терапии или тому подобному, при котором субъект, такой как человек, получает медицинскую помощь с целью лечения расстройства, уничтожения патогена или улучшения состояния субъекта, непосредственно или опосредованно. Лечение также относится к снижению частоты встречаемости, облегчению симптомов, исключению рецидива, предотвращению рецидива, предотвращению встречаемости, снижению риска встречаемости, улучшению симптомов, улучшению прогноза или к комбинации перечисленных эффектов. В объем термина "лечение" может дополнительно входить сокращение популяции, снижение скорости роста или вирулентности бактерий у субъекта, посредством чего контролируют или сокращают бактериальную инфекцию у субъекта или бактериальную контаминацию органа, ткани или окружающей среды. Таким образом, "лечение", которое снижает частоту встречаемости, например, может быть эффективным для ингибирования роста по меньшей мере одной грамотрицательной бактерии в определенной среде обитания, будь то субъект или окружающая среда. С другой стороны, "лечение" уже развившейся инфекции относится к ингибированию роста, сокращению популяции, уничтожению, включая устранение, грамотрицательных бактерий, ответственных за инфекцию или контаминацию.

[0059] "Предотвращение" относится к предотвращению встречаемости, рецидива, распространения, начала или развития расстройства, такого как бактериальная инфекция. Не предполагается, что настоящее изобретение ограничено полным предотвращением или предотвращением развития инфекции. В некоторых вариантах реализации отсрочивается начало, или уменьшается тяжесть приобретенного впоследствии заболевания или уменьшается вероятность приобрести заболевание, и перечисленное является примером предотвращения.

[0060] "Приобретенные заболевания" относятся к заболеваниям, проявляющимся клиническими или субклиническими симптомами, такими как обнаружение жара, сепсиса или бактериемии, а также к заболеваниям, которые можно обнаружить по росту бактериального патогена (например, в культуре), когда симптомы, связанные с такой патологией, еще не проявились.

[0061] Подразумевают, что в объем термина "производное" в контексте пептида или полипептида, или их активных фрагментов, входит, например, полипептид, модифицированный таким образом, что он содержит одну или более химических молекул, отличных от аминокислоты, которая по существу не оказывает неблагоприятного влияния и не нейтрализует литическую активность. Химическая молекула может быть связана с пептидом ковалентно, например, через аминоконцевой аминокислотный остаток, карбоксиконцевой аминокислотный остаток или внутренний аминокислотный остаток. Такие модификации могут быть природными или не встречающимися в природе. В некоторых вариантах реализации не встречающаяся в природе модификация может включать добавление защитной или кэппирующей группы на реакционноспособную группу, добавление детектируемой метки, такой как антитело и/или флуоресцентная метка, добавление или модификацию гликозилированием, или добавление объемообразующей группы, такой как ПЭГ (пегилирование), и другие изменения, известные специалистам в данной области техники. В некоторых вариантах реализации не встречающаяся в природе модификация может представлять собой модификацию кэппированием, такую как N-концевые ацетилирования и С-концевые амидирования. Примеры защитных групп, которые можно добавить к пептидам Chp, включают, но не ограничены t-Boc и Fmoc. Широко применяемые белки флуоресцентного мечения, такие как, но не ограничиваясь перечисленными: зеленый флуоресцентный белок (GFP), красный флуоресцентный белок (RFP), голубой флуоресцентный белок (CFP), желтый флуоресцентный белок (YFP) и mCherry, -представляют собой компактные белки, которые могут быть связаны ковалентно или нековалентно с пептидом Chp или слиты с пептидом Chp, не препятствуя нормальным функциям клеточных белков. В некоторых вариантах реализации полинуклеотид, кодирующий флуоресцентный белок, можно вставить против хода транскрипции или по ходу транскрипции от полинуклеотидной последовательности Chp.В результате получают слитый белок (например, пептид Chp::GFP), который не препятствует функции клетки или функции пептида Chp, к которому он присоединен. Конъюгирование полиэтиленгликоля (ПЭГ) с белками применяют как способ продления времени полужизни в кровотоке множества фармацевтических белков. Таким образом, в контексте производных пептида Chp, в объем термина "производное" входят пептиды Chp, химически модифицированные ковалентным присоединением одной или более молекул ПЭГ. Ожидается, что пегилированные пептиды Chp будут проявлять пролонгированное время полужизни в кровотоке по сравнению с непегилированными пептидами Chp, при этом сохраняя биологическую и терапевтическую активность.

[0062] "Процент идентичности последовательностей аминокислот" относится к проценту аминокислотных остатков в кандидатной последовательности, которые идентичны аминокислотным остаткам в эталонной полипептидной последовательности, такой как конкретная последовательность пептида Chp, после выравнивания последовательностей и введения гэпов, при необходимости, чтобы добиться максимального процента идентичности последовательностей, и не рассматривая любые консервативные замены как часть идентичности последовательностей. Выравнивания с целью определения процента идентичности последовательностей аминокислот можно добиться различными способами, которые находятся в рамках компетенции в данной области, например, применяя общедоступное программное обеспечение, такое как BLAST, или коммерчески доступное программное обеспечение, например, от DNASTAR. Две или более полипептидных последовательностей могут быть идентичны на любой процент от 0 до 100%, или любой целое значение между указанными. В контексте настоящего изобретения два полипептида "по существу идентичны", если по меньшей мере 80% аминокислотных остатков (например, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 92,5%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98%, или по меньшей мере приблизительно 99%) идентичны. Термин "процент (%) идентичности последовательностей аминокислот", описанный в данной заявке, также используют по отношению к пептидам Chp.Таким образом, в объем термина "по существу идентичный" будут входить мутированные, укороченные, слитые или другим образом модифицированные по последовательности варианты выделенных полипептидов и пептидов Chp, описанных в данной заявке, и их активные фрагменты, а также полипептиды со значительной идентичностью последовательностей (например, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 92,5%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичные, что измеряют, например, с помощью одного или более способов, упомянутых выше) по отношению к эталонному (дикого типа или другому интактному) полипептиду.

[0063] В данной заявке две последовательности аминокислот "по существу гомологичны", если по меньшей мере приблизительно 80% аминокислотных остатков (например, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 92,5%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99%) идентичны или представляют собой консервативные замены. Последовательности полипептидов согласно настоящему изобретению по существу гомологичны, если одна или более, например, до 10%, до 15% или до 20% аминокислот полипептида, такого как пептиды Chp, описанные в данной заявке, заменены на сходную аминокислоту или консервативную замену аминокислоты, и причем полученные в результате этого пептиды обладают по меньшей мере одной активностью (например, антибактериальным действием) и/или специфичностью к бактериям эталонного полипептида, такого как пептиды Chp, описанные в данной заявке.

[0064] В данной заявке "консервативная замена аминокислоты" представляет собой такую замену, при которой аминокислотный остаток заменяют на аминокислотный остаток, содержащий боковую цепь со сходным зарядом. Семейства аминокислотных остатков, содержащих боковые цепи со сходными зарядами, были определены в данной области. Данные семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серии, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин).

[0065] "Ингаляционная композиция" относится к фармацевтическим композициям согласно настоящему описанию, которые составлены для непосредственной доставки в респираторный тракт в процессе или в сочетании с обычным дыханием или вспомогательной вентиляцией легких (например, путем интратрахеобронхиального, пульмонального и/или назального введения), включая, но не ограничиваясь перечисленными: атомизированные, распыляемые, сухие порошковые и/или аэрозольные составы.

[0066] "Биопленка" относится к бактериям, которые прикрепляются к поверхностям и агрегируют с образованием водосодержащего полимерного матрикса, который может состоять из бактериальных и/или происходящих из хозяина компонентов. Биопленка представляет собой агрегат микроорганизмов, в котором клетки слипаются друг с другом на биотической или абиотической поверхности. Данные адгерентные клетки часто заключены в матрикс, состоящий из внеклеточного полимерного вещества (EPS), но не ограниченный им. Биопленка EPS, которую также называют слизью (хотя не все, описанное как слизь, является биопленкой) или налетом, представляет собой полимерный конгломерат, как правило, состоящий из внеклеточной ДНК, белков и полисахаридов.

[0067] "Подходящий" в контексте антибиотика, подходящего для применения против некоторых бактерий, относится к антибиотику, который, как обнаружили, эффективен против данных бактерий, даже если впоследствии развивается устойчивость.

[0068] "Наружная мембрана" или "НМ" относится к особенности грамотрицательных бактерий. Наружная мембрана состоит из липидного бислоя с внутренней выстилкой из фосфолипидов и внешней амфифильной выстилкой, состоящей по большей части из липополисахарида (ЛПС). ЛПС содержит три основные части: гексаацилированный фосфолипид на основе глюкозамина, называемый липидом А, полисахаридную сердцевину и выступающую внешнюю полисахаридную цепь, называемую О-антигеном. НМ представляет собой нежидкую сплошную среду, стабилизированную тремя основными взаимодействиями, включая: i) авидное связывание молекул ЛПС друг с другом, особенно если присутствуют катионы для нейтрализации фосфатных групп; ii) плотную упаковку сильно насыщенных ацильных цепей; и iii) гидрофобную укладку молекулы липида А. Образованная в результате этого структура является барьером как для гидрофобных, так и для гидрофильных молекул. Под НМ пептидогликан образует тонкий слой, который очень чувствителен к гидролитическому расщеплению: в отличие от пептидогликана грамположительных бактерий, который имеет толщину 30 - 100 нанометров (нм) и состоит из до 40 слоев, пептидогликан грамотрицательных бактерий имеет толщину лишь 2 - 3 нм и состоит лишь из 1 - 3 слоев.

Фаги Microviridae

[0069] Представители семейства фагов Microviridae могут представлять особый интерес в качестве потенциальных источников противоинфекционных агентов по ряду причин. Как описано в данной заявке, было обнаружено, что большая субпопуляция данных фагов, включая фаги рода хламидий Microvirus (семейства Microvirus, подсемейства Gokushovirinae), не содержат консервативной последовательности амурина, а вместо этого кодируют небольшие, неохарактеризованные катионные пептиды, которые, похоже, составляют основу до настоящего момента неохарактеризованной литической системы. Кроме того, бактериофаги семейства Microviridae инфицируют важные с медицинской точки зрения организмы, включая представителей семейств Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae и Chlamydiaceae (Doore SM и др., 2016. Virology 491:45-55.). У них также отсутствуют амурины, и вместо этого, как описано в данной заявке, они кодируют уникальные неохарактеризованные подобные противомикробным пептиды (называемые пептидами амуринов), которые ранее не были идентифицированы или у которых не была определена функция. Пришли к выводу, что если предполагаемые подобные противомикробным пептиды действуют способом, сходным с таковым у ранее описанных противомикробных пептидов (AMP), то спрогнозируют, что они позволяют "лизис извне" способом, не возможным для амуринов и их цитоплазматических мишеней.

[0070] На основании биоинформационного анализа всех аннотированных геномных последовательностей Microviridae в GenBank (с акцентом на фаги, у которых отсутствуют амурины), идентифицировали 40 новых и синтенических открытых рамок считывания. Они кодируют малые катионные пептиды с предсказанной альфа-спиральной структурой, сходной с AMP (но с последовательностями аминокислот, непохожими на AMP), из врожденных иммунных систем различных позвоночных. Данные пептиды, в совокупности названные "пептидами Chp" или "пептидами амуринов", главным образом, обнаруживают в хламидиях рода Microvirus и, в меньшей степени, в других родственных представителях подсемейства Gokushovirinae. См., например, Таблицы 1 и 2 ниже. Пептиды Chp из ряда фагов Microviridae могут проявлять 30 - 100% идентичности друг с другом и могут не иметь или иметь небольшую гомологию с другими пептидами в базе данных белковых последовательностей. См., например, таблицу 3 ниже. На основании предсказания, что пептиды Chp обладают АМР-подобными активностями, синтезировали 39 различных представителей семейства (Chp2 и Chp3 представляли собой идентичные последовательности аминокислот) для тестирования в различных тестах с аспартатаминотрансферазой (ACT). На основании значений минимальной подавляющей концентрации (МПК), составляющей 0,25 - 4 мкг/мл, в присутствии сыворотки человека, несколько пептидов Chp продемонстрировали лучшую активность в сыворотке по сравнению с группой из вплоть до 17 известных исследованных AMP (включая эффекторы врожденного иммунитета и их производные). Более того, продемонстрировали активность против диапазона грамотрицательных патогенов, включая несколько из приоритетного перечня Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) и Центров по контролю заболеваемости (ЦКЗ), включая P. aeruginosa, Е coli, Е, cloacae, K. pneumoniae, А. baumannii и S. typhimurium.

[0071] Для по меньшей мере двух из эффективных пептидов Chp, Chp2 и Chp4 продемонстрировали способность оказывать синергичное действие in vitro с диапазоном вплоть до 11 антибиотиков против P. aeruginosa, включая антибиотики, применяемые при лечении в клинике грамотрицательных инфекций. Кроме того, для обоих Chp2 и Chp4 показали сильные активности против биопленки в формате анализа МРБК (Минимальная разрушающая биопленку концентрация, МРБК = 0,25 мкг/мл) и бактерицидную активность в формате анализа активности по времени гибели при концентрациях вплоть до 1 мкг/мл или ниже. См. пример 5 ниже.

[0072] В целом, данные открытия согласуются как с ролью представителей семейства Chp в процессе лизиса клетки-хозяина (в контексте жизненного цикла бактериофага), так и с применением очищенных пептидов Chp или их производных в качестве противомикробных агентов широкого спектра действия для нацеливания на грамотрицательные патогены. Один главный недостаток применения ранее описанных AMP в качестве лекарства от инвазивных инфекций касается токсичности для эритроцитов и генерализованной мембранолитической активности (т.е., гемолиза) (Oddo А. и др., 2017. Hemolytic Activity of Antimicrobial Peptides. Methods Mol Biol 1548:427-435). Как правило, это можно исследовать in vitro, применяя стандартизированный анализ обнаружения лизиса красных кровяных клеток человека. Множество пептидов Chp, описанных в данной заявке, не проявляют гемолитической активности против красных кровяных клеток человека в противоположность нескольким AMP, которые, как описано в литературе (а также Тритон Х-100), обладают гемолитической активностью. В некоторых вариантах реализации пептиды Chp, описанные в данной заявке, могут проявлять лишь минимальную гемолитическую активность или не проявлять гемолитической активности против красных кровяных клеток человека, по сравнению с AMP. Другой недостаток AMP, описанный в литературе, касается утраты активности в присутствии внеклеточного матрикса крови человека и при физиологических концентрациях солей (Mohanram Н. и др., 2016. Salt-resistant short antimicrobial peptides. Biopolymers 106:345-356); действительно, данный эффект известных AMP можно посмотреть ниже в таблице 6. Результаты, предоставленные в данной заявке, демонстрируют, что некоторые пептиды Chp активны в присутствии либо сыворотки, либо плазмы человека и/или активны в ростовых средах, таких как среда Мюллера-Хинтона и среда на основе казаминовых кислот, содержащих физиологические концентрации солей. Без привязки к какой-либо теории полагают, что различия, наблюдаемые в активностях пептидов Chp и пептидов AMP (в литературе) можно объяснить различием источников указанных двух типов агентов, причем пептиды Chp получают из фага, а AMP по большей части получают на основе эффекторов врожденных иммунных систем позвоночных. Высокая активность пептидов Chp, активность пептидов Chp во внеклеточном матриксе крови и/или отсутствие гемолитической активности делает их подходящими для применения для лечения инвазивных заболеваний. Например, в некоторых вариантах реализации пептиды Chp могут быть активны в наномолярных количествах.

[0073] Вкратце, тогда как направленные на определенный патоген лекарства на основе лизина способны служить в качестве направленной терапии для лечения тяжелых одномикробных инфекций, вызванных известными патогенами MDR, все еще существует нереализованная потребность медицины в агентах для борьбы с тяжелыми и угрожающими жизни инфекциями, например, полимикробными устойчивыми грамотрицательными инфекциями (например, некоторыми внутрибрюшными инфекциями, а также инфекциями тяжелых ожогов, хирургических и других ран). Пептиды Chp, описанные в данной заявке, помогают удовлетворить данную потребность, так как здесь было показано, что они проявляют сильную активность против всех основных патогенов ESKAPE (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa и Enterobacter), обычно ассоциированных с MDR, и ожидают, что они будут активны против множества грамотрицательных бактерий. Пептиды Chp, описанные в данной заявке, могут быть активны при высоких наномолярных концентрациях, сравнимых с таковыми у активных лизинов. Пептиды Chp, описанные в данной заявке, также могут отвечать за высокоэффективные, быстрые, бактериолитические эффекты, способность устранять биопленки, синергизм с обычными антибиотиками и синергизм друг с другом, такой как синергизм между двумя или более пептидами Chp.

[0074] Хотя пептиды Chp согласно настоящему описанию не обязательно должны быть модифицированы путем добавления противомикробных пептидов, в некоторых вариантах реализации пептиды Chp, описанные в данной заявке, можно включить в состав слитого белка. Например, слитый белок может содержать пептид Chp, описанный в данной заявке, и лизин, такой как лизин, активный против грамотрицательных бактерий. В некоторых вариантах реализации пептид Chp можно добавить к N-концу или С-концу лизина с линкерной последовательностью или без нее. Предполагается, что слитые полипептиды, содержащие более чем один бактериолитический фрагмент, могут вносить положительный вклад в бактериолитическую активность исходного лизина и/или исходного пептида Chp.

Полипептиды.

[0075] В данной заявке продемонстрировано и объяснено, что пептиды Chp, описанные в данном разделе, включая пептиды Chp дикого типа, модифицированные пептиды Chp и их производные или активные фрагменты, можно использовать в фармацевтических композициях и способах, описанных в данной заявке.

[0076] В некоторых вариантах реализации пептид Chp выбран из по меньшей мере одного из: Chp1 (SEQ ID NO: 1), Chp2 (SEQ ID NO: 2), CPAR39 (SEQ ID NO: 3), Chp3 (SEQ ID NO: 54); Chp4 (SEQ ID NO: 4), Chp6 (SEQ ID NO: 6), Chp7 (SEQ ID NO: 7), Chp8 (SEQ ID NO: 8), Chp 9 (SEQ ID NO: 9), Chp 10 (SEQ ID NO: 10), Chp 11 (SEQ ID NO: 11), Chp12 (SEQ ID NO: 12), Gkh1 (SEQ ID NO: 13), Gkh2 (SEQ ID NO: 14), Unp1 (SEQ ID NO: 15), Ecp1 (SEQ ID NO: 16), Tma1 (SEQ ID NO: 17), Ecp2 (SEQ ID NO: 18), Osp1 (SEQ ID NO: 19), Unp2 (SEQ ID NO: 20), Unp3 (SEQ ID NO: 21), Gkh3 (SEQ ID NO: 22), Unp5 (SEQ ID NO: 23), Unp6 (SEQ ID NO: 24), Spi1 (SEQ ID NO: 25), Spi2 (SEQ ID NO: 26), Еср3 (SEQ ID NO: 55), Ecp4 (SEQ ID NO: 56); Lvp1 (SEQ ID NO: 57), Lvp2 (SEQ ID NO: 58), ALCES1 (SEQ ID NO: 59), AVQ206 (SEQ ID NO: 60), AVQ244 (SEQ ID NO: 61), CDL907 (SEQ ID NO: 62), AGT915 (SEQ ID NO: 63), HH3930 (SEQ ID NO: 64), Fen7875 (SEQ ID NO: 65), SBR77 (SEQ ID NO: 66) и Bdp1 (SEQ ID NO: 67), или их активных фрагментов, обладающих литической активностью.

[0077] Пептид Chp может представлять собой модифицированный пептид Chp или его активный фрагмент. В некоторых вариантах реализации пептид Chp или его активный фрагмент содержит по меньшей мере одну модификацию относительно по меньшей мере одной из последовательностей SEQ ID NO: 1 - 4, 6 - 26 и 54 - 66, такую как по меньшей мере одна замена, вставка или делеция аминокислоты. В некоторых вариантах реализации модифицированный пептид Chp содержит полипептидную последовательность, идентичную по меньшей мере на 80%, например, по меньшей мере на 85%, например, по меньшей мере на 90%, например, по меньшей мере на 92,5%, например, по меньшей мере на 95%, например, по меньшей мере на 98% или, например, по меньшей мере на 99% последовательности аминокислот по меньшей мере одного пептида Chp, выбранного из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 1 - 4, 6 - 26 и 54 - 66, или его активного фрагмента, причем модифицированный пептид Chp ингибирует рост, сокращает популяцию и/или уничтожает по меньшей мере один вид грамотрицательных бактерий, такой как Р. Aeruginosa, и необязательно по меньшей мере один дополнительный вид грамотрицательных бактерий, описанный в данной заявке, необязательно в присутствии сыворотки человека.

[0078] В некоторых вариантах реализации пептид Chp выбран из (i) по меньшей мере одного из Chp1 (SEQ ID NO: 1), Chp2 (SEQ ID NO: 2), CPAR39 (SEQ ID NO: 3), Chp3 (SEQ ID NO: 54); Chp4 (SEQ ID NO: 4), Chp6 (SEQ ID NO: 6), Chp7 (SEQ ID NO: 7), Chp8 (SEQ ID NO: 8), Chp10 (SEQ ID NO: 10), Chp11 (SEQ ID NO: 11), Ecp1 (SEQ ID NO: 16), Ecp2 (SEQ ID NO: 18), ЕсрЗ (SEQ ID NO: 55), Ecp4 (SEQ ID NO: 56), Osp1 (SEQ ID NO: 19), Unp2 (SEQ ID NO: 20), Gkh3 (SEQ ID NO: 22), Unp5 (SEQ ID NO: 23), Unp6 (SEQ ID NO: 24), Spi1 (SEQ ID NO: 25), Lvp1 (SEQ ID NO: 57), ALCES1 (SEQ ID NO: 59), AVQ206 (SEQ ID NO: 60), CDL907 (SEQ ID NO: 62), AGT915 (SEQ ID NO: 63) и SBR77 (SEQ ID NO: 66), или их активных фрагментов, или (ii) модифицированного пептида Chp, последовательность которого по меньшей мере на 80%, например, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 92,5%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% идентична по меньшей мере одной из последовательностей SEQ ID NO: 1 - 4, 6 - 8, 10, 11, 16, 18, 19, 21-25, 54-57, 59, 60, 62, 63 и 66, причем модифицированный пептид Chp ингибирует рост, сокращает популяцию и/или уничтожает Pseudomonas aeruginosa, и по меньшей мере один дополнительный вид грамотрицательных бактерий, необязательно в присутствии сыворотки человека.

[0079] В некоторых вариантах реализации пептид Chp выбран из (i) по меньшей мере одного из Chp2 (SEQ ID NO: 2), Chp3 (SEQ ID NO: 54), Chp4 (SEQ ID NO: 4), Chp6 (SEQ ID NO: 6), Ecp1 (SEQ ID NO: 16) и Ecp2 (SEQ ID NO: 18), или их активных фрагментов, или (ii) модифицированного пептида Chp, последовательность которого по меньшей мере на 80%, например, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 92,5%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% идентична по меньшей мере одной из последовательностей SEQ ID NO: 2, 4, 6, 16, и 18, причем модифицированный пептид Chp ингибирует рост, сокращает популяцию и/или уничтожает по меньшей мере один вид грамотрицательных бактерий, такой как, Pseudomonas aeruginosa,, и по меньшей мере один дополнительный вид грамотрицательных бактерий, необязательно в присутствии сыворотки человека.

[0080] В некоторых вариантах реализации пептид Chp выбран из (i) по меньшей мере одного пептида Chp, имеющего последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; и SEQ ID NO: 6, или их активных фрагментов, или (ii) модифицированного пептида Chp, последовательность которого по меньшей мере на 92,5% идентична по меньшей мере одной из последовательностей SEQ ID NO: 2, 4 и 6, причем модифицированный пептид Chp ингибирует рост, сокращает популяцию и/или уничтожает по меньшей мере один вид грамотрицательных бактерий, такой как, Pseudomonas aeruginosa, и по меньшей мере один дополнительный вид грамотрицательных бактерий, необязательно в присутствии сыворотки человека.

[0081] В некотором варианте реализации пептид Chp согласно настоящему описанию представляет собой производное одного из эталонных пептидов Chp, который был химически модифицирован. Химическая модификация включает, но не ограничена добавлением химических групп, созданием новых связей и удалением химических групп.Химические модификации могут встречаться в любом месте пептида Chp, включая боковые цепи аминокислот, а также амино- или карбоксиконцы. Например, в некоторых вариантах реализации пептид Chp содержит модификацию путем N-концевого ацетилирования. В некоторых вариантах реализации пептид Chp или его активный фрагмент содержит модификацию путем С-концевого амидирования. Такие модификации могут присутствовать в более чем одном сайте в пептиде Chp.

[0082] Более того, одну или более боковых групп или концевых групп пептида Chp или его активного фрагмента можно защитить с помощью защитных групп, известных среднему специалисту в данной области.

[0083] В некоторых вариантах реализации пептиды Chp, или их активные фрагменты, конъюгированы с увеличивающей срок их существования группой. В некоторых вариантах реализации увеличивающая срок существования группа представляет собой полиэтиленгликоль. Полиэтиленгликоль ("ПЭГ") применяли для получения терапевтических полипептидов с увеличенным сроком существования (Zalipsky, S., Bioconjugate Chemistry, 6:150-165 (1995); Mehvar, R., J. Pharm, Pharmaceut. Sci., 3:125-136 (2000), который полностью включен в данную заявку посредством ссылки). Остов ПЭГ (СН2СН2-0-)n, где n представляет собой количество повторяющихся мономеров, гибкий и амфифильный. При присоединении к другой химической молекуле, такой как пептид Chp или его активный фрагмент, полимерные цепи ПЭГ могут защищать такие полипептиды от иммунного ответа и других механизмов клиренса. В результате, пегилирование может приводить к улучшенной эффективности и безопасности, оптимизируя фармакокинетику, повышая биодоступность и снижая иммуногенность и количество и/или частоту введения доз.

Полинуклеотиды.

Пептиды Chp и их активные фрагменты.

[0084] В одном аспекте настоящего изобретения предложен выделенный полинуклеотид, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид Chp или его активные фрагменты, обладающие литической активностью. В данной заявке в объем термина "литическая активность" входит способность пептида Chp убивать бактерии, уменьшать популяцию бактерий или ингибировать рост бактерий, например, путем проникновения через наружную мембрану грамотрицательных бактерий (например, P. aeruginosa) в присутствии или отсутствие сыворотки человека. Также в объем термина "литическая активность" входит способность удалять или уменьшать биопленку и/или способность снижать минимальную подавляющую концентрацию (МПК) антибиотика в присутствии и/или отсутствие сыворотки человека.

[0085] В некоторых вариантах реализации молекула нуклеиновой кислоты кодирует пептид Chp, имеющий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; SEQ ID NO: 57; SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO: 63; SEQ ID NO: 64; SEQ ID NO: 65 и SEQ ID NO: 66 или их активных фрагментов.

[0086] В некоторых вариантах реализации молекула нуклеиновой кислоты кодирует пептид Chp, имеющий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; SEQ ID NO: 57; SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO: 63; SEQ ID NO: 64; SEQ ID NO: 65 и SEQ ID NO: 66 или их активных фрагментов.

[0087] В некоторых вариантах реализации молекула нуклеиновой кислоты кодирует пептид Chp, имеющий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; SEQ ID NO: 57; SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO: 63 и SEQ ID NO: 66 или их активных фрагментов, и в некоторых вариантах реализации нуклеиновая кислота кодирует пептид Chp, имеющий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 18; и SEQ ID NO: 54 или их активных фрагментов.

[0088] В некоторых вариантах реализации пептиды Chp, описанные в данной заявке, и их активные фрагменты способны проникать через наружную мембрану грамотрицательных бактерий. Без ограничения теорией, после проникновения через наружную мембрану пептиды Chp или их активные фрагменты могут разрушать пептидогликан - основной структурный компонент бактериальной клеточной стенки - приводя к лизису клетки. В некоторых вариантах реализации пептиды Chp или их активные фрагменты, описанные в данной заявке, содержат положительно заряженные (и амфипатические) N- и/или С-концевые α-спиральные домены, которые способствуют связыванию с анионной наружной мембраной грамотрицательных бактерий, чтобы осуществить транслокацию в находящийся прямо под ней пептидогликан.

[0089] Способность пептида Chp или его активного фрагмента проникать через наружную мембрану грамотрицательных бактерий можно оценить с помощью любого способа, известного в данной области, такого как описанный в WO 2017/049233, который полностью включен в данную заявку посредством ссылки. Например, пептид Chp или его активный фрагмент можно инкубировать с грамотрицательными бактериями и гидрофобным соединением. Большинство грамотрицательных бактерий в высокой степени устойчивы к гидрофобным соединениям благодаря наличию наружной мембраны и, следовательно, не позволяют поглощение гидрофобных агентов, таких как 1-N-фенилнафтиламин (NPN), кристаллический фиолетовый или 8-анилино-1-нафталинсульфоновая кислота (ANS). NPN, например, флуоресцирует сильно при гидрофобных условиях и слабо при водных условиях. Соответственно, флуоресценцию NPN можно использовать в качестве меры проницаемости наружной мембраны.

[0090] В частности, способность пептида Chp или его активного фрагмента проникать через наружную стенку можно оценить путем инкубации, например, NPN с грамотрицательными бактериями, например, штаммом РА01 P. aeruginosa, в присутствии пептида Chp или его активного фрагмента, активность которого необходимо исследовать. Более высокая индукция флуоресценции по сравнению с флуоресценцией, излученной в отсутствие пептида Chp (отрицательный контроль), свидетельствует о проникновении через наружную мембрану. Кроме того, индукцию флуоресценции можно сравнить с таковой у известных пермеабилизующих агентов, таких как ЭДТА (этилендиаминтетраацетат), или антибиотика, такого как антибиотик крайней меры, применяемый для лечения P. aeruginosa, т.е., полимиксин В (РМВ), чтобы оценить уровень пермеабилизации наружной мембраны.

[0091] В некоторых вариантах реализации пептиды Chp, описанные в данной заявке, или их активные фрагменты проявляют литическую активность в присутствии и/или отсутствие сыворотки человека. Подходящие способы оценки активности пептида Chp или его активного фрагмента в сыворотке человека известны в данной области и описаны в примерах. Вкратце, значение МПК (т.е., минимальная концентрация пептида, достаточная для подавления роста бактерий по меньшей мере на 80% по сравнению с контролем) можно определить для пептида Chp или его активного фрагмента и сравнить, например, с соединением, неактивным в сыворотке человека, например, лизоцимом фага Т4 или артилизином GN126. Лизоцим фага Т4 доступен для приобретения, например, у Sigma-Aidrich, Inc. GN126 соответствует Art-175, который описан в литературе и получен путем соединения AMP SMAP-29 с GN лизином KZ144. См. Briers и др. 2014, Antimicrob, Agents Chemother. 58:3774-3784, который полностью включен в данную заявку посредством ссылки.

[0092] В частности, можно определить значения МПК для пептида Chp или его активного фрагмента против, например, лабораторного штамма РА01 P. aeruginosa, например, в среде Мюллера-Хинтона, среде Мюллера-Хинтона, дополненной сывороткой человека, казаминокислотой (КАК), описанной в данной заявке, которая содержит физиологические концентрации соли, и КАК, дополненной сывороткой человека. Использование РА01 позволяет тестирование в присутствии повышенных концентраций сыворотки, поскольку в отличие от большинства клинических изолятов РА01 нечувствителен к антибактериальной активности внеклеточного матрикса крови человека.

[0093] В некоторых вариантах реализации пептиды Chp, описанные в данной заявке, или их активные фрагменты способны уменьшать биопленку. Способы оценки минимальной разрушающей биопленку концентрации (МРБК) пептида Chp или его активного фрагмента можно определить, используя вариант метода микроразведений в бульоне для определения МПК с модификациями (см. Ceri и др. 1999. J. Clin Microbial. 37:1771-1776, который полностью включен в данную заявку посредством ссылки, и Schuch и др., 2017, Antimicrob. Agents Chemother. 61, страницы 1-18, который полностью включен в данную заявку посредством ссылки). В данном способе свежие колонии, например, штамма P. aeruginosa, такого как АТСС 17647, суспендируют в среде, например, растворе фосфатного буфера (ФБР), разбавляют, например, 1:100 в TSBg (триптический соевый бульон, дополненный с 0,2% глюкозой), добавляют, например, в виде аликвот по 0,15 мл в устройство Калгари для выращивания биопленок (96-луночный планшет с крышкой, на которой находится 96 выступов из поликарбоната; Innovotech Inc.) и инкубируют, например, 24 часа при 37°С. Биопленки затем промывают и обрабатывают, например, серией 2-кратных разведений лизина в TSBg, например, при 37°С в течение 24 часов. После обработки лунки промывают, сушат на воздухе, например, при 37°С и окрашивают, например, 0,05% кристаллическим фиолетовым в течение 10 минут.После окрашивания из биопленок удаляют краситель, например, в 33% уксусной кислоте и определяют оптическую плотность на 600 нм (ОП600), например, экстрагированного кристаллического фиолетового. МРБК каждого образца представляет собой минимальную концентрацию пептида Chp, необходимую для удаления по меньшей мере 95% биомассы биопленки, что оценивают путем определения количества кристаллического фиолетового.

[0094] В некоторых вариантах реализации пептиды Chp, описанные в данной заявке, или их активные фрагменты уменьшают минимальную подавляющую концентрацию (МПК) антибиотика в присутствии и/или отсутствие сыворотки человека. Можно применять любой известный способ оценки МПК. В некоторых вариантах реализации применяют анализ методом «шахматной доски», чтобы определить влияние пептида Chp или его активного фрагмента на концентрацию антибиотика. Анализ методом «шахматной доски» основан на модификации способа CLSI определения МПК по микроразведениям в бульоне (см. Институт клинических и лабораторных стандартов (CLSI), CLSI. 2015. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard, 10ое издание. Институт клинических и лабораторных стандартов, Уэйн, Пенсильвания, который полностью включен в данную заявку посредством ссылки, и Ceri и др. 1999. J, Clin, Microbiol. 37: 1771-1776, который также полностью включен в данную заявку посредством ссылки).

[0095] Шахматные доски конструируют путем сначала подготовки колонок, например, в 96-луночном полипропиленовом микротитрациоином планшете, в которых каждая лунка содержит одинаковое количество антибиотика, разбавленного в 2 раза вдоль горизонтальной оси. В отдельном планшете подготавливают сопоставимые ряды, в которых каждая лунка содержит одинаковое количество пептида Chp или его активного фрагмента, разбавленного, например, в 2 раза вдоль вертикальной оси. Разведения пептида Chp или его активного фрагмента и антибиотика затем объединяют, так что каждая колонка содержит постоянное количество антибиотика и удваивающиеся разведения пептида Chp, при этом каждый ряд содержит постоянное количество пептида Chp и удваивающиеся разведения антибиотика. Следовательно, в каждой лунке содержится уникальная комбинация пептида Chp и антибиотика. Бактерии добавляют к комбинациям лекарственных средств при концентрациях 1×10⁵ КОЕ/мл в КАК, например, с добавлением или без сыворотки человека. МПК каждого лекарственного средства, отдельно и в комбинации, затем регистрируют, например, через 16 часов при 37°С в окружающей атмосфере. Сумму фракционных подавляющих концентраций (ΣFIC) рассчитывают для каждого лекарственного средства и минимальное значение ΣFIC (ΣFICмин) используют для определения действия комбинации пептид Chp/антибиотик.

[0096] В некоторых вариантах реализации пептиды Chp, описанные в данной заявке, или их активные фрагменты проявили низкую токсичность по отношению к эритроцитам. Любую методику, известную в данной области, можно использовать для оценки возможной гемолитической активности пептидов Chp согласно настоящему изобретению или их активных фрагментов.

[0097] В некоторых вариантах реализации выделенные полинуклеотиды согласно настоящему описанию содержат молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует модифицированный пептид Chp, например, пептид Chp, содержащий одну или более вставок, делеций и/или замен аминокислот по сравнению с эталонным пептидом Chp.Такие эталонные пептиды Chp содержат любую из последовательностей SEQ ID NO. 1 - 4, 6 - 26 и 54 - 66. В некоторых вариантах реализации последовательность модифицированного пептида Chp по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична последовательности эталонного полипептида Chp, имеющего последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 1 - 4, 6 - 26 и 54 - 66.

[0098] Модифицированные пептиды Chp согласно настоящему описанию обычно разрабатывают таким образом, чтобы они сохранили а-спиральный домен, присутствие или отсутствие которого можно легко определить, применяя различное программное обеспечение, такое как Jpred4 (compio.dundee.ac.uk/jpred) и Helical Wheel (hael.net/helical.htm).

[0099] В некоторых вариантах реализации α-спиральный домен охватывает большую часть молекулы. См., например, Chp1 и Chp4 на фигуре 1. В некоторых вариантах реализации α-спиральный домен прерывается (см., например, Chp2 на фигуре 1) и в некоторых вариантах реализации α-спиральный домен укорочен (см., например, Chp6 и Osp1 на фигуре 1). α-спиральный домен пептидов Chp согласно настоящему описанию изменяется в размере приблизительно от 3 до 32 аминокислот, чаще приблизительно от 10 до 25 аминокислотных остатков.

[00100] Модифицированные пептиды Chp согласно настоящему описанию обычно сохраняют одну или более функциональных или биологических активностей эталонного пептида Chp. В некоторых вариантах реализации модификация улучшает антибактериальную активность пептида Chp.Обычно модифицированный пептид Chp обладает улучшенной антибактериальной активностью in vitro (например, в буфере и/или среде) по сравнению с эталонным пептидом Chp.В других вариантах реализации модифицированный пептид Chp обладает улучшенной антибактериальной активностью in vivo (например, в модели инфекции у животного). В некоторых вариантах реализации модификация улучшает антибактериальную активность пептида Chp в отсутствие и/или присутствии сыворотки человека.

[00101] В некоторых вариантах реализации пептиды Chp, описанные в данной заявке, или их варианты или активные фрагменты способны ингибировать рост, или сокращать популяцию или уничтожать P. aeruginosa и необязательно по меньшей мере один другой вид грамотрицательных бактерий в отсутствие или присутствии, или как в отсутствие, так и в присутствии сыворотки человека.

[00102] В некоторых вариантах реализации молекулы нуклеиновых кислот согласно настоящему описанию кодируют активный фрагмент пептидов Chp или модифицированных пептидов Chp, описанных в данной заявке. Термин "активный фрагмент" относится к части полноразмерного пептида Chp, которая сохраняет одну или более биологических активностей эталонного пептида. Таким образом, активный фрагмент пептида Chp или модифицированного пептида Chp в данной заявке ингибирует рост, или сокращает популяцию, или уничтожает P. aeruginosa и необязательно по меньшей мере один вид грамотрицательных бактерий, описанный в данной заявке, в отсутствие или присутствии, или как в отсутствие, так и в присутствии сыворотки человека. Обычно в активных фрагментах сохраняется α-спиральный домен. В некоторых вариантах реализации активный фрагмент представляет собой катионный пептид, в котором сохранился α-спиральный домен.

Векторы и клетки-хозяева.

[00103] В другом аспекте настоящего изобретения предложен вектор, содержащий выделенный полинуклеотид, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую любой пептидов Chp или их активных фрагментов, описанных в данной заявке, или последовательность, комплементарную последовательности выделенных полинуклеотидов согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах реализации вектор представляет собой плазмиду или космиду. В других вариантах реализации вектор представляет собой вирусный вектор, причем в вирусный вектор можно лигировать дополнительные фрагменты ДНК. В некоторых вариантах реализации вектор может автономно реплицироваться в клетке-хозяине, в которую его внедрили. В некоторых вариантах реализации вектор может встроиться в геном клетки-хозяина после внедрения в клетку-хозяина и благодаря этому реплицироваться вместе с геномом хозяина.

[00104] В некоторых вариантах реализации определенные векторы, которые в данной заявке называют "рекомбинантными векторами экспрессии" или "векторами экспрессии", могут направлять экспрессию генов, с которыми они функционально связаны. Полинуклеотидная последовательность является "функционально связанной", когда ее помещают в функциональную взаимосвязь с другой последовательностью нуклеотидов. Например, промотор или регуляторную последовательность ДНК называют "функционально связанными" с последовательностью ДНК, которая кодирует РНК и/или белок, если две указанные последовательности функционально связаны или расположены таким образом, что промотор или регуляторная последовательность ДНК влияет на уровень экспрессии кодирующей или структурной последовательности ДНК. Функционально связанные последовательности ДНК обычно, но не обязательно, контактируют.

[00105] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложен вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует пептид Chp, имеющий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; SEQ ID NO: 57; SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO: 63; SEQ ID NO: 64; SEQ ID NO: 65 и SEQ ID NO: 66 или их активных фрагментов.

[00106] В некоторых вариантах реализации вектор содержит молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует пептид Chp, имеющий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; SEQ ID NO: 57; SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO: 63; SEQ ID NO: 64; SEQ ID NO: 65 и SEQ ID NO: 66 или их активных фрагментов.

[00107] В некоторых вариантах реализации вектор содержит молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует пептид Chp, имеющий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; SEQ ID NO: 57; SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO: 63 и SEQ ID NO: 66 или их активных фрагментов, и в некоторых вариантах реализации вектор содержит молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует пептид Chp, имеющий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 54 или их активных фрагментов.

[00108] Как правило, можно использовать любую систему или вектор, подходящие для сохранения, размножения или экспрессии полипептида в хозяине, для экспрессии пептидов Chp, описанных в данной заявке, или их активных фрагментов. Подходящую последовательность ДНК/полинуклеотидную последовательность можно встроить в систему экспрессии с помощью любого из различных хорошо известных и обычных методик, таких как, например, методики, описанные в Sambrook и др., ред., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3е изд.), тома 1 - 3, Cold Spring Harbor Laboratory (2001). Кроме того, в пептиды Chp или их активные фрагменты также можно добавить метки, чтобы обеспечить удобные способы выделения, например, c-myc, биотин, поли-His и т.д. Наборы для таких систем экспрессии доступны для приобретения.

[00109] Для экспрессии полинуклеотидных последовательностей, кодирующих пептиды Chp, описанные в данной заявке, или их активные фрагменты, можно использовать большое разнообразие комбинаций хозяина/вектора экспрессии. Большое количество подходящих векторов известно специалистам в данной области техники и доступно для приобретения. Примеры подходящих векторов предложены, например, в Sambrook и др., ред., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3е изд.), тома 1 - 3, Cold Spring Harbor Laboratory (2001). Такие векторы включают, среди прочих, хромосомные, эписомные и полученные из вируса векторы, например, векторы, полученные из бактериальных плазмид, из бактериофага, из транспозонов, из эписом дрожжей, из инсерционных элементов, из хромосомных элементов дрожжей, из вирусов, таких как бакуловирусы, паповавирусы, такие как SV40, вирусов коровьей оспы, аденовирусов, вирусов оспы птиц, вирусов псевдобешенства и ретровирусов, и векторы, полученные из их комбинаций, такие как векторы, полученные из генетических элементов плазмиды и бактериофага, таких как космиды и фагмиды.

[00110] Более того, векторы могут обеспечивать конститутивную или индуцируемую экспрессию пептидов Chp или их активных фрагментов согласно настоящему описанию. Подходящие векторы включают, но не ограничены производными SV40 и известных бактериальных плазмид, например, плазмиды Е. coli colEI, pCRI, pBR322, рМВ9 и их производные, такие плазмиды как RP4, pBAD24 и pBAD-ТОРО; ДНК фагов, например, множество производных фага А, например, NM989, и ДНК других фагов, например, ДНК М13 и одноцепочечная ДНК нитевидного фага; плазмиды дрожжей, такие как плазмида 2D или ее производные; векторы, пригодные для эукариотических клеток, такие как векторы, пригодные для клеток насекомых или млекопитающих; векторы, полученные из комбинаций плазмид и ДНК фагов, такие как плазмиды, которые были модифицированы, чтобы использовать ДНК фага или другие контролирующие экспрессию последовательности; и тому подобные векторы. Множество упомянутых выше векторов доступны для приобретения от поставщиков, таких как New England Biolabs Inc., Addgene, Takara Bio Inc., ThermoFisher Scientific Inc., и т.д.

[00111] Кроме того, векторы могут содержать различные регуляторные элементы (включая промотор, сайт связывания рибосомы, терминатор, энхансер, различные цис-действующие элементы для контролирования уровня экспрессии), причем вектор конструируют в зависимости от клетки-хозяина. В данных векторах экспрессии полинуклеотидных последовательностей, кодирующих пептиды Chp или их активных фрагменты согласно настоящему описанию, можно использовать любую из большого разнообразия контролирующих экспрессию последовательностей (последовательностей, которые контролируют экспрессию полинуклеотидной последовательности, функционально связанной с ней). Пригодные контролирующие последовательности включают, но не ограничены перечисленными: ранний или поздний промоторы SV40, CMV, вируса осповакцины, вируса полиомы или аденовируса, систему lac, систему trp, систему ТАС, систему TRC, систему LTR, основные участки оператора и промотора фага А, контролирующие участки белка оболочки fd, промотор 3-фосфоглицераткиназы или других гликолитических ферментов, промоторы кислой фосфатазы (например, Pho5), промоторы факторов спаривания дрожжей, промотор Е, coli для экспрессии в бактериях и другие промоторные последовательности, которые, как известно, контролируют экспрессию генов прокариотических или эукариотических клеток или их вирусов, и различные комбинации перечисленных последовательностей. Как правило, полинуклеотидные последовательности, кодирующие пептиды Chp или их активные фрагменты, функционально связаны с гетерологичным промотором или регуляторным элементом.

[00112] В другом аспекте настоящего изобретения предложена клетка-хозяин, содержащая любой из векторов, описанных в данной заявке, включая векторы экспрессии, содержащие полинуклеотидные последовательности, кодирующие пептиды Chp или их активные фрагменты согласно настоящему описанию. Большое разнообразие клеток-хозяев пригодны для экспрессии полипептидов согласно настоящему изобретению. Неограничивающие примеры клеток-хозяев, подходящих для экспрессии полипептидов согласно настоящему изобретению, включают хорошо известные эукариотические и прокариотические хозяева, такие как штаммы Е. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, грибы, такие как дрожжи, и клетки животных, такие как клетки СНО, RI.I, B-W и L-M, клетки почки африканской зеленой мартышки (например, COS 1, COS 7, BSCI, BSC40 и ВМТ10), клетки насекомых (например, Sf9), и клетки человека и клетки растений в культуре. Хотя хозяином экспрессии может быть любая известная клетка хозяин экспрессии, в обычном варианте реализации хозяин экспрессии представляет собой один из штаммов Е, coli. Указанные штаммы включают, но не ограничены доступными для приобретения штаммами Е, coli, такими как Тор10 (ThermoFisher Scientific, Inc.), DH5a (Thermo Fisher Scientific, Inc.), XLI-Blue (Agilent Technologies, Inc.), SCSIIO (Agilent Technologies, Inc.), JM109 (Promega, Inc.), LMG194 (АТСС) и BL21 (Thermo Fisher Scientific, Inc.)

[00113] Есть несколько преимуществ применения Е. coli в качестве системы хозяина, включая: быструю кинетику роста, причем при оптимальных условиях окружающей среды ее время удвоения составляет приблизительно 20 мин (Sezonov и др., J, Bacterial. 189 8746-8749 (2007)), простоту получения культур с высокой плотностью, простую и быструю трансформацию экзогенной ДНК и т.д. Подробности, касающиеся экспрессии белка в Е. coli, включая селекцию плазмиды, а также селекцию штамма, подробно обсуждаются в Rosano, G. и Ceccarelli, Е., Front Microbial., 5: 172 (2014).

[00114] Эффективная экспрессия пептидов Chp согласно настоящему изобретению или их активных фрагментов зависит от различных факторов, таких как оптимальные сигналы экспрессии (на уровне как транскрипции, так и трансляции), правильная укладка белка и особенности роста клетки. В отношении способов конструирования вектора и способов трансдукции клетки-хозяина сконструированным рекомбинантным вектором можно применять обычные способы, известные в данной области. Хотя должно быть очевидно, что не все векторы, контролирующие экспрессию последовательности и хозяева будут одинаково хорошо функционировать в отношении экспрессии полинуклеотидных последовательностей, кодирующих пептиды Chp или их активные фрагменты согласно настоящему описанию, специалист в данной области техники сможет выбрать подходящие векторы, контролирующие экспрессию последовательности и хозяев без лишнего экспериментирования, чтобы осуществить желательную экспрессию, не отклоняясь от объема настоящего изобретения.

[00115] Пептиды Chp или их активные фрагменты согласно настоящему описанию можно выделить и очистить из рекомбинантных культур клеток с помощью хорошо известных способов, включая преципитацию сульфатом аммония или этанолом, экстрагирование кислотами, анионобменную или катионообменную хроматографию, хроматографию на фосфоцеллюлозе, хроматографию гидрофобных взаимодействий, аффинную хроматографию, хроматографию на гидроксиапатите и хроматографию на лектине. Высокоэффективную жидкостную хроматографию также можно применять для очистки пептида Chp.

[00116] В качестве альтернативы, векторная система, используемая для получения пептидов Chp или активных фрагментов согласно настоящему описанию, может представлять собой бесклеточную систему экспрессии. Различные бесклеточные системы экспрессии доступны для приобретения, включая, но не ограничиваясь системами, доступными от Promega, LifeTechnologies, Clonetech и т.д.

[00117] Как указано выше, когда возникает необходимость в получении и очистке белка, существует ряд альтернатив. Примеры подходящих способов и стратегий, которые будут рассматривать при получении и очистке белка, предложены в WO 2017/049233, которая полностью включена в данную заявку посредством ссылки, и дополнительно предложены в Structural Genomics Consortium и др., Nat. Methods., 5(2): 135-146 (2008).

Фармацевтические композиции.

[00118] Композициям согласно настоящему описанию можно придать форму растворов, суспензий, эмульсии, таблеток, пилюль, пеллет, капсул, содержащих жидкости капсул, порошков, составов с замедленным высвобождением, суппозиториев, эмульсий для применения на тампонах, аэрозолей, спреев, суспензий, пастилок, троше, леденцов, инъекционных средств, жевательных резинок, мазей, смазок, пластырей с замедленным высвобождением, пропитанных жидкостью салфеток и их комбинаций.

[00119] Введение композиций согласно настоящему описанию или их фармацевтически приемлемых форм может быть топическим, т.е., фармацевтическую композицию можно нанести непосредственно на то место, где требуется ее действие (например, непосредственно на рану), или системным. В свою очередь, системное введение может быть энтеральным или пероральным, т.е., композицию можно вводить через пищеварительный тракт, парентеральным, т.е., композицию можно вводить путями, отличными от пищеварительного тракта, например, путем инъекции или ингаляции. Таким образом, пептиды Chp согласно настоящему описанию и композиции, содержащие их, можно вводить субъекту перорально, парентерально, посредством ингаляции, топически, ректально, назально, буккально, через имплантированный резервуар или с помощью любого другого известного способа. Пептиды Chp согласно настоящему описанию, или их активные фрагменты, также можно вводить посредством лекарственных форм с замедленным высвобождением.

[00120] Для перорального введения пептиды Chp согласно настоящему описанию или их активные фрагменты можно включить в состав твердых или жидких препаратов, например, таблеток, капсул, порошков, растворов, суспензий и дисперсий. В состав композиции можно включить вспомогательные вещества, такие как, например, лактоза, сахароза, кукурузный крахмал, желатин, картофельный крахмал, альгиновая кислота и/или стеарат магния.

[00121] Для получения твердых композиций, таких как таблетки и пилюли, пептид Chp согласно настоящему описанию или его активный фрагмент можно смешать с фармацевтическим вспомогательным веществом с получением твердой композиции, которой еще не придали лекарственную форму. При желании таблетки можно покрыть сахаром или покрыть кишечнорастворимой оболочкой с помощью стандартных методик. Таблетки или пилюли можно покрыть или другим способом смешать с получением лекарственной формы, дающей преимущество пролонгированного действия. Например, таблетка или пилюля может содержать компонент с внутренней дозировкой и компонент с наружной дозировкой, последний представляет собой оболочку над первым. Два указанных компонента можно разделить кишечнорастворимым слоем, который служит для препятствования разрушению в желудке и позволяет внутреннему компоненту пройти неповрежденным в двенадцатиперстную кишку или замедлить его высвобождение. Для таких кишечнорастворимых слоев или покрытий можно применять различные материалы, такие материалы включают множество полимерных кислот и смесей полимерных кислот с такими материалами как шеллак, цетиловый спирт и ацетат целлюлозы.

[00122] Композиции для топического применения согласно настоящему описанию могут дополнительно содержать фармацевтически или физиологически приемлемый носитель, такой как носитель, приемлемый для дерматологии или для введения в ухо. Такие носители, в случае дерматологически приемлемых носителей, могут быть совместимы с кожей, ногтями, слизистыми оболочками, тканями и/или волосами, и могут включать любой обычно применяемый дерматологический носитель, удовлетворяющий данным требованиям. В случае носителей, приемлемых для введения в ухо, указанный носитель может быть совместим со всеми отделами уха. Такие носители может легко выбрать средний специалист в данной области. Носители для топического введения композиций согласно настоящему описанию включают, но не ограничены перечисленными: минеральное масло, жидкую нефть, белый вазелин, пропиленгликоль, соединения полиоксиэтилена и/или полиоксипропилена, эмульсионный воск, сорбитанмоностеарат, полисорбат 60, воск цетиловых эфиров, цетеариловый спирт, 2-октилдодеканол, бензиловый спирт и воду. При составлении мазей для кожи активные компоненты согласно настоящему описанию могут входить в состав, например, содержащий маслянистую углеводородную основу, безводную абсорбирующую основу, абсорбирующую основу типа вода в масле, смываемую водой основу типа масло в воде и/или водорастворимую основу. При составлении композиций для введения в ухо активные компоненты согласно настоящему описанию могут входить в состав, например, содержащий водную полимерную суспензию, включая такие носители как декстраны, полиэтиленгликоли, поливинилпирролидон, полисахаридные гели, геллановые камеди, такие как гельрит®, целлюлозные полимеры, такие как гидроксипропилметилцеллюлоза, и карбоксисодержащие полимеры, такие как полимеры или сополимеры акриловой кислоты, а также другие полимерные мягчительные средства. Композиции для топического применения согласно настоящему описанию могут находиться в любой форме, подходящей для топического применения, включая водные, водно-спиртовые или масляные растворы; дисперсионные лосьоны или сыворотки; водные, безводные или масляные гели; эмульсии, полученные путем диспергирования жирной фазы в водной фазе (М/В, или масло в воде) или наоборот (В/М, или вода в масле); микроэмульсии или, в качестве альтернативы, микрокапсулы, микрочастицы или дисперсии липосом ионного и/или неионного типа; кремы; лосьоны; гели; пены (для которых могут применять емкость под давлением, подходящий аппликатор, эмульгатор и инертный пропеллент); эссенции; молочко; суспензии и пластыри. Композиции для топического применения согласно настоящему описанию также могут содержать адъюванты, такие как гидрофильные или липофильные желатинирующие агенты, гидрофильные или липофильные активные агенты, консервирующие агенты, антиоксиданты, растворители, отдушки, наполнители, фотозащитные фильтры, поглотители запахов и красящие вещества. В дополнительном аспекте композиции для топического применения, описанные в данной заявке, можно вводить в сочетании с такими приспособлениями как трансдермальные пластыри, повязки, прокладки, обмотки, матрицы и бинты, которые способны держаться на коже или другим образом быть связаны с кожей или другой тканью субъекта, которые способны доставлять терапевтически эффективное количество одного или более пептидов Chp или их активных фрагментов, описанных в данной заявке.

[00123] В одном варианте реализации композиции для топического применения согласно настоящему описанию дополнительно содержат один или более компонентов, используемых для лечения топических ожогов. Такие компоненты могут включать, но не ограничены перечисленными: пропиленгликолевый гидрогель; комбинацию гликоля, целлюлозного производного и водорастворимой соли алюминия; антисептик; антибиотик и кортикостероид. Также можно добавить увлажнители, такие как твердые или жидкие восковые эфиры; стимуляторы всасывания, такие как гидрофильные глины или крахмалы; загущающие агенты и защищающие кожу агенты. Составы для топического применения могут быть в форме ополаскивателей, таких как ополаскиватель для полости рта. См., например, WO2004/004650.

[00124] Композиции согласно настоящему описанию также можно вводить путем инъекции терапевтического агента, содержащего подходящее количество пептида Chp или его активного фрагмента и носитель. Например, пептид Chp или его активный фрагмент можно вводить внутримышечно, интратекально, субдермально, подкожно или внутривенно для лечения инфекций грамотрицательными бактериями, таких как инфекции, вызванные P. aeruginosa. Носитель может состоять из дистиллированной воды, солевого раствора, альбумина, сыворотки или любой их комбинации. Кроме того, фармацевтические композиции для парентеральных инъекций могут содержать фармацевтически приемлемые водные или неводные растворы пептидов Chp, описанных в данной заявке, или их активных фрагментов дополнительно к одному или более из следующих компонентов: рН-буферные растворы, адъюванты (например, консерванты, смачивающие агенты, эмульгирующие агенты и диспергирующие агенты), липосомальные составы, наночастицы, дисперсии, суспензии или эмульсии, а также стерильные порошки для растворения в стерильных инъецируемых растворах или дисперсиях непосредственно перед применением.

[00125] В случаях, когда выбранным способом введения является парентеральная инъекция, можно применять изотонический состав. Как правило, вспомогательные вещества для изотоничности могут включать хлорид натрия, декстрозу, маннит, сорбит и лактозу. В некоторых случаях изотонические растворы, такие как фосфатно-солевой буферный раствор, являются предпочтительными. Стабилизаторы могут включать желатин и альбумин. В состав можно добавить сосудосуживающий агент.Фармацевтические препараты, соответствующие данному типу применения, могут быть предложены стерильными и апирогенными.

[00126] Разбавитель может дополнительно содержать одно или более других вспомогательных веществ, таких как этанол, пропиленгликоль, масло или фармацевтически приемлемый эмульгатор или поверхностно-активное вещество.

[00127] В другом варианте реализации композиции согласно настоящему описанию представляют собой композиции для ингаляции. Композиции для ингаляции согласно настоящему описанию могут дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель. В одном варианте реализации пептиды Chp согласно настоящему описанию или их активные фрагменты могут входить в состав в виде сухого порошка для ингаляции. В конкретных вариантах реализации раствор для ингаляции, содержащий пептиды Chp или их активные фрагменты, может дополнительно входить в состав с пропеллентом для аэрозольной доставки. В некоторых вариантах реализации растворы могут быть распыляемыми.

[00128] Поверхностно-активное вещество можно добавить в ингаляционную фармацевтическую композицию согласно настоящему описанию, чтобы уменьшить поверхностное и межфазное натяжение между лекарственными средствами и пропеллентом. Если лекарственные средства, пропеллент и вспомогательное вещество находятся в форме суспензии, можно использовать или не использовать поверхностно-активное вещество. Если из лекарственных средств, пропеллента и вспомогательного вещества нужно получить раствор, то можно использовать или не использовать поверхностно-активное вещество, в зависимости, например, от растворимости конкретного лекарственного средства и вспомогательного вещества. Поверхностно-активное вещество может представлять собой любое подходящее нетоксичное соединение, которое не вступает в реакцию с лекарственным средством и которое уменьшает поверхностное натяжение между лекарственным средством, вспомогательным веществом и пропеллентом и/или действует как смазка для клапана.

[00129] Примеры подходящих поверхностно-активных веществ включают, но не ограничены перечисленными: олеиновую кислоту; сорбитантриолеат; цетилпиридиния хлорид; соевый лецитин; полиоксиэтилен (20) сорбитанмонолаурат; полиоксиэтилен (10) стеариловый эфир; полиоксиэтилен (2) олеиловый эфир; блок-сополимеры полиоксипропилен-полиоксиэтилен-этилендиамин; полиоксиэтилен (20) сорбитанмоностеарат; полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат; блок-сополимеры полиоксипропилен-полиоксиэтилен; этоксилат касторового масла и их комбинации.

[00130] Примеры подходящих пропеллентов включают, но не ограничены перечисленными: дихлордифторметан, трихлорфторметан, дихлортетрафторэтан и диоксид углерода.

[00131] Примеры подходящих вспомогательных веществ для применения в композициях для ингаляции включают, но не ограничены перечисленными: лактозу, крахмал, пропиленгликолевые диэфиры среднецепочечных жирных кислот; сложные эфиры триглицериды среднецепочечных жирных кислот, с короткими цепями или длинными цепями, или любую их комбинацию; перфтордиметилциклобутан; перфторциклобутан; полиэтиленгликоль; ментол; лаурогликоль; моноэтиловый эфир диэтиленгликоля; полигликолизированные глицериды среднецепочечных жирных кислот; спирты; эвкалиптовое масло; короткоцепочечные жирные кислоты и их комбинации.

[00132] В некоторых вариантах реализации предложены назальные применения композиций согласно настоящему описанию. Назальные применения включают непосредственное применение, например, назальные спреи, назальные капли, назальные мази, растворы для промывания носа, растворы для инъекции в нос, назальные тампоны, бронхиальные спреи и ингаляционные составы, а также опосредованное применение, например, в виде пастилок для рассасывания и средств для полоскания полости рта или горла, или посредством применения мазей, которые наносят на ноздри или лицо, и любой комбинации данных и аналогичных способов применения.

[00133] В другом варианте реализации фармацевтические композиции согласно настоящему описанию содержат дополняющий агент, включая один или более противомикробных агентов и/или один или более обычных антибиотиков. Для того чтобы ускорить лечение инфекции или усилить антибактериальное действие, терапевтический агент, содержащий пептид Chp согласно настоящему описанию или его активный фрагмент, может дополнительно содержать по меньшей мере один дополняющий агент, который также может усиливать бактерицидную активность пептида. Дополняющий агент может представлять собой один или более антибиотиков, применяемых для лечения инфекции грамотрицательными бактериями. В одном варианте реализации дополняющий агент представляет собой антибиотик или противомикробный агент, применяемый для лечения инфекций, вызванных Р. aeruginosa.

[00134] Композиции согласно настоящему описанию могут быть представлены в единичной лекарственной форме, и их можно получить с помощью любых способов, хорошо известных в данной области. Количество активных ингредиентов, которое можно объединить с материалом носителя для получения разовой лекарственной формы, будет изменяться, например, в зависимости от хозяина, которого лечат, длительности воздействия инфекционных бактерий на реципиента, размера и массы тела субъекта и конкретного способа введения. Количество активных ингредиентов, которое можно объединить с материалом носителя для получения разовой лекарственной формы, например, может представлять собой такое количество каждого соединения, которое оказывает терапевтическое действие. В некоторых вариантах реализации из ста процентов общее количество может находиться в диапазоне от приблизительно 1 процента до приблизительно девяноста девяти процентов активных ингредиентов, например, от приблизительно 5 процентов до приблизительно 70 процентов, или от приблизительно 10 процентов до приблизительно 30 процентов.

Дозировка и введение.

[00135] Вводимые дозы зависят от множества факторов, включая активность инфекции, лечение которой проводят; возраст, состояние здоровья и общее физическое состояние субъекта, лечение которого проводят; активность конкретного пептида Chp или его активного фрагмента; природу и активность антибиотика, при его наличии, с которым объединяют пептид Chp или его активный фрагмент согласно настоящему описанию; и суммарный эффект такого сочетания. В некоторых вариантах реализации эффективные количества пептида Chp или его активного фрагмента, которые будут вводить, могут находиться в диапазоне от приблизительно 1 - 50 мг/кг (или от 1 до 50 мкг/мл). В некоторых вариантах реализации пептид Chp или его активный фрагмент можно вводить 1 - 4 раза ежедневно в течение периода в диапазоне от 1 до 14 дней. Антибиотик, если его также применяют, будут вводить в стандартных схемах введения доз или в меньших количествах с учетом наличия какого-либо синергизма. Тем не менее, все такие дозировки и схемы приема (либо пептида Chp или его активного фрагмента, либо любого антибиотика, который будут вводить в сочетании с ним) подлежат оптимизации. Оптимальные дозировки можно определить путем проведения пробных экспериментов по определению эффективности in vitro и in vivo, которые находятся в рамках компетенции в данной области техники, но с учетом настоящего изобретения.

[00136] Предполагается, что пептиды Chp, описанные в данной заявке, или их активные фрагменты могут оказать быстрое бактерицидное действие и, когда их применяют в количествах ниже МПК, могут оказать бактериостатическое действие. Дополнительно предполагается, что пептиды Chp, описанные в данной заявке, или их активные фрагменты могут быть активны против ряда устойчивых к антибиотикам бактерий и могут быть не связаны с развитием устойчивости. На основании настоящего описания, в условиях клиники, пептиды Chp или их активные фрагменты согласно настоящему изобретению могут представлять собой эффективную альтернативу (или дополнение) лечению инфекций, возникающих из устойчивых к лекарственному средству и к нескольким лекарственным средствам бактерий, отдельно или вместе с антибиотиками (включая антибиотики, к которым развилась устойчивость). Полагают, что существующие механизмы устойчивости грамотрицательных бактерий не влияют на чувствительность к литической активности пептидов Chp согласно настоящему изобретению или их активных фрагментов.

[00137] В некоторых вариантах реализации время воздействия пептидов Chp, описанных в данной заявке, или их активных фрагментов может влиять на необходимую концентрацию единиц активного пептида на мл. Носители, которые классифицированы как носители с "длительным" или "замедленным" высвобождением (такие как, например, некоторые назальный спреи или пастилки), могут содержать или предоставлять меньшую концентрацию единиц пептида на мл, но на протяжении более длительного периода времени, тогда как носитель с "коротким" или "быстрым" высвобождением (такой как, например, жидкость для полоскания горла) может содержать или предоставлять высокую концентрацию единиц пептида (мкг) на мл, но на протяжении более короткого периода времени. Существуют обстоятельства, при которых может быть необходима большая дозировка в единицах/мл или меньшая дозировка в единицах/мл.

[00138] Для пептидов Chp или их активных фрагментов согласно настоящему описанию терапевтически эффективную дозу можно сначала оценить либо в анализах на культуре клеток, либо в моделях на животных, обычно, на мышах, кроликах, собаках или свиньях. Модель на животных также можно применять для достижения желательного диапазона концентраций и пути введения. Полученную информацию затем можно использовать для определения эффективных доз, а также путей введения у людей. Дозировку и введение можно дополнительно скорректировать для предоставления достаточных уровней активного ингредиента или для поддержания желаемого эффекта. Дополнительные факторы, которые можно учитывать, включают тяжесть болезненного состояния; возраст, массу тела и пол пациента; режим питания; желательную длительность лечения; способ введения; время и частоту введения; комбинации лекарственных средств; аллергические реакции; переносимость/ответ на терапию и решение лечащего врача.

[00139] Схема лечения может включать ежедневное введение (например, один раз, два раза, три раза и т.д. в день), введение через день (например, один раз, два раза, три раза и т.д. через день), два раза в неделю, один раз в неделю, один раз в две недели, один раз в месяц и т.д. В одном варианте реализации настоящего изобретения лечение можно вводить в виде непрерывной инфузии. Единичные дозы можно вводить многократно. Интервалы также могут быть неравномерными, в зависимости от отслеживаемых клинических симптомов. В качестве альтернативы, единичную дозу можно вводить в виде состава с замедленным высвобождением, и в данном случае можно использовать менее частое введение. Дозировка и частота могут изменяться в зависимости от пациента. Специалист в данной области техники поймет, что такие руководства будут скорректированы для локализованного введения, например, интраназального, ингаляционного, ректального и т.д., или для системного введения, например, перорального, ректального (например, через клизму), внутримышечного (в/м), интраперитонеального (и/п), внутривенного (в/в), подкожного (п/к), трансуретального и т.п.

Способы.

[00140] Пептиды Chp и их активные фрагменты согласно настоящему описанию можно применять in vivo, например, для лечения бактериальных инфекций, вызванных грамотрицательными бактериями, такими как P. aeruginosa, у субъекта, а также in vitro, например, чтобы снизить уровень бактериальной контаминации, например, на поверхности, например, медицинского устройства.

[00141] Например, в некоторых вариантах реализации пептиды Chp или их активные фрагменты согласно настоящему изобретению можно применять для предотвращения, контролирования, разрушения и лечения бактериальных биопленок, образованных грамотрицательными бактериями. Образование биопленки происходит, когда микробные клетки сцепляются друг с другом и окружаются матриксом внеклеточного полимерного вещества (EPS) на поверхности. Рост микробов в такой защищенной окружающей среде, которая обогащена биомакромолекулами (например, полисахаридами, нуклеиновыми кислотами и белками) и питательными веществами позволяет улучшенный обмен сигналами между микробами и повышенную вирулентность. Биопленка может образоваться в любой поддерживающей окружающей среде, включая живые и неживые поверхности, такие как слизистые пробки легкого больного муковисцидозом (MB), контаминированные катетеры, контактные линзы и т.д. (Sharma и др. Biologicals, 42(1):1-7 (2014), который полностью включен в данную заявку посредством ссылки). Таким образом, в одном варианте реализации пептиды Chp или их активные фрагменты согласно настоящему описанию можно применять для предотвращения, контролирования, прерывания и лечения бактериальных инфекций, обусловленных грамотрицательными бактериями, когда бактерии защищены бактериальной биопленкой.

[00142] В одном аспекте настоящего изобретения предложен способ лечения бактериальной инфекции, вызванной одной или более дополнительными грамотрицательными бактериями, описанными в данной заявке, включающий введение субъекту, у которого диагностирована, есть риск развития или проявляются симптомы бактериальной инфекции, фармацевтической композиции, описанной в данной заявке.

[00143] Подразумевают, что термины "инфекция" и "бактериальная инфекция" включают инфекции дыхательных путей (ИДП), такие как инфекции дыхательных путей у пациентов с муковисцидозом (MB), инфекции нижних дыхательных путей, такие как острые приступы хронического бронхита (ОПХБ), острый синусит, внебольничная пневмония (ВБП), больничная пневмония (БП) и нозокомиальные инфекции дыхательных путей; заболевания, передающиеся половым путем, такие как гонококковый цервицит и гонококковый уретрит; инфекции мочевыводящих путей; острое воспаление среднего уха; сепсис, включая сепсис новорожденных и катетер-ассоциированный сепсис; и остеомиелит.Также предусмотрены инфекции, вызванные устойчивыми к лекарственным средствам бактериями и бактериями с множественной лекарственной устойчивостью.

[00144] Неограничивающие примеры инфекций, вызванных грамотрицательными бактериями, такими как P. aeruginosa, включают: А) нозокомиальные инфекции: 1. инфекции дыхательных путей особенно у пациентов с муковисцидозом и у пациентов на искусственной вентиляции легких; 2. бактериемию и сепсис; 3. раневые инфекции, особенно у пациентов с ожогами; 4. инфекции мочевыводящих путей; 5. послеоперационные инфекции на инвазивных устройствах; 6. эндокардит в результате внутривенного введения зараженных растворов лекарственных средств; 7. инфекции у пациентов с синдромом приобретенного иммунодефицита, химиотерапией рака, терапией стероидами, гематологическими злокачественными новообразованиями, трансплантацией органов, заместительной почечной терапией и другими состояниями с тяжелой нейтропенией; В) внебольничные инфекции: 1. внебольничные инфекции дыхательных путей; 2. менингит; 3. фолликулит и инфекции наружного слухового прохода, вызванные зараженной водой; 4. злокачественный наружный отит у пожилых и диабетиков; 5. остеомиелит пяточной кости у детей; 6. инфекции глаз, обычно связанные с зараженной контактной линзой; 7. кожные инфекции, такие как инфекции ногтей у людей, чьи руки часто контактируют с водой; 8. инфекции желудочно-кишечного тракта; и 9. инфекции костно-мышечной системы.

[00145] Один или более видов грамотрицательных бактерий согласно способам настоящего изобретения может включать любой из видов грамотрицательных бактерий, описанных в данной заявке. Обычно дополнительные виды грамотрицательных бактерий выбраны из одного или более из перечисленных: Acinetobacter baumannii, Acinetobacter haemolyticus, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Aeromonas hydrophila, видов Bacteroides, таких как Bacteroides fragilis, Bacteroides theataioatamicron, Bacteroides distasonis, Bacteroides ovatus, Bacteroides vuigatus, Bartonella Quintana, Bordetella pertussis, видов Brucella, таких как Brucella melitensis, видов Burkhoideria, таких как Burkhoideria cepacia, Burkhoideria pseudomallei и Burkhoideria mallei, Fusobacterium, Prevotella corporis, Prevotella intermedia, Prevotella endodontalis, Porphyromonas asaccharolytica, Campylobacter jejuni, Campylobacter fetus, Campylobacter coli, видов Chlamydia, таких как Chlamydia pneumoniae и Chlamydia trachomatis, Citrobacter freundii, Citrobacter koseri, Coxiella burnetii, видов Edwarsiella, таких как Edwarsiella tarda, Eikenella corrodens, видов Enterobacter, таких как Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes и Enterobacter agglomerans, Escherichia coli, Francisella tularensis, Haemophilus influenzae, Haemophilus ducreyi, Helicobacter pylori, Kingella kingae, видов Klebsiella, таких как Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Klebsiella rhinoscleromatis и Klebsiella ozaenae, Legionella penumophila, видов Moraxella, таких как Moraxella catarrhalis, видов Morganella, таких как Morganella morganii, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, P. aeruginosa, Pasteurella multocida, Plesiomonas shigelloides, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Proteus penneri, Proteus myxofaciens, видов Providencia, таких как, Providencia stuartii, Providencia rettgeri, Providencia alcalifaciens, Pseudomonas fluorescens, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Salmonella paratyphi, видов Serratia, таких как Serratia marcescens, видов Shigella, таких как Shigella flexneri, Shigella boydii, Shigella sonnei и Shigella dysenteriae, Stenotrophomonas maltophilia, Streptobacillus moniliformis, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, Vibrio alginolyticus, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Ricketsia prowazekii, Coxiella burnetii, Ehrlichia chafeensis и/или Bartonella hensenae.

[00146] Чаще по меньшей мере один другой вид грамотрицательных бактерий выбран из одного или более из перечисленных: Acinetobacter baumannii, Bordetella pertussis, Burkhoideria cepacia, Burkhoideria pseudomallei, Burkhoideria mallei, Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, Francisella tularensis, Haemophilus influenzae, Haemophilus ducreyi, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Legionella penumophila, Moraxella catarrhalis, Morganella morganii, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pasteurella multocida, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Salmonella typhi, Serratia marcescens, Shigella flexneri, Shigella boydii, Shigella sonnei, Shigella dysenteriae, Stenotrophomonas maltophilia, Vibrio cholerae и/или Chlamydia pneumoniae.

[00147] Еще чаще по меньшей мере один другой вид грамотрицательных бактерий выбран из одного или более из перечисленных: Salmonella typhimurium, Salmonella typhi, видов Shigella, Escherichia coli, Acinetobacter baumanii, Klebsiella pneumonia, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitides, видов Serratia, Proteus mirabilis, Morganella morganii, видов Providencia, видов Edwardsiella, видов Yersinia, Haemophilus influenza, Bartonella quintana, видов Brucella, Bordetella pertussis, видов Burkhoideria, видов Moraxella, Francisella tularensis, Legionella pneumophila, Coxiella burnetii, видов Bacteroides, видов Enterobacter и/или видов Chlamydia.

[00148] Еще чаще по меньшей мере один другой вид грамотрицательных бактерий выбран из одного или более из перечисленных: видов Klebsiella, видов Enterobacter, Escherichia coli, Citrobacter freundii, Salmonella typhimurium, Yersinia pestis и/или Franciscella tulerensis.

[00149] В некоторых вариантах реализации инфекция грамотрицательными бактериями приводит к локализованной инфекции, такой как топическая бактериальная инфекция, например, раны на коже. В других вариантах реализации бактериальная инфекция представляет собой системную патогенную бактериальную инфекцию. Обычные грамотрицательные патогены и связанные с ними инфекции приведены в таблице А настоящего описания. Подразумевается, что они служат примерами бактериальных инфекций, которые можно лечить, уменьшать или предотвращать с помощью пептидов Chp и их активных фрагментов согласно настоящему изобретению, и не являются ограничивающими.

[00150] В некоторых вариантах реализации пептиды Chp и их активные фрагменты согласно настоящему описанию применяют для лечения субъекта, имеющего риск получить инфекцию, обусловленную грамотрицательными бактериями. Субъекты, имеющие риск получить грамотрицательную бактериальную инфекцию, включают, например, пациентов с муковисцидозом, пациентов с нейтропенией, пациентов с некротизирующим энтероколитом, пациентов с ожогами, пациентов с раневыми инфекциями и, в более общем смысле, пациентов в больничных условиях, в частности, хирургических пациентов и пациентов, которых лечат с применением имплантируемого медицинского устройства, такого как катетер, например, центральный венозный катетер, устройство Хикмана или электрофизиологические кардиоустройства, например, кардиостимуляторы и имплантируемые дефибрилляторы. Другие группы пациентов с риском инфицирования грамотрицательными бактериями включают, без ограничения, пациентов с имплантированными протезами, например, с полной заменой сустава (например, полной заменой колена или бедра).

[00151] В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ предотвращения или лечения бактериальной инфекции, включающий совместное введение субъекту, у которого диагностирована, есть риск развития или проявляются симптомы бактериальной инфекции, комбинации первого эффективного количества композиции, содержащей эффективное количество пептида Chp или его активного фрагмента, описанного в данной заявке, и второго эффективного количества антибиотика, подходящего для лечения грамотрицательной бактериальной инфекции.

[00152] Пептиды Chp и их активные фрагменты согласно настоящему описанию можно вводить совместно с антибиотиками стандарта лечения или с антибиотиками крайней меры, отдельно или в различных комбинациях, что находится в рамках компетенции в данной области. Обычные антибиотики, применяемые против Р. Aeruginosa, описаны в таблице В. Антибиотики для других грамотрицательных бактерий, таких как виды Klebsiella, виды Enterobacter, Escherichia coli, Citrobacter freundii, Salmonella typhimurium, Yersinia pestis и Franciscella tulerensis, сходны с таковыми, предложенными в таблице В для P. aeruginosa.

[00153] В более конкретных вариантах реализации антибиотик выбран из одного или более из перечисленных: цефтазидим, цефепим, цефоперазон, цефтобипрол, ципрофлоксацин, левофлоксацин, аминогликозиды, имипенем, меропенем, дорипенем, гентамицин, тобрамицин, амикацин, пиперациллин, тикарциллин, пенициллин, рифампицин, полимиксин В и колистин.

[00154] Комбинирование пептидов Chp или их активных фрагментов согласно настоящему описанию с антибиотиками обеспечивает эффективную антибактериальную схему лечения. В некоторых вариантах реализации совместное введение пептидов Chp или их активных фрагментов согласно настоящему описанию с одним или более антибиотиками можно осуществить при более низких дозах и количествах либо пептидов Chp или их активных фрагментов, либо антибиотика, либо обоих, и/или с меньшей частотой и/или продолжительностью лечения с улучшенной бактерицидной и бактериостатической активностью, пониженным риском устойчивости к антибиотику и с пониженным риском вредных неврологических или почечных побочных действий (таких как связанные с применением колистина или полимиксина В). Предшествующие исследования показали, что общая совокупная доза колистина связана с повреждением почки, позволяя предложить, что снижение дозировки или сокращение продолжительности лечения с применением комбинированной терапии пептидами Chp или их активными фрагментами может снизить частоту возникновения нефротоксичности (Spapen и др. Ann Intensive Care, 1: 14 (2011), который полностью включен в данную заявку посредством ссылки). В данной заявке термин "сниженная доза" относится к дозе одного активного ингредиента в комбинации по сравнению с монотерапией тем же активным ингредиентом. В некоторых вариантах реализации доза пептидов Chp или их активных фрагментов или антибиотика в комбинации может быть субоптимальной или даже подпороговой по сравнению с соответствующей монотерапией.

[00155] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложен способ повышения антибиотической активности одного или более антибиотиков против грамотрицательных бактерий по сравнению с активностью указанных антибиотиков, применяемых отдельно, путем введения субъекту пептидов Chp или их активных фрагментов, описанных в данной заявке, вместе с интересующим антибиотиком. Указанная комбинация эффективна против бактерий и позволяет преодолеть устойчивость к антибиотику и/или применять антибиотик при более низких дозах, снижая нежелательные побочные действия, такие как нефротоксическое и нейротоксическое действие полимиксина В.

[00156] Пептиды Chp или их активные фрагменты, необязательно в комбинации с антибиотиками согласно настоящему описанию, можно дополнительно комбинировать с дополнительными агентами, пермеабилизующими наружную мембрану грамотрицательных бактерий, включая, но не ограничиваясь перечисленными: металлохелаты, такие как, например, ЭДТА, трис, молочную кислоту, лактоферрин, полимиксины, лимонную кислоту (Vaara М. Microbial Rev, 56(3):395-441 (1992), который полностью включен в данную заявку посредством ссылки).

[00157] В другом дополнительном аспекте настоящего изобретения предложен способ ингибирования роста, или сокращения популяции, или уничтожения по меньшей мере одного вида грамотрицательных бактерий, указанный способ включает приведение в контакт бактерий с композицией, содержащей эффективное количество пептида Chp или его активного фрагмента, описанного в данной заявке, причем указанный пептид Chp или его активный фрагмент ингибирует рост, или сокращает популяцию, или уничтожает по меньшей мере один вид грамотрицательных бактерий.

[00158] В некоторых вариантах реализации ингибирование роста, или сокращение популяции, или уничтожение по меньшей мере одного вида грамотрицательных бактерий включает приведение в контакт бактерий с пептидами Chp или активными фрагментами, описанными в данной заявке, причем указанные бактерии присутствуют на поверхности, например, медицинских устройств, полов, лестниц, стен и столешниц в больницах и других учреждениях здравоохранения или зданиях общественного пользования, и на поверхностях оборудования в операционных, пунктах неотложной помощи, палатах, клинике и санитарных узлах, и тому подобных помещений.

[00159] Примеры медицинских устройств, которые можно защитить, применяя пептиды Chp или их активные фрагменты, описанные в данной заявке, включают, но не ограничены трубками и другими медицинскими изделиями, контактирующими с поверхностью тела человека, такими как мочевые катетеры, катетеры для отбора слизи, катетеры для аспирации, пупочные катетеры, контактные линзы, внутриматочные устройства, внутривлагалищные и внутрикишечные устройства, эндотрахеальные трубки, бронхоскопы, зубные протезы и ортодонтические устройства, хирургические устройства, стоматологические устройства, трубки, стоматологические линии подачи воды, ткани, бумагу, индикаторные полоски (например, бумажные индикаторные полоски или пластиковые индикаторные полоски), клеи (например, гидрогелевые клеи, термоплавкие клеи или клеи на основе растворителя), бинты, тканевые повязки или заживляющие устройства и окклюзионные пластыри, и любые другие изделия, контактирующие с поверхностью тела человека, которые применяют в области медицины. Указанные устройства могут включать электроды, эктопротезы, фиксирующие ленты, компрессионные бинты и различные типы устройств мониторинга. Медицинские устройства также могут включать любое устройство, которое можно поместить в место введения или имплантации, такое как кожа около места введения или имплантации, и которое может содержать по меньшей мере одну поверхность, которая поддается колонизации грамотрицательными бактериями.

Примеры

Материалы и методы

[00160] Бактериальные штаммы и условия роста. Большую часть исследований, описанных в данной заявке, провели, применяя устойчивый к карбапенамам P. aeruginosa клинический изолят CFS-1292, полученный из крови человека в Больнице специальной хирургии в Нью-Йорке (предоставлен доктором Lars Westblade, профессором кафедры Патологической анатомии и Лабораторной медицины), но также можно применять доступные для приобретения устойчивые к антибиотикам изоляты. Все другие изоляты получали либо из Американской коллекции типовых культур ("АТСС"), либо из коллекции д'Эрелля ("HER"), либо из репозитория BEI Resources ("НМ"), либо из Больницы специальной хирургии в Нью-Йорке ("HSS"). Изоляты культивировали и исследовали в любых из следующих сред: лизогенном бульоне (LB; Sigma-Aldrich), средах на основе казаминокислоты (КАК) (5 г/л казаминокислоты, Ameresco/VWR; 5,2 мМ K₂HPO₄, Sigma-Aldrich; 1 мМ MgSO₄, Sigma-Aldrich), КАК, дополненной 100 мМ NaCl, или КАК, дополненной 2,5% сывороткой человека (типа АВ, мужская, объединенная; Sigma-Aldrich). Все антибиотики и белковые реагенты (например, лизоцим Т4) получали от Sigma-Aldrich, если не указано иное.

[00161] Биоинформационные исследования. Все белки идентифицировали в аннотированных записях базы данных GenBank для всех геномов Microviridae и Leviviridae. Номер доступа для каждого пептида группы Chp указан ниже в таблицах 1 и 2. Анализ Blastp проводили, используя сервер UniProt, доступный по адресу uniprot.org/blast/. Предсказания вторичной структуры белков осуществляли, применяя JPRED4, доступный по адресу www.compbio.dundee.ac.uk/jpred/index, и I-Tasser, доступный по адресу www.zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/. Филогенетический анализ проводили, применяя программу для множественного выравнивания последовательностей ClustalW, доступную по адресу www.genome.jp/tools-bin/clustalw. Предсказанные молекулярные массы и изоэлектрические точки определяли, используя ресурсный портал ExPASy, доступный по адресу web.expasy.org/compute_pi/.

[00162] Определение минимальных ингибиторных концентраций (МПК). Значения МПК определяли, используя модификацию стандартного рекомендованного способа микроразведения в бульоне, описанного Институтом клинических и лабораторных стандартов (CLSI) (2015. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard, 10ое издание. Институт клинических и лабораторных стандартов, Уэйн, Пенсильвания). Модификация была основана на замене среды Мюллера-Хинтона, в некоторых случаях, либо на среды КАК (с NaCl и без), либо на КАК, дополненную 2,5% сывороткой человека. В данной заявке МПК представляет собой минимальную концентрацию пептида, достаточную для подавления по меньшей мере 80% бактериального роста по сравнению с контролем.

[00163] Определение минимальных разрушающих биопленку концентраций (МРБК). Значения МРБК определяли, используя вариант метода микроразведений в бульоне для определения МПК с модификациями (Ceri Н и др., 1999. J Clin Microbiol 37:1771-1776; и Schuch R и др., 2017. Antimicrob Agents Chemother 61). Свежие колонии штамма АТСС 17647 P. aeruginosa суспендировали в ФБР (0,5 единиц МакФарланда), разбавляли 1:100 в LB с 0,2% глюкозой, добавляли в виде аликвот объемом 0,15 мл в каждую лунку 96-луночного устройства Калгари для выращивания биопленок (Innovotech) и инкубировали в течение 24 часов при 37 С для образования биопленок на выступах из поликарбоната. Биопленки промывали и обрабатывали серией 2-кратных разведений каждого пептида в TSBg при 37°С в течение 16 часов. После обработки лунки промывали, сушили на воздухе при 37°С, окрашивали 0,05% кристаллическим фиолетовым в течение 10 минут и удаляли краситель в 33% уксусной кислоте. Определяли ОП600 экстрагированного кристаллического фиолетового. Значение МРБК каждого образца определяли как минимальную концентрацию лекарственного средства, необходимую для удаления >95% биомассы биопленки, что оценивали путем определения количества кристаллического фиолетового (по сравнению с необработанными контролями). Лизоцим фага Т4 использовали в качестве отрицательного контроля, и он не проявлял активности против биопленки.

[00164] Анализ методом «шахматной доски». Анализ методом «шахматной доски» основан на модификации способа CLSI определения МПК путем микроразведения в бульоне (CLSI 2015; и Moody J. 2010. Synergy testing: broth microdilution checkerboard and broth macrodilution methods, стр. 5.18.1-5.18.23. В Garcia LS (ред), Clinical Microbiology Procedures Handbook, том 2). Шахматные доски конструировали путем сначала подготовки колонок в 96-луночном полипропиленовом микротитрационном планшете, в которых каждая лунка содержала одинаковое количество антибиотика, разбавленного в 2 раза вдоль горизонтальной оси. В отдельном планшете подготавливали сопоставимые ряды, в которых каждая лунка содержала одинаковое количество пептида, разбавленного, например, в 2 раза вдоль вертикальной оси. Разведения пептида и антибиотика затем объединяли, так что каждая колонка содержала постоянное количество антибиотика и удваивающиеся разведения лизина грамотрицательных бактерий, при этом каждый ряд содержал постоянное количество лизина грамотрицательных бактерий и удваивающиеся разведения антибиотика. Следовательно, в каждой лунке содержалась уникальная комбинация пептида и антибиотика. Бактерии добавляли к комбинациям лекарственных средств при концентрации 1×10⁵ КОЕ/мл в КАК с 2,5% сывороткой человека. МПК каждого агента, отдельно и в комбинации, затем регистрировали через 16 часов при 37°С в окружающей атмосфере. Сумму индексов фракционных подавляющих концентраций (FICI) рассчитывали для каждого лекарственного средства, и минимальное значение FICI использовали для определения синергизма. FICI рассчитывали, как описано далее: FICI=FIC А+FIC В, где FIC А представляет собой МПК каждого антибиотика в комбинации/МПК каждого антибиотика отдельно, и FIC В представляет собой МПК каждого лизина грамотрицательных бактерий в комбинации/МПК каждого лизина грамотрицательных бактерий отдельно. Комбинации считали синергичными, если FICI составлял ≤0,5, сильно аддитивными, если FICI составлял от >0,5 до <1, аддитивными, если FICI составлял 1-<2, и антагонистическими, если FICI составлял >2. Анализ методом «шахматной доски» проводили, применяя штамм CFS-1292 P. Aeruginosa в KAK/HuS с комбинациями либо Chp2, либо Chp4 против диапазона из 11 различных антибиотиков, включая амикацин, азитромицин, азтреонам, ципрофлоксацин, колистин, фосфомицин, гентамицин, имипенем, пиперациллин, рифампицин и тобрамицин. Для большинства комбинаций наблюдали значения FICI <0,5, что свидетельствует о способности Chp2 и Chp4 действовать синергично с широким спектром антибиотиков (см. ниже таблицу 8). Данные открытия позволяют предположить, что пептиды Chp могут проявлять сильную антибактериальную активность в присутствии антибиотиков.

[00165] Анализ гемолитической активности лизина грамотрицательных бактерий. Гемолитическую активность измеряли как количество гемоглобина, высвобожденное в результате лизиса эритроцитов человека (Lv Y и др., 2014. PLoS One 9:е86364). Вкратце, 3 мл свежих клеток крови человека (hRBC), полученных из объединенной крови здоровых доноров (BioreclamationlVT), в пробирке из поликарбоната, содержащей гепарин, центрифугировали при 1000xg в течение 5 мин при 4 С. Полученные эритроциты промывали три раза фосфатно-солевым буферным раствором (ФБР, рН 7,2) и ресуспендировали в 30 мл ФБР. Объем 50 мкл раствора эритроцитов инкубировали с 50 мкл каждого лизина грамотрицательных бактерий (в ФБР) в диапазоне 2-кратных разведений (от 128 мкг/мл до 0,25 мкг/мл) в течение 1 ч при 37 С.Интактные эритроциты осаждали путем центрифугирования при 1000xg в течение 5 мин при 4°С, и супернатант переносили в новый 96-луночный планшет. Высвобождение гемоглобина отслеживали путем измерения поглощения по оптической плотности (ОП) на 570 нм. Минимальную гемолитическую концентрацию определяли как наименьшую концентрацию пептида, приводящую к видимому лизису (что соответствует минимальной концентрации, приводящей к значению ОП ≥5% от такового для необработанного контрольного образца). Использовали дополнительные контроли, включая hRBC в ФБР, обработанные, как описано выше, либо 0,1% тритоном Х-100, либо каждым из ряда противомикробных пептидов с известной гемолитической активностью, включая RR12, RR12 пoляpный и RR12 гидрофобный (Mohanram Н. и др., 2016. Biopolymers 106:345-356), и с маленькой гемолитической активностью или без нее, включая RI18 (Lyu Y. и др., 2016. Sci Rep 6:27258) и RR22.

[00166] Анализ активности лизина грамотрицательных бактерий по времени гибели. Ночную культуру штамма CFS-1292 P. aeruginosa разбавляли 1:00 свежей средой КАК с 2,5% сывороткой человека (KAK/HuS) и растили в течение 2,5 часов при 37°С при взбалтывании. Бактерии в экспоненциальной фазе роста затем разбавляли 1:100 в KAK/HuS и добавляли пептид в конечной концентрации либо 1, либо 10 мкг/мл. В анализ включали контрольные культуры без добавления пептида (т.е., с буфером в качестве контроля). Культуры инкубировали при 37°С с аэрацией и в моменты времени 1 ч, 3 ч и 24 ч отбирали образцы для количественного посева на чашки с агаром с КАК.

[00167] Микроскопия. Аликвоты штамма CFS-1292 P. aeruginosa, выращенного в течение 2,5 часов в LB, промывали ФБР и ресуспендпровал и либо в ФБР, либо в 100% сыворотке человека, и обрабатывали в течение 15 минут при комнатной температуре с добавлением и без пептида Chp2 в конечной концентрации 10 мкг/мл. Подгруппы образцов окрашивали, применяя набор для определения жизнеспособности клеток Live/Dead (ThermoFisher), следуя протоколу производителя, и исследовали с помощью дифференциальной интерференционно-контрастной (ДИК) микроскопии и флуоресцентной микроскопии. Пример 1. Идентификация пептидов Chp.

[00168] Обладая знанием об определенном плохо описанном бактериофаге (Chlamydiamicroviridae), который специфично инфицирует и убивает грамотрицательные бактерии хламидии, исследовали опубликованные геномы данных организмов, изначально с целью определить новые лизины, хотя не наблюдали ни подобные лизинам последовательности, ни какие-либо последовательности, сходные с ранее описанными амуринами. Хламидии не используют пептидогликаны (известная мишень лизинов) в своих структурах так широко, как другие бактерии, но вместо этого хламидии, как правило, используют пептидогликаны только во время деления. Следовательно, возник вопрос, что же было мишенью фага хламидий. Было выдвинуто предположение, что механизм, посредством которого фаг хламидий внедряется в мишень, может отличаться от ранее известных механизмов, и что его мишень может отличаться, и сфокусировали свое внимание на липополисахариде (ЛПС) - главном компоненте наружной мембраны грамотрицательных бактерий и препятствии для проникновения лизинов через наружную мембрану.

[00169] Изучили опубликованные геномы Chlamydiamicrovirus с целью идентифицировать синтенические локусы, т.е., сходные гены в одинаковом положении в геноме в группе генетически родственных фагов, что позволяло предположить сходную функцию. Обнаружили малые сильно катионные пептиды, у которых был очень сходный профиль молекулярного заряда с ранее обнаруженными противомикробными пептидами (AMP). Хотя не наблюдали подобия белковых последовательностей фага хламидий с последовательностями AMP, лизинов или известных белков амуринов (таких как белок А2, белок Е и другие белки), общий положительный заряд был их характерным признаком. Применяя методики биоинформатики, описанные выше (JPRED и iTASSAR), осуществили предсказание структуры, которое выявило присутствие альфа-спиралей - отличительного признака множества AMP. Все находки -альфа-спирали, общий заряд, консервативность среди хламидий и родственные фагам грамотрицательных бактерий геномы - позволили предположить, что данные белки могут представлять собой семейство ранее не охарактеризованных фаговых литических полипептидов и что они могут обуславливать ранее неописанный фаговый литический механизм. Тот факт, что предсказали их малый размер и растворимость (на основании их профиля заряда), также означал, что после синтеза они, вероятно, будут сразу пригодны для тестирования просто путем их добавления в культуры чувствительных бактерий.

[00170] На основании описания выше, 12 консервативных последовательностей внутри синтенических локусов выбрали из геномов Microviridae в базе данных GenBank, и, в частности, из геномов Chlamydiamicrovirus (а также некоторых других вирусов, описанных ниже). Указанные 12 консервативных последовательностей были аннотированы лишь как гипотетические, неохарактеризованные или неструктурные белки и кодировали малые (предположительно) катионные белки с предсказанными альфа-спиральными структурами. Данные 12 последовательностей описаны в таблице 1. Один из пептидов из таблицы 1 - Chp5 - синтезировали таким образом, чтобы его молекулярный заряд отличался от такового у Chp4, путем замены аргининов и лизинов, которые положительно заряжены, на отрицательно заряженные аминокислотные остатки. Спрогнозировали, что Chp5 будет неактивным. Хотя данные пептиды не проявляют подобия последовательностей с другими литическими или противомикробными белками, предсказали, что они принимают альфа-спиральные структуры (например, см. фигуру 1), аналогично подсемействам большого семейства антибактериальных агентов AMP. Было выдвинуто предположение, что пептиды Chp выполняют функцию лизиса хозяина для фагов, из которых они получены.

[00171] На основании описанных выше факторов, дополнительное исследование геномов других фагов (родственных Chlamydiamicrovirus, из того же семейства Microviridae), которые инфицируют грамотрицательные бактерии, а также других неописанных источников, у которых присутствовали те же синтения и профиль заряда, дало 14 дополнительных пептидов, перечисленных в таблице 2. Вместе все 39 пептидов (за исключением Chp5) образуют родственное семейство новых полученных из фагов литических агентов. Все они получены из источников Microviridae.

[00172] Таким образом, полный перечень всех представителей семейства Chp (включая некоторые особенности каждого пептида) представлен в таблице 1 и таблице 2. В данную группу входят пептиды Chp1 - 4 и 6 -12 и CPAR39, которые получены из 11 различных Chlamydiamicrovirus и описаны в таблице 1; пептиды Chp2 и Chp3 представляют собой два идентичных пептида из двух различных фагов. Выше указано, что Chp5 представляет собой модифицированное производное Chp4, полученное путем замены всех положительно заряженных аминокислот, включая аргинины и лизины, на отрицательно заряженные аминокислоты, включая глутамин и глутаминовую кислоту. Дополнительные 27 представителей семейства Chp были идентифицированы по гомологии с белками Chlamydiamicrovirus и описаны в таблице 2 ("Дополнительные представители семейства Chp"). Дополнительные 27 представителей семейства Chp получены не из источников Chlamydiamicrovirus, а из предполагаемых источников - фагов Microviridae.

[00173]

[00174]

[00175] Дополнительные сведения, касающиеся гомологий белковых последовательностей нескольких представителей семейства Chp, представлены в таблице 3. Chp1, Bdp1, Lvp1 и Lvp2 являются единственными представителями семейства Chp, для которых в аннотации GenBank указана предсказанная активность. Chp1 (последовательность в GenBank NP_044319.1) аннотирован как связывающий ДНК белок, хотя не предоставлены данные, подтверждающие этот факт, и аннотация не соответствует предполагаемой роли в лизисе хозяина. В целом, белки Chp идентичны друг другу на 39 - 100% и не гомологичны другим пептидам в базе данных белковых последовательностей. Укорененное и неукорененное филогенетические деревья, показывающие некоторых представителей семейства Chp, представлены на фигурах 2А и 2В, соответственно.

[00176]

Пример 2. Синтез пептидов Chp.

[00177] Все пептиды Chp синтезировали в GenScript, Нью-Джерси, США, с кэппированием [N-концевое ацетилирование (Ас) и С-концевое амидирование (NH₂)] на сдельной основе. В GenScript оценивали чистоту каждого пептида с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и масс-спектрометрии (МС). В GenScript также проводили тест на растворимость для всех пептидов и определяли чистое содержание пептидов (NPC%), применяя элементный анализатор органических веществ Vario MICRO. За исключением Chp5, Lvp1 и Lvp2, все пептиды были растворимы в воде, и их суспендировали при концентрации либо 5 мг/мл, либо 10 мг/мл. Chp5 и Lvp1 суспендировали в ДМСО при концентрации 10 мг/мл; Lvp2 суспендировали в ДМСО при концентрации 2 мг/мл. Контрольные пептиды RI18, RP-1, WLBU2, ВАС3, GN-2 amp, GN-3 amp, GN-4 amp, GN-6 amp и Bac8c также синтезировали в GenScript, как описано выше. Все дополнительные пептиды представляли собой коммерчески доступные продукты, приобретенные либо у GenScript, либо y Anaspec. Пример 3. Активность пептидов Chp: минимальная подавляющая концентрация (МПК) против грамотрицательных бактерий.

[00178] 39 указанных пептидов Chp (за исключением Chp3, пептидная последовательность которого была идентична Chp2) синтезировали и исследовали в форматах тестирования чувствительности к противомикробным средствам (ACT). Сначала определяли значения МПК против устойчивого к карбапенаму клинического изолята CFS-1292 Р aeruginosa в среде КАК, дополненной 2,5% сывороткой человека (таблица 4). Несколько пептидов, включая Chp1, Chp2, Chp4, Chp6, CPAR39 (с дитиотреитолом (ДТТ)), Chp7, Chp8, Chp10, Chp11, Ecp1, Ecp2, Osp1, Spi1, Gkh3, Unp2, Unp5, Unp6, Еср3, Ecp4, Lvp1, ALCES1, AVQ206, CDL907, AGT915 и SBR77, проявили лучшие значения МПК в диапазоне 0,25 - 4 мкг/мл. Пептиды Chp5, CPAR39 (без ДТТ), Gkh1, Unp1, Spi2 и Bdp1 оказались лишь слабо активными и проявили значения МПК ≥32 мкг/мл. CPAR39 уникален в данной группе, так как он содержит внутренние остатки цистеина, и для его активности требуется присутствие 0,5 мМ ДТТ. Chp5 был разработан как производное Chp4, в котором все положительно заряженные остатки были заменены на отрицательно заряженные остатки; на основании исследования катионных AMP предсказали, что катионные остатки необходимы для антибактериальной активности, и замена катионных остатков на анионные остатки будет нарушать активность. Соответственно, Chp5 (МПК >64 мкг/мл) представляет собой неактивный вариант Chp4 (МПК=0,5 мкг/мл). Как CPAR39 (без ДТТ), так и Chp5 использовали в качестве отрицательных контролей.

[00179] Дополнительное тестирование МПК проводили, применяя пептиды Спр1, Chp2, Chp4, CPAR39 (без ДТТ), Chp6, Еср1 и Еср2 против ряда грамотрицательных организмов, включая Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae и Acinetobacter baumannii, который включал некоторые основные патогены ESKAPE (таблица 5). Тестирование проводили в КАК (содержащей физиологические концентрации соли), которая не была дополнена 2,5% сывороткой человека, ввиду различной чувствительности целевых организмов к присутствию сыворотки человека. Лучшие значения МПК, составляющие 1 - 4 мкг/мл, наблюдали против всех исследованных штаммов для Chp2, Chp4, Chp6, Еср1 и Еср2, что свидетельствует об активности широкого спектра у пептидов согласно настоящему изобретению Chp в контексте физиологических концентраций соли. Chp2 и Еср1 дополнительно исследовали против Salmonella typhimurium и продемонстрировали МПК, равную 2 мкг/мл.

[00180] Значения МПК для обоих Chp2 и Chp4 также определили и сравнили с таковым для ряда AMP из литературы (включая эффекторы врожденного иммунитета и их производные) против лабораторного штамма РА01 P. aeruginosa в среде Мюллера-Хинтона, дополненной либо 50% плазмой человека, либо 50% сывороткой человека (таблица 6). Здесь применение РА01 (лабораторного изолята) позволяет тестирование в присутствии повышенных концентраций сыворотки или плазмы; РА01, в отличие от большинства клинических изолятов, нечувствителен к антибактериальной активности внеклеточного матрикса крови человека. В таблице 6 значения МПК для Chp2 и Chp4 составляли 2 мкг/мл; для сравнения, только RI18 и протегрин обладали сходной активностью (МПК=1-4 мкг/мл), а 18 дополнительных исследованных пептидов были либо неактивны, либо слабо активны.

Пример 4. Активность пептидов Chp: разрушение биопленки грамотрицательных бактерий.

[00181] Для того чтобы оценить активность против биопленки, определяли значения МРБК (минимальной разрушающей биопленку концентрации) для пептидов Chp2 и Chp4 против зрелых биопленок, образованных штаммом АТСС 17647 Р. aeruginosa в триптической соевой питательной среде, дополненной 2% глюкозой. Значения МРБК, равные 0,25 мкг/мл, наблюдали как для Chp2, так и для Chp4 (таблица 7), что согласуется со способностью эффективно разрушать зрелые биопленки. Для сравнения, наблюдаемая активность RI18 - высоко активного AMP (15), - была значительно ниже и составляла 4 мкг/мл, и наблюдаемая активность лизоцима Т4, слабо активного лизина, составляла >64 мкг/мл.

Пример 5. Комбинация пептидов Chp и антибиотиков.

[00182] Для того чтобы оценить синергизм между либо Chp2, либо Chp4 и группой из 11 антибиотиков, каждую комбинацию Chp2 с 11 антибиотиками и Chp4 с 11 антибиотиками исследовали в стандартном формате анализа методом «шахматной доски», используя штамм CFS-1292 P. aeruginosa в среде КАК, дополненной 2,5% сывороткой человека. В анализе методом «шахматной доски» рассчитывали значения индекса фракционных подавляющих концентраций (FICI). Значения FICI ≤0,5 соответствуют синергизму, значения >0,5 - 1 соответствуют сильно аддитивной активности, значения 1 - 2 соответствуют аддитивной активности и значения >2 считают антагонистическими. В таблице 8 ниже показано, что для обоих Chp2 и Chp4 значения соответствовали либо синергизму (т.е., ≤0,5), либо сильно аддитивным (т.е., >0,5 - 1) взаимодействиям между пептидом Chp и антибиотиком.

Пример 6. Оценка гемолитической активности пептидов Chp.

[00183] Противомикробные пептиды, пригодные для применения для лечения инвазивных инфекций, должны проявлять низкую токсичность по отношению к эритроцитам (Oddo А. и др., 2017. Methods Mol Biol 1548:427-435). Для исследования возможной гемолитической активности применяли обычную методику (описанную выше в разделе Материалы и методы) измерения способности AMP лизировать красные кровяные клетки, основанную на определении минимальных гемолитических концентраций (МГК) в отношении красных кровяных клеток человека. Для 33 из 37 исследованных пептидов Chp не наблюдали гемолиза, при этом значения МГК составляли >128 мкг/мл (таблица 9). Контроль тритон Х100 исследовали при исходной концентрации 2%, и МГК наблюдали при 0,007%. Для сравнения, для четырех AMP с известной гемолитической активностью, включая RI18, R12, RR12p и RR12h, наблюдали значения МГК в диапазоне 4-128 мкг/мл. Тритон Х-100, мембранолитический детергент, который обычно используют в качестве положительного контроля в гемолитическом анализе, был гемолитическим в диапазоне концентраций от 2% до 0,007%. Данные открытия позволяют предположить, что пептиды Chp не оказывают токсичного действия in vitro (т.е., не проявляют гемолитическую активность), которое обычно наблюдают для AMP. Ожидают, что данное свойство будет также у остальных пептидов Chp из таблиц 1 и 2, на основании не только процента идентичности последовательностей, подобия 3D структуры и профиля заряда, но также на прогнозировании того, что, как литические агенты, пептиды согласно настоящему изобретению наиболее вероятно будут очень высокоспецифичны к оболочке грамотрицательных клеток.

Пример 7. Продолжительность литической активности против грамотрицательных бактерий.

[00184] Исследовали активность Chp2 и Chp4 против штамма CFS-1292 Р aeruginosa в формате анализа активности по времени гибели, используя КАК с 2,5% сывороткой человека, как описано в разделе Материалы и методы. Оценка жизнеспособности бактерий через 1, 3 и 24 часа после обработки концентрациями 1 мкг/мл и 10 мкг/мл либо Chp2, либо Chp4 показала ее снижение на несколько порядков, соответствующее эффективной бактерицидной активности во всех случаях (таблица 10). В таблице 10 представлено снижение на порядки (log) количества колониеобразующих единиц (по сравнению с необработанными контролями), что определили, применяя формат анализа активности по времени гибели для штамма CFS-1292 Р. aeruginosa после обработки КАК, дополненной 2,5% сывороткой человека.

[00185] Кроме того, проводили оценку стабильности, чтобы обнаружить кратность изменения МПК после инкубации пептидов, полученных как описано выше в примере 2. Стабильность оценивали после инкубации в 100% сыворотке человека при 37°С через 10 минут, 1 час и 2 часа. Результаты представлены ниже в таблице 11.

В Таблице 11 показано, что все из Chp1, Chp2, CPAR39, Chp4, Chp5, Chp6, Chp7, Chp8, Chp9, Chp10, Chp11, Chp12, Gkh1, Gkh2, Gkh3, Ecp1, Ecp2, Еср3, Ecp4, Osp1, Unp1, Unp2, Unp3, Unp5, Unp6, Spi1, Spi2, Bdp1, Lvp1, Lvp2, ALCES1, AVQ206, AVQ244, CDL907, AGT915, HH3930, Fen7875 и SBR77 были достаточно стабильны через 10 минут, 1 час и 2 часа.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> CONTRAFECT CORPORATION

<120> ПОЛУЧЕННЫЕ ИЗ БАКТЕРИОФАГОВ ПРОТИВОМИКРОБНЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ И ИХ

ПРИМЕНЕНИЕ ПРОТИВ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ

<130> 0341.0002-PCT

<140>

<141>

<150> 62/650,235

<151> 2018-03-29

<160> 80

<170> PatentIn версии 3.5

<210> 1

<211> 36

<212> ПРТ

<213> Вирус хламидий Chp1

<400> 1

Met Val Arg Arg Arg Arg Leu Arg Arg Arg Ile Ser Arg Arg Ile Phe

1 5 10 15

Arg Arg Thr Val Ala Arg Val Gly Arg Arg Arg Arg Ser Phe Arg Gly

20 25 30

Gly Ile Arg Phe

35

<210> 2

<211> 44

<212> ПРТ

<213> Фаг хламидий 2

<400> 2

Met Arg Leu Lys Met Ala Arg Arg Arg Tyr Arg Leu Pro Arg Arg Arg

1 5 10 15

Ser Arg Arg Leu Phe Ser Arg Thr Ala Leu Arg Met His Pro Arg Asn

20 25 30

Arg Leu Arg Arg Ile Met Arg Gly Gly Ile Arg Phe

35 40

<210> 3

<211> 35

<212> ПРТ

<213> Вирус хламидий CPAR39

<400> 3

Met Cys Lys Lys Val Cys Lys Lys Cys Pro Lys Lys Gly Pro Lys Asn

1 5 10 15

Ala Pro Lys Ile Gly Ala Phe Tyr Glu Arg Lys Thr Pro Arg Leu Lys

20 25 30

Gln Ser Thr

35

<210> 4

<211> 39

<212> ПРТ

<213> Фаг хламидий 4

<400> 4

Met Ala Arg Arg Tyr Arg Leu Ser Arg Arg Arg Ser Arg Arg Leu Phe

1 5 10 15

Ser Arg Thr Ala Leu Arg Met His Arg Arg Asn Arg Leu Arg Arg Ile

20 25 30

Met Arg Gly Gly Ile Arg Phe

35

<210> 5

<211> 39

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 5

Met Ala Glu Gln Tyr Glu Leu Ser Gln Glu Gln Ser Glu Gln Leu Phe

1 5 10 15

Ser Glu Thr Ala Leu Gln Met His Glu Gln Asn Glu Leu Gln Glu Ile

20 25 30

Met Gln Gly Gly Ile Glu Phe

35

<210> 6

<211> 40

<212> ПРТ

<213> Фаг хламидий морской свинки

<400> 6

Met Ala Arg Arg Arg Tyr Arg Leu Pro Arg Arg Arg Ser Arg Arg Leu

1 5 10 15

Phe Ser Arg Thr Ala Leu Arg Met His Pro Arg Asn Arg Leu Arg Arg

20 25 30

Ile Met Arg Gly Gly Ile Arg Phe

35 40

<210> 7

<211> 38

<212> ПРТ

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 7

Met Lys Arg Arg Lys Met Thr Arg Lys Gly Ser Lys Arg Leu Phe Thr

1 5 10 15

Ala Thr Ala Asp Lys Thr Lys Ser Ile Asn Thr Ala Pro Pro Pro Met

20 25 30

Arg Gly Gly Ile Arg Leu

35

<210> 8

<211> 39

<212> ПРТ

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 8

Met Ser Lys Lys Arg Ser Arg Met Ser Arg Arg Arg Ser Lys Lys Leu

1 5 10 15

Phe Ser Lys Thr Ala Leu Arg Thr Lys Ser Val Asn Thr Arg Pro Pro

20 25 30

Met Arg Gly Gly Phe Arg Phe

35

<210> 9

<211> 40

<212> ПРТ

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 9

Met Ser Leu Arg Arg His Lys Leu Ser Arg Lys Ala Ser Lys Arg Ile

1 5 10 15

Phe Arg Lys Gly Ala Ser Arg Thr Lys Thr Leu Asn Thr Arg Ala Thr

20 25 30

Pro Met Arg Gly Gly Phe Arg Ile

35 40

<210> 10

<211> 38

<212> ПРТ

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 10

Met Lys Arg Arg Lys Leu Ser Lys Lys Lys Ser Arg Lys Ile Phe Thr

1 5 10 15

Arg Gly Ala Val Asn Val Lys Lys Arg Asn Leu Arg Ala Arg Pro Met

20 25 30

Arg Gly Gly Phe Arg Ile

35

<210> 11

<211> 37

<212> ПРТ

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 11

Met Ala Lys Lys Met Thr Lys Gly Lys Asp Arg Gln Val Phe Arg Lys

1 5 10 15

Thr Ala Asp Arg Thr Lys Lys Leu Asn Val Arg Pro Leu Leu Tyr Arg

20 25 30

Gly Gly Ile Arg Leu

35

<210> 12

<211> 39

<212> ПРТ

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 12

Met Ala Gly Lys Lys Met Val Ser Lys Gly Lys Asp Arg Gln Ile Phe

1 5 10 15

Arg Lys Thr Ala Asp Arg Thr Lys Lys Met Asn Val Arg Pro Leu Leu

20 25 30

Tyr Arg Gly Gly Ile Arg Leu

35

<210> 13

<211> 41

<212> ПРТ

<213> Морской гокушовирус

<400> 13

Met Arg Arg Pro Arg Lys Met Asn Tyr Lys Lys Ser Lys Arg Met Phe

1 5 10 15

Ser Arg Thr Ala Ala Arg Thr His Arg Lys Asn Ser Leu Arg Gly Ser

20 25 30

Arg Pro Met Arg Gly Gly Ile Arg Leu

35 40

<210> 14

<211> 34

<212> ПРТ

<213> Gokushovirinae Fen672_31

<400> 14

Met Ser Lys Lys Ala Ser Arg Lys Ser Phe Thr Lys Gly Ala Val Lys

1 5 10 15

Val His Lys Lys Asn Val Pro Thr Arg Val Pro Met Arg Gly Gly Ile

20 25 30

Arg Leu

<210> 15

<211> 35

<212> ПРТ

<213> Неизвестно

<220>

<223> описание неизвестного:

последовательность фага Microviridae

<400> 15

Met Lys Met Arg Lys Arg Thr Asp Lys Arg Val Phe Thr Arg Thr Ala

1 5 10 15

Ala Lys Ser Lys Lys Val Asn Ile Ala Pro Lys Ile Phe Arg Gly Gly

20 25 30

Ile Arg Leu

35

<210> 16

<211> 39

<212> ПРТ

<213> Escherichia coli

<400> 16

Met Ala Arg Ser Arg Arg Arg Met Ser Lys Arg Ser Ser Arg Arg Ser

1 5 10 15

Phe Arg Lys Tyr Ala Lys Thr His Lys Arg Asn Phe Lys Ala Arg Ser

20 25 30

Met Arg Gly Gly Ile Arg Leu

35

<210> 17

<211> 47

<212> ПРТ

<213> Cognatishimia maritima

<400> 17

Met Glu Ser Pro Asn Ser Arg Ser Gln Leu Gly Ile Thr Leu Tyr Leu

1 5 10 15

Leu Ser Thr Ile Phe Pro Asp Ala Cys Phe Arg Tyr Arg Arg Glu Leu

20 25 30

Pro Tyr Pro Leu Val Ile Trp Gly Val Ala Thr Leu Cys Leu Gln

35 40 45

<210> 18

<211> 39

<212> ПРТ

<213> Escherichia coli

<400> 18

Met Ala Arg Ser Arg Arg Arg Met Ser Lys Arg Ser Ser Arg Arg Ser

1 5 10 15

Phe Arg Lys Tyr Ala Lys Ser His Lys Lys Asn Phe Lys Ala Arg Ser

20 25 30

Met Arg Gly Gly Ile Arg Leu

35

<210> 19

<211> 37

<212> ПРТ

<213> Вид Oscillibacter

<400> 19

Met Arg Lys Arg Met Ser Lys Arg Val Asp Lys Lys Val Phe Arg Arg

1 5 10 15

Thr Ala Ala Ser Ala Lys Lys Ile Asn Ile Asp Pro Lys Ile Tyr Arg

20 25 30

Gly Gly Ile Arg Leu

35

<210> 20

<211> 37

<212> ПРТ

<213> Неизвестно

<220>

<223> описание неизвестного:

последовательность фага Microviridae

<400> 20

Met Arg Arg Arg Arg Leu Ser Arg Arg Thr Ser Arg Arg Phe Phe Arg

1 5 10 15

Lys Gly Leu Lys Val Arg Arg Arg Asn Leu Arg Ala Arg Pro Met Arg

20 25 30

Gly Gly Phe Arg Ile

35

<210> 21

<211> 39

<212> ПРТ

<213> Неизвестно

<220>

<223> описание неизвестного:

последовательность фага Microviridae

<400> 21

Met Ala Arg Arg Lys Lys Met Lys Gly Lys Arg Asp Lys Arg Val Phe

1 5 10 15

Lys Gln Thr Ala Asn Lys Thr Lys Ala Ile Asn Ile Ser Pro Lys Asn

20 25 30

Met Arg Gly Gly Thr Arg Leu

35

<210> 22

<211> 53

<212> ПРТ

<213> Морской гокушовирус

<400> 22

Met Leu Thr Val Trp Ser Asp Thr Pro Thr Ile Lys Arg Arg Lys Asp

1 5 10 15

Met Tyr Arg Lys Arg Met Ser Arg Lys Lys Ser Lys Lys Val Phe Ala

20 25 30

Lys Thr Ala Met Lys Val Asn Lys Arg Asn His Val Lys Pro Met Arg

35 40 45

Gly Gly Tyr Arg Ile

50

<210> 23

<211> 39

<212> ПРТ

<213> Морской гокушовирус

<400> 23

Met Met Lys Tyr Arg Lys Lys Met Ser Ala Lys Ser Ser Arg Lys Gln

1 5 10 15

Phe Thr Lys Gly Ala Met Lys Val Lys Gly Lys Asn Phe Thr Lys Pro

20 25 30

Met Arg Gly Gly Ile Arg Leu

35

<210> 24

<211> 38

<212> ПРТ

<213> Морской гокушовирус

<400> 24

Met Arg Arg Tyr Asn Val Asn Lys Gly Lys Ser Ala Lys Lys Phe Arg

1 5 10 15

Lys Gln Val Ser Lys Thr Lys Val Ala Asn Leu Arg Ser Asn Pro Met

20 25 30

Arg Gly Gly Trp Arg Leu

35

<210> 25

<211> 28

<212> ПРТ

<213> Вирус спироплазмы

<400> 25

Met Ala Tyr Arg Gly Phe Lys Thr Ser Arg Val Val Lys His Arg Val

1 5 10 15

Arg Arg Arg Trp Phe Asn His Arg Arg Arg Tyr Arg

20 25

<210> 26

<211> 38

<212> ПРТ

<213> Вирус спироплазмы

<400> 26

Met Arg Arg Lys Val Lys Asn Thr Lys Arg His Gln Trp Arg Leu Thr

1 5 10 15

His Ser Ala Arg Ser Ile Lys Arg Ala Asn Ile Met Pro Ser Asn Pro

20 25 30

Arg Gly Gly Arg Arg Phe

35

<210> 27

<211> 111

<212> ДНК

<213> Вирус хламидий Chp1

<400> 27

atggttcgta gaagacgttt gagaagaaga ataagtagaa gaatttttag aagaacagta 60

gctagagttg gtagaaggcg aaggtctttt cgtggtggta ttagatttta a 111

<210> 28

<211> 135

<212> ДНК

<213> Фаг хламидий 2

<400> 28

atgaggttaa aaatggcacg aagaagatac agacttccgc gacgtagaag tcgaagactt 60

ttttcaagaa ctgcattgag gatgcatcca agaaataggc ttcgaagaat tatgcgtggc 120

ggcattaggt tctag 135

<210> 29

<211> 108

<212> ДНК

<213> Вирус хламидий CPAR39

<400> 29

ttgtgcaaaa aagtgtgcaa aaaatgccca aaaaaagggc caaaaaatgc ccccaaaatc 60

ggagcatttt acgagagaaa aacacctaga cttaaacagt ctacttga 108

<210> 30

<211> 120

<212> ДНК

<213> Фаг хламидий 4

<400> 30

atggcacgaa gatacagact ttcgcgacgc agaagtcgac gacttttttc aagaactgca 60

ttaagaatgc atcgaagaaa tagacttcga agaattatgc gtggcggcat taggttttag 120

<210> 31

<211> 120

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 31

atggcggaac agtatgaact gagccaggaa cagagcgaac agctgtttag cgaaaccgcg 60

ctgcagatgc atgaacagaa cgaactgcag gaaattatgc agggcggcat tgaattttaa 120

<210> 32

<211> 123

<212> ДНК

<213> Фаг хламидий морской свинки

<400> 32

atggcacgaa gaagatacag acttccgcga cgtagaagtc gaagactttt ttcaagaact 60

gcattaagga tgcatccaag aaataggctt cgaagaatta tgcgtggcgg cattaggttc 120

tag 123

<210> 33

<211> 117

<212> ДНК

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 33

atgaaacgta gaaaaatgac aagaaaaggt tctaagcgtc tttttactgc aactgctgat 60

aaaactaaat ctatcaatac tgccccgccg ccaatgcgtg gcggtatccg gttgtaa 117

<210> 34

<211> 120

<212> ДНК

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 34

atgtctaaaa agcgttctcg catgtctcgc cgccgttcta agaagttgtt ctcgaaaacg 60

gctctccgca cgaagagtgt caacacccgt ccgcctatgc gcggagggtt ccggttctga 120

<210> 35

<211> 123

<212> ДНК

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 35

atgtctcttc gtcgtcataa gctttctcgt aaggcgtcta agcgtatttt tcgtaaaggt 60

gcatcacgca cgaagacttt gaatactcgt gctacgccta tgcgcggcgg tttccgtatt 120

taa 123

<210> 36

<211> 117

<212> ДНК

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 36

atgaaacgtc gtaaactgtc caaaaagaaa tctcgcaaga ttttcactcg cggtgctgta 60

aatgtgaaaa agcgtaacct tcgcgctcgc ccaatgcgcg gcggtttccg gatctaa 117

<210> 37

<211> 114

<212> ДНК

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 37

atggctaaaa aaatgactaa aggcaaggat cgtcaggttt ttcgtaaaac cgctgatcgt 60

actaagaaac tcaatgttag accgttgtta tatcgaggag gtatcagatt atga 114

<210> 38

<211> 120

<212> ДНК

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 38

atggcaggaa aaaaaatggt atcaaaagga aaagatagac agattttccg aaaaactgct 60

gatcgcacta aaaaaatgaa tgtgcgcccg ctattatatc gtggaggtat tagattatga 120

<210> 39

<211> 126

<212> ДНК

<213> Морской гокушовирус

<400> 39

atgagaagac caagaaaaat gaactataaa aaatcaaaaa gaatgttttc acgcacagca 60

gcgagaacac acagaaaaaa ctctctaaga ggtagccgac ctatgagagg cggaatacgt 120

ctttaa 126

<210> 40

<211> 105

<212> ДНК

<213> Gokushovirinae Fen672_31

<400> 40

atgtcgaaga aggcgtcgag gaagagtttt actaagggtg ccgttaaggt tcataagaaa 60

aatgttccta ctcgtgttcc tatgcgtggc ggtattaggc tttag 105

<210> 41

<211> 108

<212> ДНК

<213> Неизвестно

<220>

<223> описание неизвестного:

последовательность фага Microviridae

<400> 41

atgaaaatgc gtaagcggac ggacaagcga gtgtttaccc gcaccgctgc taagtccaag 60

aaagtgaaca ttgccccgaa aatttttaga ggaggtatcc gtctgtga 108

<210> 42

<211> 120

<212> ДНК

<213> Escherichia coli

<400> 42

atggctcgtt ctcgccgtcg tatgtccaag cgttcttccc gtcgttcgtt ccgtaagtac 60

gcaaagacgc ataaacgtaa ctttaaagcc cgctctatgc gtggtggaat tcgtctttga 120

<210> 43

<211> 144

<212> ДНК

<213> Cognatishimia maritima

<400> 43

atggaaagcc cgaacagccg cagccagctg ggcattaccc tgtatctgct gagcaccatt 60

tttccggatg cgtgctttcg ctatcgccgc gaactgccgt atccgctggt gatttggggc 120

gtggcgaccc tgtgcctgca gtaa 144

<210> 44

<211> 120

<212> ДНК

<213> Escherichia coli

<400> 44

atggctcgtt cccgtagacg tatgtctaag cgttcttccc gccgttcgtt ccgcaagtat 60

gcgaagtcgc ataagaagaa ctttaaagcc cgctcaatgc gtggcggtat ccgtttataa 120

<210> 45

<211> 114

<212> ДНК

<213> Вид Oscillibacter

<400> 45

atgagaaagc gaatgtctaa gcgtgttgac aagaaggtgt tccgtcgtac tgccgcatct 60

gccaagaaga ttaacattga ccccaagatt taccgtggag gtattcgcct atga 114

<210> 46

<211> 114

<212> ДНК

<213> Неизвестно

<220>

<223> описание неизвестного:

последовательность фага Microviridae

<400> 46

atgagacgtc gtcgtctatc ccgcagaact tcccgccgtt ttttccgtaa aggacttaag 60

gttcgccgtc gtaacctccg cgcgagaccc atgagaggcg gattcagaat ttga 114

<210> 47

<211> 120

<212> ДНК

<213> Неизвестно

<220>

<223> описание неизвестного:

последовательность фага Microviridae

<400> 47

atggcacgac gcaagaagat gaaaggcaag cgggataaac gggtgtttaa gcagacagcc 60

aacaaaacca aggctatcaa catcagccca aaaaacatga gagggggtac gagactgtga 120

<210> 48

<211> 162

<212> ДНК

<213> Морской гокушовирус

<400> 48

atgttaactg tgtggagtga cacccctacc ataaaaagga gaaaagacat gtatagaaag 60

agaatgtcaa gaaagaaaag taaaaaggtt tttgcaaaaa ccgcaatgaa agtaaataaa 120

agaaaccacg ttaaacctat gcgtggtgga tatagaatat aa 162

<210> 49

<211> 120

<212> ДНК

<213> Морской гокушовирус

<400> 49

atgatgaagt acagaaaaaa aatgagcgct aaaagtagcc gaaagcaatt tacaaaaggc 60

gccatgaaag tgaagggtaa aaacttcaca aaaccaatgc gcggaggcat ccgtctatag 120

<210> 50

<211> 117

<212> ДНК

<213> Морской гокушовирус

<400> 50

atgcgacgtt acaatgtaaa taaaggtaaa tctgctaaga agtttcgaaa gcaggtaagt 60

aagacgaagg ttgcaaacct acgttctaat ccaatgcgag gtggttggag actctaa 117

<210> 51

<211> 87

<212> ДНК

<213> Вирус спироплазмы

<400> 51

atggcttatc gtggttttaa aacgagtcgt gttgtaaaac atagagtacg tagaagatgg 60

tttaatcata gaagacgtta tagatag 87

<210> 52

<211> 117

<212> ДНК

<213> Вирус спироплазмы

<400> 52

gtgagacgca aggttaagaa cacaaagcgt catcagtgga ggttgactca ttctgcacgt 60

tcaattaaac gtgctaatat aatgccgtca aatcctcgtg gtggacgtcg tttttag 117

<210> 53

<211> 135

<212> ДНК

<213> Фаг хламидий 3

<400> 53

atgaggttaa aaatggcacg aagaagatac agacttccgc gacgtagaag tcgaagactt 60

ttttcaagaa ctgcattaag gatgcatcca agaaataggc ttcgaagaat tatgcgtggc 120

ggcattaggt tctag 135

<210> 54

<211> 44

<212> ПРТ

<213> Фаг хламидий 3

<400> 54

Met Arg Leu Lys Met Ala Arg Arg Arg Tyr Arg Leu Pro Arg Arg Arg

1 5 10 15

Ser Arg Arg Leu Phe Ser Arg Thr Ala Leu Arg Met His Pro Arg Asn

20 25 30

Arg Leu Arg Arg Ile Met Arg Gly Gly Ile Arg Phe

35 40

<210> 55

<211> 39

<212> ПРТ

<213> Вид Escherichia

<400> 55

Met Ala Arg Ser Arg Arg Arg Met Ser Lys Arg Ser Ser Arg Arg Ser

1 5 10 15

Phe Arg Lys Tyr Ala Lys Thr His Lys Lys Asn Phe Lys Ala Arg Ser

20 25 30

Met Arg Gly Gly Ile Arg Leu

35

<210> 56

<211> 39

<212> ПРТ

<213> Вид Escherichia

<400> 56

Met Ala Arg Ser Arg Arg Arg Met Ser Lys Arg Ser Ser Arg Arg Ser

1 5 10 15

Phe Arg Lys Tyr Ala Lys Ser His Lys Lys Asn Phe Lys Ala Arg Ser

20 25 30

Met Arg Gly Gly Ile Arg Leu

35

<210> 57

<211> 55

<212> ПРТ

<213> фаг PP7 Pseudomonas

<400> 57

Met Ser Ser Thr Leu Cys Arg Trp Ala Val Lys Ala Leu Arg Cys Thr

1 5 10 15

Arg Val Tyr Lys Glu Phe Ile Trp Lys Pro Leu Val Ala Leu Ser Tyr

20 25 30

Val Thr Leu Tyr Leu Leu Ser Ser Val Phe Leu Ser Gln Leu Ser Tyr

35 40 45

Pro Ile Gly Ser Trp Ala Val

50 55

<210> 58

<211> 35

<212> ПРТ

<213> Фаг AP205 Acinetobacter

<400> 58

Met Lys Lys Arg Thr Lys Ala Leu Leu Pro Tyr Ala Val Phe Ile Ile

1 5 10 15

Leu Ser Phe Gln Leu Thr Leu Leu Thr Ala Leu Phe Met Tyr Tyr His

20 25 30

Tyr Thr Phe

35

<210> 59

<211> 38

<212> ПРТ

<213> ассоциированный с фекалиями европейского лося Microvirus MP12 5423

<400> 59

Met Ala Lys Lys Ile Arg Asn Lys Ala Arg Asp Arg Arg Ile Phe Thr

1 5 10 15

Arg Thr Ala Ser Arg Met His Lys Ala Asn Arg Thr Pro Arg Phe Met

20 25 30

Arg Gly Gly Ile Arg Leu

35

<210> 60

<211> 38

<212> ПРТ

<213> Неизвестно

<220>

<223> описание неизвестного:

последовательность образцов Gokushovirinae из окружающей среды

<400> 60

Met Arg Arg Lys Lys Met Ser Arg Gly Lys Ser Lys Lys Leu Phe Arg

1 5 10 15

Arg Thr Ala Lys Arg Val His Arg Lys Asn Leu Arg Ala Arg Pro Met

20 25 30

Arg Gly Gly Ile Arg Met

35

<210> 61

<211> 39

<212> ПРТ

<213> Неизвестно

<220>

<223> описание неизвестного:

последовательность образцов Gokushovirinae из окружающей среды

<400> 61

Met Ala Lys Arg His Lys Ile Pro Gln Arg Ala Ser Gln His Ser Phe

1 5 10 15

Thr Arg His Ala Gln Lys Val His Pro Lys Asn Val Pro Arg Leu Pro

20 25 30

Met Arg Gly Gly Ile Arg Leu

35

<210> 62

<211> 37

<212> ПРТ

<213> Неизвестно

<220>

<223> описание неизвестного:

последовательность некультивированной бактерии

<400> 62

Met Arg Lys Lys Met His Lys Ser Leu Asp Lys Arg Val Phe Asn Arg

1 5 10 15

Thr Ala Lys Lys Ser Lys Lys Ile Asn Val Asn Pro Val Val Tyr Arg

20 25 30

Gly Gly Ile Arg Leu

35

<210> 63

<211> 38

<212> ПРТ

<213> Морской гокушовирус

<400> 63

Met Arg Arg Tyr Asn Val Asn Lys Gly Lys Ser Ala Lys Lys Phe Arg

1 5 10 15

Lys Gln Val Ser Lys Thr Lys Val Ala Asn Leu Arg Ser Asn Pro Met

20 25 30

Arg Gly Gly Trp Arg Leu

35

<210> 64

<211> 41

<212> ПРТ

<213> Неизвестно

<220>

<223> описание неизвестного:

последовательность HH01 Richelia intracellularis

<400> 64

Met Arg Pro Val Lys Arg Ser Arg Val Asn Lys Ala Arg Ser Ala Gly

1 5 10 15

Lys Phe Arg Lys Gln Val Gly Lys Thr Lys Met Ala Asn Leu Arg Ser

20 25 30

Asn Pro Met Arg Gly Gly Trp Arg Leu

35 40

<210> 65

<211> 41

<212> ПРТ

<213> Gokushovirinae Fen7875_21

<400> 65

Met Lys Pro Leu Lys Arg Lys Pro Val Gln Lys Ala Arg Ser Ala Ala

1 5 10 15

Lys Phe Arg Arg Asn Val Ser Thr Val Lys Ala Ala Asn Met Ala Val

20 25 30

Lys Pro Met Arg Gly Gly Trp Arg Phe

35 40

<210> 66

<211> 44

<212> ПРТ

<213> фаг микобактерий BabyRay

<400> 66

Met Thr Lys Arg Asp Ile Glu Tyr Arg Lys Ala Leu Gly Leu Asn Pro

1 5 10 15

Ser Glu Pro Leu Pro Lys Ile Val Gly Ala Val Thr Arg His Gly Ala

20 25 30

Thr Leu Lys Arg Pro Arg Val Thr Ala Leu Ala Arg

35 40

<210> 67

<211> 38

<212> ПРТ

<213> Неизвестно

<220>

<223> описание неизвестного:

последовательность фага phiMH2K Bdellovibrio

<400> 67

Met Lys Arg Lys Pro Met Ser Arg Lys Ala Ser Gln Lys Thr Phe Lys

1 5 10 15

Lys Asn Thr Gly Val Gln Arg Met Asn His Leu Asn Pro Arg Ala Met

20 25 30

Arg Gly Gly Ile Arg Leu

35

<210> 68

<211> 120

<212> ДНК

<213> Вид Escherichia

<400> 68

atggctcgtt ctcgtcgtcg tatgtctaaa cgttcttctc gtcgttcttt tcgtaaatat 60

gctaaaactc ataaaaaaaa ttttaaagct cgttctatgc gtggaggaat tcgtttataa 120

<210> 69

<211> 117

<212> ДНК

<213> Вид Escherichia

<400> 69

atggcgcgca gccgccgccg catgagcaaa cgcagcagcc gccgcagctt tcgcaaatat 60

gcgaaaagcc ataaaaaaaa ctttaaagcg cgcagcatgc gcggcggcat tcgcctg 117

<210> 70

<211> 168

<212> ДНК

<213> фаг PP7 Pseudomonas

<400> 70

ttgtcgtcaa ccttgtgccg ctgggccgtt aaggccctgc ggtgtacccg tgtgtataag 60

gagtttatat ggaaaccctt agtagcgctc agttacgtga cgttgtatct tctgagctcg 120

gtcttcctgt cccaactcag ctaccccatc gggagctggg cggtgtag 168

<210> 71

<211> 108

<212> ДНК

<213> Фаг AP205 Acinetobacter

<400> 71

atgaagaaaa ggacaaaagc cttgcttccc tatgcggttt tcatcatact cagctttcaa 60

ctaacattgt tgactgcctt gtttatgtat taccattata ccttttag 108

<210> 72

<211> 117

<212> ДНК

<213> ассоциированный с фекалиями европейского лося Microvirus MP12 5423

<400> 72

atggcaaaga aaattagaaa caaagcacgt gatagacgta tcttcacaag aacagcttca 60

cgcatgcaca aggcaaaccg cacaccaaga tttatgagag gcggtattag gttatga 117

<210> 73

<211> 117

<212> ДНК

<213> Неизвестно

<220>

<223> описание неизвестного:

последовательность образцов Gokushovirinae из окружающей среды

<400> 73

atgcgtcgta aaaaaatgtc acgcggtaaa tcaaaaaaac tctttcgccg aacagcaaaa 60

cgcgttcatc gaaaaaacct acgagctcgc ccaatgcgtg gcggcatacg catgtag 117

<210> 74

<211> 120

<212> ДНК

<213> Неизвестно

<220>

<223> описание неизвестного:

последовательность образцов Gokushovirinae из окружающей среды

<400> 74

atggcgaagc gacacaaaat cccgcaacgc gcgtcacaac attccttcac gcgccatgcg 60

caaaaggtcc accctaagaa cgttccccgc ctgccaatgc gaggcggtat ccgtctctaa 120

<210> 75

<211> 114

<212> ДНК

<213> Неизвестно

<220>

<223> описание неизвестного:

последовательность некультивированной бактерии

<400> 75

atgcgtaaaa aaatgcacaa atcattagac aagcgagtgt ttaaccgcac tgcaaaaaaa 60

tcaaaaaaaa taaatgttaa tcctgtagtt tatcgtggag gtattagatt atga 114

<210> 76

<211> 117

<212> ДНК

<213> Морской гокушовирус

<400> 76

atgcgacgtt acaatgtaaa taaaggtaaa tctgctaaga agtttcgaaa gcaggtaagt 60

aagacgaagg ttgcaaacct acgttctaat ccaatgcgag gtggttggag actctaa 117

<210> 77

<211> 126

<212> ДНК

<213> Неизвестно

<220>

<223> описание неизвестного:

последовательность HH01 Richelia intracellularis

<400> 77

atgcgtccag ttaaaagatc aagagtaaat aaggcccgat ctgcaggcaa gtttcgtaag 60

caggtcggta aaacaaagat ggcaaatctg cgtagtaatc cgatgcgcgg cggatggcgg 120

ctgtga 126

<210> 78

<211> 126

<212> ДНК

<213> Gokushovirinae Fen7875_21

<400> 78

atgaagccat tgaagcgtaa gccggttcag aaggcgcggt cagcagccaa gttccgtcga 60

aatgtgtcta ccgttaaggc tgccaatatg gcggtgaagc cgatgcgcgg cggttggcgg 120

ttctga 126

<210> 79

<211> 135

<212> ДНК

<213> фаг микобактерий BabyRay

<400> 79

atgaccaaga gagacatcga gtaccggaaa gctttggggc tcaacccatc tgagccgctc 60

ccgaagattg tgggtgccgt cacccgccac ggggccactc tgaaacgccc acgggtcacc 120

gcactggccc gatag 135

<210> 80

<211> 117

<212> ДНК

<213> Неизвестно

<220>

<223> описание неизвестного:

последовательность фага phiMH2K Bdellovibrio

<400> 80

atgaaaagaa aaccaatgag ccgcaaggcc tctcaaaaaa ccttcaaaaa gaacacaggc 60

gttcaacgca tgaaccatct caacccacgc gccatgcgtg gtggcattag actataa 117

<---

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к происходящим из бактериофагов противомикробным полипептидам, и может быть использовано в медицине для лечения инфекций, вызванных грамотрицательными бактериями. Предложена фармацевтическая композиция для ингибирования роста, сокращения популяции или уничтожения по меньшей мере одного вида грамотрицательных бактерий, содержащая эффективное количество выделенного пептида Chp с SEQ ID NO: 2, или его активного фрагмента, в котором сохранен альфа-спиральный домен, или модифицированного пептида Chp, последовательность аминокислот которого по меньшей мере на 80% идентична SEQ ID NO: 2 и в котором сохранен альфа-спиральный домен. Изобретение обеспечивает получение противомикробных агентов, обладающих активностью широкого спектра против грамотрицательных патогенов и способностью сохраняться в присутствии сыворотки. 3 н. и 15 з.п. ф-лы, 3 ил., 13 табл., 7 пр.

1. Фармацевтическая композиция для ингибирования роста, сокращения популяции или уничтожения по меньшей мере одного вида грамотрицательных бактерий, содержащая:

эффективное количество: (i) выделенного пептида Chp, имеющего последовательность аминокислот SEQ ID NO: 2, или его активного фрагмента, в котором сохранен α-спиральный домен; или (ii) модифицированного пептида Chp, последовательность аминокислот которого по меньшей мере на 80% идентична последовательности аминокислот SEQ ID NO: 2, и в котором сохранен α-спиральный домен, причем указанный пептид Chp, активный фрагмент или пептид Chp, обладающий по меньшей мере 80% идентичности последовательности с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 2, ингибирует рост, сокращает популяцию или уничтожает по меньшей мере один вид грамотрицательных бактерий; и

фармацевтически приемлемый носитель.

2. Фармацевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что пептид Chp дополнительно содержит по меньшей мере одну не встречающуюся в природе модификацию относительно последовательности аминокислот SEQ ID NO: 2 или ее активных фрагментов.

3. Фармацевтическая композиция по п. 2, отличающаяся тем, что указанная не встречающаяся в природе модификация выбрана из группы, состоящей из модификаций путем замены, модификаций путем N-концевого ацетилирования и модификаций путем C-концевого амидирования.

4. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 1 - 3, отличающаяся тем, что последовательность аминокислот выбрана из SEQ ID NO: 2 или ее активных фрагментов.

5. Фармацевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что последовательность аминокислот представляет собой SEQ ID NO: 2.

6. Фармацевтическая композиция по п. 1, которая представляет собой раствор, суспензию, эмульсию, ингаляционный порошок, аэрозоль или спрей.

7. Фармацевтическая композиция по п. 1, дополнительно содержащая один или более антибиотиков, подходящих для лечения грамотрицательных бактерий.

8. Фармацевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что указанная аминокислотная последовательность представляет собой SEQ ID NO: 4.

9. Способ предотвращения или лечения бактериальной инфекции, вызванной по меньшей мере одним видом грамотрицательных бактерий, включающий введение субъекту, у которого диагностирована, есть риск развития или проявляются симптомы бактериальной инфекции, эффективного количества фармацевтической композиции согласно любому из пп. 1 - 8.

10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что грамотрицательные бактерии выбраны из группы, состоящей из Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, Salmonella, Neisseria gonorrhoeae и Shigella.

11. Способ по п. 9, отличающийся тем, что по меньшей мере один вид грамотрицательных бактерий представляет собой Pseudomonas aeruginosa.

12. Способ по п. 9, отличающийся тем, что бактериальная инфекция представляет собой топическую или системную бактериальную инфекцию.

13. Способ по п. 9, дополнительно включающий введение указанному субъекту антибиотика, подходящего для лечения инфекции, вызванной грамотрицательной бактерией.

14. Способ по п. 13, отличающийся тем, что антибиотик выбран из одного или более из перечисленных: азитромицин, азтреонам, фосфомицин, цефтазидим, цефепим, цефоперазон, цефтобипрол, ципрофлоксацин, левофлоксацин, аминогликозиды, имипенем, меропенем, дорипенем, гентамицин, тобрамицин, амикацин, пиперациллин, тикарциллин, пенициллин, рифампицин, полимиксин B и колистин.

15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что антибиотик выбран из одного или более из перечисленных: амикацин, азитромицин, азтреонам, ципрофлоксацин, колистин, фосфомицин, гентамицин, имипенем, пиперациллин, рифампицин и тобрамицин.

16. Способ по п. 13, отличающийся тем, что введение фармацевтической композиции по пп. 1 - 8 более эффективно ингибирует рост, сокращает популяцию или уничтожает грамотрицательные бактерии, чем введение антибиотика отдельно.

17. Способ предотвращения или лечения бактериальной инфекции, вызванной по меньшей мере одним видом грамотрицательных бактерий, включающий совместное введение субъекту, у которого диагностирована, есть риск развития или проявляются симптомы бактериальной инфекции, комбинации эффективного количества фармацевтической композиции согласно любому из пп. 1 - 8 и эффективного количества антибиотика, подходящего для лечения инфекции, вызванной грамотрицательной бактерией,

причем указанные первое и второе количества вместе эффективны для предотвращения или лечения указанной бактериальной инфекции.

18. Способ по п. 17, отличающийся тем, что антибиотик выбран из одного или более из перечисленных: азитромицин, азтреонам, фосфомицин, цефтазидим, цефепим, цефоперазон, цефтобипрол, ципрофлоксацин, левофлоксацин, аминогликозиды, имипенем, меропенем, дорипенем, гентамицин, тобрамицин, амикацин, пиперациллин, тикарциллин, пенициллин, рифампицин, полимиксин B и колистин.

19. Способ по п. 17 или 18, отличающийся тем, что антибиотик выбран из одного или более из перечисленных: амикацин, азитромицин, азтреонам, ципрофлоксацин, колистин, фосфомицин, гентамицин, имипенем, пиперациллин, рифампицин и тобрамицин.