СПОСОБ НЕПРЕРЫВНОЙ ИНАКТИВАЦИИ ВИРУСОВ Российский патент 2019 года по МПК A61L2/00 

Изобретение касается способа непрерывной инактивации вирусов. В частности, изобретение касается способа непрерывной инактивации вирусов в петле выдерживания при низком рН.

Биофармацевтические производственные процессы требуют различных независимых этапов для снижения вирусной нагрузки. Часто используемым способом инактивации (оболочковых) вирусов является контактирование с кислой средой.

Инактивация вирусов при низком рН в периодическом режиме известна и часто используется в биофармацевтическом производстве активных субстанций, напр., антител (Sofer 2003, Virus Inactivation in the 1990s - and into the 21st Century. Part 4. BioPharm International). При этом инактивируемый материал, а именно жидкость, потенциально содержащую активные вирусы, помещают в подходящую емкость, доводят до рН ≤ 4 с помощью кислого раствора, при необходимости гомогенизируют и позволяют отстояться в течение необходимого

времени. Инактивация вирусов обусловлена контактом вирусов с кислым раствором в течение конкретного времени, зависящего от продукта и процесса. Все содержимое емкости таким образом подвергается инактивации на протяжении практически идентичного времени выдержки, и, следовательно, достигаемое снижение вирусной нагрузки в каждом элементарном объеме емкости тоже практически идентично.

Если процесс производства биофармацевтических и биологических продуктов, в частности, фармацевтических антител, должен происходить в непрерывном режиме, то необходимо обеспечить требуемое время выдержки для инактивации вирусов. Для целей настоящего изобретения непрерывная инактивация вирусов означает, что введение потока подачи в модуль инактивации вирусов и отвод потока продукта из модуля инактивации вирусов происходит без перерывов. Непрерывная работа производственной установки, содержащей по меньшей мере один биореактор, для целей настоящего изобретения означает, что введение потока подачи в биореактор и отвод потока продукта из производственной установки происходит без перерывов, в то же время некоторые стадии процесса могут быть выполнены в полунепрерывном режиме.

Требуемое для инактивации вирусов время выдержки (= время пребывания) может быть достигнуто в петле выдерживания. При этом достижение ламинарности потока в петле выдерживания может представлять некоторую трудность. При ламинарном течении в трубе устанавливается параболическая эпюра скоростей, что приводит к широкому распределению времени выдержки (Фиг. 1). Поскольку максимальная скорость в центре потока в трубе вдвое превышает среднюю скорость, но скорость возле стенок трубы равна нулю (условие прилипания), то в подобных случаях происходит очень широкий разброс по времени выдержки. Достигнутое таким способом время выдержки может колебаться от половины среднего времени выдержки (из-за быстротекущих элементарных объемов жидкости в середине трубы) до бесконечно длительного времени выдержки (из-за прилипания элементарных объемов жидкости, находящихся близко к стенкам). Поскольку, с одной стороны, минимальное время выдержки необходимо для эффективной инактивации вирусов, но, с другой стороны, длительное выдерживание при низком рН может повредить продукт (напр., белок), то достижение узкого распределения времени выдержки в режиме непрерывной работы является обязательным. В данном случае изменение ситуации с ламинарного потока на турбулентный поток идеального вытеснения, обладающий одинаковым временем выдержки, не является приемлемой альтернативой. Турбулентные потоки требуют высоких скоростей потока. Если необходимо добиться длительного времени выдержки, стандартного для инактивации вирусов при низком рН (например, 60-120 минут), это приводит к нежелательно крупным размерам установок.

Одним из способов осуществления непрерывной инактивации вирусов является УФ-облучение: WO 2002038191, ЕР 1339643 В1, ЕР 1464342 В1, ЕР 1914202 А1 и ЕР 1916224 А1 описывают использование спиральной петли выдерживания, в которой инактивируемый материал облучают ультрафиолетовым излучением и, следовательно, инактивируют присутствующие в нем вирусы. Во время протекания жидкости по спирально закрученной трубе на эту жидкость действует центробежная сила. Центробежные силы вызывают вторичные потоки (известные как вихри Дина), что приводит к улучшенному радиальному смешиванию и более гомогенному облучению инактивируемого материала. Спиральная структура, используемая в упомянутых документах, является прямой спиральной катушкой, направление оси спирали которой неизменно. Для использования в непрерывной инактивации вирусов при низком рН использование прямой спиральной структуры, как при облучении ультрафиолетом, непрактично, поскольку распределение времени выдержки может, конечно, быть уже, нежели в случае прямой трубы с ламинарным потоком, но все же слишком широко. По причине сравнительно широкого распределения времени выдержки такая геометрия все же привела бы к большим размерам установки для инактивации вирусов с помощью рН.

Поскольку, с одной стороны, необходимо достичь минимального времени выдержки для каждого элементарного объема жидкости, а с другой стороны, продукт, в частности белковый продукт, может быть поврежден при низком рН, то для инактивации вирусов с помощью рН необходимо добиться очень малого распределения времени выдержки.

Nigam et al. [US 7337835 B2, AIChE Journal (1984), Vol. 30, No. 3, p. 363-368, Chem. Eng. Comm. (1983) 23, 4-6, p. 277-289] указывают, что в случае потока в спиральной катушке изгибание осей спиральных катушек приводит к изменению в направлении действия нормалей центробежной силы на жидкость. Наименьшего распределения времени выдержки, по Nigam et al., можно добиться при значении числа Дина D_n≥3, в то время как при Dn<3 происходит расширение распределения времени выдержки. Авторы ссылаются на эту технологию как на "спиральный инвертор потока" (СИП). Принцип действия СИП показан на Фиг. 2. Центробежная сила, создающаяся спиральной формой трубы, генерирует вторичные потоки, в результате чего может быть реализовано узкое распределение времени выдержки в теплообменниках даже в случае ламинарного потока. Nigam et al. указывают, что выполнение 90°-ных изгибов обеспечивает значительно более узкое распределение времени выдержки, нежели в прямой спирали или в прямой трубе с ламинарным потоком. Nigam et al. также указывают, что чем больше изгибов использовано в конструкции, тем меньше распределение времени выдержки. С увеличением количества изгибов также достигается приближение распределения времени выдержки к таковому в трубе с турбулентным потоком и режимом идеального вытеснения.

Применимость такой формы трубы в процессах, требующих одновременно длительного времени выдержки и узкого распределения времени выдержки, напр., инактивации вирусов при низком рН, не изучена и не упоминается. Длительное время выдержки несущественно для работы теплообменника.

Таким образом, задачей настоящего изобретения было предоставить новое, простое и недорогое решение, делающее возможным достижение необходимого времени выдержки в петле выдерживания с непрерывным потоком, для непрерывной инактивации вирусов при низком рН с узким распределением времени выдержки.

Задача изобретения разрешена обеспечением устройства непрерывной инактивации вирусов в потоке продукта, включающего трубу или шланг 1, имеющую/-ий впуск 4 и выпуск 5, каждый из которых соединен с линией потока продукта 8 для передачи потока продукта.

- где труба или шланг 1 изогнут/-а и/или спирально закручен/-а с количеством витков n вокруг оси катушки h и имеет одно или более изменений направления и/или изгибов 2 оси катушки, угол которых составляет а от 45° до 180°, изменяющих направление действия нормалей центробежной силы и

- устройство характеризуется числом Дина >; 0 и параметром скручивания >; 0.

Устройство может, кроме числа Дина ≥ 0, также иметь число Дина ≥ 1, предпочтительно ≥ 2, предпочтительно ≥ 3, более предпочтительно ≥ 4.

Устройство может, кроме параметра скручивания ≥ 0, также иметь параметр скручивания ≥ 100, ≥ 200, ≥ 300, ≥ 400, особенно предпочтительно ≥ 500.

В особенно предпочтительном варианте осуществления устройство имеет число Дина ≥ 3 и параметр скручивания ≥ 500.

Труба или шланг 1 предпочтительно спирально закручена вокруг оси катушки h. Сечение оси катушки обычно круглое.

Образец изогнутой конфигурации известен из ЕР 0944431 А1, в частности на Фиг. 5-11, которые включены в данную заявку посредством ссылки вместе с их описанием.

Предлагаемое устройство может включать стойку-держатель 6, несущую одну или больше рамок 3. Альтернативно, стойка-держатель образует ось катушки. Рамки и/или стойка-держатель могут быть полыми или заполненными. Если шланг или труба 1 имеют достаточную прочность и гибкость, возможна также самоподдерживаемая структура.

Что касается размеров установки, то в настоящую заявку включены посредством ссылки указания Nigam et al.: US 7337835B2, AIChE Journal (1984), Vol. 30, No. 3, p. 363-368, Chem. Eng. Comm. (1983) 23, 4-6, p. 277-289. В частности, Nigam et al. указывают, что повышение смешивания в радиальном направлении, приводящее к сужению распределения времени выдержки, происходит даже при углах α от 45° до 180°, но предпочтительно в диапазоне от 40° до 120° и в частности 90°. Фиг. 2 демонстрирует принцип СИП согласно Nigam et al. и его конструктивные параметры для частного случая α=90°. Можно увидеть, как изменяется профиль потока в зависимости от направления спиральной катушки.

В качестве конструктивных параметров можно упомянуть:

внутренний диаметр шланга d_i

величину шага р

диаметр трубчатого каркаса катушки d_ct

- диаметр катушки d_c

- количество витков на плече n (плечо - это область прямой спиральной катушки между двумя последовательными изгибами)

- угол α изгибов

- количество изгибов (в продемонстрированной рамке - 4 изгиба на рамку)

Безразмерные параметры, описывающие систему - число Рейнольдса Re число Дина Dn и параметр скручивания Т.

Число Рейнольдса Re рассчитывается по формуле:

,

используя плотность жидкости ρ, среднюю скорость потока и динамическую вязкость η.

Число Дина Dn рассчитывается по формуле:

Параметр скручивания Т рассчитывается по формуле:

Nigam et al. указывают, что наилучших результатов возможно достичь, когда величина шага минимизирована, угол α=90°, число Дина равно не менее чем 3 и параметр скручивания ≥500. Для формирования стабильных вторичных потоков в спирали на каждом плече должно также быть по меньшей мере два полных витка. [AIChE Journal (1984), Vol. 30, No. 3, p. 363-368] и [Chem. Eng. Comm. (1983) 23, 4-6, p. 277-289].

Определение размеров предлагаемого устройства обычно выполняют следующим образом:

- В первую очередь устанавливают желаемый объемный расход.

- На его основании рассчитывают возможные размеры, используя вышеизложенные формулы, при условии, что число Дина предпочтительно ≥3 и параметр скручивания предпочтительно ≥500.

- Пример полученных кривых показан для объемного расхода 3 мл/мин на Фиг. 4. Подходящие размеры устройства можно найти, согласно Nigam et al., слева от благоприятной кривой для параметра скручивания = 500 и слева от благоприятной кривой для числа Дина = 3. Наиболее подходящие внутренний диаметр трубы и диаметр трубы катушки выбирают так, чтобы оптимизировать, в частности, занимаемое ими пространство. В данном случае внутренний диаметр шланга выбран таким образом, чтобы добиться минимально требуемого времени выдержки. Диаметр трубчатого каркаса катушки затем делают наименьшим из возможных. Это делают по причине того, что, согласно Nigam et al., распределение времени выдержки тем меньше, чем больше изгибов содержит секция выдерживания. Для определенной длины шланга секции выдерживания и определенного числа витков на одну спираль, можно сделать тем больше изгибов, чем меньше диаметр трубчатого каркаса катушки. Приблизительно можно рассчитать число изгибов "изгиб в секции выдерживания, имеющей длину L, где n_{плечо,рамка} - количество плеч в рамке, n_{виток,плечо} - количество витков на плечо, π - число пи и d_c - диаметр катушки, где d_c=d_ct+d_o: здесь, d_o - внешний диаметр шланга.

Согласно изобретению, вышеперечисленные параметры были выбраны в качестве примера для опытной установки непрерывной инактивации вирусов при объемном расходе около 3 мл/мин. Необходимую длину шланга рассчитывали на основе минимального времени выдержки, необходимого в данном конкретном случае, и внутреннего диаметра шланга. Следующий шаг - выбор диаметра трубчатого каркаса катушки таким образом, чтобы удовлетворять следующему условию: и число Дина ≥0, и параметр скручивания ≥0, предпочтительно и число Дина ≥2, предпочтительно ≥3, и параметр скручивания ≥300, предпочтительно ≥500. См. Фиг. 4.

Внутренний диаметр d_i трубы или шланга 1 обычно составляет от 1 до 30 мм, предпочтительно в диапазоне от 3 до 6 мм. Например, в опытной установке использовалась коммерчески доступная труба/шланг со внутренним диаметром 3 мм. Затем выбирали минимально возможный диаметр трубчатого каркаса катушки. Чем меньше выбранный диаметр трубчатого каркаса катушки, тем больше изгибов можно на ней реализовать для заданной длины шланга. Поскольку увеличение количества изгибов сужает распределение времени выдержки, это количество всегда должно быть настолько большим, насколько возможно.

Общую длину L и внутренний диаметр труб/шлангов 1 адаптируют к размерам всей установки / объемному расходу установки, так чтобы придерживаться необходимого в каждом конкретном случае времени выдержки.

В случае установки, имеющей вышеупомянутые размеры, общая длина L трубы или шланга 1 обычно составляет от 1 до 200 м, предпочтительно от 50 до 100 м.

Количество витков n между двумя изменениями направления и/или изгибами 2 обычно составляет не менее чем 2-20, предпочтительно 5-15, особенно предпочтительно 10, при этом количество витков выбирают таким образом, чтобы модуль занимал как можно меньший объем.

Если стойка-держатель образует ось катушки или шланг/труба 1 является самоподдерживающим, то ось катушки обычно имеет от 2 до n изменений направления и/или изгибов 2, где n может быть любым желаемым числом. Число n выбирают так, чтобы общая длина L труб/шлангов 1 была закручена вокруг модуля и занимала как можно меньший объем.

Если в качестве оси катушки используются рамки, то каждая рамка 3 обычно имеет от 2 до 6 изменений направления и/или изгибов 2. Предпочтение отдают квадратным рамкам (изгибы на 90°), как показано на Фиг. 2, но не ограничиваются этим. Одну или более рамок обычно закрепляют друг над другом на стойке 6, пока общая длина L трубы/шланга 1 не закручивается вокруг модуля и не занимает как можно меньший объем.

Узкое распределение времени выдержки, достигнутое таким путем, делает возможным достижение желаемого устранения вирусов при конкретном зависимом от продукта и процесса минимальном времени выдержки, без достижения максимального, также зависимого от продукта и процесса времени выдержки, которое привело бы к повреждению продукта (типично - от 30 минут для чувствительных к рН продуктов и до 120 минут для менее чувствительных продуктов). Необходимое время выдержки и максимальное время выдержки зависят от продукта и обычно определяются экспериментальным путем. Максимальное время выдержки оптимизируют так, чтобы повреждение продукта было минимальным, с целью уменьшить потребность в дальнейших стадиях очистки, насколько это возможно. Распределение времени выдержки приближается к среднему времени выдержки трубчатого реактора с идеальным потоком. Таким образом возможно обеспечить эффективную инактивацию вирусов в непрерывном режиме при низком рН, при которой результаты устранения вирусов и качество продукта сравнимы с инактивацией вирусов в периодическом режиме.

Возможно простое, масштабируемое и недорогое производство устройства (также и для одноразового использования), особенно при использовании рамок на стойке. Шланг/трубу закручивают на рамках нужным образом до или после стерилизации шланга/трубы. После использования модуля в производственном процессе шланг/трубу можно снять с рамок и утилизировать или очистить (если необходимо многоразовое использование). Углы изгибов должны иметь определенные значения. Расположение шланга/трубы также должно быть определено, напр., для простых и воспроизводимых катушек - с помощью направляющих пазов, фрезерованных в рамках. Таким образом обеспечивается одинаковая эффективность установки в каждом производственном цикле.

Кроме этого, устройство может быть стерилизуемым, предпочтительно автоклавируемым или иррадиируемым гамма-лучами. Для достижения подобных свойств предпочтение отдают использованию шлангов, соответствующих определенным требованиям качества, напр., медицинского качества (USP класса VI). Предлагаемое устройство предпочтительно автоклавируют или облучают гамма-лучами, что делает возможной работу в стерильных условиях.

Кроме того, предложен способ непрерывной инактивации вирусов в потоке продукта с применением устройства, включающий следующие стадии:

а) обеспечение потока инактивируемого продукта,

б) подачу потока продукта на впуск 4 трубы или шланга 1, имеющей/-его впуск 4 и выпуск 5, при этом труба или шланг 1 изогнут/-а и/или спирально закручен/-а с количеством витков п вокруг оси катушки h и имеет одно или более изменений направления и/или изгибов оси катушки 2 под углом α от 45° до 180° с целью изменения направления действия нормалей центробежной силы, где устройство характеризуется числом Дина ≥ 2 и параметром скручивания > 100,

в) прохождение потока продукта по трубе или шлангу 1 в вирус-инактивирующих условиях и

г) выход потока продукта из трубы или шланга 1 через выпуск 5,

причем рН потока продукта на стадии а) устанавливают на уровне ≤ 4, а после стадии г) рН доводят до ≥ 5 для того, чтобы остановить инактивацию вирусов.

Жидкий поток продукта, могущий содержать как продукт, так и инактивируемые вирусы, обеспечивается на стадии а).

Устройство на стадии б) предлагаемого способа может, кроме числа Дина ≥ 2, также иметь число Дина ≥ 3, предпочтительно ≥ 4.

Устройство на стадии б) предлагаемого способа может, кроме параметра скручивания > 100, также иметь параметр скручивания ≥ 200, ≥ 300, ≥ 400, особенно предпочтительно ≥ 500.

В особенно предпочтительном варианте осуществления устройство на стадии б) предлагаемого способа имеет число Дина ≥ 3 и параметр скручивания ≥ 500.

В качестве вирус-инактивирующих условий стадии в) можно упомянуть рН ≤ 4, обработку ультрафиолетом или термическую обработку.

На стадии а) значение рН потока продукта устанавливают на уровне ≤ 4, если инактивируемый материал еще не имеет необходимого значения рН. В этом случае после стадии г) рН доводят до ≥ 5 с помощью основания для того, чтобы остановить инактивацию вирусов.

Доводку рН инактивируемого раствора до ≤ 4 могут, например, проводить добавлением раствора HCl. Такое добавление обычно проводят выше по потоку от предлагаемого устройства.

рН продукта перед входом в устройство инактивации вирусов измеряют с помощью сенсора рН0501 (Фиг. 8). Этот рН-сенсор обычно не выполняет регулирующей функции. Запись рН-сигнала служит только для мониторинга процесса.

Если производственный процесс требует одной или нескольких регулировок рН, устройство для инактивации вирусов соединяют с модулем регулировки рН. Обычно используют два модуля регулировки рН, один перед инактивацией для приведения потока продукта к рН ≤ 4 (стадия б), и другой после инактивации для нейтрализации потока продукта (стадия г).

На стадии в) достигают желаемого времени контакта (= времени выдержки) кислого раствора и любых присутствующих вирусов.

В качестве основания на стадии г) возможно, например, использовать раствор гидроксида натрия (NaOH).

Способ может быть реализован как периодическая операция и как непрерывный производственный процесс, а значит, быть интегрированным в периодический и непрерывный процесс.

Если устройство для инактивации интегрируют в непрерывный производственый процесс, предпочтение отдают одному или более модулей регулировки рН, в которых поток продукта проходит петлю рециркуляции. На Фиг. 8 показан пример инактивации вируса и последующей нейтрализации, однако этим примером они не ограничиваются. М0503 передает поток продукта в мешок В0502, где рН после выхода со стадии инактивации вирусов доводят до значения ≥5. Содержимое мешка В0502 посредством рециркуляционного насоса М0504 передают через петлю рециркуляции на рН-сенсор рН0502, измеряющий рН потока продукта. После сенсора подают регулирующий агент для модицикации рН. Насос для подачи регулирующего агента М0505 регулируется связанным сенсором рН0502.

В предлагаемом способе поток инактивируемого продукта обычно представляет собой раствор из биореактора, в частности, раствор белка или пептида, особенно предпочтительно - раствор антител.

Техническим преимуществом непрерывной инактивации вирусов согласно предлагаемому изобретению, по сравнению с известной в данной области техники инактивацией вирусов в периодическом режиме, яляется возможность интегрировать ее в непрерывный рабочий процесс, также известный как "биотехнологическая очистка", без необходимости изменять режим работы процесса. В предложенном способе нет изменения режима процесса с периодического на непрерывный и обратно, но наоборот, вся "биотехнологическая очистка" или весь производственный процесс (как выше, так и ниже по потоку) может выполняться непрерывно.

В данной заявке также предлагается производственная установка, включающая одно или более предлагаемых устройств для непрерывной инактивации вирусов в потоке продукта и предпочтительно по меньшей мере один модуль регулировки рН.

Предлагаемое изобретение, включая предпочтительные варианты осуществления, проиллюстрировано следующими чертежами и примерами, не ограничиваясь ими. Варианты осуществления могут быть скомбинированы любым желаемым способом, кроме тех случаев, когда из контекста ясно иное.

Используются следующие обозначения:

1 = изогнутая/-ый и/или спирально закрученная/-ый труба или шланг

2 = изменения направления и/или изгибы 2 оси катушки h под углом α от 45° до 180°

3 = рамка

4 = впуск

5 = выпуск

6 = стойка-держатель

7 = основание

8 = линия потока продукта

Фиг. 1 иллюстрирует параболический профиль потока в трубе, по которой идет ламинарный поток (сверху: труба в продольном разрезе). Линии одинаковой скорости в направлении потока в трубе, по которой идет ламинарный поток (снизу: труба в поперечном разрезе).

а = стенка трубы

b = аксиальная ось трубы по направлению потока

с = радиальная ось

d = линии одинаковой скорости потока в направлении потока

На Фиг. 2 показан принцип и конструктивные параметры СИП с изображением профиля потока.

Показаны линии одинаковой скорости в направлении потока. Профили потока взяты из: Ind. Eng. Chem. Res. (2008), 47, 10, pp. 3630-3638

- внутренний диаметр шланга d_i

- внешний диаметр шланга d_o

- величина шага p

- диаметр трубчатого каркаса катушки d_ct

- диаметр катушки d_c

- угол α изгибов

е = направление действия центробежной силы

f = направление потока через спиральные катушки

g = направление потока жидкости в спиральной катушке

h = ось катушки/ось спирали

На Фиг. 3 показаны результаты изучения поведения по времени выдержки устройства непрерывной инактивации вирусов, имеющего различное количество изгибов, при объемном расходе 3 мл/мин, по сравнению с прямой трубой с ламинарным потоком и трубой идеального потока. (Изгиб = 90°-ное изменение направления для изменения нормалей направления действия центробежной силы на поток. Безразмерная концентрация 1 соответствует концентрации витамина В12 0,25 г/л).

На Фиг. 4 показан график проектирования СИП для объемного расхода 3 мл/мин.

На Фиг. 5 показана фотография устройства, использованного для опытов измерения времени выдержки (4 рамки).

На Фиг. 6 показана ступенчатая функция раствора-индикатора, введенного в Примере 1 на впуске устройства инактивации вирусов.

i = ось времени

j = ось УФ-сигнала

k = момент времени, в которой раствор-индикатор вводили на впуске СИП

На Фиг. 7 показан чертеж устройства непрерывной инактивации вирусов согласно примеру СИП. Слева: стойка-держатель со смонтированными рамками. Справа: стойка-держатель без смонтированных рамок.

На Фиг. 8 показана технологическая схема инактивации вирусов с последующей регулировкой рН; спирально закрученная труба 1, а также ее изменения направления и/или изгибы 2 показаны исключительно схематически.

Фиг. 9. Схема конструкции рамки, использованной в опытах.

Пример 1:

Конструкцию рамок выполняли, как показано на Фиг. 4. График был построен для объемного расхода 3 мл/мин и показывает диапазон, в котором можно изменять такие конструктивные параметры, как внутренний диаметр шланга и диаметр трубчатого каркаса катушки, с целью придерживаться при конструировании рамок необходимых условий значений числа Дина ≥3 и параметра скручивания ≥500.

Для опытов был выбран внутренний диаметр шланга 3 мм. Затем был выбран диаметр трубчатого каркаса катушки 63 мм, так что длина шланга, закрученного на каждой рамке, была бы минимальной.

Размеры использованной в опыте установки, результаты работы которой показаны на Фиг. 3, являются следующими:

Диаметр рамки (диаметр трубчатого каркаса катушки) 63 мм; длина рамки по внешним краям 195 мм. Внутренний диаметр шланга 3 мм; внешний диаметр шланга 5 мм. Рамки конструировали как показано на Фиг. 9.

На каждом плече всегда находилось 11 витков при минимальной величине шага, так что на рамке было закручено 9,5 м шланга. Минимальная величина шага означает, что шланг находится в контакте со спиралью. Для случая "3 изгиба" использовалась одна рамка. Следовательно, в данном опыте использовали 9,5 м шланга. Для случая "15 изгибов" использовали 4 рамки. На четырех рамках было в общей сложности закручено 38 м шланга. Для случая "27 изгибов" использовали семь рамок. На семи рамках было в общей сложности закручено 66,5 м шланга. Длина шланга, использованная на одну рамку, при условии постоянного количества витков на плечо, пропорциональна диаметру трубчатого каркаса катушки. Внешний диаметр использованного шланга составлял 5 мм.

На Фиг. 5 показано взаиморасположение рамок и катушек шланга, использованное в опытах измерения времени выдержки. Однако по соображениям ясности для данной фигуры был использован больший диаметр шланга (внутренний диаметр шланга 6 мм). Следовательно, нанести использованные в опытах 11 витков на плечо было невозможно.

В экспериментальной установке шланг, использованный в соответствующих опытах, как показано на Фиг. 2 и Фиг. 5, сначала был свит отдельно на каждой рамке. Рамки со шлангами были затем расположены одна над другой на стойке-держателе. Выпуск верхней рамки был подсоединен ко впуску подлежащей рамки, так что катушка шланга проходила через рамки сверху вниз. Альтернативно поток может проходить также снизу вверх или горизонтально.

Опыты измерения времени выдержки в устройстве для непрерывной инактивации вирусов (СИП) выполняли с помощью УФ-измерений на выпуске системы. Объемный расход всегда составлял 3 мл/мин, внутренний диаметр используемых силиконовых шлангов 3 мм, внешний диаметр шлангов 5 мм. Внешний диаметр рамок, на которых были закручены шланги, составлял 63 мм (диаметр трубчатого каркаса катушки). Раствор витамина В12 концентрацией 0,25 г/л использовали в качестве субстанции-индикатора, поскольку витамин В12 поглощает ультрафиолетовое излучение при длине волны 280 нм и, таким образом, подходит для использования в качестве индикатора.

Сначала СИП промывали дистиллированной водой. В момент времени к изменяли раствор-индикатор на впуске инактивации вирусов и записывали измерительный сигнал УФ-сенсора (см. Фиг. 6). Затем к системе применяли ступенчатую функцию раствора-индикатора. Когда УФ-сигнал на выпуске системы соответствовал УФ-сигналу раствора-индикатора, опыт можно было остановить, поскольку система с этого момента была полностью заполнена раствором-индикатором, и таким образом, ответ системы на ступенчатую функцию был полностью записан.

Для различных записанных кривых времени выдержки измерения нормализовали до безразмерных параметров с целью сделать возможным их сравнение. Время нормализовали до среднего времени выдержки τ;

где V - перепускной объем секции выдерживания, и - объемный расход.

Безразмерные концентрации получали нормализацией измеренного УФ-сигнала до максимального записанного УФ-сигнала (при концентрации витамина В12 0,25 мг/л). Концентрация витамина В12 0,25 мг/л, следовательно, была принята за безразмерную концентрацию 1. УФ-сигнал дистиллированной воды был принят за безразмерную концентрацию 0.

Результаты измерений показаны на Фиг. 3. Распределение времени выдержки в прямой трубе с ламинарным потоком аналитически определяли по следующему уравнению. F(θ) - безразмерная концентрация и θ - безразмерное время.

Прямая труба с ламинарным потоком, благодаря параболическому профилю потока, имеет сравнительно широкое распределение времени выдержки. Элементарные объемы жидкости в центре трубы передвигаются значительно быстрее, чем те, которые находятся в близкой к стенке области (см. Фиг. 1).

Если же, с другой стороны, шланг спирально закручен, то центробежная сила вызывает смешивание системы в радиальном направлении. Как следствие, медленно текущие элементарные объемы жидкости, относительно близкие к оси спирали, движутся вовне и смещают элементарные объемы, расположенные там, вовнутрь. В результате введения в конструкцию изгибов вторичные потоки, вызванные центробежной силой, выстраиваются заново, что приводит к улучшенному радиальному смешиванию. На Фиг. 2 показано, как профиль потока поворачивается на 90° после каждого 90°-ного изгиба. Как можно увидеть на Фиг. 3, использование изгибов позволяет достигнуть значительного сужения распределения времени выдержки.

Наилучший результат во время тестов показал СИП, имеющий 27 изгибов (большее количество изгибов не испытывали). Было получено распределение времени выдержки, приближенное к таковому в трубе с идеальным потоком. Возможно, дополнительные изгибы могут еще больше сузить распределение времени выдержки. Описанная технология, таким образом, подходит в качестве способа непрерывной инактивации вирусов.

Работа, легшая в основу данной патентной заявки, была проведена во исполнение соглашения о финансовой поддержке "Bio.NRW: MoBiDiK - Modulare Bioproduktion - Disposable und Kontinuierlich" в рамках Европейского Фонда Регионального Развития (ЕФРР).

Изобретение относится к снижению вирусной нагрузки в биофармацевтических производственных процессах. Представлен способ непрерывной инактивации вирусов в потоке продукта с применением устройства, включающий: обеспечение потока инактивируемого продукта, подачу потока продукта на впуск трубы или шланга, прохождение потока продукта по трубе или шлангу в вирус-инактивирующих условиях и выход потока продукта из трубы или шланга через выпуск. Причем труба или шланг изогнут/-а и/или спирально закручен/-а с количеством витков n вокруг оси катушки h и имеет одно или более изменений направления и/или изгибов оси катушки под углом α от 45° до 180° с целью изменения направления действия нормалей центробежной силы, где устройство характеризуется числом Дина ≥2 и параметром скручивания >100. При этом рН потока продукта на стадии обеспечения потока устанавливают на уровне ≤4, а после стадии выхода потока рН доводят до ≥5 для того, чтобы остановить инактивацию вирусов. Достигается простота и надежность инактивации вирусов. 2 з.п. ф-лы, 9 ил.

1. Способ непрерывной инактивации вирусов в потоке продукта с применением устройства, включающий следующие стадии:

а) обеспечение потока инактивируемого продукта,

б) подачу потока продукта на впуск (4) трубы или шланга (1), имеющей/-его впуск (4) и выпуск (5), при этом шланг или труба (1) изогнут/-а и/или спирально закручен/-а с количеством витков n вокруг оси катушки h и имеет одно или более изменений направления и/или изгибов оси катушки (2) под углом α от 45° до 180° с целью изменения направления действия нормалей центробежной силы, где устройство характеризуется числом Дина ≥2 и параметром скручивания >100,

в) прохождение потока продукта по трубе или шлангу (1) в вирус-инактивирующих условиях и

г) выход потока продукта из трубы или шланга (1) через выпуск (5),

причем рН потока продукта на стадии а) устанавливают на уровне ≤4, а после стадии г) рН доводят до ≥5 для того, чтобы остановить инактивацию вирусов.

2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что устройство на стадии б) характеризуется числом Дина ≥3 и параметром скручивания ≥300, предпочтительно ≥500.

3. Способ по п. 1 или 2, характеризующийся тем, что инактивируемый раствор является раствором макромолекул, предпочтительно раствором белка или пептида, особенно предпочтительно раствором антител.