ВАЛИДАЦИЯ ОЧИЩЕНИЯ ВИРУСА В НЕПРЕРЫВНОМ РЕЖИМЕ Российский патент 2021 года по МПК C12Q1/68 C12Q1/22 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Данная заявка является международной заявкой в соответствии с Договором о патентной кооперации, которая заявляет приоритет по европейской заявке ЕР № 16194959.9, поданной 21 октября 2016 г., содержание которой настоящим включено посредством ссылки во всей своей полноте.

Непрерывная обработка для производства терапевтических белков приобретает все большую важность, и появляются первые решения для реализации действительно непрерывных систем. Важной частью непрерывного процесса производства терапевтических белков является вирусная инактивация. Klutz с соавт. представили спиральный инвертор потока (CFI) в качестве инструмента для непрерывной вирусной инактивации при низком pH (Klutz, S. et al. 2015, Journal of Biotechnology 213, стр. 120 - 130). Он предлагает жесткие и определенные распределения времени пребывания, чтобы адаптировать концепцию периодического процесса для непрерывных процессов (Klutz, S. et al. (2015) Chemical Engineering Research and Design 95, стр. 22 - 33). Кроме того, особенно интересными являются непрерывные процессы производства терапевтического белка, допускающие использование одноразовой технологии.

Однако, чтобы использовать непрерывную обработку для производства терапевтических белков в соответствии с нормативными принципами и стандартами, такими как GMP (ICH Harmonized Tripartite Guideline - Согласованное трёхстороннее руководство Международной конференции по гармонизации), FDA (нормативы CBER, 2/28/1997) и EMEA (нормативы 1996 г. CPMP/BWP/268/95, или нормативы 2009 г. EMEA/CHMP/BWP/398498), необходимо не только обеспечить, чтобы любое вирусное загрязнение было надежно удалено, но также необходимо это продемонстрировать.

Следовательно, тестирование на очищение от вирусов требуется контролирующими органами для подачи на рассмотрение исследуемых лекарственных препаратов (IND), и это имеет особенно важное значение при разработке процессов, среди прочего, для антител (моноклональных), рекомбинантных белков и гликопротеинов, а также продуктов, производных из тканей и крови.

Другими словами, эффективное очищение от вирусов является обязательным для всех биофармацевтических процессов производства, чтобы гарантировать безопасность пациентов. Например, для получения моноклональных антител (mAb) необходимы две независимые специализированные стадии очищения от вирусов. Каждая стадия должна достигать логарифма величины уменьшения (LRV) ≥ 4.

Поэтому целью настоящего изобретения было предоставить новое, простое и недорогое решение для демонстрации того, что вирусное загрязнение надежно очищено, то есть, удалено или инактивировано.

Изобретение достигает этой цели путем предоставления способа валидации очищения от вирусов в непрерывном режиме, включающего стадии:

a) предоставление пробы, подлежащей валидации,

b) внесение в пробу добавки для анализа допустимым способом,

c) осуществление очищения от вирусов,

d) отбор образца из пробы с внесенной добавкой для анализа и

e) анализ образца из пробы с внесенной добавкой для анализа со стадии d).

Данный способ обладает тем преимуществом, что он создает возможность для простой и недорогой валидации очищения от вирусов в непрерывном режиме.

В контексте данного документа термин «валидация» относится к процессу установления доказательства или высокой степени уверенности в том, что конкретный процесс, метод или система будут в обязательном порядке давать результат, отвечающий заранее определенным критериям приемлемости. Например, в фармацевтической промышленности очень важно удостовериться, чтобы процесс, адаптированный для самостоятельного проведения, постоянно будет воспроизводить ожидаемые результаты.

В контексте данного документа термин «в непрерывном режиме» относится к тому факту, что валидация выполняется непрерывно в процессе обработки пробы. В отличие от этого, в «периодическом» способе полная загрузка пробы, например, продукта, будет подвергнута валидации в заданный момент времени. Другими словами, непрерывный процесс, в контексте данного документа, относится к процессу для выполнения по меньшей мере двух последовательных стадий процесса, в соответствии с которым вторая стадия процесса начинает обработку пробы до того, как завершается первая стадия процесса.

В контексте данного документа термин «очищение» относится к удалению вирусных частиц или инактивации вирусных частиц.

Таким образом, стадия выполнения очищения от вирусов приводит к тому, что в пробе присутствует меньше вирусных частиц и/или вирусные частицы больше не способны инфицировать клетки, особенно клетки-хозяева, то есть, они инактивируются.

В контексте данного документа термин «проба» относится к веществу, потенциально содержащему вирусы.

В контексте данного документа термин «внесение добавки для анализа» относится к преднамеренному увеличению количества вирусной нагрузки в существенной степени.

В контексте данного документа термин «вирус» используется взаимозаменяемо с термином «вирусная частица» и относится к агенту, который меньше бактерии и который может воспроизводиться только после заражения клетки-хозяина.

Во многих случаях исследований очищения от вирусов концентрация вирусов в заданном образце является чрезвычайно низкой. В других процессах экстракции низкие уровни примесей можно не принимать в расчет, но поскольку вирусы являются инфекционными примесями, даже одной вирусной частицы может быть достаточно, чтобы разрушить всю технологическую цепочку. Именно по этой причине необходимо принять специальные меры для определения подходящего способа удаления или инактивации для любого типа вируса, извлекаемого из любого типа пробы.

Исследования с внесением добавки для анализа были созданы специально для этой цели. Исследование с внесением добавки для анализа представляет собой исследование, проведенное, чтобы определить возможные методы удаления вируса, то есть, очищения или инактивации. Они основываются на том принципе, что увеличение количества вирусов (или уровня активности) пробы в 10⁴ или 10⁵ раз по сравнению с исходным будет изменять соотношения удаления/инактивации вируса только на один порядок. На основании этих знаний были проведены исследования с внесением добавки для анализа, известные в данной области техники, в которых количество вирусов (или уровень активности) увеличивается или «вносится добавкой для анализа» в 10⁴ или 10⁵ раз по сравнению с исходной пробой. Затем проба с этим новым высоким количеством или уровнем активности обычно подвергается выбранному методу очищения. В уровне техники определение количества вирусов или уровень активности берется в начале и в конце выбранного метода очистки и используется при расчете коэффициента ослабления. Этот коэффициент ослабления (RF - сокр. от англ. Reduction Factor) из общепринятых исследований для стадии удаления или инактивации вируса вычисляется с использованием следующего уравнения:

RF_стадии = log₁₀ [(V1 x T1)/(V2 x T2)]

где:

• V1 = объем исходного сырья с внесенной добавкой для анализа до стадии очищения;

• T1 = концентрация вируса в исходном сырье с внесенной добавкой для анализа до стадии очищения;

• V2 = объем материала после стадии очищения; и

• T2 = концентрация вируса в материале после стадии очищения.

В контексте данного документа термин «допустимый способ» относится к тому факту, что внесение добавки для анализа должно выполняться воспроизводимо, а желаемый уровень содержания вирусных частиц должен обеспечиваться всегда.

Другими словами, необходимо обеспечить, чтобы точка внесения добавки для анализа выбиралась таким образом, чтобы содержание вирусных частиц неизменно достигало желаемого уровня, независимо от отдельной операции перед очищением от вирусов.

Следовательно, метод очищения от вирусов должен учитывать конкретные особенности непрерывного процесса, например, изменяющиеся уровни pH, время пребывания, температуру, концентрации добавок, гомогенность раствора и проводимость.

В одном варианте исполнения способа валидации проба представляет собой поток и/или поток продукта.

В контексте данного документа термин «поток» относится к непрерывному течению жидкости и/или газа.

В контексте данного документа термин «поток продукта» относится к потоку, содержащему продукт.

В одном варианте исполнения способа валидации, описанного здесь, проба представляет собой поток продукта. Этот поток продукта, например, течет из одной отдельной операции к другой отдельной операции, пока продукт не достигнет желаемых характеристик.

В альтернативном варианте исполнения способа валидации, описанного здесь, проба представляет собой поток. Этот поток может представлять собой, например, поток, входящий в производственный процесс.

Один и тот же производственный процесс может включать как способ валидации, описанный здесь, в котором проба представляет собой поток продукта, так и способ валидации, описанный здесь, в котором проба представляет собой поток.

Коэффициент ослабления, необходимый для конкретного потока и/или потока продукта, зависит от многих различных факторов, некоторые из которых включают:

• ожидаемую начальную концентрация вируса, и/или

• очищаемый продукт, и/или

• инфицирующую дозу вируса (для использования in vivo), и/или

• является ли инактивация равноценной альтернативой полному удалению, и если это так, то условия этой инактивации.

Для добавления материала, вносимого как добавка для анализа, можно использовать насос или шприц.

В предпочтительном варианте исполнения способа валидации, описанного в данном документе, стадия внесения в пробу добавки для анализа правильным образом выполняется с использованием разъема, например Y-образного соединения и/или T-образного соединения.

В предпочтительном варианте исполнения способа валидации, описанного в данном документе, не используется никакого смесительного блока для смешивания потока и/или потока продукта и материала для внесения добавки для анализа.

В альтернативном варианте для смешивания потока и/или потока продукта и материала для внесения добавки для анализа используют статический смеситель и/или смесительный сосуд или сосуд без перемешивания.

В одном варианте исполнения способа валидации, описанного в данном документе, стадия d) отбора образца из пробы с внесенной добавкой для анализа включает отбор образца в течение предварительно определенного периода времени.

Этот вариант исполнения является предпочтительным, поскольку он учитывает, что в непрерывном производственном процессе поток продукта может подвергаться периодически колеблющимся условиям в различных отдельных операциях, например, в том, что касается значения pH, проводимости или концентрации продукта.

Преимущество этого варианта исполнения становится особенно очевидным при ссылке на пример, описанный ниже. В этом примере поток продукта представляет собой элюат из непрерывной хроматографии, а для вирусной инактивации используется спиральный инвертор потока (CFI). В этом варианте исполнения отбор образца в течение заранее определенного периода времени, то есть фиксированная продолжительность отбора образца, обладает тем эффектом, что исключаются влияния колеблющегося рН, являющегося результатом непрерывной хроматографии. В этом предпочтительном варианте исполнения, кроме того, предпочтительно, чтобы продолжительность отбора образца была установлена на время одного переключения.

В контексте данного документа термин «время переключения» относится ко времени, в течение которого непрерывная хроматография элюирует определенную колонку перед переключением на следующую колонку для элюирования.

Посредством установки продолжительности отбора образца на время одного переключения собирается полный набор ожидаемых уровней pH, полученных в результате непрерывной хроматографии. Другими словами, посредством отбора образца на протяжении предварительно определенного периода времени, например, времени переключения, учитываются периодически изменяющиеся условия. В противном случае, например, в случае измерения pH после непрерывной хроматографии, результат может быть искаженным или не воспроизводимым, в зависимости от того, взят ли образец в тот момент времени, когда поток продукта, выходящий из непрерывной хроматографии, имеет высокий уровень pH, по сравнению с моментом времени, когда поток продукта, выходящий из непрерывной хроматографии, имеет низкий уровень рН. Таким образом, чтобы предоставить способ, который надежно дает один и тот же результат при одинаковых условиях, то есть, который подходит для процедуры валидации для вирусной инактивации в непрерывном режиме, предпочтительно, чтобы стадия отбора проб с внесенной добавкой для анализа включала отбор проб в течение заранее определенного периода времени, например, времени переключения, в случаях, когда отдельная операция, предшествующая инактивации вируса, имеет периодически изменяющиеся условия.

В одном варианте исполнения способа валидации, описанного в настоящем документе, проба содержит по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из пептида, белка, низкомолекулярного лекарственного средства, нуклеиновой кислоты.

В контексте данного документа термин «пептид» относится к полимеру из аминокислот относительно короткой длины (например, менее 50 аминокислот). Этот полимер может быть линейным или разветвленным, он может содержать модифицированные аминокислоты, и он может прерываться не аминокислотами. Этот термин также охватывает аминокислотный полимер, который был модифицирован; например, путем образования дисульфидной связи, гликозилирования, липидизации, ацетилирования, фосфорилирования или любых других манипуляций, таких как соединение с метящим компонентом, таким как, но без ограничения ими, флуоресцентные маркеры, частицы, биотин, шарики, белки, радиоактивные метки, хемилюминесцентные метки, биолюминесцентные метки и тому подобное.

В контексте данного документа термин «белок» относится к полипептиду из аминокислот. Термин охватывает белки, которые могут быть полноразмерными, дикого типа или их фрагментами. Белок может быть человеческим, не человеческим, и искусственным или химическим миметиком соответствующей встречающейся в природе аминокислоты, а также встречающихся в природе аминокислотных полимеров и не встречающегося в природе аминокислотного полимера.

Предпочтительно, белок представляет собой терапевтический белок.

В контексте данного документа термин «терапевтический белок» относится к белку, который можно вводить в организм, чтобы вызвать биологический или соматический ответ ткани, органа или системы указанного организма.

Еще более предпочтительно белок представляет собой антитело.

Термин «антитело» в контексте данного документа относится к связывающей молекуле, такой как иммуноглобулин или иммунологически активная часть иммуноглобулина, то есть, молекуле, которая содержит участок связывания антигена.

В контексте данного документа термин «низкомолекулярное лекарственное средство» относится к соединению с низкой молекулярной массой (< 900 дальтон), которое может помочь регулировать биологический процесс.

В контексте данного документа термин «нуклеиновая кислота» относится к дезоксирибонуклеотидам или рибонуклеотидам и их полимерам в одноцепочечной или двухцепочечной форме. При отсутствии конкретных ограничений, эти термины охватывают нуклеиновые кислоты, содержащие аналоги природных нуклеотидов, которые обладают такими же свойствами связывания, что и эталонная нуклеиновая кислота, и метаболизируются способом, аналогичным встречающимся в природе нуклеотидам. Если не указано иное, конкретная последовательность нуклеиновой кислоты также потенциально включает ее консервативно модифицированные варианты (например, замены вырожденных кодонов) и комплементарные последовательности, а также явно указанную последовательность.

В примере, описанном ниже, для вирусной инактивации использовался спиральный инвертор потока (CFI). Он был сконструирован, чтобы обеспечить определенное минимальное время пребывания.

В контексте данного документа термин «минимальное время пребывания» относится ко времени, в течение которого отдельный вирус/вирусная частица по крайней мере остается в данном устройстве, например, CFI.

В одном варианте исполнения способа валидации, описанного в данном документе, стадия внесения добавки для анализа допустимым способом включает внесение добавки для анализа в образец после гомогенизации.

В контексте данного документа термин «гомогенизация» относится к отдельной операции, которая обеспечивает, чтобы одна или несколько характеристик пробы, которые являются важными для очищения от вирусов, являются однородными внутри этой пробы.

Например, если проба представляет собой поток продукта, отдельная операция перед очищением от вирусов является непрерывной хроматографией, а характеристикой пробы, которая важна для очищения от вирусов, является значение рН, то гомогенизация гарантирует, что весь поток продукта при выходе из этой гомогенизации находится при одном и том же уровне рН.

В предпочтительном варианте исполнения гомогенизацию проводят в контуре гомогенизации.

В контексте данного документа термин «контур гомогенизации» относится к ёмкостному реактору с непрерывным перемешиванием (CSTR), сконструированному из трубопровода. Другими словами, контур гомогенизации состоит не из одного большого резервуара с перемешивающим устройством, а скорее из кольцевой компоновки трубопроводов, через которую прокачивается поток. Поскольку внутренний объемный поток выше, чем входной и выходной потоки, достигается хорошее перемешивание входящего потока.

При использовании контура гомогенизации в виде ёмкостного реактора с непрерывным перемешиванием (CSTR) для регулирования уровня рН непрерывной хроматографии, который колеблется между рН 3 и рН 7, невозможно определить, из какой конкретной хроматографической колонки происходит данный образец. Следовательно, отобранный объем может содержать элюат из одной или даже двух неопределенных колонок системы непрерывной хроматографии. Чтобы исключить влияние различных хроматографических колонок, некоторые точки отбора проб внутри CFI отбирались дважды.

В примере, обсуждаемом ниже, точка внесения добавки для анализа была установлена после контура гомогенизации.

Это имело место, так как CFI был фактическим устройством инактивации вируса при низком pH. Следовательно, внесение добавки для анализа перед контуром гомогенизации вызвало бы потенциальную потерю в максимальном LRV, потому что проба имеет определенное время пребывания при низких уровнях pH в контуре гомогенизации до фактической отдельной операции (UO - сокр. от англ. Unit Operation), то есть, вирусной инактивации при низком pH в CFI.

В одном варианте исполнения способа валидации, описанного здесь, очищение от вирусов на стадии с) представляет собой вирусную инактивацию.

Эту вирусную инактивацию предпочтительно проводят при уровне pH ≤ 4. При этих условиях вирусная инактивация обладает тем эффектом, что если задано подходящее время пребывания, она надежно инактивирует большие вирусы в оболочке.

В одном варианте исполнения способа валидации, описанного в настоящем документе, очищение от вирусов на стадии c) очищения от вирусов представляет собой вирусную инактивацию, которая осуществляется в спиральном инверторе потока (CFI).

Эта вирусная инактивация проводится, например, при уровне pH ≤ 4 в CFI. Использование CFI является благоприятным, поскольку оно обеспечивает, что время пребывания, необходимое для инактивации вируса, является стабильным и гарантирующим сокращение.

Предпочтительно, вирусную инактивацию проводят при уровне pH ≤ 4.

Однако вирусная инактивация также может быть достигнута с использованием растворителей и/или детергентов, таких как три(н-бутил)фосфат и Твин или Тритон Х-100, или других инактивирующих химических веществ, таких как йод или бета-пропиолактон. Кроме того, инактивация вируса с использованием CFI также может быть достигнута путем облучения и/или осаждения, например, с использованием каприловой кислоты.

Кроме того, может быть использована комбинация вирусной инактивации посредством обработки при низком pH и использования растворителей и/или детергентов и/или облучения и/или осаждения.

В другом варианте исполнения способа валидации, описанного в данном документе, очищение от вирусов на стадии с), в дополнение или вместо CFI, проводят в реакторе идеального вытеснения, прямой трубке и/или прямом змеевике.

В еще одном варианте исполнения способа валидации, описанного в данном документе, стадия отбора образца пробы с внесенной добавкой для анализа включает отбор образца методом «от конца к началу».

В контексте данного документа термин «отбор образца методом «от конца к началу»» относится к способу, в котором отбор образца начинается в конце процесса, а затем продвигается по направлению к началу указанного процесса.

Например, в случае вирусной инактивации в CFI отбор образца методом «от конца к началу» означает, что первые образцы отбираются на выходе или рядом с выходом из CFI, тогда отбор образца продолжается по направлению ко входу в CFI, то есть, против движения потока в CFI.

В случае вирусной инактивации в виде непрерывного процесса отбор образца методом «от конца к началу» имеет то преимущество, что поток или поток продукта не нужно останавливать, чтобы взять образец в начале этого непрерывного процесса. В случае примера, описанного ниже, такая остановка непрерывного потока продукта искажала бы анализ, поскольку вирусная инактивация продолжалась бы при низком значении pH ≤ 4, но поток продукта не проходил бы через CFI. Следовательно, уровень вирусной инактивации больше не коррелировал бы с расстоянием, на которое поток продуктов продвинулся в CFI. Кроме того, необходимую часть CFI пришлось бы сначала промывать и достигать стационарного состояния после каждого отбора образца, что привело бы к значительно увеличенной продолжительности эксперимента.

Кроме того, отбор образца внутри CFI приводит к нарушению структуры внутреннего потока. Поэтому способ отбора образца должен был быть выбран тщательно, чтобы гарантировать достоверные результаты также по этой причине. Таким образом, в примере, описанном ниже, отбор образца начинался в XM18 и заканчивался в XM12 (см. ФИГ. 3).

В еще одном варианте исполнения способа валидации, описанного в данном документе, стадия отбора образца пробы с внесенной добавкой для анализа включает немедленную нейтрализацию каждой капли пробы, когда она поступает в контейнер для отбора образца.

Эта характерная особенность немедленной нейтрализации каждой капли пробы, когда она поступает в контейнер для отбора образца, может быть достигнута путем заполнения контейнера буферным раствором, который немедленно сдвигает значение рН до ~ 7, например, 2М раствором Трис-буфера. Таким образом, это обеспечивает, чтобы в случаях вирусной инактивации с использованием низких значений pH, которая сильно зависит от времени, реакция надежно останавливалась сразу после отбора образца, тем самым предотвращая неоднородное время пребывания при низких уровнях pH внутри образца.

Предпочтительно, образцы отбираются через трехходовые запорные краны. Кроме того, может быть использован любой метод отбора образца, который позволяет отбирать пробы без прерывания процесса, например, могут использоваться Т-образные соединения или трубка CFI может быть последовательно укорочена.

В еще одном варианте исполнения способа валидации, описанного в данном документе, стадия d) анализа образца пробы с внесенной добавкой для анализа включает определение того, присутствуют ли вирусные частицы.

Это определение может быть выполнено с помощью метода, который позволяет увеличение числа вирусных частиц и их определение, например, с использованием стандартных методов, известных в данной области, таких как секвенирование нового поколения и/или другие методы на основе ПЦР в сочетании с методами секвенирования.

В другом варианте исполнения способа валидации, описанного в данном документе, стадия d) - анализ образца пробы с внесенной добавкой для анализа - включает количественное определение вирусных частиц.

В целом, количественная оценка вируса включает подсчет количества вирусов в определенном объеме для определения концентрации вируса с помощью таких методов, как анализ бляшкообразования, анализ инфекционных центров, титрование в конечной точке - также называемое анализом разведения в конечной точке - анализы количественной оценки вируса на основе белка, просвечивающая электронная микроскопия, регулируемое резистивное импульсное зондирование, количественная ПЦР и/или культивирование в большом объеме (англ. large volume plating).

Предпочтительно, указанное количественное определение вирусных частиц достигается посредством титрования в конечной точке и/или посева в большом объеме.

Титрование в конечной точке - также называемое анализом разведения в конечной точке - количественно определяет количество вируса, необходимое для уничтожения 50 % инфицированных клеток-хозяев или для получения цитопатического действия в 50 % инокулированных клеток культуры ткани. Таким образом, это относится к дозе, инфицирующей культуру ткани (TCID50), как к количественному показателю титра инфекционного вируса. При использовании в контексте культуры ткани клетки-хозяева высевают и добавляют серийные разведения вируса. После инкубации процент гибели клеток (то есть, инфицированные клетки) наблюдают и регистрируют вручную для каждого разведения вируса, и результаты используют, чтобы математически рассчитать результат TCID50. Два метода, обычно используемые для расчета TCID50, представляют собой метод Спирмена-Кербера и метод Рида-Менча.

Культивирование в большом объеме (LVP) относится к тому же методу обнаружения, что и анализ TCID₅₀. В отличие от титрования в конечной точке, для LVP используется намного большее количество жидкости, что приводит к гораздо более низкому пределу обнаружения.

Еще более предпочтительно, указанное количественное определение вирусных частиц достигается посредством комбинации титрования в конечной точке и культивирования в большом объеме.

Предпочтительно, вирус для очищения представляет собой большие вирусы с оболочкой. Кроме того, можно очищать от небольших вирусов без оболочки с помощью фильтров для вирусов.

Предпочтительно, для исполнения способа валидации, описанного здесь, используется одноразовое оборудование.

Предпочтительно, для исполнения способа валидации, описанного здесь, используется оборудование, выбрасываемое после разового применения.

В предпочтительном варианте исполнения оборудование является одноразовым и выбрасываемым после разового применения.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению способа валидации, описанного здесь, в непрерывном процессе производства терапевтических белков.

Таким образом, в целом, способ валидации, описанный здесь впервые, преодолевает предубеждение из уровня техники о том, что очищение от вирусов должно выполняться в периодическом процессе, чтобы гарантировать определенное время пребывания.

Кроме того, способ валидации, описанный здесь, впервые демонстрирует, что возможно

• переводить определенное время пребывания в периодическом процессе в непрерывный процесс,

• обеспечить достоверную процедуру внесения добавки для анализа в непрерывном процессе,

• проводить валидацию в условиях процесса, не нарушая сам процесс, путем выбора обоснованной точки внесения добавки для анализа,

• отбирать репрезентативные образцы с учетом всех колебаний и трудностей измерения, например, колебания насосов, pH, концентрации вируса, колебаний концентрации, измерения условий потока,

• создать достоверную процедуру отбора образца без нарушения последующих точек отбора образца.

Пример

Ниже описан примерный способ проведения валидации очищения от вирусов в непрерывном режиме.

Для всех экспериментов использовали прототип хроматографического блока Tarpon Biosystems BioSMB. Аналитические данные всех экспериментов включали измерение pH и проводимости с помощью pH-электродов и одноразовых датчиков проводимости с люэровским соединением, соответственно, а также анализы для определения концентрации вируса.

Кроме того, для вирусной инактивации применяли спиральный инвертор потока (CFI). Он был сконструирован, чтобы обеспечить минимальное время пребывания, составляющее 120 мин. Следовательно, среднее время пребывания превышает 120 минут и определяется при помощи характеризации RTD (residence time distribution - распределения времени пребывания), как описано ниже. Изображение окончательной компоновки CFI можно увидеть на фигуре 3.

Общую компоновку установки можно увидеть на фигуре 1. В этой компоновке ступень инактивации вируса при низком pH устанавливается после хроматографического блока. Профиль элюирования хроматографического блока Tarpon BioSMB показывает периодически колеблющийся уровень pH между элюирующим буферным раствором (pH 3,1) и промывочным буферным раствором (pH 7,0). Поскольку общий рН для инактивации вируса при низком рН должен лежать ниже 4, для выравнивания профиля рН используется контур гомогенизации. Другими словами, контур гомогенизации (HL) можно понимать как ёмкостный реактор с непрерывным перемешиванием (CSTR), приводящий к уровням pH, постоянно составляющим ниже 4. После этого HL происходит фактическая инактивация вируса при низком pH в спиральном инверторе потока (CFI).

Чтобы охарактеризовать две отдельные операции HL и CFI, были проведены исследования распределения времени пребывания. Было измерено изменение в проводимости между водой качества Milli-Q и 1М раствором NaCl. Более конкретно, скорость потока была установлена на 4,8 мл/мин. Функции стадии осуществляли с помощью трехходового крана. Были исследованы три различные компоновки: HL (A), CFI (B) и комбинация HL и CFI (C). Функции стадий выполнялись в обоих возможных направлениях. Поэтому после полного заполнения 1М раствором NaCl эксперимент повторяли в другом направлении, заполняя UO, то есть, CFI или HL, водой качества Milli-Q при постоянном потоке 4,8 мл/мин. Измерения концентрации были приведены к 1 и ограничены значениями в интервале от 0,5 % до 99,5 % от максимального значения. Среднее время пребывания определяли путем численного интегрирования с использованием правила трапеций. Время пребывания затем было приведено к одному с помощью среднего времени пребывания. Относительную ширину R_W рассчитывали в соответствии с уравнением 1. θ_0,005 и θ_0,995, таким образом, представляют безразмерные значения времени, когда было достигнуто 0,5 % и 99,5 % от максимальной безразмерной концентрации. Следовательно, относительная ширина показывает, насколько узким является RTD.

(1)

Чтобы исследовать два различных средних уровня pH для вирусной инактивации при низком pH, тестировали два различных метода непрерывной хроматографии. Экспериментальная процедура для обоих методов была одинаковой. Более конкретно, CFI был запущен и подвергнут очистке без демонтажа (CIP - от англ. cleaning in place очищение на месте) независимо от хроматографии. Перед первым экспериментом с вирусом этот CFI полностью промывали буферным раствором и подвергали процедуре CIP с помощью 0,1М раствора NaOH. После этого была проведена еще одна промывка буферным раствором, в результате чего вся система оставалась без пузырьков воздуха, застрявших внутри. Параллельно этому начинали непрерывную хроматографию, которая требовала 2,5 часа первоначального прогона, прежде чем первая колонка однократно прошла все циклы. Системы HL и CFI были подключены к непрерывной хроматографии во время начальной фазы после промывки и процедуры CIP. После первых 2,5 часов непрерывной хроматографии CFI в течение 3 часов должен был полностью заполняться хроматографическим элюатом с внесенной добавкой для анализа, чтобы достичь стационарного состояния. Необходимую продолжительность, составляющую 3 ч, определяли из соответствующих экспериментов RTD. После первого эксперимента с вирусом CFI подвергали процедуре CIP с помощью 5М NaOH в течение по меньшей мере 1 ч.

Необходимо было разработать новую процедуру внесения добавки для анализа для непрерывного процесса. Чтобы достичь стандартного уровня внесения добавки для анализа в 5 %, необходимо было добавить 230 мкл/мин материала для внесения добавки для анализа к потоку хроматографического элюата, составляющему 4,6 мл/мин. Для добавления потока, вносящего добавку для анализа в поток хроматографического элюата через соединитель, использовали насос Gilson Minipuls 3. Никакого внутреннего смесительного блока не использовали. Точка добавления была установлена после контура гомогенизации.

Чтобы извлекать образцы в разные моменты времени внутри CFI, между определенными рамками были помещены трехходовые запорные краны. Точки отбора образца, а также окончательный CFI можно увидеть на ФИГ. 3. Моменты времени, представленные различными точками отбора образца, были определены путем измерения среднего времени пребывания в пределах всего CFI. Поскольку инактивация вируса при низком pH сильно зависит от времени, реакцию пришлось останавливать во время процедуры отбора образца. Поэтому каждый контейнер для отбора образца перед отбором был заполнен 4,13 мл 2М раствором Трис-буфера. С помощью этого метода pH каждой капли образца нейтрализовался немедленно при попадании в контейнер для отбора образца. Это предотвратило неоднородное время пребывания при низких уровнях pH внутри образца.

Чтобы исключить влияние колеблющегося рН, продолжительность отбора образца была установлена на одно время переключения (17,3 мин) непрерывной хроматографии. Это приводит к полному сбору ожидаемых уровней pH из непрерывной хроматографии.

При использовании контура гомогенизации в качестве ёмкостного реактора с непрерывным перемешиванием (CSTR), чтобы регулировать уровень рН непрерывной хроматографии, который колеблется между рН 3 и рН 7, невозможно определить, из какой конкретной колонки для хроматографии происходит данный образец, взятый в CFI. Следовательно, объем взятых образца может содержать элюат из одной или даже двух точно не установленных колонок из системы непрерывной хроматографии. Чтобы исключить влияние различных хроматографических колонок, некоторые точки отбора образца внутри CFI отбирались дважды. Первый образец был взят в пределах одного времени переключения (17,3 мин). После этого отбор образца был приостановлен на половину времени переключения (8,65 мин), прежде чем отбор образца был продолжен еще в течение одного времени переключения. В пределах остановки отбора образца, позиция трехходового крана не изменялась. Непрерывный поток через точку отбора образца подавали в контейнер для отходов. При этой процедуре внутри системы отбора образца не задерживалось никакой остаточной жидкости. Остаточная жидкость подвергалась бы воздействию низких уровней pH в течение более длительного времени пребывания и, следовательно, искажала бы результаты.

С помощью результатов экспериментов с водой и раствором NaCl, проведенных, чтобы охарактеризовать используемый контур гомогенизации (HL) и спиральный инвертор потока (CFI), были определены соответствующие времена пребывания в точках отбора образца. Результаты измерений RTD можно увидеть на ФИГ. 4.

Как упомянуто выше, CFI был сконструирован, чтобы обеспечить минимальное время пребывания, составляющее 120 минут.

Перед проведенными экспериментами были осуществлены анализы на цитотоксичность и интерференцию. Определили, что необходимое окончательное разведение образца составляло 1 : 54. При этом коэффициенте разведения не могли наблюдать никакого влияния на рост клеток и репликацию вируса.

Измерения pH и проводимости в обоих режимах непрерывной хроматографии показывают периодически колеблющееся поведение. Кроме того, можно увидеть демпфирующий эффект HL, а также частично CFI.

ФИГ. 1 показывает схематичное представление схемы процесса для предварительного вирусного исследования.

ФИГ. 2 показывает экспериментальную установку для измерений RTD.

«Конд.» означает датчик проводимости, компоновка A для измерений RTD в HL, компоновка B для измерений RTD в CFI, компоновка C для измерений RTD в обоих UO вместе

ФИГ. 3 показывает схематичное представление точек отбора образца, а также окончательного CFI.

ФИГ. 4 изображает результаты характеризации распределения времени пребывания

Верхняя левая диаграмма на ФИГ. 4 показывает результаты характеризации RTD для CFI. Среднее время пребывания было определено при 145 мин с относительной шириной R_W 0,819. Следовательно, каждое колено трубки из 10 колен трубок, выполненных внутри CFI, обеспечивает время пребывания 14,5 мин. RTD внутри CFI является очень узким, что приводит к минимизированному времени пребывания каждого отдельного элемента текучей среды, то есть, вирусной частицы.

Нижняя левая диаграмма на ФИГ. 4 показывает результаты для HL. Это показывает типичное поведение RTD для CSTR. Среднее время пребывания составляет 8,12 мин, R_W составляет 0,027. Верхняя правая диаграмма на ФИГ. 4 показывает измерение для комбинации HL и CFI. По сравнению с результатами CFI, показанными на верхней левой диаграмме, среднее время пребывания увеличивается до 154 мин, относительная ширина уменьшается до 0,739. Нижняя правая диаграмма на ФИГ. 4 показывает общее сравнение результатов эксперимента, а также расчетные графики для прямых трубок с ламинарным течением и прямых змеевиков с ламинарным течением. Комбинация HL и CFI приводит к заметно более широкому распределению времени пребывания, чем использование исключительно CFI. Тем не менее, оба комплекса показывают значительно лучшее RTD, чем альтернативы, прямая трубка с ламинарным течением и прямой змеевик с ламинарным течением.

ФИГ. 5 изображает результаты непрерывного процесса для предварительного вирусного исследования.

Титр вируса и результаты LRV для двух экспериментов можно увидеть на ФИГ. 5. Верхняя часть диаграммы показывает результаты однократного отбора образца в режиме А непрерывной хроматографии. Первые два столбца представляют результаты титра вируса для образца в режиме «load» и «hold». Поскольку не наблюдается никакого снижения титра вируса для образца в режиме «hold», условия процесса (например, температура и состав буферного раствора), также как и сам тестируемый элемент (mAB), не оказывают влияния на устойчивость вируса. Следовательно, вирусная инактивация вызвана исключительно условиями низкого pH. Столбцы в середине диаграммы показывают титр вируса и соответствующие значения LRV из образцов для титрования. Титр вируса во всех образцах был снижен до предела обнаружения, что привело к значениям LRV «>». Снижение LRV с 4,12 (1M16) до 4,01 на образцах 1M17 и 1M18 вызвано различными коэффициентами разведения, поскольку образцы 1M17 и 1M18 были дополнительно проанализированы с помощью культивирования в большом объеме. Поэтому анализируемые объемы изменяются с 33,33 мкл (1М16) до 44,44 мкл (1М17 и 1М18). В правой части диаграммы можно увидеть результаты LVP для образцов 1M17 и 1M18. Даже при проанализированном объеме, составляющем 2133,33 мкл, зараженных лунок обнаружить не смогли, что привело к значениям LRV > 5,82.

Средняя и нижняя диаграмма на ФИГ. 5 показывают результаты двух отборов образцов в режиме B хроматографии ProtA. Процедура отбора образца была начата с 3М18 для 17,31 мин. После паузы, составляющей 8,66 мин, отбирали образец 4М18. Дальнейший отбор образца также был проведен по двум точкам.

ФИГ. 6 показывает схематичную диаграмму логарифмической величины уменьшения (LRV - log reduction value) титра вируса в зависимости от времени пребывания в CFI, которое в случае CFI равно определенному местоположению в CFI. Другими словами, данное логарифмическое уменьшение титра вируса всегда достигается в одном и том же месте в CFI благодаря кинетике реакции в этом CFI. Следовательно, LRV в данный момент времени 1 всегда будет отвечать упомянутому LRV в конкретной точке отбора образца внутри CFI, например, в этом случае, в точке отбора образца после рамки 1. Аналогичным образом, в этом примере LRV в момент времени 6 всегда будет соответствовать LRV в точке отбора образца после рамки 6. Следовательно, отбор образца пробы с внесенной добавкой для анализа является связанным с расположением, а не с моментом времени, как это было бы в случае периодических условий.

Источники информации:

Klutz, S.; Magnus, J.; Lobedann, M.; Schwan, P.; Maiser, B.; Niklas, J.; Temming, M.; Schembecker, G. (2015): Developing the biofacility of the future based on continuous processing and single-use technology. In Journal of Biotechnology 213, с. 120 – 130.

Klutz, S.; Kurt, S.K.; Lobedann, M.; Kockmann, N. (2015): Narrow residence time distribution in tubular reactor concept for Reynolds number range 10 - 100. In Chemical Engineering Research and Design 95, с. 22 – 33.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности, раскрыт способ валидации очищения от вирусов в непрерывном режиме, включающий стадии: предоставление пробы, подлежащей валидации, внесение в данную пробу добавки для анализа допустимым способом, осуществление очищения от вирусов, отбор образца из пробы с внесенной добавкой для анализа и анализ образца из пробы с внесенной добавкой для анализа. 4 з.п. ф-лы, 6 ил., 1 пр.

1. Способ валидации очищения от вирусов путем вирусной инактивации при уровне рН ≤ 4 в непрерывном режиме, включающий стадии:

a) предоставление потока или потока продукта, подлежащего валидации,

b) внесение в поток или поток продукта добавки для анализа валидированным способом, посредством которого обеспечивается то, что внесение добавки для анализа выполняется воспроизводимо и желаемый уровень содержания вирусных частиц всегда обеспечивается,

c) осуществление очищения от вирусов путем вирусной инактивации при уровне рН ≤ 4,

d) отбор образца из потока или потока продукта с внесенной добавкой для анализа и

e) анализ образца из потока или потока продукта с внесенной добавкой для анализа со стадии d),

причем стадия d) отбора образца из потока или потока продукта с внесенной добавкой для анализа включает отбор образца в течение предварительно определенного периода времени, и причем стадия отбора образца из потока или потока продукта с внесенной добавкой для анализа включает отбор образца методом «от конца к началу» и немедленную нейтрализацию каждой капли потока или потока продукта, когда она поступает в контейнер для отбора образца.

2. Способ по п.1, причем стадия b) внесения добавки для анализа валидированным способом включает внесение добавки для анализа в поток или поток продукта после гомогенизации.

3. Способ по п.1, причем на стадии с) очищение от вирусов представляет собой вирусную инактивацию, которую проводят в спиральном инверторе потока (CFI).

4. Способ по п.1, причем стадия е) анализа образца потока или потока продукта с внесенной добавкой для анализа включает определение того, присутствуют ли вирусные частицы.

5. Способ по любому из пп.1-4, причем стадия e) анализа образца потока или потока продукта с внесенной добавкой для анализа включает количественное определение вирусных частиц.