СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ У СУБЪЕКТА САХАРНОГО ДИАБЕТА И/ИЛИ МЕТАБОЛИЧЕСКОГО СИНДРОМА ИЛИ ДИАГНОСТИРОВАНИЯ МЕТАБОЛИЧЕСКОГО СИНДРОМА У СУБЪЕКТА Российский патент 2019 года по МПК G01N33/68 

Объектом настоящего изобретения является способ прогнозирования риска развития у субъекта сахарного диабета и/или метаболического синдрома или для диагностирования метаболического синдрома у субъекта, где в указанного субъекта нет диабета, который включает следующие стадии:

- определение уровня про-нейротензина или его фрагментов из по меньшей мере 5 аминокислот в биологической жидкости, полученной из указанного субъекта; и

- корреляцию указанного уровня про-нейротензина или его фрагментов с риском развития в указанного субъекта сахарного диабета и/или метаболического синдрома, где повышенный уровень является прогностическим для повышенного риска возникновения сахарного диабета и/или метаболического синдрома, или где повышенный уровень коррелирует с диагностированием метаболического синдрома у субъекта, где у указанного субъекта нет диабета.

Термин "повышенный уровень" обозначает уровень выше определенного порогового уровня.

Нейротензин представляет собой нейропептид, состоящий из 13 аминокислот, который имеет происхождение из предшественника препро-нейротензина и стехиометрически высвобождается совместно со стабильным пептидом из 117 аминокислот про-нейротензин (P-NT) и зрелый гормон связывается с тремя различными рецепторами, рецептором нейротензина 1 и 2 (Ntsr1 и Ntsr2), которые представляют собой рецепторы, связанные с G-белком, и рецептором нейротензина 3 (Ntsr3), который не связан с G-белком и также известен как Сортиллин-1 (SORT1).

Нейротензин высвобождается периферически из тонкого кишечника, а также центрально из гипоталамуса. Периферическая секреция нейротензина стимулируется потреблением пищи, в особенности жиров, и известно, что он регулирует моторику желудочно-кишечного тракта и секрецию поджелудочного сока и желчи. Интересно, что нейротензин вовлечен в контролирование аппетита в качестве анорексического гормона, поскольку он сильно уменьшает потребление пищи, как после центральной (интрацеребровентрикулярной), так и после периферической (внутрибрюшинной) инъекции крысам, эффект, который, вероятно, опосредуется главным образом через рецептор нейротензин-1 (Ntsr1). У людей, страдающих ожирением, по сравнению со здоровыми людьми с нормальным весом, послеобеденные концентрации нейротензина в плазме уменьшены после потребления жидкой жирной пищи (Widen и др., 1992, Reg peptides; Plasma concentrations of regulatory peptides in obesity following modified sham feeding (MSF) and a liquid test meal), что указывает на нарушение регуляции секреции нейротензина при ожирении. Тем не менее, не было проведено существенных исследований о том, будет ли и как нейротензин связан с регуляцией ожирения. Интересно, что P-NT существенно повышается после обходного желудочного анастомоза (Roux-en-Y), операции, которая, как показано, приводит к нормогликемии у большинства пациентов с ожирением при диабете II типа, но не известно, вовлечен ли в целом нейротензин в развитие сахарного диабета. Кроме того, система нейротензина вовлечена в развитие ишемической болезни сердца и инфаркта миокарда в виде вариации гена Ntsr3 (SORT1), который является одним из наиболее сильно чувствительных генов при распространенной ишемической болезни сердца, что известно для людей.

Механизм взаимосвязи между ожирением и злокачественным новообразованием в значительной степени неизвестен, тем не менее, одна из основных теорий состоит в том, что избыток жировых отложений приводит к повышенной периферической ароматизации андрогенов и, следовательно, к повышенному уровню циркулирующих эстрогенов. Дополнительно, было показано, что один из отличительных признаков ожирения, гиперинсулинемия, ингибирует продукцию в печени глобулина, связывающего половые гормоны (Sexual Hormone Binding Globulin (SHBG)), таким образом повышая биодоступные уровни как эстрогенов, так и андрогенов, предполагая пути, посредством которых ожирение может повышать риск распространенных форм злокачественных новообразований, запускаемых формами половых гормонов, таких как рак молочной железы и предстательной железы. Интересно, что экспрессия как нейротензина, так и Ntsr1 является распространенной при злокачественных раковых опухолях протоков груди и экспериментально фармакологическая блокада или РНК молчание NTSR1 уменьшает рост опухоли у мышей.

Уровни экспрессии рецептора нейротензина 1 (NTSR1) в клетках рака молочной железы используют для определения прогноза субъекта, страдающего от рака молочной железы (US 2011/0305633). Кроме того, те же самые авторы отмечают, что в настоящее время не описана четкая корреляция между циркулирующим нейротензином и состоянием опухолей поджелудочной железы, предстательной железы или медуллярных опухолей щитовидной железы, вероятно, вследствие быстрого клиренса печенью. Интересно, что было обнаружено в группе из 51 пациентов с инвазивным раком протоков молочной железы 91% всех опухолей были положительными по рецептору нейротензина 1 (NTSR1), но только 31% всех опухолей были положительными по нейротензину в указанной ткани. (Souaze и др. Cancer Research 2006; 66: (12) страницы 6243-6249).

Были получены данные, свидетельствующие о том, что нейротензин и рецепторы нейротензина принимают участие в росте злокачественных новообразований, в частности, при раке легких, раке поджелудочной железы и раке толстой кишки (Carraway и др.; Peptides 27 (2006) 2445-2460). Было описано, что уровни NT в сыворотке пациентов с раком поджелудочной железы были существенно увеличенными (Picheon и др., Anticancer Research 1999; 19; 1445-50). Также интересно, что в этой группе было обнаружено, что NT уровни согласуются с прогрессированием заболевания как при раке предстательной железы, так и при раке поджелудочной железы. Дополнительно, в отличие от этого, Meggiato и др.; Tumori 1996; 82; 592-5; обнаружили, что уровни NT в плазме были нормальными при раке поджелудочной железы, но были повышены в случае диагностирования панкреатита.

Применение копептина для прогнозирования диабета было описано Enhorning и др., Circulation. 2010; 121:2102-2108

Задачей настоящего изобретения является исследование прогностической и диагностической способности NT для предсказания риска развития у субъекта сахарного диабета и/или метаболического синдрома или для диагностирования метаболического синдрома у субъекта, где в указанного субъекта нет диабета. Для решения этой задачи, мы измеряли стабильные фрагменты про-нейротензина в плазме натощак в указанном перспективном групповом исследовании Swedish (Malmö Diet and Cancer Study) и относительный исходный уровень этого биомаркера к частоте возникновения диабета в течение последующих 15 лет.

Объектом настоящего изобретения является способ прогнозирования риска развития у субъекта сахарного диабета и/или метаболического синдрома или для диагностирования метаболического синдрома у субъекта, где в указанного субъекта нет диабета, который включает следующие стадии:

- определение уровня про-нейротензина или его фрагментов из по меньшей мере 5 аминокислот в биологической жидкости, полученной из указанного субъекта; и

- корреляцию указанного уровня про-нейротензина или его фрагментов с риском развития в указанного субъекта сахарного диабета и/или метаболического синдрома, где повышенный уровень является прогностическим для повышенного риска возникновения сахарного диабета и/или метаболического синдрома, или где повышенный уровень коррелирует с диагностированием метаболического синдрома у субъекта, где в указанного субъекта нет диабета.

Объектом настоящего изобретения является способ прогнозирования риска развития у субъекта сахарного диабета и/или метаболического синдрома или для диагностирования метаболического синдрома у субъекта, где в указанного субъекта нет диабета, который включает следующие стадии:

- определение уровня про-нейротензина 1-117 или его фрагментов из по меньшей мере 5 аминокислот или про-нейротензина 1-117, содержащего пептиды, в биологической жидкости, полученной из указанного субъекта; и

- корреляцию указанного уровня про-нейротензина 1-117 или его фрагментов или про-нейротензина 1-117, содержащего пептиды, с риском развития в указанного субъекта сахарного диабета и/или метаболического синдрома, где повышенный уровень является прогностическим для повышенного риска возникновения сахарного диабета и/или метаболического синдрома, или где повышенный уровень коррелирует с диагностированием метаболического синдрома у субъекта, где в указанного субъекта нет диабета.

Термин "субъект", как используется в настоящей заявке, относится к живому организму человека или организму, отличному от человека. Предпочтительно в настоящей заявке субъект относится к человеку. В специфическом варианте осуществления изобретения указанный субъект представляет собой особь женского пола. В специфическом варианте осуществления изобретения указанный субъект представляет собой не-IFG (не предрасположенный к диабету) субъект.

В одном варианте осуществления изобретения, уровень про-нейротензина или его фрагментов из по меньшей мере 5 аминокислот или про-нейротензина 1-117, содержащего пептиды, в биологической жидкости, представляет собой уровень натощак про-нейротензина или его фрагментов из по меньшей мере 5 аминокислот или про-нейротензина 1-117, содержащего пептиды. Уровень натощак обозначает отсутствие потребления пищи за 12 ч до отбора образца крови.

Уровни про-нейротензина 1-117 или его фрагментов из по меньшей мере 5 аминокислот или про-нейротензина 1-117, содержащего пептиды, в биологической жидкости, полученной из указанной особи женского пола, которые являются предсказательными для риска развития сахарного диабета и/или метаболического синдрома высвобождается из тонкого кишечника. Высвобождение нейротензина из тонкого кишечника стимулируется поглощением пищи, в особенности жирами, и известно, что он регулирует моторику желудочно-кишечного тракта и секрецию поджелудочного сока и желчи. Про-нейротензин 1-117 и его фрагменты или про-нейротензин 1-117, содержащий пептиды, которые используются в качестве суррогатного маркера для высвобожденного нейротензина в виде нейротензина и про-нейротензина 1-117 и его фрагментов или про-нейротензина 1-117, содержащего пептиды, высвобождаются в эквимолярных количествах из про-нейротензина.

Неожиданно в настоящем изобретении было обнаружено, что периферическая секреция нейротензина/про-нейротензина 1-117 или его фрагментов из по меньшей мере 5 аминокислот или про-нейротензина 1-117, содержащего пептиды, является индикаторной для чувствительности особи женского пола относительно развития сахарного диабета и/или метаболического синдрома. Таким образом, режим питания в виде уменьшения потребления жиров может снижать указанный риск в указанного субъекта.

Корреляция между уровнем про-нейротензина или его фрагментов из по меньшей мере 5 аминокислот или PNT 1-117, содержащего пептиды, в биологической жидкости, полученной из указанного субъекта и риск развития сахарного диабета и/или метаболического синдрома является непрерывной, то есть чем более высокий уровень, тем более высокий риск.

Учитывая целесообразность, специалист в данной области техники может использовать порог (и).

Таким образом, термин "повышенный уровень" может обозначать уровень выше порогового уровня.

Биологическая жидкость может быть выбрана из группы, включающей кровь, сыворотку, плазму, мочу, цереброспинальную жидкость (csf), и слюну.

Данные согласно настоящему изобретению указывают на сильную корреляцию между уровнем про-нейротензина или его фрагментов, в особенности про-нейротензина 1-117 или его фрагментов или про-нейротензина 1-117, содержащего пептиды, с диабетом, в частности, у субъектов без преобладающего диабета.

Данные согласно настоящему изобретению также указывают на сильную корреляцию между уровнями про-нейротензина или его фрагментов, в особенности про-нейротензина 1-117 или его фрагментов или про-нейротензина 1-117, содержащего пептиды, с диабетом, у субъектов с гипертонией, которые представляют собой распространенную группу с высоким риском для сердечнососудистого заболевания и/или диабет.

Фрагменты про-нейротензина, которые могут быть определены в биологической жидкости, могут представлять собой, например,

SEQ ID NO:1 (Про-нейротензин 1-147)

SEQ ID NO:2 (про-нейротензин 1-125 (большой нейромедин N))

SEQ ID NO:3 (нейромедин N:)

SEQ ID NO:4 (нейротензин)

SEQ ID NO:5 (про-нейротензин 1-117)

SEQ ID NO:6 (про-нейротензин 1-132)

SEQ ID NO 7: (Про-нейротензин 1-125)

SEQ ID NO:8 (про-нейротензин 120-140)

SEQ ID NO:9 (про-нейротензин 120-147)

SEQ ID NO:10 (про-нейротензин 128-147)

В более специфическом варианте осуществления способа в соответствии с настоящим изобретением определяют уровень про-нейротензина 1-117.

В специфическом варианте осуществления уровня про-нейротензина, в особенности про-нейротензина 1-117 или его фрагментов или про-нейротензина 1-117, содержащего пептиды, измеряют с помощью иммуноанализа. Более специфически используют иммунологический анализ, как описано в Ernst и др. Peptides 27 (2006) 1787-1793.

Иммунологический анализ, который можно использовать для определения уровня про-нейротензина или его фрагментов из по меньшей мере 5 аминокислот или про-нейротензина 1-117, содержащего пептид, может включать стадии, как изложено в примере 2. Все пороги и значения будут понятными с учетом теста и калибровки, используемых в соответствии с примером 2. Для квалифицированного специалиста в данной области техники известно, что на абсолютное значение порога может оказывать влияние используемая калибровка. Это обозначает, что все значения и пороги, представленные в настоящей заявке, следует понимать в контексте калибровки, используемой в настоящей заявке (Пример 2). Человеческий P-NT-калибратор доступен от ICI-Diagnostics, Berlin, Germany. Альтернативно, анализ может быть откалиброван с помощью синтетического или рекомбинантного P-NT 1-117 или его фрагментов (см. также Ernst и др, 2006).

Порог для определения риска развития у субъекта сахарного диабета и/или метаболического синдрома или для диагностирования метаболического синдрома у субъекта, где в указанного субъекта нет диабета в соответствии со способами согласно настоящему изобретению составляет больше 78 пмоль/л PNT, предпочтительно 100 пмоль/л, более предпочтительно 150 пмоль/л. В специфическом варианте осуществления указанный порог составляет около 100 пмоль/л. Эти пороги относятся к вышеуказанному способу калибровки. pro-NT значение выше указанного порога обозначает, что у субъекта есть повышенный риск развития сахарного диабета и/или метаболического синдрома.

Определение диабета было следующим: в анамнезе клинический диагноз или прием противодиабетических лекарственных средств или уровень глюкозы в цельной крови натощак >/=6,1 ммоль/л (примечание, это составляет =7,0 ммоль/л в плазме) на момент начала исследования.

Пре-диабет, нарушенная гликемия натощак (IFG): IFG=уровень глюкозы в плазме натощак 6,1-6,9 ммоль/л.

Определение нормальное кровяное давление /высокое кровяное давление (НВР) осуществляли следующим образом:

НВР: Систолическое ВР>/=140 мм рт.ст. или Диастолическое BP>/=90 мм рт.ст. или прием противогипертонических лекарственных средств. Субъекты, которые имеют нормальное кровяное давление (BP), представляют собой все другие субъекты, то есть субъекты с Систолическим ВР <140 мм рт.ст. или Диастолическим BP <90 мм рт.ст. или которые не принимают противогипертонических лекарственных средств.

В специфическом варианте осуществления способа в соответствии с изобретением указанный субъект представляет собой субъект без диабета с уровнем глюкозы в крови натощак меньше, чем 6,1 ммоль/л, но больше, чем 5,4 ммоль/л.

В специфическом варианте осуществления способа в соответствии с изобретением указанный субъект представляет собой субъект без диабета с уровнем глюкозы в крови натощак, равным или меньше, чем 5,4 ммоль/л.

В специфическом варианте осуществления способа в соответствии с изобретением определяют указанный риск развития у субъекта сахарного диабета II типа.

В специфическом варианте осуществления способа в соответствии с изобретением предсказание риска для субъекта развития сахарного диабета и/или метаболического синдрома или диагностирование метаболического синдрома улучшается путем дополнительного определения и использования уровня по меньшей мере одного лабораторного параметра или другого маркера, выбранного из группы, включающей уровень глюкозы в крови или плазме натощак, триглицериды, HDL холестерин или его субфракции, LDL холестерин или его субфракции, цистатин С, инсулин, CRP, вазопрессин или его предшественники или его фрагменты и BNP или его предшественники или его фрагменты.

В специфическом варианте осуществления способа в соответствии с изобретением дополнительно определяют по меньшей мере один клинический параметр, выбранный из группы, включающей возраст, пол, систолическое артериальное давление, диастолическое артериальное давление, лечение гипертонии (АНТ), индекс массы тела, окружность талии, отношение окружности талии к окружности бедер, курение в данный период, наследственную предрасположенность к диабету и более ранее сердечнососудистое заболевание (CVD).

Другой вариант осуществления изобретения представляет собой способ прогнозирования риска развития у субъекта сахарного диабета и/или метаболического синдрома или для диагностирования метаболического синдрома у субъекта, где в указанного субъекта нет диабета в соответствии с любым из предшествующих пунктов, где уровень про-нейротензина или его фрагментов либо отдельно или в сочетании с другими прогностически пригодными лабораторными или клиническими параметрами используют для прогнозирования риска развития у субъекта сахарного диабета и/или метаболического синдрома или для диагностирования метаболического синдрома с помощью способа, который может быть выбран из следующих альтернатив:

- сравнение со средним значением уровня про-нейротензина или его фрагментов или про-нейротензина 1-117, содержащего пептиды, в группе заранее определенных образцов в популяции предположительно здоровых субъектов,

- сравнение с квантилем уровня про-нейротензина или его фрагментов или про-нейротензина 1-117, содержащего пептиды, в группе заранее определенных образцов в популяции предположительно здоровых субъектов,

- расчет на основе анализа пропорциональных рисков Кокса (Сох Proportional Hazards analysis) или с помощью расчета индекса риска, такого как NRI (Net Reclassification Index) или IDI (Integrated Discrimination Index).

В одном варианте осуществления изобретения, образец выбирают из группы, включающей образец крови, образец сыворотки, образец плазмы, образец спинно-мозговой жидкости, образец слюны и образец мочи или экстракт любого из вышеуказанных образцов. В специфическом варианте осуществления способа в соответствии с изобретением определяют уровень про-нейротензина или его фрагментов или про-нейротензина 1-117, содержащего пептид, имеющий длину по меньшей мере 5 аминокислот, путем диагностического анализа, предпочтительно путем иммунологического анализа.

В специфическом варианте осуществления способа в соответствии с изобретением способ осуществляют более одного раза для наблюдения за риском возникновения сахарного диабета и/или метаболического синдрома или для наблюдения за проведением лечения метаболического синдрома у субъекта, где в указанного субъекта нет диабета.

В специфическом варианте осуществления способа в соответствии с изобретением указанное наблюдение осуществляют для оценки ответа указанного субъекта на проведенные профилактические и/или терапевтические процедуры.

В специфическом варианте осуществления способа в соответствии с изобретением способ используют для классификации указанных субъектов в группы риска.

Также настоящим изобретением охватывается портативное устройство для осуществления способа в соответствии с изобретением.

Также настоящим изобретением охватывается анализ и/или набор для осуществления способа в соответствии с изобретением.

Объектом изобретения также является связующее к нейротензину или к рецептору нейротензина, для применения для предотвращения или лечения сахарного диабета и/или метаболического синдрома у субъекта.

В одном варианте осуществления изобретения, связующее уменьшает биологическую активность нейротензина на 70% или меньше.

В соответствии с изобретением связующее к нейротензину выбирают из группы, включающей антитела, например, IgG, типичный полноразмерный иммуноглобулин, или фрагменты антител, содержащие по меньшей мере F-вариабельный домен тяжелой и/или легкой цепи, как, например, химически связанные антитела (фрагмент, связывающий антиген), включая, но не ограничиваясь только ими, Fab-фрагменты, включая Fab минитела, одноцепочечное Fab антитело, одновалентное Fab антитело с эпитопными метками, например, Fab-V5Sx2; двухвалентное Fab (мини-антитело), димеризованное с СН3 доменом; двухвалентное Fab или мультивалентное Fab, например, образованное путем мультимеризации с помощью гетерологичного домена, например, путем димеризации dHLX доменов, например, Fab-dHLX-FSx2; Р(ab')2-фрагменты, scFv-фрагменты, мультимеризованные мультивалентные или/и мультиспецифические scFv-фрагменты, двухвалентные и/или биспецифические диатела, BITE® (биспецифический захватыватель Т-клеток), трифункциональные антитела, поливалентные антитела, например, из другого класса, чем G; антитела с одним доменом, например, нанотела, имеющие происхождение из нанотела, имеющие происхождение из верблюдов или рыб.

В соответствии с изобретением связующее к рецептору нейротензина выбирают из группы, включающей антитела, например, IgG, типичный полноразмерный иммуноглобулин, или фрагменты антител, содержащие по меньшей мере F-вариабельный домен тяжелой и/или легкой цепи, как, например, химически связанные антитела (фрагмент, связывающий антиген), включая, но не ограничиваясь только ими, Fab-фрагменты, включая Fab минитела, одноцепочечное Fab антитело, одновалентное Fab антитело с эпитопными метками, например, Fab-V5Sx2; двухвалентное Fab (мини-антитело), димеризованное с CH3 доменом; двухвалентное Fab или мультивалентное Fab, например, образованное путем мультимеризации с помощью гетерологичного домена, например, путем димеризации dHLX доменов, например, Fab-dHLX-FSx2; Р(ab')2-фрагменты, scFv-фрагменты, мультимеризованные мультивалентные или/и мультиспецифические scFv-фрагменты, двухвалентные и/или биспецифические диатела, BITE® (биспецифический захватыватель Т-клеток), трифункциональные антитела, поливалентные антитела, например, из другого класса, чем G; антитела с одним доменом, например, нанотела, имеющие происхождение из нанотела, имеющие происхождение из верблюдов или рыб, или пептидный антагонист например, [D-Trp¹¹]-Нейротензин, [Tyr(Ме)¹¹]-Нейротензин (например, описанный Quiron и др.), или непептидный антагонист, например, Левокабастин, SR-48692 (NTS1 селективный), SR-142948 (неселективный), SR-142948A, CP 96345, [3H]SR-48692, SR 48692, SR-48527 и SR-49711, или связующий каркас, например, не-Ig каркасы на основе тетранектина (например, описанные в US 2010/0028995), фибронектиновые каркасы (например, описанные в ЕР 1266 025; каркасы на основе липокалина ((например, описанные в WO 2011/154420); убиквитиновые каркасы (например, описанные в WO 2011/073214), трансфериновые каркасы (например, описанные в US 2004/0023334), каркасы белка А (например, описанные в ЕР 2231860), каркасы на основе анкиринового повтора (например, описанные в WO 2010/060748), микробелки, предпочтительно микробелки, образующие цистиновый клубок) каркасы (например, описанные в ЕР 2314308), каркасы на основе домена Fyn SH3 (например, описанные в WO 2011/023685) каркасы на основе домена EGFR-A (например, описанные в WO 2005/040229) и каркасы на основе домена Куница (например, описанные в ЕР 1941867).

Примеры

Пример 1

Разработка антител

Пептиды/ конъюгаты для иммунизации:

Пептиды для иммунизации синтезировали (JPT Technologies, Berlin, Germany) с дополнительным N-концевым цистеиновым остатком для конъюгации пептидов с бычьим сывороточным альбумином (BSA). Пептиды ковалентно связывали с BSA путем использования Sulfo-SMCC (Perbio-science, Bonn, Germany). Процедуру сочетания осуществляли в соответствии с руководством Perbio.

Меченное антитело (LA) пептид (P-NT 1-19):

Твердофазное антитело (SPA) пептид (P-NT 44-62):

Антитела создавали в соответствии со следующим методом:

BALB/c мыши иммунизировали с помощью 100 мкг Пептид-BSA-Конъюгат в день 0 и 14 (эмульгированного в 100 мкл полного адъюванта Фрейнда) и 50 мкг в день 21 и 28 (в 100 мкл неполного адъюванта Фрейнда). За три дня до этого осуществляли эксперимент слияния, животное получало 50 мкг конъюгата, растворенного в 100 мкл солевого раствора, вводимого в виде одной внутрибрюшинной и одной внутривенной инъекции.

Спленоциты от иммунизированных мышей и клетки миеломной клеточной линии SP2/0 сливали с 1 мл 50% полиэтиленгликоля в течение 30 с при 37°C. После промывки, клетки высевали в планшет для культивирования клеток на 96 лунок. Гибридные клоны отбирали путем выращивания в HAT среде [RPMI 1640 культуральная среда, дополненная 20% фетальной бычьей сывороткой и НАТ-добавкой]. Через две недели HAT среду заменяли на НТ Среду для трех пассажей с последующим возвращением к нормальной среде для культивирования клеток.

Супернатанты культуры клеток изначально подвергали скринингу относительно антиген-специфических IgG антител через три недели после слияния. Положительные тестируемые микрокультуры переносили в планшеты на 24 лунки для размножения. После повторного испытания отобранные культуры клонировали и повторно клонировали, используя технику предельных разведений, и определяли изотипы.

(Lane, R.D. "A short-duration polyethylene glycol fusiontechnique for increasing production of monoclonal antibody-secreting hybridomas", J. Immunol. Meth. 81:223-228; (1985), Ziegler, В. и др. "Glutamate decarboxylase (GAD) is not detectable on the surface of rat islet cells examined by cytofluorometry and complement-dependent antibody-mediated cytotoxicity of monoclonal GAD antibodies", Horm. Metab. Res. 28:11-15, (1996)).

Продукция моноклонального антитела

Антитела получали с помощью стандартных методов продукции антител (Marx и др., Monoclonal antibody Production, ATLA 25, 121, 1997,) и очищали с помощью хроматографии белка А. Чистота антител составляла >95% на основе анализа SDS гель электрофореза.

Пример 2

Иммунологический анализ для количественного определения про-нейротензина человека

Используемая технология представляла собой люминесцентный иммунологический анализ на пробирке с многослойным покрытием, на основе метки сложным эфиром акридиния.

Меченное соединение (радиоактивный индикатор): 100 мкг (100 мкл) LA (1 мг/мл в PBS, pH 7,4, смешивали с 10 мкл NHS-сложного эфира акридиния (1 мг/мл в ацетонитриле, InVent GmbH, Germany) (ЕР 0353971) и инкубировали в течение 20 мин. при комнатной температуре. Меченное LA очищали путем гель-фильтрации ВЭЖХ на Bio-Sil SEC 400-5 (Bio-Rad Laboratories, Inc., USA) Очищенное LA разводили в (300 ммоль/л фосфат калия, 100 ммоль/л NaCl, 10 ммоль/л Na-EDTA, 5 г/л Бычий сывороточный альбумин,, pH 7,0). Конечная концентрация составляла около 800 тыс.относительных световых единиц (RLU) меченного соединения (около 20 нг меченного антитела) на 200 мкл. Хемилюминесценцию сложного эфира акридиния измеряли с помощью AutoLumat LB 953 (Berthold Technologies GmbH & Co. KG).

Твердая фаза: Полистироловые пробирки (Greiner Bio-One International AG, Austria) покрывали (18 ч при комнатной температуре) с помощью SPA (1,5 мкг SPA/0,3 мл 100 ммоль/л NaCl, 50 ммоль/л TRIS/HCl, pH 7,8). После блокирования с помощью 5% бычьего сывороточного альбумина, пробирки промывали с помощью PBS, pH 7,4 и высушивали в вакууме.

Калибровка:

Исследование калибровали, используя разведения сыворотки человека, содержащей P-NT. Пул сыворотки человека с высокой P-NT-иммунореактивностью (InVent Diagostika, Hennigsdorf, Germany) разводили сывороткой лошади (Biochrom AG, Deutschland) (стандарты для анализа).

Стандарты калибровали с помощью P-NT-калибратора человека (ICI-Diagnostics, Berlin, Germany). Альтернативно, анализ может быть откалиброван с помощью синтетического или рекомбинантного P-NT 1-117 или его фрагментов (см. также Ernst и др., 2006).

P-NT Иммунологический анализ:

50 мкл образца (или калибратора) пипетировали в SPA покрытые пробирки, после добавления меченного LA (200 мкл), пробирки инкубировали в течение 16-22 ч при 18-25°C. Несвязанный радиоактивный индикатор удаляли путем промывок 5 раз (каждый 1 мл) с помощью промывочного раствора (20 мМ PBS, pH 7,4, 0,1% Triton Х-100).

Связанное в пробирке LA измеряли с помощью LB 953

На фигуре 1 представлена типичная P-NT кривая доза/сигнал.

Пример 3

Популяционное исследование

Мы измеряли P-NT в плазме натощак от 4362 участников популяции на основе Malmö Diet and Cancer Study начального исследования в 1991-1994 гг. (возраст особей мужского пола 58±6 лет и 59% особей женского пола). Мы использовали многофакторные подогнанные (все традиционные факторы сердечно-сосудистых рисков, факторы риска диабета и в анализах злокачественного новообразования также унаследованная склонность к злокачественному новообразованию) модели пропорциональных рисков Кокса относительно исходной линии P-NT (относительный риск на каждое среднеквадратичное отклонение повышал логарифмическое преобразование P-NT) к времени первого события каждой из изученных контрольных точек в течение среднего времени последующего наблюдения более чем 12 лет. Выборку конечных точек осуществляли из Swedish National Hospital Discharge Registry, Swedish Myocardial Infarction Registry, Stroke in Malmö Registry и Swedish Cancer Registry. Выборку конечных точек с помощью этих реестров ратифицировали и считали достоверными.

Квартиль-концентрации были практически идентичными у всех представленных анализируемых подгруппах женщин.

Квартиль-концентрации были практически идентичными у всех представленных анализируемых подгруппах мужчин.

P-NT и прогнозирование сахарного диабета

Среди субъектов без сахарного диабета на исходном уровне, у 142 развивался выявленный впервые сахарный диабет в течение среднего времени последующего наблюдения 12,7±2,2 лет. После подгонки к исходным уровням всех факторов риска диабета (возраст, пол, лечение гипертонии, систолическое артериальное давление, индекс массы тела, окружность талии, курение, более ранее сердечно-сосудистое заболевание и концентрации натощак глюкоза, триглицериды, инсулин, HDL и LDL в крови) каждый средне-квадратичное отклонение (SD) повышение исходной линии P-NT предоставляло относительный риск (95% доверительный интервал) 1,28 (1,09-1,50) (Р=0,003) для риска выявленного впервые диабета. В подгруппе субъектов без пре-диабета (Нарушенная гликемия натощак, IFG), также повышалось соотношение рисков для частоты диабет на 1 SD повышение P-NT: 1,48 (1,17-1,86) (Р=0,001).

P-NT был независимо связан с выявленным впервые диабетом.

Среди субъектов без нарушенной гликемии натощак и сахарного диабета на исходном уровне у 68 субъектов развивался выявленный впервые диабет в течение последующего периода наблюдения и после полной подгонки для факторов риска диабета каждый SD повышение P-NT связано с относительным риском 1,48 (1,17-1,87) (Р=0,001) для риска впервые выявленного сахарного диабета в общей популяции, 1,47 (1,08-2,00) (Р=0,014) у женщин и 1,56 (1,08-2,27) (Р=0,019) у мужчин. Из всех факторов риска диабета, включенных в многовариантную Сох регрессионную модель, только исходные уровни концентрации глюкозы в крови натощак имели сильную статистическую взаимосвязь с впервые выявленным сахарным диабетом, которую имел P-NT.

Фигура 2: Анализ выживаемости Каплана-Мейера прогнозирования диабета

2а) Все субъекты без диабета, используя среднее пороговое (104,6 пмоль/л)

2b) Все субъекты без диабета и пре-диабета (IFG), пороговое, (104,6 пмоль/л)

Анализ подгрупп

Используя те же переменные в уравнении, мы использовали различные подгруппы для прогнозирования диабета, субъекты с диабетом на исходном уровне были исключены.

P-NT является достоверно предсказательным для развития диабета. Предсказательная эффективность P-NT была более сильной у субъектов без IFG (пре-диабет).

Описание фигур:

На фигуре 1 представлена типичная P-NT кривая доза/сигнал

Фигура 2: Анализ выживаемости Каплана-Мейера прогнозирования диабета

2а) Все субъекты без диабета, используя среднее пороговое (104,6 пмоль/л)

2b) Все субъекты без диабета и пре-диабета (IFG), пороговое, (104,6 пмоль/л)

Объектом настоящего изобретения является способ прогнозирования риска развития у субъекта сахарного диабета или метаболического синдрома, где у указанного субъекта нет диабета. Способ включает следующие стадии: определение уровня про-нейротензина 1-117 или полипептидов, содержащих про-нейротензин 1-117, с помощью иммунного анализа в образце крови, сыворотки или плазмы, взятом у указанного субъекта, и корреляцию указанного уровня про-нейротензина 1-117 или пептидов, содержащих про-нейротензин 1-117, с риском развития диабета или метаболического синдрома, где повышенный уровень по сравнению с пороговым значением является прогностическим для повышенного риска возникновения сахарного диабета или метаболического синдрома. 2 н. и 21 з.п. ф-лы, 3 пр., 19 табл., 3 ил.

1. Способ прогнозирования риска развития сахарного диабета у субъекта, где у указанного субъекта нет диабета, который включает следующие стадии:

- определение уровня про-нейротензина 1-117, состоящего из SEQ ID NO: 5, или полипептидов, содержащих про-нейротензин 1-117, с помощью иммунного анализа в образце крови, сыворотки или плазмы, взятом у указанного субъекта, где указанные пептиды, содержащие про-нейротензин 1-117, выбраны из группы, включающей SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6; и

- корреляцию указанного уровня про-нейротензина 1-117 или пептидов, содержащих про-нейротензин 1-117, с риском развития диабета, где повышенный уровень по сравнению с пороговым значением является прогностическим для повышенного риска возникновения сахарного диабета.

2. Способ по п. 1, где указанный субъект представляет собой субъект без предиабета (не-IFG).

3. Способ по п. 1 или 2, где определяют уровень натощак про-нейротензина 1-117 или пептидов, содержащих про-нейротензин 1-117.

4. Способ по п. 1 или 2, где определяют уровень про-нейротензина 1-117.

5. Способ по п. 1 или 2, где указанный субъект представляет собой субъект без диабета с уровнем глюкозы в крови натощак меньше чем 6,1 ммоль/л, но больше чем 5,4 ммоль/л.

6. Способ по п. 1 или 2, где указанный субъект представляет собой субъект с уровнем глюкозы в крови натощак, равным или меньше чем 5,4 ммоль/л.

7. Способ по п. 1 или 2, где определяют риск развития сахарного диабета II типа.

8. Способ по п. 1 или 2, где дополнительно определяют по меньшей мере один клинический параметр, выбранный из группы, включающей возраст, пол, систолическое артериальное давление, диастолическое артериальное давление, лечение гипертонии (АНТ), индекс массы тела, окружность талии, отношение окружности талии к окружности бедер, курение в данный период, наследственную предрасположенность к диабету и более ранее сердечно-сосудистое заболевание (CVD).

9. Способ по п. 1 или 2, где образец выбирают из группы, включающей образец сыворотки и образец плазмы.

10. Способ по п. 1 или 2, где указанный способ осуществляют более чем один раз с целью контроля риска развития сахарного диабета, где указанным субъектом является субъект, у которого нет диабета.

11. Способ по п. 10, где указанный контроль осуществляют с целью оценки ответа указанного субъекта на предпринятые профилактические или терапевтические процедуры.

12. Способ по п. 1 или 2 для классификации указанных субъектов в группы риска.

13. Способ прогнозирования риска развития метаболического синдрома у субъекта, где у указанного субъекта нет диабета, который включает следующие стадии:

- определение уровня про-нейротензина 1-117, состоящего из SEQ ID NO: 5, или полипептидов, содержащих про-нейротензин 1-117, с помощью иммунного анализа в образце крови, сыворотки или плазмы, взятом у указанного субъекта, где указанные пептиды, содержащие про-нейротензин 1-117, выбраны из группы, включающей SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6; и

- корреляцию указанного уровня про-нейротензина 1-117 или пептидов, содержащих про-нейротензин 1-117, с риском развития метаболического синдрома, где повышенный уровень по сравнению с пороговым значением является прогностическим для повышенного риска возникновения метаболического синдрома.

14. Способ по п. 13, где указанный субъект представляет собой субъект без предиабета (не-IFG).

15. Способ по п. 13 или 14, где определяют уровень натощак про-нейротензина 1-117 или пептидов, содержащих про-нейротензин 1-117.

16. Способ по п. 13 или 14, где определяют уровень про-нейротензина 1-117.

17. Способ по п. 13 или 14, где указанный субъект представляет собой субъект без диабета с уровнем глюкозы в крови натощак меньше чем 6,1 ммоль/л, но больше чем 5,4 ммоль/л.

18. Способ по п. 13 или 14, где указанный субъект представляет собой субъект с уровнем глюкозы в крови натощак, равным или меньше чем 5,4 ммоль/л.

19. Способ по п. 13 или 14, где дополнительно определяют по меньшей мере один клинический параметр, выбранный из группы, включающей возраст, пол, систолическое артериальное давление, диастолическое артериальное давление, лечение гипертонии (АНТ), индекс массы тела, окружность талии, отношение окружности талии к окружности бедер, курение в данный период, наследственную предрасположенность к диабету и более ранее сердечно-сосудистое заболевание (CVD).

20. Способ по п. 13 или 14, где образец выбирают из группы, включающей образец сыворотки и образец плазмы.

21. Способ по п. 13 или 14, где указанный способ осуществляют более чем один раз с целью контроля риска развития метаболического синдрома или с целью контроля курса лечения метаболического синдрома у субъекта, где указанным субъектом является субъект, у которого нет диабета.

22. Способ по п. 21, где указанный контроль осуществляют с целью оценки ответа указанного субъекта на предпринятые профилактические или терапевтические процедуры.

23. Способ по п. 13 или 14 для классификации указанных субъектов в группы риска.