СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ ОЖИРЕНИЯ У СУБЪЕКТА Российский патент 2021 года по МПК G01N33/74 

Объектом настоящего изобретения является способ определения активности переработки жира и/или прогнозирования риска развития ожирения у субъекта, включающий в себя следующие стадии:

определение с помощью иммуноанализа уровня пронейротензина 1-117 или его фрагментов длиной по меньшей мере 5 аминокислот или содержащих пронейротензин 1-117 пептидов в биологической жидкости, полученной от указанного субъекта, или

определение уровня пронейротензина 1-117 или его фрагментов длиной по меньшей мере 5 аминокислот в биологической жидкости, полученной от указанного субъекта; и

соотнесение указанного уровня пронейротензина 1-117 или его фрагментов или содержащих пронейротензин 1-117 пептидов с активностью переработки жира и/или риском возникновения ожирения у указанного субъекта, где повышенный уровень свидетельствует о повышенной активности переработки жира и/или прогнозирует повышенный риск развития ожирения,

и где субъект не страдает ожирением во время забора образца биологической жидкости от указанного субъекта.

Нейротензин представляет собой 13-аминокислотный нейропептид, полученный из препронейротензинового предшественника и стехиометрически высвобождаемый вместе со стабильным 117-аминокислотным пептидом пронейротензином (P-NT), где зрелый гормон связывается с тремя различными рецепторами: нейротензиновыми рецепторами 1 и 2 (Ntsrl и Ntsr2), которые представляют собой связанные с G-белком рецепторы, и нейротензиновым рецептором 3 (Ntsr3), который не является связанным с G-белком рецептором и также известен как Сортиллин-1 (SORT1).

Нейротензин высвобождается периферически из тонкого кишечника, а также централизованно из гипоталамуса. Периферическая секреция нейротензина стимулируется приемом пищи, особенно, жира, и, как известно, регулирует желудочно-кишечную моторику и секрецию ферментов поджелудочной железы и желчи. Интересно, что нейротензин участвуют в контроле аппетита в качестве аноректического гормона, поскольку резко снижает потребление пищи у крыс как после инъекции в ЦНС (интрацеребровентрикулярно), так и после периферической (внутрибрюшинной) инъекции, эффект, который, по-видимому, главным образом опосредуется нейротензиновым рецептором (Ntsr1). При ожирении, по сравнению с людьми, имеющими нормальный вес, концентрация нейротензина в плазме крови после приема пищи была снижена после жидкой жирной пищи (Wisen et al. 1992, Reg Peptides 39(1): 43-54), и более низкие уровни нейротензина натощак наблюдались у людей с ожирением по сравнению с худощавой контрольной группой (Weiss et al. 2001, Obes Surg 11: 735-739), позволяя предположить, что регуляция секреции нейротензина нарушается при ожирении. Однако не было проведено ни одного крупного исследования, связан ли нейротензин с риском развития ожирения и каким образом.

Предметом настоящего изобретения являлось изучение прогностической силы нейротензина (NT) в отношении прогнозирования риска развития ожирения у не страдающего ожирением субъекта. Для решения этой проблемы, авторы измерили содержание стабильных фрагментов пронейротензина в плазме натощак в указанном Шведском проспективном когортном исследовании (Malmö Diet and Cancer Study) и связанный базовый уровень этого биомаркера с развитием ожирения в течение 15-летнего периода наблюдений.

Риск ожирения у не страдающего ожирением субъекта может коррелировать с активностью переработки жира у указанного субъекта. Таким образом, определение уровня пронейротензина 1-117 или его фрагментов длиной по меньшей мере 5 аминокислот или содержащих пронейротензин 1-117 пептидов в биологической жидкости может представлять собой определение активности переработки жира.

Объектом настоящего изобретения является способ определения активности переработки жира и/или прогнозирования риска развития ожирения у субъекта, включающий в себя следующие стадии:

определение с помощью иммуноанализа уровня пронейротензина 1-117 или его фрагментов длиной по меньшей мере 5 аминокислот или содержащих пронейротензин 1-117 пептидов в биологической жидкости, полученной от указанного субъекта, или

определение уровня пронейротензина 1-117 или его фрагментов длиной по меньшей мере 5 аминокислот в биологической жидкости, полученной от указанного субъекта; и

соотнесение указанного уровня пронейротензина 1-117 или его фрагментов или содержащих пронейротензин 1-117 пептидов с активностью переработки жира и/или риском возникновения ожирения у указанного субъекта, где повышенный уровень свидетельствует о повышенной активности переработки жира и/или прогнозирует повышенный риск развития ожирения,

и где субъект не страдает ожирением во время забора образца биологической жидкости от указанного субъекта.

Активность переработки жира определяется как абсорбция, метаболизм и/или накопление жира в организме человека. Активность переработки жира является синонимом поглощения жира организмом или способности к накоплению поглощенного и процессированного жира. Женщина с более высокой активностью переработки жира имеет более высокий риск развития ожирения.

Пищевой жир состоит из множества полярных и неполярных липидов. Триацилглицерин (TAG) является превалирующим жиром в пище, давая 90-95% от общего объема энергии, получаемой из пищевых жиров. Пищевые жиры включают также фосфолипиды, стерины (например, холестерин) и многие другие липиды (например, жирорастворимые витамины). Расщепление липидов начинается в ротовой полости в результате контакта с лингвальными липазами, которые секретируются железами на языке, начиная процесс расщепления триглицеридов. Расщепление продолжается в желудке в результате действия как лингвальных, таки и желудочных ферментов. Желудок также является основным местом эмульгирования пищевых жиров и жирорастворимых витаминов, являющегося одним из основных факторов перистальтики. Первично процессированные эмульсии липидов входят в двенадцатиперстную кишку в виде мелких липидных капель, а затем смешиваются с желчью и панкреатическим соком, претерпевая заметные изменения в своей химической и физической форме. Эмульгирование продолжается в двенадцатиперстной кишке наряду с гидролизом и мицеллообразованием в процессе подготовки к поглощению через стенку кишечника. Желчь и панкреатический сок обеспечивают панкреатическую липазу, соли желчных кислот и колипазу, которые функционируют совместно, обеспечивая эффективное расщепление и всасывание липидов. TAG расщепляются в основном панкреатической липазой в верхнем сегменте тонкого кишечника. Свободные жирные кислоты захватываются из просвета кишечника в энтероциты и используются для биосинтеза нейтральных жиров. Оказавшись внутри энтероцитов, продукты гидролиза TAG должны пересечь цитоплазму, чтобы достигнуть эндоплазматического ретикулума (ER), где они используются для синтеза сложных липидов.

Основными липопротеинами, секретируемыми кишечником, являются VLDL и хиломикроны. Из них хиломикроны синтезируются исключительно в кишечнике для транспортировки пищевых жиров и жирорастворимых витаминов в кровь. Хиломикроны представляют собой в основном очень крупные сферические TAG-богатые частицы, которые также содержат PL (фосфолипиды), холестерин, витамин Е, витамин А и белок. Липопротеиновое ядро содержит TAG, холестериновые эфиры и жирорастворимые витамины, тогда как поверхность содержит монослой фосфолипидов (преимущественно фосфатидилхолина), свободного холестерина и белка.

По мере циркуляции триглицериды хиломикронов подвергаются гидролизу липопротеинлипазой, ферментом, находящимся на поверхности клеток эндотелия капилляров мышечной и жировой ткани. Циркулирующие хиломикроны имеют время полужизни 5-10 минут. Гидролиз хиломикронов приводит к высвобождению жирных кислот и глицерина из ядра хиломикронов, а также неэтерифицированного холестерина из поверхностного слоя этих частиц. Делипидирование происходит преимущественно в жировой, мышечной и сердечной тканях, которые поглощают и окисляют или накапливают жирные кислоты, высвобождаемые липопротеинлипазой.

Жирные кислоты, холестерин и желчные кислоты, которые избегают абсорбции в кишечнике, выделяются в виде фекальных жирных кислот, а также в виде нейтральных и кислых стеринов, соответственно.

У субъектов с эффективной переработкой жира доля жира, всасываемая желудочно-кишечным трактом, является меньшей, всасываемый жир метаболизируются почти полностью, и только очень маленькое количество жира транспортируется и накапливается в адипоцитах субъектов или же вообще не транспортируется и не накапливается. В отличие от этого, у пациентов с неэффективной переработкой жира доля всасываемого жира в желудочно-кишечном тракте является высокой, но всасываемый жир метаболизируется в меньшей степени, и большее количество жира транспортируется и накапливается в адипоцитах субъекта.

Термин «субъект», используемый в данном описании, относится к живому человеку или животному. Предпочтительно, чтобы в данном описании субъектом являлся человек. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанный субъект представляет собой субъекта без диабета. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанный субъект является субъектом, не имеющим преддиабета. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения субъект не страдает от метаболического синдрома. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения субъект не страдает от сердечного заболевания. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения субъект не страдает от рака. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения субъект является субъектом женского пола.

Термин «сердечное заболевание» включает инфаркт миокарда, ишемическую болезнь сердца, инсульт, сердечную недостаточность (острую или хроническую сердечную недостаточность), фибрилляцию предсердий и трепетание предсердий.

Термин «риск начала ожирения» является синонимом «риску ожирения», где субъект не страдает ожирением во время отбора образца биологической жидкости у указанного субъекта.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения уровнем пронейротензина или его фрагментов длиной по меньшей мере 5 аминокислот или содержащих пронейротензин 1-117 пептидов в биологической жидкости является уровень пронейротензина или его фрагментов длиной по меньшей мере 5 аминокислот или содержащих пронейротензин 1-117 пептидов натощак. Уровень натощак означает отсутствие приема пищи за 10 часов или, предпочтительно, за 12 часов до забора образца крови.

Поскольку уровень пронейротензина или его фрагментов длиной по меньшей мере 5 аминокислот или содержащих пронейротензин 1-117 пептидов натощак не обусловлен недавним приемом жира, по-видимому, в одном варианте осуществления уровень натощак является мерой для количественного определения активности переработки жира у указанного субъекта. Этот факт может являться недостающим звеном, которое объясняет, почему некоторые субъекты подвержены ожирению, поскольку они перерабатывают большое количество поглощенного жира, тогда как другие лица с низким уровнем пронейротензина или его фрагментов длиной по меньшей мере 5 аминокислот или содержащих пронейротензин 1-117 пептидов имеют низкий уровень активности переработки жира. Но также и определение пронейротензина или его фрагментов длиной по меньшей мере 5 аминокислот или содержащих пронейротензин 1-117 пептидов в образце, взятом не натощак, может быть показателем активности переработки жира, поскольку у некоторых субъектов уровень может повышаться больше, чем у других, при одном и том же поглощенном количестве жира. В последнем варианте пронейротензин или его фрагменты длиной по меньшей мере 5 аминокислот или содержащие пронейротензин 1-117 пептиды могут быть измерены на исходном уровне до приема жира и после него, где субъекты с повышенной активностью переработки жира будут реагировать, высвобождая большее количество пронейротензина или его фрагментов длиной по меньшей мере 5 аминокислот или содержащих пронейротензин 1-117 пептидов при поглощении жира.

Таким образом, один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой способ определения активности переработки жира и/или прогнозирования риска развития ожирения у субъекта, включающий в себя следующие этапы:

определение с помощью иммуноанализа уровня пронейротензина 1-117 или его фрагментов длиной по меньшей мере 5 аминокислот или содержащих пронейротензин 1-117 пептидов в отобранном не натощак или натощак образце биологической жидкости, полученном от указанного субъекта, или

определение уровня пронейротензина 1-117 или его фрагментов длиной по меньшей мере 5 аминокислот в отобранном не натощак или натощак образце биологической жидкости, полученном от указанного субъекта; и

введение указанному субъекту жира

определение с помощью иммуноанализа уровня пронейротензина 1-117 или его фрагментов длиной по меньшей мере 5 аминокислот или содержащих пронейротензин 1-117 пептидов в образце биологической жидкости, полученном от указанного субъекта после поглощения жира или

определение уровня пронейротензина 1-117 или его фрагментов длиной по меньшей мере 5 аминокислот в биологической жидкости, полученной от указанного субъекта после поглощения жира; и

вычисление разницы между указанными уровнями до и после поглощения жира и

соотнесение указанной разницы между уровнями пронейротензина 1-117 или его фрагментов длиной по меньшей мере 5 аминокислот или содержащих пронейротензин 1-117 пептидов до и после поглощения жира и/или риском возникновения ожирения у указанного субъекта, где более высокая разница свидетельствует о повышенной активности переработки жира и/или прогнозирует повышенный риск развития ожирения,

и где субъект не страдает ожирением во время забора образца биологической жидкости от указанного субъекта.

Это означает, что разница между уровнем пронейротензина 1-117 или его фрагментов длиной по меньшей мере 5 аминокислот или содержащих пронейротензин 1-117 пептидов до поглощения жира и указанным уровнем после поглощения жира может свидетельствовать об активности переработки жира. Статус указанного субъекта до приема жира может быть натощак или не натощак. Указанным субъектам вводят стандартизированное количество жира (пероральный тест на толерантность к жиру), например, определенное количество сливок, содержащих определенное количество жира. В примере 4 было показано, что некоторые люди реагируют более чувствительно на прием жира чем другие, и, таким образом, имеют более высокую активность переработки жира.

Уровень пронейротензина 1-117 или его фрагментов длиной по меньшей мере 5 аминокислот или содержащих пронейротензин 1-117 пептидов в биологической жидкости, полученной от указанного субъекта, который прогнозирует риск развития впервые выявленного ожирения и является показателем активности переработки жира, высвобождается из тонкого кишечника. Высвобождение нейротензина из тонкого кишечника стимулируется приемом пищи, особенно жиров (Go and Demol 1981. Peptides (Suppl. 2): 267-269) и, как известно, регулирует желудочно-кишечную моторику и секрецию ферментов поджелудочной железы и желчи (Reinecke 1985. Prog Histochem Cytochem 16: 1-172). Пронейротензин 1-117 или его фрагменты длиной по меньшей мере 5 аминокислот или содержащие пронейротензин 1-117 пептиды использовали в качестве суррогатных маркеров высвобождаемого нейротензина, поскольку нейротензин и пронейротензин 1-117 или его фрагменты длиной по меньшей мере 5 аминокислот или содержащие пронейротензин 1-117 пептиды высвобождаются в эквимолярных количествах из пронейротензина.

Важным открытием настоящего изобретения является то, что периферическая секреция нейротензина/пронейротензина 1-117 или его фрагментов длиной по меньшей мере 5 аминокислот или содержащих пронейротензин 1-117 пептидов является показателем подверженности субъекта к развитию впервые выявленного ожирения и является мерой активности переработки жира. Таким образом, диета, например, снижение потребления жира, может снизить этот риск у указанного субъекта.

Корреляция между уровнем пронейротензина или его фрагментов длиной по меньшей мере 5 аминокислот или содержащих PNT 1-117 пептидов в биологической жидкости, полученной от указанного субъекта и риском развития ожирения, а также активностью переработки жира, является непрерывной, т.е. чем выше уровень, тем выше риск.

На практике специалист в данной области техники может использовать пороговые уровни.

Термин «повышенный уровень» означает уровень выше определенного порогового уровня.

Пороговые уровни могут быть определены путем анализа образцов от субъектов, у которых развилось определенное состояние (например, ожирение), и образцов от субъектов, у которых не развилось состояние. Одним из возможных вариантов для определения порогового уровня является построение кривых ошибок (ROC-кривых) путем откладывания значений переменной относительно ее относительной частоты в «нормальной» популяции (например, у субъектов, у которых нет ожирения) и в «больной» популяции (например, у субъектов, у которых есть ожирение). Распределение уровней маркеров для субъектов, у которых развивается или не развивается определенное состояние, вероятно, будет перекрываться. В таких условиях, тест не способен отличить «норму» от «болезни» со 100% точностью, а перекрывающаяся область указывает, где этот тест не может отличить «норму» от «болезни». Выбирают порог, выше которого (или ниже которого, в зависимости от того, как маркер изменяется при «заболевании») тест показывает патологию, и ниже которого тест показывает норму. Площадь под кривой ROC является мерой вероятности того, что субъективное измерение позволит правильно определить состояние. Кривые ROC можно использовать, даже если результаты тестирования не всегда дают точное число. До тех пор, пока можно ранжировать результаты, можно построить ROC-кривую. Например, результаты теста для образцов от «больных» могут быть ранжированы в зависимости от степени (например, 1=низкая, 2=средняя и 3=высокая). Это ранжирование можно соотнести с результатами для «нормальной» популяции, и построить ROC-кривую. Эти способы хорошо известны в данной области (Hanley et al. 1982. Radiology 143: 29-36). Предпочтительно, чтобы пороговое значение выбирали таким образом, чтобы обеспечить площадь под ROC-кривой больше примерно 0,5, более предпочтительно, больше примерно 0,7, еще более предпочтительно, больше примерно 0,8, еще более предпочтительно, больше примерно 0,85 и, наиболее предпочтительно, больше примерно 0,9. Термин «примерно» в данном контексте относится к +/- 1-5% от заданного измерения. Горизонтальная ось ROC-кривой представляет собой (1-специфичность), которая возрастает с увеличением степени ложных результатов. Вертикальная ось кривой представляет собой чувствительность, которая возрастает с увеличением степени истинных результатов. Таким образом, для конкретного выбранного порога, может быть определено значение (1-специфичности) и может быть получена соответствующая чувствительность. Площадь под ROC-кривой является мерой вероятности того, что измеренный уровень маркера позволит правильно идентифицировать заболевание или состояние. Таким образом, площадь под кривой может быть использована для определения эффективности теста. Отношение шансов является мерой величины эффекта, описывая силу ассоциации или отсутствие независимости между двумя двоичными значениями (например, отношение шансов события, происходящего в тестируемой отрицательной группе к его шансам в тестируемой положительной группе).

Пороговые уровни могут быть получены, например, из анализа Каплана-Мейера, где возникновение заболевания или вероятность серьезного состояния и/или смерти коррелируется, например, с квартилями соответствующих маркеров в популяции. Согласно этому анализу, субъекты с уровнями маркеров выше 75-го процентиля имеют значительно повышенный риск получить заболевание согласно изобретению. Этот результат также подтверждается регрессионным анализом Кокса с поправкой на классические факторы риска. Самый высокий квартиль относительно всех других субъектов с высокой степень достоверности связан с повышенным риском получения заболевания или вероятностью серьезного заболевания и/или смерти согласно настоящему изобретению.

Другими предпочтительными пороговыми значениями являются, например, 90-й, 95-й и 99-й процентиль эталонной популяции. Путем использования более высокого процентиля, чем 75-й процентиль, можно уменьшить количество выявленных ложноположительных субъектов, но можно было бы упустить субъектов, которые имеют умеренный, хотя и по-прежнему повышенный риск. Таким образом, можно было бы адаптировать пороговое значение в зависимости от того, считается ли более целесообразным идентификация наибольшего количества субъектов, имеющих риск, за счет также выявления «ложноположительных» субъектов, или считается более целесообразным идентификация в основном субъектов с высокой степенью риска за счет потери некоторого количества субъектов, имеющих умеренную степень риска.

Другими математическими возможностями для рассчета риска индивидуума с использованием значения уровня маркера у индивидуума и других прогностических лабораторных и клинических параметров являются, например, NRI (Остаточный индекс реклассификации) или IDI (Интегрированный индекс дискриминации). Индексы могут быть вычислены в соответствии с Pencina (Pencina MJ, et al.: Evaluating the added predictive ability of a new marker: from area under the ROC curve to reclassification and beyond. Stat Med. 2008;27:157-172).

Биологическая жидкость может быть выбрана из группы, включающей кровь, сыворотку, плазму, мочу, спинномозговую жидкость (CSF) и слюну. В одном конкретном варианте осуществления биологическая жидкость может быть выбрана из группы, включающей кровь, сыворотку, плазму.

Полученные данные свидетельствуют о сильной корреляции между уровнем пронейротензина или его фрагментов, особенно, пронейротензина 1-117 или его фрагментов или содержащих пронейротензин 1-117 пептидов с развитием впервые выявленного ожирения и с активностью переработки жира.

Фрагментами пронейротензина, которые могут быть определены в биологической жидкости, могут являться, например, следующие последовательности:

SEQ ID NO: 1 (пронейротензин 1-147)

SDSEEEMKAL EADFLTNMHT SKISKAHVPS WKMTLLNVCS LVNNLNSPAE ETGEVHEEEL VARRKLPTAL DGFSLEAMLT IYQLHKICHS RAFQHWELIQ EDILDTGNDK NGKEEVIKRK IPYILKRQLY ENKPRRPYIL KRDSYYY

SEQ ID NO: 2 (пронейротензин 1-125 (большой нейромедин N))

SDSEEEMKAL EADFLTNMHT SKISKAHVPS WKMTLLNVCS LVNNLNSPAE ETGEVHEEEL VARRKLPTAL DGFSLEAMLT IYQLHKICHS RAFQHWELIQ EDILDTGNDK NGKEEVI KR KIPYIL

SEQ ID NO: 3 (нейромедин N)

KIPYIL

SEQ ID NO: 4 (нейротензин)

пиро-QLYENKPRRP YIL

SEQ ID NO: 5 (пронейротензин 1-117)

SDSEEEMKAL EADFLTNMHT SKISKAHVPS WKMTLLNVCS LVNNLNSPAE ETGEVHEEEL VARRKLPTAL DGFSLEAMLT IYQLHKICHS RAFQHWELIQ EDILDTGNDK NGKEEVI

SEQ ID NO: 6 (пронейротензин 1-132)

SDSEEEMKAL EADFLTNMHT SKISKAHVPS WKMTLLNVCS LVNNLNSPAE ETGEVHEEEL VARRKLPTAL DGFSLEAMLT IYQLHKICHS RAFQHWELIQ EDILDTGNDK NGKEEVIKRK IPYILKRQLY EN

SEQ ID NO: 7 (пронейротензин 1-140 (большой нейротензин)

SDSEEEMKAL EADFLTNMHT SKISKAHVPS WKMTLLNVCS LVNNLNSPAE ETGEVHEEEL VARRKLPTAL DGFSLEAMLT IYQLHKICHS RAFQHWELIQ EDILDTGNDK NGKEEVIKRK IPYILKRQLY ENKPRRPYIL

SEQ ID NO: 8 (пронейротензин 120-140)

KIPYILKRQL YENKPRRPYI L

SEQ ID NO: 9 (пронейротензин 120-147)

KIPYILKRQL YENKPRRPYIL KRDSYYY

SEQ ID NO: 10 (пронейротензин 128-147)

QLYENKPRRP YILKRDSYYY

В более конкретном варианте осуществления способа по настоящему изобретению определяют уровень пронейротензина 1-117.

В конкретном варианте осуществления уровень пронейротензина, особенно, пронейротензина 1-117 или его фрагментов или содержащих пронейротензин 1-117 пептидов измеряется с помощью иммуноанализа. Более конкретно, используют иммуноанализ, описанный в Ernst et al. Peptides 27 (2006) 1787-1793. В одном конкретном варианте осуществления изобретения определяется иммунореактивность пронейротензина 1-117, где иммунореактивность означает следующее:

Определение уровня пронейротензина или его фрагментов может означать, что определяется иммунореактивность в отношении пронейротензина или его фрагментов, включая нейротензин и нейромедин N. Связывающий агент, используемый для определения пронейротензина или его фрагментов, включая нейротензин и нейромедин N, в зависимости от области связывания может связываться более чем с одной из приведенных выше молекул. Это очевидно для специалиста в данной области техники.

Таким образом, согласно настоящему изобретению определяется уровень иммунореактивного анализируемого вещества с использованием по меньшей мере одного связывающего агента, который связывается с областью в пределах аминокислотной последовательности любого из вышеуказанных пептидов и пептидных фрагментов (а именно, пронейротензина (про-NT) и фрагментов по любой из последовательностей, от 1 до 10), в биологической жидкости, полученной от указанного субъекта; и проводится корреляция с конкретными вариантами клинической значимости.

В более конкретном варианте осуществления способа по настоящему изобретению определяется уровень про-NT 1-117 (SEQ ID NO: 5, пронейротензин 1-117). В более конкретном варианте осуществления определяется уровень иммунореактивного анализируемого вещества с использованием по меньшей мере одного связывающего агента, который связывается с про-NT 1-117, и проводится корреляция с конкретными вариантами клинической значимости согласно настоящему изобретению.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения определяется иммунореактивность в отношении пронейротензина или его фрагментов, не включающих нейротензин и нейромедин N.

Иммуноанализ, который может быть полезен для определения уровня пронейротензина или его фрагментов длиной по меньшей мере 5 аминокислот или содержащего пронейротензин 1-117 пептида, может включать стадии, описанные в примере 2. Иммуноанализ, который может быть полезен для определения уровня пронейротензина или его фрагментов длиной по меньшей мере 5 аминокислот или содержащего пронейротензин 1-117 пептида, может включать по меньшей мере одно антитело или по меньшей мере два антитела, специфичных к эпитопам в пронейротензине 1-117. По меньшей мере одно из этих антител может быть помечено. Все пороговые уровни и значения должны рассматриваться в свете тестов и калибровок, используемых в соответствии с примером 2. Специалист в данной области может знать, что абсолютное пороговое значение может зависеть от используемой калибровки. Это означает, что все значения и пороговые уровни, приведенные в данном описании, следует понимать в контексте калибровки, используемой в данном документе (пример 2). Калибровочный стандарт для про-NT человека доступен от ICI-Diagnostics, Берлин, Германия. В альтернативном варианте, калибровка в анализе может быть проведена с помощью синтетического или рекомбинантного про-NT 1-117 или его фрагментов (см. также Ernst et. al, 2006).

В одном варианте осуществления настоящего изобретения это может быть так называемый POC-тест (тест, проводимый в месте оказания медпомощи), который представляет собой технологию тестирования, позволяющую проводить тестирование в пределах 1 часа рядом с пациентом без необходимости полностью автоматизированной аналитической системы. Одним из примеров этой технологии является технология иммунохроматографических анализов.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения такой анализ представляет собой сэндвич-иммуноанализ с использованием любого вида технологии обнаружения, включающей, но не ограниченной ими, энзиматическую метку, хемилюминесцентную метку, электрохемилюминесцентную метку, предпочтительно, полностью автоматизированный анализ. В одном варианте осуществления настоящего изобретения такой анализ представляет собой сэндвич-анализ с энзиматической меткой. Примеры автоматизированного или полностью автоматизированного анализа включают в себя анализы, которые могут быть использованы для одной из следующих систем: Roche Elecsys®, Abbott Architect®, Siemens Centauer®, Brahms Kryptor®, Biomerieux Vidas®, Alere Triage®.

Известно множество иммуноанализов, которые могут быть использованы для анализов и способов по настоящему изобретению; они включают в себя: радиоиммуноанализы («RIA»), гомогенные энзиматически-усиленные иммуноанализы («EMIT»), твердофазные иммуноферментные анализы («ELISA»), иммуноферментный анализ с реактивацией апофермента («ARIS»), щуп-иммуноанализы и иммунохроматографические анализы.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения по меньшей мере один из указанных двух связывающих агентов помечен для обнаружения.

Предпочтительные способы обнаружения включают иммуноанализы в различных форматах, такие как, например, радиоиммуноанализ (RIA), хемилюминесцентные и флуоресцентные иммуноанализы, твердофазные иммуноферментные анализы (ELISA), Luminex-массивы на шариках, белковые микрочипы и экспресс-тесты, такие как, например, иммунохроматографические тестовые полоски.

В предпочтительном варианте осуществления указанную метку выбирают из группы, включающей хемилюминесцентную метку, энзиматическую метку, флуоресцентную метку, радиоактивный йод.

Анализы могут представлять собой гомогенные или гетерогенные анализы, конкурентные и неконкурентные анализы. В одном варианте осуществления анализа представляет собой сэндвич-анализ, который является неконкурентным иммуноанализом, в котором молекула, которую необходимо обнаружить и/или количественно определить, связывается с первым антителом и со вторым антителом. Первое антитело может быть связано с твердой фазой, например, с шариками, поверхностью лунки или другого контейнера, чипом или полоской, а второе антитело представляет собой антитело, которое помечено, например, с помощью красителя, радиоактивного изотопа или реакционноспособной или каталитически активной молекулы. Количество меченого антитела, связавшегося с анализируемым веществом, затем измеряют подходящим способом. Общая композиция и процедуры, входящие в «сэндвич-анализы», являются устоявшимися и известны специалисту в данной области.

В другом варианте осуществления анализ включает в себя две захватывающие молекулы, предпочтительно, антитела, которые обе присутствуют в виде дисперсии в жидкой реакционной смеси, где первый метящий компонент присоединен к первой захватывающей молекуле, где указанный первый метящий компонент является частью системы мечения, основанной на флуоресцентном или хемилюминесцентном гашении или амплификации, а второй метящий компонент указанной системы мечения присоединен к второй захватывающей молекуле, так что при связывании обеих захватывающих молекул с анализируемым веществом генерируется измеримый сигнал, который позволяет обнаружение образовавшихся сэндвич-комплексов в растворе, содержащем образец.

В другом варианте осуществления изобретения указанная метящая система включает криптаты редкоземельных элементов или хелаты редкоземельных элементов в комбинации с флуоресцентным красителем или хемилюминесцентным красителем, в частности, красителем цианинового типа.

В контексте настоящего изобретения флуоресцентные анализы включают использование красителей, которые могут быть, например, выбраны из группы, включающей FAM (5- или 6-карбоксифлуоресцеин), VIC, NED, флуоресцеин, флуоресцеинизотиоцианат (FITC), IRD-700/800, цианиновые красители, такие как Cy3, Cy5, CY3.5, CY5.5, Cy7, ксантен, 6-карбокси-2',4',7',4,7-гексахлорофлуоресцеин (HEX), ТЕТ, 6- карбокси-4',5'-дихлор-2',7'-диметоксифлуоресцеин (JOE), N,N,N',N'-тетраметил-6-карбоксиродамин (TAMRA), 6-карбокси-Х-родамин (RОХ), 5-карбоксиродамин-6G (R6G5), 6-карбоксиродамин-6G (RG6), родамин, родамин зеленый, родамин красный, родамин 110, красители BODIPY, такие как BODIPY TMR, Oregon Green, кумарины, такие как умбеллиферон, бензимиды, такие как Hoechst 33258; фенантридины, такие как Texas Red, Yakima Yellow, Alexa Fluor, PET, бромистый этидий, акридиниевые красители, карбазольные красители, феноксазиновые красители, порфириновые красители, полиметиновые красители и т.п.

В контексте настоящего изобретения хемилюминесцентные анализы включают использование красителей, основанных на физических принципах, описанных для хемилюминесцентных материалов в (24). Предпочтительными хемилюминесцентными красителями являются сложные эфиры акридиния.

Как уже было указано в настоящем описании, «анализ» или «диагностический анализ» может относится к любому типу, применяемому в области диагностики. Такой анализ может быть основан на связывании подлежащего обнаружению анализируемого вещества с одним или несколькими захватывающими зондами с определенным сродством. В отношении взаимодействия между захватывающими молекулами и молекулами-мишенями или молекулами, представляющими интерес, константа аффинности, предпочтительно, превышает 10⁸ M^-1.

В контексте настоящего изобретения «связывающие молекулы» представляют собой молекулы, которые могут быть использованы для связывания молекулы-мишени или молекулы, представляющей интерес, т.е. анализируемого вещества (а именно, в контексте данного изобретения пронейротензина и его фрагментов), в образце. Связывающие молекулы, поэтому, должны иметь определенную форму, как пространственную, так и относительно поверхностных характеристик, таких как поверхностный заряд, гидрофобность, гидрофильность, наличие или отсутствие доноров и/или акцепторов Льюиса, чтобы специфично связывать молекулы-мишени или молекулы, представляющие интерес. Таким образом, связывание, например, может быть опосредовано ионными, Ван-дер-Ваальсовыми, пи-пи, сигма-пи, гидрофобными или за счет образования водородных связей взаимодействиями или комбинацией двух или нескольких из указанных выше взаимодействий между захватывающими молекулами и молекулами-мишенями или молекулами, представляющими интерес. В контексте настоящего изобретения, связывающие молекулы могут быть, например, выбраны из группы, включающей молекулу нуклеиновой кислоты, углеводную молекулу, PNA-молекулу, белок, антитело, пептид или гликопротеин. Предпочтительно, чтобы связывающие молекулы представляли собой антитела, включая их фрагменты с достаточной аффинностью к мишени или молекуле, представляющей интерес, и включая рекомбинантные антитела или фрагменты рекомбинантных антител, а также химически и/или биохимически модифицированные производные указанных антител или фрагментов, полученных из их вариабельной цепи с длиной по меньшей мере 12 аминокислот.

Хемилюминесцентная метка может представлять собой сложный эфир акридиния, стероидные метки, включая изолюминольные метки, и т.п.

Энзиматическими метками могут являться лактатдегидрогеназа (LDH), креатинкиназа (СРК), щелочная фосфатаза, аспартат-аминотрансфераза (AST), аланин-аминотрансфераза (ALT), кислая фосфатаза, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа и т.д.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения по меньшей мере одно из указанных двух связывающих веществ связано с твердой фазой в виде магнитных частиц и полистирольными поверхностями.

Пороговый уровень для определения риска субъекта в отношении развития впервые выявленного ожирения, составляет выше 60 пмоль/л про-NT, предпочтительно, выше 90 пмоль/л, более предпочтительно, выше 123 пмоль/л. В конкретном варианте осуществления указанный порог превышает 180 пмоль/л или превышает 190 пмоль/л. Эти пороговые значения связаны с указанным выше способом калибровки. Уровень про-NT выше указанного порогового означает, что субъект имеет повышенный риск развития впервые выявленного ожирения.

Ожирение определяется как индекс массы тела >30 кг/м².

Субъект без ожирения определяется, как имеющий индекс массы тела <30 кг/м².

Впервые выявленное ожирение определяется как возникновение ожирения у не страдающих ожирением субъектов через некоторый наблюдаемый промежуток времени после анализа.

Индекс массы тела (ИМТ) определяется как вес тела в килограммах, разделенный на квадрат роста в метрах.

Наблюдаемый промежуток времени составляет до 1 года, предпочтительно, до 2 лет, более предпочтительно, до 5 лет, еще более предпочтительно, более 10 лет, еще более предпочтительно, до 15 лет, еще более предпочтительно, до 16,5 лет, наиболее предпочтительно, до 18 лет.

Диабет определяется следующим образом: известный врачебный диагноз или нахождение на антидиабетических препаратах, либо уровень глюкозы в крови натощак >/= 6,1 ммоль/л (что соответствует >/= 7,0 ммоль/л в плазме) при исходном обследовании.

Преддиабет или нарушенная гликемия натощак (IFG) определяются как уровень глюкозы в крови натощак между >/=5,4 и <6,1 ммоль/л (что соответствует 6,1-6,9 ммоль/л в плазме).

В конкретном варианте осуществления способа по изобретению указанный субъект представляет собой не имеющего диабет субъекта с уровнем глюкозы в крови натощак ниже 5,4 ммоль/л (что соответствует <6,1 ммоль/л в плазме). Метаболический синдром определяется согласно критериям Всемирной организации здравоохранения ((Alberti and Zimmet. 1998. Diabet Med. 15:539-553; World Health Organization. 1999. Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications: report of a WHO Consultation. Part 1: diagnosis and classification of diabetes mellitus. Geneva, Switzerland: World Health Organization), которые требуют наличия резистентности к инсулину, выявленной в результате одного из следующего: (1) диабета II типа; (2) нарушенной гликемии натощак; (3) нарушенной толерантности к глюкозе или (4) для пациентов с нормальным уровнем глюкозы натощак (<110 мг/дл) поглощение глюкозы меньше нижней квартили для эталонной популяции, исследуемой в гиперинсулинемических эугликемических условиях; и двух из следующего: (1) кровяного давления≥140/90 мм рт.ст.; (2) дислипидемии: триглицеридов (TG) ≥1,695 ммоль/л и холестерина липопротеинов высокой плотности (HDL-C) ≤0,9 ммоль/л (мужчины), <1,0 ммоль/л (женщины); (3) центрального ожирения: отношение окружности талии и бедер >0,90 (мужчины), > 0,85 (женщины), или индекс массы тела >30 кг/м²; (4) микроальбуминурии: скорость выделяемого с мочой альбумина≥20 мкг/мин или соотношение альбумин:креатинин≥30 мг/г.

Субъект может иметь нормальное кровяное давление (ВР). Указанный субъект может быть нормотензивным/с высоким кровяным давлением.

Определение нормотензивного/высокого кровяного давления (НВР) выглядит следующим образом:

НВР: систолическое ВР >/= 140 мм рт.ст. или диастолическое ВР >/= 90 мм рт.ст. или нахождение на антигипертензивных препаратах. Субъектами, имеющими нормальное кровяное давление (ВР), являются все другие субъекты, т.е. субъекты с систолическим ВР <140 мм рт.ст. или диастолическим ВР <90 мм рт.ст. или не находящиеся на антигипертензивных препаратах.

В конкретном варианте осуществления способа по изобретению прогнозирование риска у субъекта возникновения впервые выявленного ожирения улучшается за счет дополнительного определения и использования уровня по меньшей мере одного лабораторного параметра или дополнительного маркера, выбранных из группы, включающей глюкозу в крови или плазме натощак, триглицериды, HDL-холестерин или его субфракции, LDL-холестерин или его субфракции, цистатин С, инсулин, CRP, оценочную скорость клубочковой фильтрации (eGFR).

В конкретном варианте осуществления способа по изобретению дополнительно определяется по меньшей мере один клинический параметр, выбранный из группы, включающей возраст, пол, систолическое артериальное давление, диастолическое артериальное давление, гипотензивное лечение (AHT), окружность талии, соотношение талии и бедер, курение, наследственность по диабету, наследственность по онкологии и предшествующие сердечно-сосудистые заболевания (CVD).

Еще один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой способ определения активности переработки жира и/или прогнозирования риска впервые выявленного ожирения, где уровень пронейротензина или его фрагментов, отдельно или в сочетании с другими прогностически полезными лабораторными или клиническими параметрами, используется для определения активности переработки жира и/или прогнозирования риска возникновения впервые выявленного ожирения у субъекта с помощью способа, который может быть выбран из следующих альтернатив:

- сравнение с медианой уровня пронейротензина или его фрагментов или содержащих пронейротензин 1-117 пептидов в наборе предварительно проанализированных образцов в популяции практически здоровых субъектов,

- сравнение с квантилем уровня пронейротензина или его фрагментов или содержащих пронейротензин 1-117 пептидом в наборе предварительно проанализированных образцов в популяции практически здоровых субъектов,

- расчет, основанный на анализе пропорциональных рисков Кокса или с помощью расчетов индексов риска, таких как NRI (Остаточный индекс реклассификации) или IDI (Интегрированный индекс дискриминации).

В одном варианте осуществления настоящего изобретения образец выбран из группы, включающей образец крови, образец сыворотки, образец плазмы, образец спинномозговой жидкости, образец слюны и образец мочи или экстракт какого-либо из указанных выше образцов. В конкретном варианте осуществления способа по изобретению уровень пронейротензина или его фрагментов или содержащего пронейротензин 1-117 пептида имеющего по меньшей мере длину 5 аминокислот, определяется с помощью диагностического анализа, предпочтительно, с помощью иммуноанализа.

В конкретном варианте осуществления способа по изобретению способ выполняется более одного раза, чтобы контролировать риск возникновения впервые выявленного ожирения или чтобы следить за ходом лечения указанного субъекта с целью снижения риска возникновения впервые выявленного ожирения у субъекта, где указанный субъект не страдает ожирением.

В конкретном варианте осуществления способа по изобретению указанный контроль выполняется для того, чтобы оценить реакцию указанного субъекта на предпринимаемые профилактические и/или терапевтические меры.

В конкретном варианте осуществления способа по изобретению способ используется для того, чтобы распределить указанных субъектов по группам риска.

Кроме того, настоящее изобретение охватывает устройство, предназначенное для использования в месте оказания медпомощи, для выполнения способа по изобретению.

Кроме того, настоящее изобретение охватывает анализ и/или набор для осуществления способа по изобретению.

Примеры

Пример 1

Получение антител

Пептиды/конъюгаты для иммунизации:

Пептиды для иммунизации были синтезированы (JPT Technologies, Берлин, Германия) с дополнительным N-концевым остатком цистеина для конъюгации пептидов с бычьим сывороточным альбумином (BSA). Эти пептиды были ковалентно связаны с BSA с использованием сульфо-SMCC (Perbio-Science, Бонн, Германия). Процедуру связывания проводили в соответствии с инструкцией от Perbio.

Пептид (P-NT 1-19)для меченого антитела (LA):

H-CSDSEEEMKALEADFLTNMH-NH2

Пептид (P-NT 44-62) для антитела на твердой фазе (SPA)):

H-CNLNSPAEETGEVHEEELVA-NH2

Антитела были получены в соответствии со следующим способом:

Мышей линии BALB/с иммунизировали 100 мкг коньюгата пептид-BSA в дни 0-й и 14-й (эмульгированного в 100 мкл полного адъюванта Фрейнда) и 50 мкг на 21-й и 28 день (в 100 мкл неполного адъюванта Фрейнда). За три дня до выполнения слияния, животное получало 50 мкг конъюгата, растворенного в 100 мкл физиологического раствора, вводимого в виде одной внутрибрюшинной и одной внутривенной инъекции.

Слияние спленоцитов от иммунизированных мышей и клеток линии миеломы SP2/0 проводили в 1 мл 50%-го полиэтиленгликоля в течение 30 секунд при 37°C. После промывки клетки высевали в 96-луночные планшеты для культивирования клеток. Гибридные клоны были отобраны путем выращивания в среде HAT (культуральная среда RPMI 1640 с добавлением 20% фетальной бычьей сыворотки и HAT-добавки). Через две недели HAT-среду заменяли HT-средой на три пассажа с последующим возвращением к нормальной клеточной культуральной среде.

Супернатанты клеточных культур сначала скринировали на антиген-специфичные IgG-антитела через три недели после слияния. Дающие положительные сигналы микрокультуры переносили в 24-луночные планшеты для размножения. После повторной проверки выбранные культуры клонировали и субклонировали с использованием метода предельных разведений и определяли изотипы. (Lane, R.D. ʺA short-duration polyethylene glycol fusiontechnique for increasing production of monoclonal antibody-secreting hybridomasʺ, J. Immunol. Meth. 81: 223-228; (1985), Ziegler, B. et al. ʺGlutamate decarboxylase (GAD) is not detectable on the surface of rat islet cells examined by cytofluorometry and complement-dependent antibody-mediated cytotoxicity of monoclonal GAD antibodiesʺ, Horm. Metab. Res. 28: 11-15, (1996)).

Получение моноклональных антител

Антитела были получены с помощью стандартных способов получения антител (Marx et al, Monoclonal Antibody Production, ATLA 25, 121, 1997) и очищены с помощью хроматографии на белке А. Чистота антител составляла >95% исходя из данных электрофореза в SDS-полиакриламидном геле.

Пример 2

Иммуноанализ для количественного определения пронейротензина человека

Используемой технологией был люминесценции сэндвич-иммуноанализ с иммобилизацией в пробирке и мечением сложным эфиром акридиния.

Меченое соединение (трейсер): 100 мкл (100 мкл) LA (1 мг/мл в PBS, рН 7,4, смешивали с 10 мкл NHS-эфира акридиния (1 мг/мл в ацетонитриле, InVent GmbH, Германия) (EP 0353971) и инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре. Меченое LA очищали с помощью гель-фильтрационной ВЭЖХ на Bio-Sil SEC 400-5 (Bio-Rad Laboratories, Inc., США). Очищенное LA разводили в буфере (300 ммоль/л фосфата калия, 100 ммоль/л NaCl, 10 ммоль/л Na-ЭДТА, 5 г/л бычьего сывороточного альбумина, рН 7,0). Конечная концентрация составляла приблизительно 800000 относительных световых единиц (RLU) меченого соединения (приблизительно 20 нг меченого антитела) на 200 мкл. Хемилюминесценцию сложного эфира акридиния измеряли на AutoLumat LB 953 (Berthold Technologies GmbH & Co. KG).

Твердая фаза: полистирольные пробирки (Greiner Bio-One International AG, Австрия) покрывали (18 часов при комнатной температуре) с использованием SPA (1,5 мкг SPA/0,3 мл 100 ммоль/л NaCl, 50 ммоль/л TRIS/HCl, рН 7,8). После блокирования с помощью 5% бычьего сывороточного альбумина пробирки промывали PBS, рН 7,4, и высушивали в вакууме.

Калибровка:

Для анализа проводили калибровку с использованием разведений содержащей про-NT сыворотки крови человека. Пул сывороток крови человека с высокой иммунореактивностью в отношении про-NT (InVent Diagostika, Хеннигсдорф, Германия) разбавляли лошадиной сывороткой (Biochrom AG, Германия) (стандарты для анализа).

Эти стандарты были откалиброваны с использованием калибровочного стандарта про-NT человека (ICI-Diagnostics, Берлин, Германия). В альтернативном варианте, для анализа можно провести калибровку с помощью синтетического или рекомбинантного про-NT 1-117 или их фрагментов (см. также Ernst et al., 2006).

Иммуноанализ на про-NT:

50 мкл образца (или калибровочного стандарта) пипеткой переносили в пробирки, покрытые SPA, после добавления меченого LA (200 мкл), пробирки инкубировали в течение 16-22 ч при 18-25°С. Несвязавшийся трейсер удаляли 5-кратным промыванием (каждый раз по 1 мл) промывочным раствором (20 мМ PBS, рН 7,4, 0,1% Тритон Х-100).

Связавшиеся с пробиркой LA измеряли с помощью AutoLumat LB 953.

На фиг.1 показана типичная кривая зависимости доза/сигнал P-NT.

Пример 3

Проводимое в городе Мальме исследование связи питания и онкологических заболеваний (Malmö Diet and Cancer (MDC) study) представляет собой популяционную проспективную эпидемиологическую когорту из 28449 мужчин (родившихся в 1923-1945 гг.) и женщин (родившихся в 1923-1950 гг.) из города Мальме на юге Швеции, которые прошли базовое обследование в период между 1991 и 1996 гг. (Minisymposium: The Malmo Diet and Cancer Study. Design, biological bank and biomarker programme. J Intern Med 233, 39-79 (1993)). Из этой когорты 6103 человек были случайным образом отобраны для участия в MDC-сердечно-сосудистой когорте (MDC-CC), которая была создана для изучения эпидемиологии болезней сонных артерий в период между 1991 и 1994 гг. (Persson et al. 2008. Atherosclerosis 200: 191-198). Для анализа пронейротензина (про-NT) были доступны образцы плазмы, взятые натощак при базовом обследовании, которые были успешно проанализированы в общей сложности у 4632 участников MDC-CC. Из них полные данные были доступны по ИМТ для 4626 участников, по окружности талии для 4625 участников и по предполагаемой степени резистентности к инсулину с использованием гомеостатической модели оценки резистентности к инсулину (HOMA-IR) (концентрация глюкозы в крови натощак × концентрация инсулина в плазме натощак/22,5) (Matthews et al. 1985. Diabetologia 28: 412-419) для 4468 участников. ИМТ определяли как вес тела в килограммах, разделенный на квадрат роста в метрах, а ожирение определяли как ИМТ≥30 кг/м². Брюшное ожирение определяли как окружность талии≥94 см у мужчин и≥80 см у женщин в соответствии с определением Международной федерации диабета (Alberti et al. 2006. Diabet Med 23: 469-489). Резистентность к инсулину считалась присутствующей у субъектов, принадлежащих к верхним 25% значений НОМА-IR в MDC-CC. «Впервые выявленное ожирение» определяется как возникновение ожирения у не страдающих ожирением участников MDC-CC, которые были повторно обследованы и получили диагноз ожирение после среднего периода наблюдения в 16,5±1,5 лет.

Про-NT измеряли в сохраненных образцах плазме, взятых натощак, которые были заморожены на -80°C непосредственно при базовом обследовании MDC-CC, с использованием современного хемилюминометрического сэндвич-иммуноанализа для обнаружения фрагмента предшественника про-NT (про-NT 1-117), как было описано ранее (Ernst et al. 2006. Peptides 27: 1787-1793). Анализы на глюкозу в крови и инсулин в плазме были проведены во время базового обследования в Отделении клинической химии больницы Университета Мальме, который входит в национальную систему стандартизации и контроля качества (Enhorning et al. 2010. Circulation 121: 2102-2108). Из 4626 субъектов с исходными данными по ИМТ и про-NT у 2900 субъектов был повторно измерен ИМТ после среднего периода наблюдения в 16,5±1,5 лет. При анализе случаев ожирения авторы исключили субъектов, которые уже страдали от ожирения при базовом обследовании, в результате чего в общей сложности осталось 2606 не страдающих ожирением субъектов для анализа про-NT в связи с возникновением ожирения. Все участники дали письменное информированное согласие, и исследование было одобрено Комитетом по этике в Университете Лунда, Лунд, Швеция.

Статистический анализ

Все субъекты при базовом обследовании MDC-CC были разделены на восходящие квартили в соответствии со значением их про-NT натощак. При перекрестном анализе авторы связали квартиль про-NT из базового обследования с дихотомическим результатом по ожирению, абдоминальным ожирением и резистентностью к инсулину с использованием скорректированной по возрасту и полу модели логистической регрессии. При анализе случаев ожирения авторы связали квартиль про-NT из базового обследования с дихотомическим результатом по возникновению ожирения с использованием логистической регрессии, скорректированной по возрасту, полу и ИМТ при базовом обследовании. Данные представлены в виде отношения шансов (95%-й доверительный интервал), и субъекты, принадлежащие к самому низкому квартилю про-NT, были определены в качестве эталонной группы (отношение шансов=1). «Р для тренда» обозначает P-значение для линейного тренда по квартилям 1-4.

Результаты исследования

Авторы измерили уровни про-NT во взятой натощак плазме у 4632 субъектов среднего возраста из популяционной сердечно-сосудистой когорты из Исследования связи питания с онкологическими заболеваниями, проводимого в городе Мальме (таблица 1). Скорректированная по возрасту и полу вероятность ожирения, абдоминального ожирения и резистентность к инсулину значительно увеличились по квартилям про-NT (таблица 2). Среди не страдающих ожирением субъектов, риск развития ожирения в течение среднего периода наблюдения 16,5±1,5 лет постепенно увеличивался с квартилями про-NT, независимо от исходного индекса массы тела, возраста и пола. Медианные концентрации про-NT составляли 60,1 пмоль/л (диапазон 3,3-75,9 пмоль/л) в квартиле 1, 89,3 пмоль/л (диапазон 75,9-105 пмоль/л) в квартиле 2, 123 пмоль/л (диапазон 105-149 пмоль/л) в квартиле 3 и 190 пмоль/л (диапазон 149-1155 пмоль/л) в квартиле 4. Не страдающие ожирением субъекты в верхнем квартиле уровней про-NT при базовом обследовании имели более чем в два раза (OR 2,06 (95%-й доверительный интервал 1,38-3,06) повышенный риск развития ожирения по сравнению с аналогичными субъектами в нижнем квартиле (таблица 2).

Используя те же переменные в уравнении, авторы исследовали различные подгруппы для прогнозирования возникновения впервые выявленного ожирения (таблица 3), при этом при базовом исследовании, соответственно, были исключены субъекты с сахарным диабетом (DM) и нарушенной гликемией натощак (IFG), высоким кровяным давлением/на антигипертензивной терапии (АHT), с метаболическим синдромом (MeSy), eGFR <60 (мл/мин/1,73 м²), онкологической наследственностью, преобладающим раком, курящие. Не страдающие ожирением субъекты из квартиля самых высоких уровней про-NT, не имеющие одного из вышеуказанных состояний, вновь имели более чем в два раза повышенный риск развития ожирения по сравнению с аналогичными субъектами из квартиля с самыми низкими уровнями про-NT (таблица 3). Не страдающие ожирением пациенты, не имеющие ни одного из этих состояний (суперздоровые субъекты), из квартиля самых высоких уровней про-NT даже показали более чем 3-кратное увеличение риска развития ожирения по сравнению с аналогичными субъектами из квартиля с наименьшими уровнями про-NT.

Пример 4

Концентрации PNT (пронейротензина) до и после теста с пероральным введением жира («теста с использованием сливок»)

В общей сложности было отобрано 54 пациента, 19 здоровых контрольных субъектов и 35 пациентов с диагнозом сердечной недостаточности. Субъекты голодали по меньшей мере 10 часов и принимали стандартизированный обогащенный жиром питьевой раствор (сливки, содержащие 30% жира). Кровь брали в начале исследования и через 1, 2 и 3 часа после приема сливок. Пронейротензин измеряли с помощью иммуноанализа, как описано выше. Базовый уровень про-NT был определен как 100%, и уровни в трех различных временных точках были связаны с ним. Про-NТ значительно повышался через 1 час после приема сливок в обоих группах, у здоровых людей и у пациентов с сердечной недостаточностью, и снижался через 2 и 3 часа, но не достигая исходного уровня (фиг.2). Кроме того, относительная концентрация про-NT значительно отличалась у здоровых и больных с сердечной недостаточностью во всех трех временных точках (р<0,05).

Таблица 1

Клинические характеристики сердечно-сосудистой когорты из Исследования связи питания с онкологическими заболеваниями, проводимого в городе Мальме (МDС-CC).

Характеристика Значение N Возраст (года) 57,7±6,0 4626 Женщины, n (%) 2661 (57,5) 4626 Индекс массы тела (кг/м²) 25,8±3,9 4626 Окружность талии (см) 84,0±12,9 4625 Глюкоза в крови натощак (мМ) 5,2±1,4 4468 Концентрация инсулина натощак (мЕд/л) 7,0 (4,0-9,0) 4468 HOMA-IR 1,5 (0,9-2,2) 4468

Данные приведены в виде среднего± стандартное отклонение для нормально распределенных переменных, а также в виде медианы и межквартильного диапазона для концентрации инсулина натощак. Категориальные данные представлены в виде чисел (в процентах). «N» означает число с полными данными; таким образом, включены в анализ. «HOMA-IR» означает гомеостатическую модельную оценку резистентности к инсулину (концентрация инсулина в плазме натощак × концентрация глюкозы в крови натощак/22,5).

Таблица 2

Концентрации пронейротензина (про-NT) в плазме натощак относительно распространенности ожирения и резистентности к инсулину, а также относительно возникновения впервые выявленного ожирения в течение длительного периода последующего наблюдения в сердечно-сосудистой когорте из Исследования связи питания с онкологическими заболеваниями, проводимого в городе Мальме.

N/N
случаев Отношение шансов (95%-й доверительный интервал) P для тренда Про-NT
Квартиль 1 Про-NT
Квартиль 2 Про-NT
Квартиль 3 Про-NT
Квартиль 4 Преобладающее ожирение 4626/604 1,0 (эталон) 1,00
(0,78-1,29) 1,13
(0,88-1,45) 1,34
(1,05-1,70) 0,01 Преобладающее абдоминальное ожирение 4625/1769 1,0 (эталон) 1,07
(0,90-1,27) 1,23
(1,04-1,46) 1,30
(1,09-1,54) 0,001 Преобладающая инсулиновая резистентность 4468/1140 1,0 (эталон) 1,30
(1,06-1,59) 1,43
(1,17-1,74) 1,70
(1,39-2,06) <0,0001 Впервые выявленное ожирение 2606/335 1,0 (эталон) 1,44
(0,95-2,10) 1,83
(1,21-2,65) 2,06
(1,38-3,06) <0,01

«N/N случаев» обозначает общее число субъектов в анализе/число случаев с интересующим заболеванием. «Про-NT» обозначает концентрацию пронейротензина в плазме натощак при базовом обследовании в MDC-CC. «Про-NT квартили 1-4» определяют квартили в популяции MDC-CC (от низшего к высшему) по про-NT. Данные представлены в виде отношения шансов (95%-й доверительный интервал), и субъекты, принадлежащие к самому низкому квартилю про-NT, были определены в качестве эталонной группы (отношение шансов=1). «Р для тренда» обозначает P-значение для линейного тренда по квартилям 1-4. Преобладающий означает, что субъекты уже имели «интересующее заболевание» при базовом обследовании, тогда как субъекты с преобладающим ожирением были исключены в анализе для прогнозирования риска впервые выявленного ожирения.

Таблица 3

Концентрации пронейротензина (про-NT) в плазме натощак относительно частоты впервые выявленного ожирения в различных подгруппах пациентов в течение длительного периода последующего наблюдения в сердечно-сосудистой когорте из Исследования связи питания с онкологическими заболеваниями, проводимого в городе Мальме.

N/N
случаев Отношение шансов (95%-й доверительный интервал) P для тренда Про-NT
Квартиль 1 Про-NT
Квартиль 2 Про-NT
Квартиль 3 Про-NT
Квартиль 4 Все 2606/335 1,0 (эталон) 1,44
(0,95-2,10) 1,83
(1,21-2,65) 2,06
(1,38-3,06) <0,01 Мужчины 1080/137 1,0 (эталон) 1,43
(0,79-2,59) 1,36
(0,75-2,48) 2,36
(1,29-4,30) 0,044 Женщины 1526/198 1,0 (эталон) 1,45
(0,85-2,46) 2,23
(1,32-3,75) 1,88
(1,09-3,21) 0,019 Нет онкологической наследственности 1456/197 1,0 (эталон) 1,65
(0,99-2,77) 1,68
(0,99-2,85) 2,37
(1,41-3,97) 0,014 Нет преобладающего рака 2362/301 1,0 (эталон) 1,36
(0,89-2,06) 1,96
1,29-2,95) 2,1
(1,38-3,19) 0,001 BP<140 1631/197 1,0 (эталон) 1,29
(0,77-2,18) 1,88
(1,13-3,15) 2,03
(1,21-3,39) 0,023 Нет AHT 2269/273 1,0 (эталон) 1,63
(1,05-2,53) 2,03
(1,31-3,13) 2,12
(1,35-3,35) 0,004 BP<140/ нет AHT 1526/175 1,0 (эталон) 1,44
(0,83-2,49) 1,99
(1,15-3,42) 2,16
(1,24-3,73) 0,026 Некурящие 2001/241 1,0 (эталон) 1,47
(0,93-2,32) 1,75
(1,12-2,74) 2,26
(1,42-3,61) 0,006 Нет преобладающего сердечного заболевания 2544/326 1,0 (эталон) 1,51
(1,00-2,26) 1,95
(1,30-2,90) 2,17
(1,44-3,26) 0,001 eGFR >60 2319/320 1,0 (эталон) 1,36
(0,90-2,04) 1,77
(1,18-2,64) 2,22
(1,47-3,35) 0,001 Нет IFG или DM 2152/254 1,0 (эталон) 1,44
(0,91-2,28) 2,03
1,30-3,19) 2,46
(1,55-3,90) <0,001 Нет MeSy 2426/302 1,0 (эталон) 1,44
(0,96-2,18) 1,92
(1,28-2,89) 2,03
(1,34-3,07) 0,003 Все здоровые 1155/123 1,0 (эталон) 1,84
(0,95-3,57) 2,68
(1,41-5,09) 3,17
(1,57-6,37) 0,005 Здоровые женщины 681/74 1,0 (эталон) 1,35
(0,56-3,25) 2,96
(1,28-6,86) 3,46
(1,37-8,73) 0,015

«N/N случаев» обозначает общее число субъектов в анализе/число случаев с интересующим заболеванием. «Про-NT» обозначает концентрацию пронейротензина в плазме натощак при базовом обследовании в MDC-CC. «Про-NT квартили 1-4» определяют квартили в популяции MDC-CC (от низшего к высшему) по про-NT. Данные представлены в виде отношения шансов (95%-й доверительный интервал), и субъекты, принадлежащие к самому низкому квартилю про-NT, были определены в качестве эталонной группы (отношение шансов=1). «Р для тренда» обозначает P-значение для линейного тренда по квартилям 1-4.

«Нет онкологической наследственности» означает отсутствие известных случаев рака в семейном анамнезе при базовом обследовании, «нет преобладающего рака» означает отсутствие ракового диагноза при базовом обследовании, «нет преобладающего сердечного заболевания» означает отсутствие инфаркта миокарда, ишемической болезни сердца, инсульта, сердечной недостаточности (острой или хронической сердечной недостаточности), фибрилляции предсердий и трепетания предсердий при базовом обследовании, BP=кровяное давление, АНТ=антигипертензивная терапия, eGFR=оценочная скорость клубочковой фильтрации, IFG=нарушенная гликемия натощак, DM=сахарный диабет, MeSy=метаболический синдром.

Таблица 4

Концентрация пронейротензина исходная (натощак) и через 1, 2 и 3 часа после приема сливок у здоровых контрольных субъектов и у пациентов с сердечной недостаточностью (HF)

про-NT [в %] Исходное значение 1 ч 2 ч 3 ч Контрольная группа 100 173,5 147,0 133,0 HF 100 227,5 201,8 179,3

Значения PNT приведены в % относительно исходного значения, которое было определено для обеих групп как 100%, соответственно.

Описание фигур:

На фиг.1 показана типичная кривая зависимости доза/сигнал Р-NТ.

На фиг.2 показан уровень PNT до и после того приема сливок у пациентов с сердечной недостаточностью и у контрольной группы.

Группа изобретений относится к диагностической медицине и раскрывает способ определения активности переработки жира и способ прогнозирования риска возникновения ожирения у субъекта. Способы включают определение уровня пронейротензина или его фрагментов длиной по меньшей мере 5 аминокислот в биологической жидкости, сопоставление полученного уровня пронейротензина или его фрагментов с активностью переработки жира и/или риском возникновения ожирения у указанного субъекта, где повышенный уровень указывает на повышенную активность переработки жира и/или прогнозирует повышенный риск возникновения ожирения. Заявленная группа изобретений позволяет определять активность переработки жира и выявлять субъектов, имеющих предрасположенность к развитию ожирения. 2 н. и 27 з.п. ф-лы, 2 ил., 4 пр., 4 табл.

1. Способ определения активности переработки жира у субъекта, включающий:

определение с помощью иммуноанализа уровня пронейротензина 1-117 или его фрагментов длиной по меньшей мере 5 аминокислот или содержащих пронейротензин 1-117 пептидов в биологической жидкости, полученной от указанного субъекта, или

определение уровня пронейротензина 1-117 или его фрагментов длиной по меньшей мере 5 аминокислот в биологической жидкости, полученной от указанного субъекта; и

соотнесение указанного уровня пронейротензина 1-117 или его фрагментов или содержащих пронейротензин 1-117 пептидов с активностью переработки жира у указанного субъекта, где повышенный уровень свидетельствует о повышенной активности переработки жира,

где субъект не страдает ожирением во время забора образца биологической жидкости от указанного субъекта и где повышенный уровень означает уровень выше порогового уровня.

2. Способ по п.1, где указанный субъект представляет собой субъекта, не имеющего преддиабета (нет IFG).

3. Способ по п.1 или 2, где определяют уровень пронейротензина 1-117 или его фрагментов или содержащих пронейротензин 1-117 пептидов натощак.

4. Способ по п.1, где определяют уровень пронейротензина 1-117.

5. Способ по п.1, где субъект не имеет диабета с содержанием глюкозы в крови натощак ниже 6,1 ммоль/л, но выше 5,4 ммоль/л.

6. Способ по п.1, где субъект не имеет рака.

7. Способ по п.1, где у субъекта никогда не диагностировали острое сердечно-сосудистое заболевание на момент отбора образца биологической жидкости у указанного субъекта, где указанное сердечно-сосудистое заболевание выбирают из группы, включающей инфаркт миокарда, инсульт, острую сердечную недостаточность и обусловленную сердечно-сосудистым заболеванием смерть, вызванную инфарктом миокарда, инсультом или острой сердечной недостаточностью.

8. Способ по п.1, где субъект не имеет метаболического синдрома.

9. Способ по п.1, где субъект представляет собой субъекта с содержанием глюкозы в крови натощак ниже 5,4 ммоль/л.

10. Способ по п.1 или 9, где дополнительно определяют по меньшей мере один клинический параметр, выбранный из группы, включающей возраст, пол, систолическое артериальное давление, диастолическое артериальное давление, антигипертензивное лечение (АНТ), окружность талии, соотношение талии и бедер, курение на текущий момент, наследственность по сахарному диабету и предшествующие сердечно-сосудистые заболевания (CVD).

11. Способ по п.1, где образец выбирают из группы, включающей образец крови, образец сыворотки, образец плазмы, образец спинномозговой жидкости, образец слюны и образец мочи или экстракт любого из вышеуказанных образцов.

12. Способ по п.1, где указанный способ выполняется более одного раза, чтобы контролировать риск заболеваемости ожирением.

13. Способ по п.12, где мониторинг выполняется для того, чтобы оценить реакцию указанного субъекта на профилактические и/или терапевтические меры.

14. Способ по п.12 или 13, где мониторинг выполняется для того, чтобы распределить указанных субъектов по группам риска.

15. Способ по п.1, где повышенный уровень означает уровень выше порогового уровня.

16. Способ прогнозирования риска развития ожирения у субъекта, включающий:

определение с помощью иммуноанализа уровня пронейротензина 1-117 или его фрагментов длиной по меньшей мере 5 аминокислот или содержащих пронейротензин 1-117 пептидов в биологической жидкости, полученной от указанного субъекта, или

определение уровня пронейротензина 1-117 или его фрагментов длиной по меньшей мере 5 аминокислот в биологической жидкости, полученной от указанного субъекта; и

соотнесение указанного уровня пронейротензина 1-117 или его фрагментов или содержащих пронейротензин 1-117 пептидов с риском возникновения ожирения у указанного субъекта, где повышенный уровень прогнозирует повышенный риск развития ожирения,

где субъект не страдает ожирением во время забора образца биологической жидкости от указанного субъекта,

где повышенный уровень означает уровень выше порогового уровня.

17. Способ по п.16, где указанный субъект представляет собой субъекта, не имеющего преддиабета (нет IFG).

18. Способ по п.16 или 17, где определяют уровень пронейротензина 1-117 или его фрагментов или содержащих пронейротензин 1-117 пептидов натощак.

19. Способ по п.16, где определяют уровень пронейротензина 1-117.

20. Способ по п.16, где субъект не имеет диабета с содержанием глюкозы в крови натощак ниже 6,1 ммоль/л, но выше 5,4 ммоль/л.

21. Способ по п.16, где субъект не имеет рака.

22. Способ по п.16, где у субъекта никогда не диагностировали острое сердечно-сосудистое заболевание на момент отбора образца биологической жидкости у указанного субъекта, где указанное сердечно-сосудистое заболевание выбирают из группы, включающей инфаркт миокарда, инсульт, острую сердечную недостаточность и обусловленную сердечно-сосудистым заболеванием смерть, вызванную инфарктом миокарда, инсультом или острой сердечной недостаточностью.

23. Способ по п.16, где субъект не имеет метаболического синдрома.

24. Способ по п.16, где субъект представляет собой субъекта с содержанием глюкозы в крови натощак ниже 5,4 ммоль/л.

25. Способ по п.16 или 24, где дополнительно определяют по меньшей мере один клинический параметр, выбранный из группы, включающей возраст, пол, систолическое артериальное давление, диастолическое артериальное давление, антигипертензивное лечение (АНТ), окружность талии, соотношение талии и бедер, курение на текущий момент, наследственность по сахарному диабету и предшествующие сердечно-сосудистые заболевания (CVD).

26. Способ по п. 16, где образец выбирают из группы, включающей образец крови, образец сыворотки, образец плазмы, образец спинномозговой жидкости, образец слюны и образец мочи или экстракт любого из вышеуказанных образцов.

27. Способ по п.16, где указанный способ выполняется более одного раза, чтобы контролировать риск заболеваемости ожирением.

28. Способ по п.27, где мониторинг выполняется для того, чтобы оценить реакцию указанного субъекта на профилактические и/или терапевтические меры.

29. Способ по п. 27 или 28, где мониторинг выполняется для того, чтобы распределить указанных субъектов по группам риска.