СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ СЛУЧНОЙ БОЛЕЗНИ (T. EQUIPERDUM) И СУРРЫ (T. EVANSI) ЛОШАДЕЙ Российский патент 2019 года по МПК G01N33/53 C12Q1/68 

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярно-генетической диагностики паразитарных болезней животных, научных исследований в ветеринарии и молекулярной биотехнологии и может быть использовано в диагностических исследованиях в научно-исследовательских институтах, ветеринарных лабораториях, животноводческих хозяйствах.

Трипаносомы - одноклеточные простейшие жгутиковые паразиты класса кинетопластид. На территории России встречаются возбудители случной болезни (Т. equiperdum) и сурры (Т. evansi) лошадей.

По данным Международного Эпизоотическое Бюро случную болезнь, вызываемую Trypanosoma equiperdum, регистрируют в Южной Африке, на юге Западной Европы, в Южной Америке, КНР, Среднем Востоке, Средней Азии (Киргизии, Узбекистане) и в России (Сибири). У лошадей случная болезнь протекает наиболее тяжело с высоким уровнем смертности (30…50%).

Tr. evansi широко распространена в Азии, Северной Африке, Центральной и Южной Америке. К ней восприимчивы большинство видов домашних и многие виды диких животных. У непривитых лошадей вызываемая этой трипаносомой болезнь - сурра (суауру), - как правило, заканчивается летально.

Согласно утвержденным Международным Эпизоотическим Бюро Правилам, ввоз лошадей из неблагополучных по случной болезни стран разрешен только при условии полного исключения у них данного трипаносомоза. С этой целью в основном применяют серологические тесты (чаще всего реакцию связывания комплемента и дополнительно иммуноферментный анализ), микроскопию мазков и биопробу на лабораторных животных.

При проведении диагностических исследований особую сложность представляет видовая дифференциация Tr. equiperdum и Tr. evansi, поскольку они неразличимы морфологически, имеют перекрестно реагирующие антигены и многочисленные сходные участки генома (фиг. 1 и фиг. 2).

Вместе с тем, разработка достоверных методов, позволяющих дифференцировать возбудителей этих двух болезней, является важной задачей для ветеринарной медицины, так как от правильности постановки диагноза зависит выбор дальнейшей стратегии. При случной болезни лошадей убивают, а при суре - лечат.

Принцип полимеразной цепной реакции (ПЦР) заключается в многократном увеличении (амплификации) определенного участка ДНК выявляемого объекта путем его копирования с помощью фермента ДНК-полимеразы и специфических праймеров. Специфические праймеры (прямой и обратный) ограничивают определенный фрагмент нуклеотидной последовательности таким образом, что элонгация новой цепи ДНК при амплификации в ПЦР происходит только между ними. Основными параметрами эффективного прохождения реакции амплификации, обеспечивающими специфичность и чувствительность, являются правильный выбор области генома идентифицируемого агента, структура и температурный режим отжига олигонуклеотидных праймеров.

До сих пор никому не удалось создать универсальную тест-систему для дифференциации трипаносом видов Т. evansi и Т. equiperdum методом ПЦР.

Уровень техники

Известен способ дифференциальной диагностики Т. evansi и Т. equiperdum серологическими методами с применение реакции связывания комплемента со специфическими трипаносомными антигенами в разведениях от 1:10 до 1:160. Данный метод позволяет дифференцировать возбудителей друг от друга, но при этом остается вероятность перекрестной реакции ввиду близкородственных генетических связей обеих трипаносом и похожести их некоторых поверхностных антигенов (Георгиу X. Получение высокоактивных и высокоспецифичных трипаносомных сывороток. ВЕТКОРМ» №1/2014 Москва стр. 26-28)

За прототип мы взяли способ диагностики Т. evansi и Т. equiperdum методом ПЦР с использованием одной пары праймеров. Однако эти праймеры позволяют установить лишь принадлежность трипаносомы из исследуемого материала к подроду Trypanozoon, и позволяет только выявить в образце сразу по меньшей мере три вида трипаносом (Т. equiperdum, Т. brucei и Т. evansi) без видовой дифференциации. В случае случной болезни и сурры это не приемлемо, так как позволяет только обнаружить возбудителя в образце, но не может различить их по видовой принадлежности. (Ломакина Н.Ф., Георгиу X., Гулюкин М.И. Трудности дифференциации трипаносом Т. evansi и Т. equiperdum // Сборник трудов VIII сероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика». Том II. Москва. Март 2014 г. стр. 491-492.)

Раскрытие изобретения

Техническим результатом является достоверная дифференциация трипаносомы видов Т. evansi и Т. equiperdum.

Сущность предполагаемого изобретения заключается в том, что для дифференциальной диагностики сначала из крови больных лошадей или из крови мышей и кроликов, которым трехкратно вводили трипаносомный антиген с адьювантом (гидроокись алюминия) и которых тотально обескровливали на 25-30 день, получают высокоактивные и высокоспецифичные ДНК-содержащие антигены Т. evansi и Т. equiperdum (Фиг. 3), которые лиофилизируют, а затем используют при постановке полимеразной цепной реакции с специально разработанными праймерами: ACGAAGTGGCTTCTGAAGG и AGCTAATCCCAACCTTGCC, AGGAGGAGCCAGAGTGGA и CCAGAGATTCCGCACCACT (Фиг. 4) - к гену RoTat1.2 VSG, гену субъединицы 5 NADH дегитрогеназы (nad5) с последующим электрофоретическим (Фиг. 5 и Фиг. 6) определением размера амплифицируемого фрагмента нуклеотидной последовательности, где по наличию на электрофораграмме фрагментов соответствующей длины в исследуемом образце диагностируют наличие в ДНК-содержащих антигенах паразитов Т. evansi или Т. equiperdum.

Осуществление изобретения.

Предлагаемое изобретение может быть проиллюстрировано следующим примером:

Нами было выявлено, что для выявления Т. evansi и Т. equiperdum целесообразно использовать праймеры к специфичному для обоих возбудителей участку гена RoTat1.2 VSG, гену субъединицы 5 NADH дегитрогеназы (nad5) как наиболее консервативной области генома. При конструировании праймеров и оценке их специфичности использовали нуклеотидные последовательности и программу BLAST, доступные в Интернете на сайте NCBI.

Предложенный способ заключается в следующем: с помощью компьютерной программы DNASTAR (Lasergene Co., USA) на основании программы, предоставленной в базах данных Интернет ресурсов GenBank (CLUA), по генотипам возбудителей выбирают рефернс - последовательность. Праймеры проверяют на отсутствие гомологии с последовательностями других микроорганизмов и генома человека программой BLAST с помощью веб-ресурса Национального центра биотехнологической информации (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). На основании проведенного компьютерного анализа были подобраны пары праймеров ACGAAGTGGCTTCTGAAGG и AGCTAATCCCAACCTTGCC, AGGAGGAGCCAGAGTGGA и CCAGAGATTCCGCACCACT, которые являются главным компонентом ПЦР и обеспечивают ее специфичность и чувствительность.

Праймеры имеют следующую характеристику: комлементарность выбранной области гена, отсутствие самокомлементарных участков внутри каждого праймера и между прямым и обратным, фланкируют область фрагментов гена RoTat1.2 VSG, гену субъединицы 5 NADH дегитрогеназы (nad5). Синтез разработанных олигонуклеотидных праймеров заказывается в коммерческом сервисном центре.

Амплификация специфических фрагментов ДНК анаплазм с помощью разработанных праймеров для дифференциальной диагностики случной болезни и суры лошадей.

В процессе проведения практических экспериментов подбирают оптимальные условия прохождения полимеразной цепной реакции с разработанными праймерами.

ДНК прогревают при 95° в течение 3 минут и используют для постановки ПЦР. Состав реакционной смеси указан в таблице 4. В качестве положительного контроля и ПЦР используют референтный штамм Альфорт. Предварительно штамм был исследован серологическими методами (РСК и ИФА). В качестве отрицательного контроля используют дистиллированную воду.

Полимеразную цепную реакцию проводят в объеме реакционной смеси 25 мкл на 1 пробу ДНК. Температурно-временной режим проведения реакции для амплификатора «Терцик» («ДНК-технология», Россия) представлен в фиг. 4.

После проведения реакции амплификации продукты ПЦР анализируют методом электрофоретического разделения в 2% агарозном геле с добавлением бромистого этидия.

В процессе ПЦР были получены продукты амплификации ДНК фрагмента специфичного участка гена RoTat1.2 VSG, гену субъединицы 5 NADH дегитрогеназы (nad5), кодирующего ДНК трипаносом. При обнаружении амплифицируемых фрагментов нуклеотидной последовательности соответствующей длины на электрофореграмме в исследуемом образце диагностируют наличие в исследуемом образце трипаносом Т. evansi или Т. equiperdum.

При учете результатов ПЦР в первую очередь оценивали контрольные образцы. В электрофоретической дорожке с положительным контрольным образцом (K+) присутствовала светящаяся полоса на уровне соответствующем фрагменту длиной 410 н.п. (Т. evansi) или 724 н.п. (Т. equiperdum) В отрицательных пробах полоса отсутствовала.

Опытные пробы оценивали по наличию в соответствующей дорожке специфической полосы, которая в положительных образцах располагалась на том же уровне, что и полоса в положительной контрольной пробе.

Заявляемое изобретение апробировано с положительным результатом и регулярной воспроизводимостью в 2015-2017 годах на 50 пробах, полученных из сохраняемых в криобанке лаборатории референтных штаммов Т. evansi и Т. equiperdum и от больных лошадей, поступивших из различных регионов.

Предлагаемое изобретение найдет применение в диагностических исследованиях в научно-исследовательских институтах, ветеринарных лабораториях, животноводческих хозяйствах.

Список литературы.

1. Георгиу X. Получение высокоактивных и высокоспецифичных трипаносомных сывороток. ВЕТКОРМ» №1/2014 Москва стр. 26-28.

2. Ломакина Н.Ф., Георгиу X., Гулюкин М.И. Трудности дифференциации трипаносом Т. evansi и Т. equiperdum // Сборник трудов VIII сероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика». Том II. Москва. Март 2014 г. стр. 491-492.

На фиг. 1 изображена дендрограмма фрагмента в 410 н.п. из области миникольца кинетопласта, построенная методом ближайшего соседа с повторной выборкой n=1000 в бутстрепном анализе в программе Mega 4. Статистическая достоверность соответствующих узлов дерева представлена в процентах. Шкала делений отражает эволюционное расстояние - число замен нуклеотидов на сайт. Эволюционное расстояние рассчитано методом максимального правдоподобия. Кружками помечены пробы, исследованные в настоящей работе.

На Фиг. 2. изображена дендрограмма фрагмента в 724 н.п. из области миникольца кинетопласта. Статистическая достоверность соответствующих узлов дерева представлена в процентах. Шкала делений отражает эволюционное расстояние - число замен нуклеотидов на сайт. Эволюционное расстояние рассчитано методом максимального правдоподобия. Кружками помечены пробы, исследованные в настоящей работе.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и ветеринарии и предназначено для дифференциальной диагностики случной болезни и сурры лошадей. Для этого сначала из крови больных лошадей или из крови мышей и кроликов, которым трехкратно вводили трипаносомный антиген с адьювантом (гидроокись алюминия) и которых тотально обескровливали на 25-30 день, получают высокоактивные и высокоспецифичные ДНК-содержащие антигены Т. evansi и Т. equiperdum, которые лиофилизируют, а затем используют при постановке полимеразной цепной реакции с праймерами к гену RoTat1.2 VSG, гену субъединицы 5 NADH дегидрогеназы (nad5) с последующим электрофоретическим определением размера амплифицируемого фрагмента нуклеотидной последовательности. При наличии на электрофореграмме фрагмента длиной 410 н.п. диагностируют наличие в образцах ДНК-содержащих антигенов ДНК Т. evansi, а при наличии фрагмента длиной 724 н.п. диагностируют наличие в образцах ДНК-содержащих антигенов ДНК Т. equiperdum соответственно. Способ позволяет достоверно дифференцировать трипаносомы видов Т. evansi и Т. equiperdum. 6 ил.

Способ дифференциальной диагностики случной болезни Т. Equiperdum и сурры Т. evansi лошадей, включающий в себя постановку полимеразной цепной реакции со специфическими праймерами и отличающийся тем, что для дифференциальной диагностики сначала из крови больных лошадей или из крови мышей и кроликов, которым трехкратно вводят трипаносомный антиген с гидроокисью алюминия и которых тотально обескровливают на 25-30 день, получают высокоактивные и высокоспецифичные ДНК-содержащие антигены Т. evansi и Т. equiperdum, которые лиофилизируют, а затем используют при постановке полимеразной цепной реакции с праймерами ACGAAGTGGCTTCTGAAGG и AGCTAATCCCAACCTTGCC, AGGAGGAGCCAGAGTGGA и CCAGAGATTCCGCACCACT к гену RoTat1.2 VSG, гену субъединицы 5 NADH дегидрогеназы (nad5) с последующим электрофоретическим определением размера амплифицируемого фрагмента нуклеотидной последовательности, где по наличию на электрофореграмме фрагмента длиной 410 н.п.диагностируют наличие в образцах ДНК-содержащих антигенов ДНК Т. evansi, а при наличии фрагмента длиной 724 н.п. диагностируют наличие в образцах ДНК-содержащих антигенов ДНК Т. equiperdum соответственно.