СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ШТАММОВ БАКТЕРИЙ ПО ГЕНУ РИБОСОМАЛЬНОЙ РНК Российский патент 2010 года по МПК C12Q1/04 C12Q1/68 C12N15/10 C12N15/11 

Изобретение относится к области медицинской микробиологии, в частности к молекулярно-генетическому типированию штаммов возбудителей инфекционных заболеваний, выявлению эпидемических штаммов и созданию на их основе перспективных вакцинных препаратов.

Среди возбудителей инфекционно-воспалительных заболеваний мочеполовых органов особое место занимают микроорганизмы семейства Mycoplasmataceae [1], удельный вес которых, по данным ВОЗ, возрос с 28,4% до 37,6% [2]. В то же время микоплазмы являются резидентами - постоянно присутствующими представителями естественной микрофлоры урогенитального тракта.

Микоплазмами инфицировано не менее 50,0% здоровых мужчин и женщин в возрасте 30-50 лет; микоплазменная инфекция может быть причиной мужского и женского бесплодия [3,4]. По данным других исследователей выделение микоплазм из канала шейки матки у женщин репродуктивного возраста не превышает 13,3%, при вагинитах увеличиваясь до 23,6% и достигает 37,0% при эктопиях шейки матки [5]. Во время беременности частота обнаружения микоплазм увеличивается в 1,5-2 раза. Частота выявления Ureaplasma urealyticum у женщин репродуктивного возраста достигает 46,0% [6].

Выявлена роль колонизации Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum в развитии преждевременного разрыва плодных оболочек [7], повышенного риска прерывания беременности в сроке до 20 недель [8]. Показана роль М. hominis, М. genitalium и U. urealyticum в развитии хориоамнионита, эндометрита. Mycoplasma hominis может вызывать послеродовую и постабортную лихорадку, при которой микроорганизмы можно выделить из крови. Наличие в цервикальном канале уреаплазм в сочетании с повышенным титром антител к данному микроорганизму могут служить маркером для выявления группы женщин с повышенным риском развития осложнений беременности (преждевременные роды и преждевременное излитие околоплодных вод) [9, 10]. Частота обнаружения U. urealyticum у женщин с привычным невынашиванием и патологией беременности составляет 40-53,0% [11].

Микоплазменные инфекции могут иметь генерализованный характер. Микоплазмы могут адсорбироваться на эпителиальных клетках урогенитального тракта, попадать в кровоток как в составе циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК), так в свободном состоянии в виде отдельных растворимых антигенов при распаде ЦИК.

Проведена сравнительная оценка диагностической ценности 6 методов (микробиологический, ПЦР, выявление антигенов в крови в реакции агрегатгемаглютинации, реакция иммунофлюоресценции, выявление антител в РПГА, ИФА) лабораторной диагностики Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum [12]. Результаты выявления возбудителей в ПЦР и РИФ были приблизительно одинаковыми (13,6 и 13,4% для Mycoplasma hominis и 44,4 и 48.8% для Ureaplasma urealyticum. Культуральным методом микроорганизмы выявляли реже 9,6% Mycoplasma hominis и 32,2% Ureaplasma urealyticum. Наиболее высокие показатели инфицированности получены при определении антигенов в крови (40,0 и 63,0% соответственно). Предложена оптимальная схема обследования пациентов: ПЦР плюс микробиологический метод, поскольку диагностикум для определения антигенов в крови (РАГА, АГ в ИФА) пока не выпускается.

Лечение микоплазменной инфекции представляет значительные трудности в связи с развивающейся устойчивостью к антибиотикам. При этом немаловажное значение имеет региональная чувствительность и резистентность возбудителя к антибактериальным препаратам [13, 14].

Представляется целесообразным перед назначением курса лечения провести тест на чувствительность выделенного штамма микоплазм к антибактериальным препаратам [15]. Хотя существует другое мнение, что определение чувствительности к антибиотикам следует проводить только при неэффективности терапии и рецидивировании процесса.

Наиболее близким решением к заявляемому является способ дифференциации штаммов Bordetella pertussis по ptxSl гену, предусматривающий выделение ДНК из штаммов В. pertussis. Затем выделенную ДНК подвергают полимеразной цепной реакции с одновременным введением праймеров S1-F2 5′-CCCCCTGCC ATGGTGTGATC-3' и S1-R2 5′-AGAGCGTCTTGCGGTCGATC-3' с получением ампликонов фрагмента гена, кодирующего S1 субъединицу коклюшного токсина (ptxS1), которые подвергают последовательно рестрикции эндонуклеазами Ehe 1 и Bfu и электрофорезу продуктов рестрикции в агарозном геле. После этого проводят дифференциацию путем сравнения размера фрагментов ДНК штаммов В. pertussis ptxS1A, ptxS1B, ptxS1D и ptxS1E аллелей гена (RU, патент №2299908, МПК C21Q 1 /68, опубл. 27.05.2007 г.) - прототип.

Данный способ - точный, ускоренный и экономически выгодный. Использование этого способа позволяет выявить эпидемические штаммы с особенностями генетической структуры ptxSl гена и создать на их основе эффективные вакцинные препараты, обладающие высокой протективной активностью в отношении циркулирующих штаммов В. pertussis, вызывающих заболевание коклюшем. Однако данный метод не позволяет проводить дифференциацию штаммов Mycoplasma hominis, обладающих разной степенью вирулентности.

Задачей настоящего изобретения является выявление эпидемических штаммов Mycoplasma hominis с различной степенью вирулентности.

Технический результат данного изобретения состоит в разработке точного, ускоренного, простого и экономически выгодного способа молекулярно-генетического типирования штаммов Mycoplasma hominis.

Технический результат данного изобретения достигается тем, что в способе дифференциации штаммов бактерий по гену рибосомальной РНК, включающем выделение ДНК, амплификацию участка гена методом полимеразной цепной реакции с одновременным введением праймеров с последующим электрофорезом полученных ампликонов в агарозном геле, определяют наличие мутации Т→С в позиции 179 гена 16S рРНК. Амплификацию участка гена проводят с одновременным введением праймеров MYF1 5′ GTTAGCAATAACCTAGCGGCGAATG 3′ и MYR1 5′ ACCCTCATCTTTTAGTGGCGCCTAG 3'.

Сущность изобретения состоит в использовании феномена высокоспецифичного взаимодействия праймеров с матричной ДНК, позволяющей различать штаммы Mycoplasma hominis, имеющие различную структуру гена, кодирующего 16S субъединицу рРНК.

При анализе нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК штаммов Mycoplasma hominis выявлена мутация - замена нуклеотида в положении 179 (тимин на цитозин). Обнаружение этого факта явилось основанием для создания праймеров с целью дифференциации штаммов Mycoplasma hominis, имеющих описанную мутацию, от штаммов без этой мутации.

Использование праймеров MYF1 5′ GTTAGCAATAACCTAGCGGCGAATG 3′ и MYR1 5′ACCCTCATCTTTTAGTGGCGCCTAG 3′ для постановки ПЦР обеспечивает фланкирование участка гена 16S рРНК размером 158 пар оснований (п.о.), содержащего указанную мутацию.

Для штаммов, имеющих мутацию, характерно образование одного фрагмента ДНК размером 158 п.о., в то время как у штаммов, не имеющих мутации, амплификация ДНК не происходит.

Апробация данного способа молекулярно-генетического типирования была проведена на 20 штаммах Mycoplasma hominis, выделенных в 2006-2007 г.г.

Полученные результаты показали, что 13 штаммов Mycoplasma hominis имели в положении 179 гена 16S рРНК тимин, у 7 штаммов Mycoplasma hominis был выявлен в положении 179 гена 16S рРНК цитозин.

Из анализа научно-технической и патентной литературы совокупность признаков, обеспечивающих дифференцирование штаммов Mycoplasma hominis, основанное на использовании феномена высокоспецифичного взаимодействия праймеров с матричной ДНК, не выявлено, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критериям «новизна» и «изобретательский уровень».

Изобретение осуществляется следующим образом.

Материалом для исследования является отделяемое уретры, заднего свода влагалища или цервикального канала.

Для выделения штаммов Mycoplasma hominis из исследуемого материала используют твердую питательную среду Хейфлика ЗАО НИЦФ (Санкт-Петербург). Среда Хейфлика - агаризованная питательная основа из перевара говяжьих сердец с добавлением дрожжевого экстракта, лошадиной сыворотки, насыщенного раствора холестерола, 2,5% раствора ацетата таллия, 20% раствора глюкозы, натриевой соли бензилпенициллина.

Для биохимических исследований используют тест-системы «Mycoplasma DUO» фирмы «Bio RAD». Оценку чувствительности и резистентности микоплазм к антибактериальным препаратам проводят с помощью тест-систем «Mycoplasma 1ST» фирмы «BIO-Merieux».

Пример.

Штаммы Mycoplasma hominis выращивали на среде Хейфлика. Через 72 часа, после появления роста изолированных колоний, отбирали 1 колонию, переносили в пробирку с 300 мкл деионизованной воды, выдерживали 15 мин при 95°С, центрифугировали при 13400 оборотов 1 мин, 10 мкл супернатанта добавляли к 20 мкл реакционной смеси, включающей следующие компоненты: 4 ед. ДНК-полимеразы ("ДиаТак", ЦНИИ эпидемиологии, Москва), 2 mM смесь dNTP, 10 рМ каждого из двух праймеров, реакционный буфер (67 mM Трис-HCl (рН 8,3), 2,5 mM MgCl2).

ПЦР проводили в амплификаторе «Терцик» (НПФ «ДНК-технология», Москва) по следующей схеме: 1 цикл - 95°С - 3 мин.; 35 циклов - 95°С - 10 сек, 68°С - 30 сек; 1 цикл - 72°С - 3 мин.

Наличие и размер ампликонов, полученных в результате ПЦР, определяли с помощью электрофореза в 2% агарозном геле. Гель окрашивали стандартным раствором бромистого этидия, результат реакции учитывали с помощью УФ-трансиллюминатора и фотографировали.

Для штаммов, имеющих мутацию, характерно образование одного фрагмента ДНК размером 158 п.о., в то время как у штаммов, не имеющих мутации, не происходит амплификации ДНК.

Результат данного исследования - дифференциация штаммов Mycoplasma hominis, имеющих различную структуру гена, кодирующего 16S субъединицу рРНК.

Клинико-лабораторное обследование пациенток показало, что штаммы М. hominis, имеющие описанную мутацию, были ассоциированы с тяжелыми клиническими формами воспалительных заболеваний органов малого таза: сальпингоофорит, эндометрит и вторичным бесплодием в 80,0% случаев при отсутствии других этиологических агентов заболеваний, передаваемых половым путем. Штаммы М. hominis, у которых указанная мутация отсутствовала, были выделены от пациенток с воспалительными заболеваниями нижнего отдела урогенитального тракта (вульвовагинит, эндоцервицит), без вовлечения в процесс органов верхних отделов малого таза. Таким образом, описанный метод позволяет дифференцировать мутантные штаммы М. hominis, обладающие высокой вирулентностью.

ЛИТЕРАТУРА

1. Кубанова А.А, Забиров К.И., Васильев М.М., Абудуев Н.К. Некоторые механизмы патогенеза репродуктивных нарушений у мужчин с урогенитальным хламидиозом и микоплазмозом // Вестник последипломного медицинского образования. - 1999. - Спец. вып.: С.53-54.

2. Короткий Н.Г., С.В.Воробьев, В.Н.Царев. Сравнительная клинико-лабораторная оценка эффективности антибиотиков при лечении больных с микоплазменной инфекцией // Вестник дерматологии и венерологии. - 2002. - №4. - С.58-61.

3. Урогенитальный микоплазмоз. Методические рекомендации для субординаторов акушеров-гинекологов. Под редакцией Полканова B.C. / Свердловск, изд-во Свердловского медицинского института. - 1985. - 21 с.

4. Раковская И.В. Микоплазмы человека и микоплазменные инфекции // Клиническая лабораторная диагностика. - 2005. - №3. - С.25-32.

5. Кисина В.И., Прилепская В.Н., Соколовский Е.В. и др. Дискутабельные вопросы клинического значения генитальных микоплазм // Клиническая дерматология и венерология. - 2007. - №1. - С.71-77.

6. Дмитриев Г.А. Лабораторная диагностика бактериальных урогенитальных инфекций. - Нижний Новгород: Изд-во НГМА. - 2003. - С.96-119.

7. Calleri L.F., С.Taccani, A. Porcelli. Ureaplasma urealyticum vaginosis and premature rupture of membranes. What is its role? / Minerva Ginecol - 2000. - 52: P.49-58.

8. Donders G.C., B.Van Bulck, Caudron J. et al. Relationship of bacterial vaginosis and mycoplasmas to the risk of spontaneous abortion. / Am. J. Obstet Gynecol. - 2000. - 183: P.431-437.

9. Horowitz J. et al. Ureaplasma urealyticum cervical colonization as a marker for pregnancy complications. / J.Horowitz Int. J. Gynaecol. Obstet. 1995; 48: P.15-19.

10. Kundsin R.B., Leviton A., Allred E.N., Poulin S.A. Ureaplasma urealyticum infection of the placenta in pregnancies that ended prematurely // Obstet Gynecol. - 1996. - 87:1: P.122-127.

11. Анкирская A.C., Демидова E.M., Земляная A.A. Генитальные микоплазмы как фактор риска развития акушерской и перинатальной патологии // Вестник АМН СССР. - 1991. - №6. - С.17-19.

12. Балабанов Д.Н., Раковская И.В., Горина Л.Г. и др. Сравнительная оценка методов диагностики микоплазменных инфекций урогенитального тракта // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2006. - №4. - С.82-85.

13. Синопальников А.И. И.А.Гучев. Макролиды: современная концепция применения. // Русский медицинский журнал. - 2003. - №11:2. - С.88-92.

14. Юцковская А.Я., Юцковский А.Д., Беседнова Н.Н., Курлеева Т.Ю Чувствительность к антибиотикам Ureaplasma urealythicum, выделенных на территории Приморского края / Антибиотики и химиотерапия. - 2002. - 47:3: С.14-17.

15. Новиков А.И., Охлопков В.А., Новиков Ю.А. и др. Диагностика микоплазменной инфекции с применением теста чувствительности к антимикробным препаратам // Клиническая дерматология и венерология. - 2005. - №3. - С.43-44.

Изобретение относится к области генной инженерии, в частности к молекулярно-генетическому типированию штаммов возбудителей инфекционных заболеваний. Выделяют ДНК бактерии Mycoplasma hominis. Проводят амплификацию участка гена методом полимеразной цепной реакции с одновременным введением праймеров с последующим электрофорезом полученных фрагментов ДНК в агарозном геле. Определяют наличие мутации Т→С в позиции 179 гена, кодирующего 16S субъединицу рРНК путем сравнения продуктов амплификации с контрольным образцом ДНК. Подобранные праймеры обладают высокой специфичностью взаимодействия с матричной ДНК, что позволяет проводить амплификацию участка гена без использования рестрикционного анализа. Способ позволяет быстро и точно дифференцировать штаммы бактерий Mycoplasma hominis, обладающие разной степенью вирулентности.

Способ дифференциации штаммов бактерий по гену рибосомальной РНК, включающий выделение ДНК, амплификацию участка гена методом полимеразной цепной реакции с одновременным введением праймеров с последующим электрофорезом полученных фрагментов ДНК в агарозном геле и дифференциацией на основе наличия мутации Т→С в позиции 179 гена 16S рРНК путем сравнения продуктов амплификации с контрольным образцом ДНК, отличающийся тем, что амплификацию участка гена проводят с одновременным введением праймеров MYF1 5' GTTAGCAATAACCTAGCGGCGAATG 3' и MYR1 5' ACCCTCATCTTTTAGTGGCGCCTAG 3', которые обладают высокой специфичностью взаимодействия с матричной ДНК, без использования рестрикционного анализа, что приводит к образованию одного фрагмента ДНК размером 158 п.о., в то время как у штаммов, не имеющих мутации, амплификация ДНК не происходит.