ШТАММ ТРИПАНОСОМ TRYPANOSOMA EQUIPERDUM, НПО "БИОЦЕНТР ", КАК КУЛЬТУРА ПАРАЗИТИЧЕСКИХ ПРОСТЕЙШИХ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКОГО ТРИПАНОСОМНОГО ДИАГНОСТИКУМА В РСК И РДСК Российский патент 2002 года по МПК C12N1/10 C12N1/10 C12R1/90 

Изобретение относится к области сельского хозяйства, к ветеринарной паразитологии и биотехнологии и может быть использовано при получении диагностических препаратов для диагностики трипаносомозов животных: случной болезни (болезнь однокопытных), су-ауру (болезнь парнокопытных). Штамм предназначен для получения диагностикума (антигена для реакции связывания комплимента (РСК) и реакции длительного связывания комплимента (РДСК)).

Известны штаммы трипанасом, выделенные путем заражения белых мышей кровью больных животных (Тимофеев Б.А., Заблоцкий. Анализ антигенных свойств трипаносом животных // Вестник РАСХН. 1999, 3, с. 59-61.; Zhou Jinlin et al. Zhongguo Shoaal xuebao. Выделение и анализ с помощью электрофореза двух ВПГ (вариантно-поверхностных гликопротеинов), клонированных трипаносом Т. Evansi // Chin J. Vet. Sci. 1999, 19 c.3).

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является штамм трипаносом, выделенный также путем заражения белых мышей кровью больных животных (Rev. elev. et med vet. Pays trop, 1997г., V 50, 1, 29-36).

Общим недостатком всех аналогичных решений, включая прототип, является малая паразитемия, незначительные вирулентные свойства, слабо выраженные антигенные свойства.

Техническим результатом данного изобретения является заявленный штамм трипаносом (Trypanosoma equiperdum), обладающий четко выраженными антигенными свойствами, высокой паразитемией у животных, и может быть использован для приготовления диагностического антигена, а также для получения диагностических сывороток.

Технический результат достигается тем, что предлагается штамм трипаносом Trypanosoma equiperdum, регистрационное наименование НПО "Биоцентр", регистрационный номер ОМ 12001 как культура паразитических простейших для изготовления специфического трипаносомного диагностикума в РСК и РДСК.

Предлагаемый штамм трипаносом веретенообразной формы длиной 11,9-26,1 мкм, шириной 1,8 мкм обладает высокой активностью. К нему восприимчивы белые мыши, белые крысы, морские свинки, собаки, крупный рогатый скот, овцы, лошади.

Для заражения животных достаточно 1 особи трипаносом. Паразитемия составляла до 200 паразитов в 1 поле зрения микроскопа (в раздавленной капле крови, взятой от инвазированных белых мышей). Антиген, приготовленный из этого штамма, реагирует с референсом-препаратом (гамма-глобулин из выворотки гипериммунных лошадей), в разведении 1,50-2 ЕА (единица активности), а с гипериммунной сывороткой дает 0% гемолиза.

Активность антигена, приготовленного из этого штамма, выражается в предельном и рабочем титре, определяемая в РСК с гипериммунной и выворотками спонтанно больных трипанососмозом животных, или референсом-препаратом (гамма-глобулин из гипериммунной сыворотки), что соответственно составляет 1: 200 и 1:50. Штамм трипаносом имеет 8 мажорных полипептидов с м.м. 35, 44, 47, 50, 54, 71, 86, 92 кДа, из которых супермажорные с м.м. 44, 54 и 71 кДа.

Штамм Trvpanosoma equiperdum (НПО "Биоцентр") обладает стабильностью, генетическими маркерами, адаптирован к лабораторным животным, способен вызывать высокую паразитемию в крови. Исходный штамм выделен от лошади, больной случной болезнью. После длительных многолетних пассажей на животных (белые мыши, белые крысы, морские свинки, овцы, собаки) и изучения его морфологических свойств, вирулентности, состава пролипептидов (в иммуноблотинге) и моноспецифических сывороток к этим полипептидам, а также исследования активности антигена из этого штамма в РСК с референс-препаратом, с гипериммунной сывороткой, была получена культура, обозначенная НПО "Биоцентр" (г. Омск).

Штамм трипаносом Trypanosoma equiperdum НПО "Биоцентр" характеризуется следующими свойствами:
- биологическими.

Штамм хорошо адаптирован к домашним и сельскохозяйственным животным: белые мыши, белые крысы, морские свинки, собаки, овцы, крупный рогатый скот и лошади. Паразитемия составляла до 200 паразитов в одном поле зрения микроскопа (в раздавленной капле крови, взятой от инвазированных белых мышей). В мазках культуры, окрашенных краской Гимза по Романовскому, трипаносомы имеют веретенообразную форму, длиной 11,9-26,1 мкм, шириной 1,8 мкм. Трипаносомы очень подвижные, на искусственных питательных средах паразиты не культивируются;
- антигенными.

Антиген из этого штамма трипаносом имеет 8 полимажорных пептидов. Предельный и рабочий титр в РСК с гипериммунной сывороткой спонтанно больных животных соответственно составляет 1: 200 и 1: 50 с референс-препаратом (гамма-глобулин из сыворотки гипериммунных лошадей). Реагирует в разведении 1:50-2 ЕА (единица активности);
- вирулентными.

Белые мыши погибают при парентеральном введении от одной особи трипаносом, паразиты образуют экзотоксин, выявляемый при подкожном введении белым мышам лизата этих простейших;
- генетическими характеристиками.

Штамм трипаносом имеет 8 мажорных полипептидов с м.м. 36, 44, 47, 50, 54, 71, 86, 92 кДа, из которых супермоторные с м.м. 44, 54 и 71 кДа;
- спектром чувствительности.

Штамм трипаносом высокочувствителен к наганину, беренилу, азидину;
- степенью адаптации и размножения.

Паразитемия составляла до 200 паразитов в 1 поле зрения микроскопа (в раздавленной капле крови от инвазировнных белых мышей).

Пример.

Проведено исследование биологических свойств штамма трипаносом (НПО "Биоцентр" г. Омск) по сравнению со штаммами Франции. Для этих целей заражают белых мышей парентеральным путем 0,5-0,7 мл кровью, содержащей трипаносомы. Через 5-7 дней их обескровливают и полученную суспензию крови (на 0,9%-ном физиологическом растворе хлорида натрия) вводят собакам (наиболее удобная модель для получения трипаносомной массы, необходимой при изготовлении диагностикума РСК). При достижении максимальной паразитемии (до 200 паразитов в 1 поле зрения микроскопа), что отмечается на 10-15-й день после заражения, животных обескровливают. К крови для предотвращения свертываемости добавляют лимонно-кислый натрий или гепарин, после чего полученную суспензию центрифугируют 10-15 мин при 3000 об/мин.

Полученная в этом случае суспензия разделяется на 3 слоя: верхний - плазма, нижний - форменные элементы, а средний - белый налет на форменных элементах - трипаносомы.

Верхний слой декантируют, слой трипаносом аккуратно собирают шпателем. Впоследствии их отмывают вначале с помощью 0,9 %-ного физиологического раствора хлорида натрия путем двукратного центрифугирования в течение 10 мин при 3,5 тыс. оборотах, а затем к осадку добавляют дистиллированную воду для деструкции трипаносом и центрифугируют дважды в течение 15 мин при 3,5 тыс. оборотах. В последующем осадок отмывается физиологическим раствором хлорида натрия путем центрифугирования в течении 20 мин при 3,5 тыс. оборотах. Полученный осадок представляет разрушенные трипаносомы. Затем эти простейшие подвергают 3-кратному замораживанию (при -15^oС) и оттаивают, после чего к ним добавляют среду 3 (желатина, сахароза и дистиллированная вода). В итоге эта смесь является цитоплазматическим антигеном, используемым для диагностики трипаносомозов. У последнего с помощью гипериммуной сыворотки или референс-сыворотки (гамма-глобулин из сыворотки гипериммунных лошадей) определяют в РСК предельный и рабочий титр активности. В качестве контроля используют антиген из штамма трипаносом, полученный во Франции. Результаты представлены в таблице.

Как видно из таблицы, из штамма трипаносом НТО "Биоцентр" при описанных условиях обработки получают более активный антиген для диагностики трипаносомозов (предельный титр 1:200, рабочий 1:50), тестируемый в РСК, по сравнению со штаммами Франции. Таким образом, штамм НТО "Биоцентр" может быть использован в производстве средств специфической диагностики.

Изобретение относится к области ветеринарии и биотехнологии. Штамм трипаносом Trypanosoma equiperdum, регистрационное наименование "НПО "Биоцентр", регистрационный номер ОМ 1200 используют для изготовления специфического трипаносомного диагностикума в РСК и РДСК. Штамм Trypanosoma equiperdum (НПО "Биоцентр") обладает стабильностью, четко выраженными биологическими, вирулентными, генетическими свойствами, высокой активностью антигена, хорошо адаптирован к домашним и сельскохозяйственным животным, способен вызывать высокую паразитемию в крови животных. 1 табл.

Штамм трипаносом Trypanosoma equiperdum, регистрационное наименование "НПО "Биоцентр", регистрационный номер ОМ 12001, для изготовления специфического трипаносомного диагностикума в РСК и РДСК.