Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, к средствам молекулярной диагностики, а именно к дифференциации вакцинного штамма «ВГНКИ» возбудителя аденовирусной инфекции от других штаммов и полевых изолятов с помощью анализа максимумов температур плавления ПЦР-продуктов с применением тандемного флуоресцирующего красителя SuperNova v605.
Инфекционный гепатит - остроконтагиозное заболевание, протекающее с явлениями лихорадки, воспалительных процессов слизистых оболочек глаз, носовой полости, желудочно-кишечного тракта, печени и желчного пузыря, сопровождающегося иногда нарушением деятельности центральной нервной системы. Вирус инфекционного гепатита относится к семейству Adenoviridae, роду Mastadenovirus, виду Canine Mastadenovirus А (генотипа CAV-1) [1, 2].
Вирионы CAV-1 представляют собой изометрические частицы кубического типа симметрии с диаметром вириона 70-90 нм. На вершинах икосаэдра имеются отростки (фиберы). Капсид вириона включает 252 капсомера без суперкапсидной оболочки. Капсид содержит 12 структурных белков. Обнаружен белок сердцевины, связанный с вирусной ДНК. Нуклеиновая кислота вириона представлена двуспиральной линейной молекулой ДНК размером около 30 500 п.н., которая кодирует белки orf1-orf30 [3, 4]. В геноме вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 выделяют различные консервативные области, в частности, ген, ответственный за синтез белка orf 16 (позиции в геноме 16757…19474 п.н.).
Штаммы вируса CAV-1, выделенные в разных регионах страны, антигенно-родственны. Вирус содержит преципитирующий, гемагтлютинирующий и комплементсвязывающий антигены и индуцирует образование соответствующих антител. Штаммы CAV-1 успешно репродуцируются в клеточных линиях почки щенков собак, песцов, лисиц [5-8]. Из перевиваемых культур к вирусу гепатита собак высокочувствительна культура клеток почки собаки Мадина-Дарби (MDCK, Madin Darbey canine kidney). При использовании данной клеточной линии цитопатическое действие достигает 95-100% через 48 ч и характеризуется округлением клеток, образованием конгломератов, напоминающих гроздья винограда. В клетках обнаруживаются внутриядерные тельца-включения. Большинство эпизоотических штаммов вируса CAV-1 обладают гемагглютинирующей активностью по отношению эритроцитов морской свинки и человека [8-11].
Система мер борьбы с инфекционным гепатитом собак генотипа CAV-1 и его профилактики предусматривает иммунизацию животных, а также контроль уровня напряженности поствакцинального иммунитета [1, 10].
Для иммунизации щенков применяют различные вакцины против инфекционного гепатита генотипа CAV-1, преимущественно состоящие из антигена CAV-1 производственного штамма «ВГНКИ».
В случае вспышек данного заболевания важно правильно дифференцировать вакцинный штамм «ВГНКИ» и полевые изоляты вируса гепатита собак друг от друга при проведении лабораторной диагностики для подтверждения безопасности производимого вакцинного лекарственного препарата и принятия дальнейших мер по лечению и борьбе с заболеванием, поскольку штаммы существенно отличаются друг от друга генетически и по строению и по функциям вирусных белков. Следует отметить, что данный анализ также необходим на этапе контроля качества вируссодержащего сырья при изготовлении вакцинных препаратов и подтверждении использования требуемого штамма при производстве вакцин против гепатита собак.
Штамм «ВГНКИ» вируса аденовирусной инфекции собак 1-го серотипа депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ», под регистрационным номером: №29 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ.
Штамм «ВГНКИ» вируса аденовирусной инфекции собак 1-го серотипа характеризуется следующими признаками и свойствами.
Морфологические признаки
Штамм «ВГНКИ» вируса аденовирусной инфекции собак 1-го серотипа (CAV-1) относится к семейству Adenoviridae, роду Mastadenovirus, виду Canine mastadenovirus А, 1 серотипу. Данный штамм вызывает инфекционный гепатит у собак. Вирионы имеют кубическую симметрию, округлую или овальную форму. Лишены наружной липопротеидной оболочки и не содержат липидов и гликопротеидов.
Антигенная структура
С помощью хроматографии и гель-электрофореза выделены три различных растворимых антигена, отличающихся по иммунологическим свойствам и связанных с различными морфологическими субъединицами вируса.
1. А-антиген, гексон - групповой, общий для всех серотипов вируса антиген, локализованный в 240 капсомерах капсида, каждый из которых граничит с шестью соседними капсомерами, что определило название антигена (hexon). Антитела против очищенного гексонного антигена нейтрализуют инфекционные свойства только гомологичного серотипа. В то же время эта сыворотка реагирует в реакции связывания комплемента с любыми гетерологичными серотипами, так как в составе гексонного антигена имеются две реактивные группы, одна из которых стимулирует образование группоспецифических, а другая - типоспецифических антител.
2. В-антиген, пентон - токсический антиген, вызывающий округление и скучивание (агрегация) чувствительных клеток однослойной культуры и отделение клеток с поверхности стекла. Локализован в капсомерах, расположенных на вершине двенадцати угловых участков вириона, каждый из которых граничит с пятью соседними капсомерами (pepton). Чувствителен к действию трипсина. Ингибирует активность интерферона и повышает тяжесть ассоциированных респираторных инфекций.
3. С-антиген - нитевой (fiber) антиген, имеет морфологически форму нити с узловым утолщением, прикрепленной к пентонному антигену. Представляет собой типоспецифический антиген, устойчив к действию трипсина, способствует адсорбции аденовирусов на эритроцитах обезьяны или крысы и их агглютинации.
Гено- и хемотаксономические характеристики
Вирионы CAV-1 представляют собой изометрические частицы кубического типа симметрии с диаметром вириона 70-90 нм. На вершинах икосаэдра имеются отростки (фиберы). Капсид содержит 12 структурных белков. Имеется также белок сердцевины, связанный с вирионной ДНК. Нуклеиновая кислота вириона представлена двуспиральной линейной ДНК.
Полный капсид содержит 252 капсомера без суперкапсидной оболочки, каждый из которых составляют 5 - 6 и более мелких субъединиц. Геном представляет собой одну молекулу двухцепочечной ДНК. Вирус имеет 10 структурных белков. Размеры его варьируют от 60 до 120 нм. Структура вириона включает преципитирующий, гемагглютинирующий и комплементсвязывающий антигены. Преципитирующий антиген состоит из двух компонентов. Один связан с инфекционной вирусной частицей, а другой не связан с инфекционностью вируса. Преципитирующий антиген не устойчив к нагреванию: при температуре 56°С разрушается за 30 минут, при 70°С - за 3-5 минут.
Гемагглютинирующий антиген обнаружен у всех выделенных эпизоотических штаммов. Он связан с инфекционным компонентом вируса, его удаление методом адсорбции ведет к снижению инфекционности вируса. Гемагглютинин устойчив к нагреванию: при 56°С разрушается за 30 минут, при 70°С - за 3-5 минут. Формалин, щелочь, фенол, лизол быстро разрушают вирусный гемагглютинин.
Методом нуклеотидного секвенирования методом Сенгера изучена первичная структура штамма «ВГНКИ» аденовируса собак 1-го серотипа и определено положение данного штамма на филогенетическом древе вируса. Вакцинный штамм «ВГНКИ» аденовируса собак относится к генотипу CAV-1, что подтверждают данные нуклеотидного и аминокислотного анализа (фиг. 1).
Биотехнологические характеристики.
Штаммы адаптированы к репродукции в перевиваемой культуре клеток почки собаки MDCK.
Штамм «ВГНКИ» вируса аденовируса собак 1-го серотипа успешно репродуцируется в культуре клеток почки щенков собак, песцов и лисиц, но не размножается в клетках человеческого, обезьяньего и бычьего происхождения.
В культуре клеток цитопатогенное действие CAV-1 характеризуется появлением отдельных округлившихся, рефрактильных клеток, которые постепенно отторгаются от стекла. По мере развития инфекции число клеток, подвергшихся дегенерации, увеличивается и образуются большие пустоты в монослое. По краям сохранившихся островков пораженные клетки концентрируются, образуя большие конгломераты, напоминающие грозди винограда. В культуре клеток через 20 - 30 часов после заражения образуются характерные внутриядерные включения, которые хорошо обнаруживаются при окраске препаратов или методом иммунофлуоресценции. Число их увеличивается и достигает максимума через 36-40 часов, когда развиваются четко выраженные цитопатические изменения.
Учитывая, что в настоящее время производственный штамм «ВГНКИ» вируса гепатита собак 1-ого серотипа применяется для изготовления вакцин, целесообразно провести поиск способа дифференциации вакцинного штамма «ВГНКИ» возбудителя аденовирусной инфекции от полевых изолятов. Для решения поставленной задачи требуется провести молекулярно-биологический анализ генома CAV-1, что даст возможность разработать способ на основе методов молекулярной биологии для контроля качества и определения специфичности используемого вакцинного сырья.
В настоящее время методы молекулярно-биологического анализа находят широкое применение в диагностике различных инфекционных заболеваний. Благодаря созданию последнего поколения флуоресцирующих красителей и технологическим усовершенствованиям платформ количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) исследование пиков температур плавления продуктов реакции стало перспективным методом генотипирования микроорганизмов, который возможно применять для дифференциации вакцинных штаммов вирусов [12-14].
Анализ максимальных значений температур плавления для различных изолятов/штаммов вирусов и других микроорганизмов представляет собой исследование кривой плавления ПЦР-продуктов в широком диапазоне температур с узким шагом. Сочетание улучшенного инструментария количественной детекции ампликонов и флуоресцирующих красителей последнего поколения позволила выявлять генетические вариации в последовательностях нуклеиновых кислот путем контролируемого плавления двухцепочечных ДНК [15-18].
Сущность представленного метода заключается в том, что после проведения ПЦР с применением флуоресцирующего красителя смесь постепенно нагревают, и при достижении определенной температуры ампликоны начинают разъединяться, флуорофор постепенно высвобождается, и флуоресценция, которая детектируется оптической системой термоциклера, снижается. Чувствительность анализа достигает одного нуклеотида, благодаря чему с помощью данного метода можно достичь высокой общей точности разработанного способа [15].
Прототипным вариантом проведения дифференциации вакцинного штамма «ВГНКИ» возбудителя аденовирусной инфекции от полевых изолятов является реакция амплификации со специфическими праймерами, гель-электрофорез и секвенирование по Сенгеру [19]. При этом указанный метод является крайне дорогостоящим, трудоемким и продолжительным во времени проводимого исследования. Следовательно, необходимо разработать альтернативный способ дифференциации вакцинного штамма «ВГНКИ» возбудителя аденовирусной инфекции от других штаммов и полевых изолятов с помощью анализа максимумов температур плавления ПЦР-продуктов с применением тандемного флуоресцирующего красителя SuperNova v605.
Задачей настоящего изобретения является разработка чувствительного и специфичного, быстрого способа дифференциации вакцинного штамма «ВГНКИ» возбудителя аденовирусной инфекции от других штаммов и полевых изолятов с помощью анализа максимумов температур плавления ПЦР-продуктов с применением тандемного флуоресцирующего красителя SuperNova v605 с целью устранения вышеуказанных недостатков.
Данная задача решена благодаря разработке способа дифференциации вакцинного штамма «ВГНКИ» возбудителя аденовирусной инфекции от других штаммов и полевых изолятов с помощью анализа максимумов температур плавления ПЦР-продуктов с применением тандемного флуоресцирующего красителя SuperNova v605.
Сущность разработанного способа заключается в следующем: 1) создание дизайна оригинальных высокоспецифичных олигонуклеотидных прямого и обратного праймеров для синтеза фрагмента ДНК с мутациями, уникальными для вакцинного штамма «ВГНКИ» генотипа CAV-1; 2) проведение ПЦР с применением тандемного флуоресцирующего красителя SuperNova v605; 3) полученные ПЦР-продукты постепенно нагревают в широком диапазоне температур и при достижении пика температуры плавления двуцепочечная молекула ДНК распадается на отдельные цепи, что вызывает яркий флуоресцентный сигнал, специфичный для красителя. Для каждого варианта нуклеотидного состава характерна своя температура плавления. Анализируя кривые плавления ПЦР-продуктов, возможно проводить дифференциацию вакцинного штамма «ВГНКИ» возбудителя аденовирусной инфекции от других штаммов и полевых изолятов.
Разработанный способ дает возможность: 1) сократить время проведения анализа до 2 ч; 2) применять тандемный флуоресцирующий краситель последнего поколения SuperNova v605, который не ингибирует реакцию и характеризующийся яркой флуоресценцией после встраивания в ампликоны, что позволяет достичь высокую точность и чувствительность проводимого анализа; 3) увеличить чувствительность и специфичность анализа за счет использования высокоспецифичных оригинальных олигонуклеотидных праймеров, рассчитанных для целевого участка ДНК гена orf16 вируса инфекционного гепатита собак 1-го серотипа (таргетный участок orf16-гена в диапазоне 17628…17719 п.н., размер ПЦР-продукта составляет 92 п.н.). Данная разработка позволит расширить арсенал средств для проведения контроля качества сырья при производстве вакцин против инфекционного гепатита собак 1-го серотипа из производственного штамма «ВГНКИ».
Технический результат изобретения заключается в расширении арсенала технических средств для проведения дифференциации вакцинного штамма «ВГНКИ» возбудителя аденовирусной инфекции от других штаммов и полевых изолятов возбудителя аденовирусной инфекции и разработке чувствительного, специфичного и объективного способа на основе анализа максимумов температур плавления ПЦР-продуктов с применением оригинальных праймеров CAV-F17628 и CAV-R17698 и тандемного флуоресцирующего красителя последнего поколения SuperNova v605 .
Сущность изобретения отражена на графических изображениях:
Фиг. 1 - Дендрограмма, отражающая филогенетическое взаимоотношения штаммов вируса «ВГНКИ» аденовирусной инфекции 1-го серотипа собак с эпизоотическими и вакцинными штаммами вируса аденовирусной инфекции 1-го серотипа (инфекционного гепатита). Дендрограмма основана на сравнительном анализе нуклеотидных последовательностях orf16-гена аденовируса собак.
Фиг. 2 - Дизайн оригинальных высокоспецифичных олигонуклеотидных праймеров для дифференциации вакцинного штамма «ВГНКИ» возбудителя аденовирусной инфекции от других штаммов и полевых изолятов с помощью анализа максимумов температур плавления ПЦР-продуктов с применением тандемного флуоресцирующего красителя SuperNova v605. Примечание: revers-complement - перевернутая комплементарная форма обратного праймера.
Фиг. 3 - Карта нуклеотидных замен для участка orf16-гена вакцинного штамма «ВГНКИ» по сравнению с другими штаммами/изолятами. Примечание: анализировали диапазон 17628…17719 п.н.; для исследования использовали следующие вакцинные штаммы/полевые изоляты аденовируса: «ВГНКИ», «CAV-1 CCC-V6», «CAV-1 15620», «CAV-1 300-2012-RS», «CAV-1 UEL/PR-SAH1», «CAV-1 313-2010-L», «CAV-2 Toronto A 26/61», «CAV-2 CC0710 QB», «CAV-2 YCA-18», «CAV-2 NTU 2/05», «CAV-2 CAV 2/001».
Фиг. 4 - Диаграмма максимумов температур плавления ПЦР-продуктов при анализе вакцинных штаммов/полевых изолятов вируса гепатита собак. Примечание: для исследования использовали следующие вакцинные штаммы аденовируса: «ВГНКИ», «CAV-1 CCC-V6», «CAV-1 15620», «CAV-1 300-2012-RS», «CAV-1 UEL/PR-SAH1», «CAV-1 313-2010-L», «CAV-2 Toronto A 26/61», «CAV-2 CC0710 QB», «CAV-2 YCA-18», «CAV-2 NTU 2/05», «CAV-2 CAV 2/001».
Сущность изобретения пояснена в перечне последовательностей, в котором:
SEQ ID NO:1 представляет последовательность нуклеотидов ДНК orf16-гена вакцинного штамма «ВГНКИ» вируса гепатита собак 1-ого серотипа;
SEQ ID NO:2 представляет последовательность аминокислот, кодируемых ДНК orf16-гена вакцинного штамма «ВГНКИ» вируса гепатита собак 1-ого серотипа.
SEQ ID NO:3 представляет последовательность нуклеотидов праймера CAV-F17628
SEQ ID NO:4 представляет последовательность праймера CAV-R17698
Заявляемый способ основан на проведении следующих этапов анализа: 1) экстрагирование ДНК CAV-1 из образца; 2) проведение ПЦР специфического фрагмента ДНК orf16-гена вируса гепатита собак 1-го серотипа размером 92 п.н. с применением разработанных оригинальных олигонуклеотидных высокоспецифичных праймеров CAV-F17628 с дизайном 5'-GGTTTAATGTATTACAATAGTAATGG-3' и CAV-R17698 с дизайном 5'- TGTGTTTCTGTCTTGCAAGTC-3' (фиг. 2, таблицы 1 и 2) и тандемного флуоресцирующего красителя SuperNova v605; 3) детекция результатов анализа с определением максимумов температуры плавления и проведение инструментального дифференциального анализа геномов вакцинного штамма «ВГНКИ» от других производственных штаммов/полевых изолятов вируса гепатита собак.
По результатам анализа опубликованных данных в научной литературе, в настоящее время используется только прототипный способ дифференциации штаммов и изолятов CAV с помощью секвенирования по Сенгеру [19], однако, как указано выше, он очень дорогостоящий, трудоемкий и продолжительный по времени проводимого исследования. При анализе публикаций способ дифференциации вакцинного штамма «ВГНКИ» возбудителя аденовирусной инфекции от других штаммов и полевых изолятов с помощью анализа максимумов температур плавления ПЦР-продуктов с применением тандемного флуоресцирующего красителя SuperNova v605 не представлен. Таким образом, сведений об аналогах предлагаемого способа авторами не обнаружено.
Разработанный способ дифференциации вакцинного штамма «ВГНКИ» возбудителя аденовирусной инфекции от других штаммов и полевых изолятов с помощью анализа максимумов температур плавления ПЦР-продуктов с применением тандемного флуоресцирующего красителя SuperNova v605 по сравнению с прототипом отличается экономической выгодой, легкостью и экспрессностью выполнения анализа, что позволяет быстро проводить анализ. Тандемный флуоресцирующий краситель SuperNova v605 более чувствителен своих аналогов, в частности, чем бромистый этидий, SYBR Green I и SYBR Green II, для обнаружения различных типов нуклеиновых кислот. Максимум возбуждения для красителя SuperNova v605 отмечается при длине волны 414 нм, а максимум излучения - при 605 нм [20].
В отличие от прототипа разработанный способ позволяет провести анализ выравнивания множественных нуклеотидных последовательностей целевого участка ДНК orf16-гена вакцинных штаммов/полевых изолятов вируса инфекционного гепатита собак. Разработанный способ предусматривает проведение ПЦР специфического фрагмента orf16-гена ДНК вируса инфекционного гепатита собак в диапазоне 17628…17719 п.н. с применением разработанных оригинальных олигонуклеотидных высокоспецифичных праймеров CAV-F17628 и CAV-R17698 для амплификации фрагмента размером 92 п.н.. Разработанный способ предусматривает проведение плавления ампликонов в разработанном режиме с учетов пиков температур плавления двуцепочечных ДНК и применение тандемного флуоресцирующего красителя SuperNova v605, а также детекцию результатов анализа с определением максимальных значений температур плавления для решения задачи по дифференциации вакцинного штамма «ВГНКИ» возбудителя аденовирусной инфекции от других штаммов и полевых изолятов. Таким образом, разработан способ дифференциации вакцинного штамма «ВГНКИ» возбудителя аденовирусной инфекции от других штаммов и полевых изолятов с помощью анализа максимумов температур плавления ПЦР-продуктов с применением тандемного флуоресцирующего красителя SuperNova v605.
Обоснованием выбранного участка orf16-гена вируса инфекционного гепатита собак является наличие уникальных нуклеотидных мутаций, характерных для вакцинного штамма «ВГНКИ» генотипа CAV-1 в сравнении со штаммами и изолятами CAV-1 и CAV-2, а именно в позиции 17653 п.н. замена C на G, 17657 п.н. - G на С, 17664 п.н. - T на А, 17673-17674 п.н. - АА на СС, 17694 п.н. - T на С, а в сравнении с CAV-2 в позиции 17684 п.н. - А на С (фиг. 3).
Ключевым элементом заявляемого способа является применение разработанных высокоспецифичных олигонуклеотидных праймеров CAV-F17628 и CAV-R17698 и анализа максимумов температур плавления ампликонов с применением тандемного флуоресцирующего красителя SuperNova v605 для дифференциации вакцинного штамма «ВГНКИ» возбудителя аденовирусной инфекции от других штаммов и полевых изолятов.
Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что новизна и изобретательский уровень заявляемого изобретения заключаются в применении разработанных высокоспецифичных олигонуклеотидных праймеров CAV-F17628 и CAV-R17698, рассчитанных для амплификации целевого участка ДНК orf16-гена вируса гепатита собак размером 92 п.н. и анализа максимальных значений температур плавления ПЦР-продуктов с применением тандемного флуоресцирующего красителя SuperNova v605.
Сущность предлагаемого изобретения пояснена на графическом материале - Диаграмма максимумов температур плавления ПЦР-продуктов при анализе вакцинных штаммов/полевых изолятов вируса гепатита собак. Примечание: для исследования использовали следующие вакцинные штаммы возбудителя аденовирусной инфекции: «ВГНКИ», «CAV-1 CCC-V6», «CAV-1 15620», «CAV-1 300-2012-RS», «CAV-1 UEL/PR-SAH1», «CAV-1 313-2010-L», «CAV-2 Toronto A 26/61», «CAV-2 CC0710 QB», «CAV-2 YCA-18», «CAV-2 NTU 2/05», «CAV-2 CAV 2/001» (фиг. 4).
На основном этапе исследования проводят выделение ДНК из образцов с использованием набора «РИБО-сорб» в соответствии с инструкцией производителя («Интерлабсервис», РФ).
На следующем этапе проводят ПЦР с применением высокоспецифичных оригинальных разработанных олигонуклеотидных праймеров и тандемного флуоресцирующего красителя SuperNova v605 для исследования стандартного образца и проб. Стандартным образцом является культуральная суспензия CAV-1 вакцинного штамма «ВГНКИ», которая изначально исследована с помощью секвенирования по Сенгеру для подтверждения наличия именно требуемого штамма в стандарте (n = 5). В качестве отрицательного контроля используют деионизированную воду без нуклеаз MilliQ.
Для постановки ПЦР готовят реакционную смесь, которая включает в свой состав следующие компоненты:
- PCR buffer 10х - 3 мкл,
- хлорид магния 25 мМ - 3 мкл,
- олигонуклеотидыне праймеры - по 5 мкл,
- краситель SuperNova v605 - 2 мкл,
- Taq ДНК-полимераза - 1 е.а. (0,1 мкл),
- элюат ДНК - 6 мкл,
- деионизированная вода - 5,9 мкл.
Итоговый объем смеси для проведения одной реакции составляет 30 мкл.
Постановку ПЦР осуществляют в детектирующем термоциклере CFX-96 (Bio-Rad, США), или аналоге при температурных и временных параметрах, сведения о которых представлены в таблице 3.
Предварительную денатурацию проводят при температуре 95°С в течение 3 минут. ПЦР в режиме реального времени включает в себя 3 подэтапа: денатурацию, отжиг олигонуклеотидов, элонгацию. Денатурацию осуществляют при температуре 97°С в течение 5 секунд, отжиг олигонуклеотидов и элонгацию - при температуре 58°С в течение 35 секунд. Далее проводят плавление при температуре, начиная с 65 до 90°С. Увеличение температуры составляет - 0,1°С за каждый шаг. При этом после первого шага плавления требуется ждать 90 секунд при температуре первого шага. Для каждого последующего шага время ожидания составляет 2 секунды.
Для детекции сигнала устанавливают канал HRM, для которого длина волны источника составляет 460 нм, детектора - 610 нм. В качестве красителя применяется SuperNova v605.
Исследование кривой плавления двуцепочечных фрагментов ДНК представленных выше вакцинных штаммов/полевых изолятов вируса гепатита собак для анализа данных и профилей плавления образцов выполняют с использованием программного обеспечения для сканирования с помощью детектирующего амплификатора. Проводят построение кривых плавления в виде параболы и детектируют пики температур плавления для полученных графиков. Выявляют, какие максимумы температур плавления характерны для указанных выше штаммов/изолятов вируса гепатита собак, что позволяет проводить дифференциацию вакцинного штамма «ВГНКИ» возбудителя аденовирусной инфекции от других штаммов и полевых изолятов с помощью анализа максимумов температур плавления ПЦР-продуктов с применением тандемного флуоресцирующего красителя SuperNova v605.
Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его исследования, которые не ограничивают объем изобретения.
Пример 1. Разработка способа дифференциации вакцинного штамма «ВГНКИ» возбудителя аденовирусной инфекции от других штаммов и полевых изолятов с помощью анализа максимумов температур плавления ПЦР-продуктов с применением тандемного флуоресцирующего красителя SuperNova v605.
Для определения показателей, позволяющих проводить дифференциацию вакцинного штамма «ВГНКИ» возбудителя аденовирусной инфекции от других штаммов и полевых изолятов с помощью анализа максимумов температур плавления ПЦР-продуктов с применением тандемного флуоресцирующего красителя SuperNova v605, осуществляли этапы работы, представленные ниже.
На первом этапе исследования проводили выделение нуклеиновой кислоты из вируссодержащего образца, как указано выше.
На следующем этапе проводили ПЦР для исследования проб в соответствии с описанием, представленным выше. Для постановки реакции готовили реакционную смесь и проводили анализ, как отражено выше.
Исследование кривой плавления для анализа данных пиков температуры плавления ампликонов участка orf16-гена ДНК вакцинных штаммов/полевых изолятов вируса инфекционного гепатита собак и профилей плавления образцов выполняли с использованием программного обеспечения CFX-96, или аналога. Проводили построение кривых плавления в виде параболы и детектировали максимумы температур плавления для полученных графиков. Тестировали ДНК CAV-1 и CAV-2 указанных вакцинных штаммов и полевых изолятов в 32 повторностях для каждого образца для получения результатов с высокой степенью достоверности (табл. 4).
Выявили, что для вакцинного штамма «ВГНКИ» данная температура составила 77,54±0,04°С (n=32, p<0,001), «CAV-1 CCC-V6» - 73,72±0,02°С (n=32, p<0,001), «CAV-1 15620» - 73,96±0,04°С (n=32, p<0,001), «CAV-1 300-2012-RS» - 73,98±0,05°С (n=32, p<0,001), «CAV-1 UEL/PR-SAH1» - 73,61±0,05°С (n=32, p<0,001), «CAV-1 313-2010-L» - 73,54±0,05°С (n=32, p<0,001), «CAV-2 Toronto A 26/61» - 74,02±0,05°С (n=32, p<0,001), «CAV-2 CC0710 QB» - 74,00±0,02°С (n=32, p<0,001), «CAV-2 YCA-18» - 74,03±0,05°С (n=32, p<0,001), «CAV-2 NTU 2/05» - 74,00±0,05°С (n=32, p<0,001), «CAV-2 CAV 2/001» - 73,96±0,05°С (n=32, p<0,001) (фиг. 4, таблица 4).
Следовательно, для каждого из исследуемых штаммов/изолятов возбудителя аденовирусной инфекции собак характерен индивидуальный пик температуры плавления. При этом значительно отличается именно вакцинный штамм «ВГНКИ» генотипа CAV-1. Таким образом, разработан способ дифференциации вакцинного штамма «ВГНКИ» возбудителя аденовирусной инфекции от других штаммов и полевых изолятов с помощью анализа максимумов температур плавления ПЦР-продуктов с применением тандемного флуоресцирующего красителя SuperNova v605.
Пример 2. Исследование аналитической специфичности разработанного способа (предлагаемое изобретение)
Специфичность анализа дифференциации вакцинного штамма «ВГНКИ» возбудителя аденовирусной инфекции от других штаммов и полевых изолятов с помощью анализа максимумов температур плавления ПЦР-продуктов с применением тандемного флуоресцирующего красителя SuperNova v605 оценивали при исследовании суспензий штамма «РВ-97» вируса бешенства, штамма «Грей» возбудителя парвовирусного энтерита, штамма «Рич» возбудителя коронавирусного энтерита собак, штамма «Мира» калицивируса кошек, вируса ящура серотипа А. Количество инфекционных доз вирусов в суспензиях составлял не менее 6,0 lg ТЦД50/см3 или 6,0 lg ККИД50/см3. Исследования проводили в 5 повторностях.
В качестве положительного контроля использовали суспензию вакцинного штамма «ВГНКИ» возбудителя инфекционного гепатита собак 1-го серотипа. Отрицательным контролем служила деионизированная вода. Для проведения исследования использовали детектирующий амплификатор марки CFX-96 (Bio-Rad, США). В результате исследования амплификация с неспецифичными нуклеиновыми кислотами других инфекционных агентов графики не были сформированы, что подтверждало высокую специфичность компонентов реакционной смеси данного способа для вируса гепатита собак (табл. 5).
В результате исследования обнаружили, что для проб, не содержащих нуклеиновую кислоту вируса инфекционного гепатита собак, и для проб отрицательного контроля не формировались графики плавления и не были обнаружены пиковые значения при анализе высокого разрешения. При исследовании положительного контроля получены следующие значения температур плавления: 77,54±0,13°С (n = 3, p<0,005). Результаты анализа контролей подтверждают стандартные данные, отраженные в примере 1.
Таким образом, полученные данные свидетельствовали о 100%-ной специфичности разработанного способа дифференциации вакцинного штамма «ВГНКИ» возбудителя аденовирусной инфекции от других штаммов и полевых изолятов с помощью анализа максимумов температур плавления ПЦР-продуктов с применением тандемного флуоресцирующего красителя SuperNova v605.
Пример 3. Определение диагностических показателей разработанного способа (предлагаемое изобретение)
Для определения диагностической чувствительности разработанного способа анализировали 365 заведомо положительных проб суспензий вируса инфекционного гепатита собак штамма «ВГНКИ» с титрами инфекционной активности не ниже 6,0 lg ТЦД50/см3.
Проведение ПЦР с последующим плавлением ампликонов осуществляли, как отражено выше. С помощью разработанного способа (предлагаемое изобретение) определили, что из 365 исследуемых проб CAV-1 все определены в качестве положительных и подтверждено наличие именно того штамма, который содержался в анализируемых суспензиях.
Для исследования специфичности метода тестировали 455 суспензии вируса инфекционного гепатита собак различных штаммов и изолятов, за исключением вакцинного штамма «ВГНКИ». В результате исследования с помощью разработанного способа (предлагаемое изобретение) определили, что все 455 пробы содержали геном возбудителя аденовирусной инфекции собак CAV-1 и CAV-2, но не штамма «ВГНКИ». Пользуясь представленными выше статистическими методами анализа определили, что в 95%-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность (DSe) составила 98,99-100,00%, диагностическая специфичность (DSp) - 99,19-100,0%, k-критерий - 1,000; общая точность (DAc) - 99,55-100,00% (табл. 6).
Основными преимуществами предлагаемого изобретения является возможность проводить за короткий промежуток времени (не более 2 ч) дифференциацию вакцинного штамма «ВГНКИ» возбудителя аденовирусной инфекции от других штаммов и полевых изолятов с помощью анализа максимумов температур плавления ПЦР-продуктов с применением тандемного флуоресцирующего красителя SuperNova v605. Разработанный способ впервые применили для решения данной задачи. Выявили, что в целевом участке orf16-гена ДНК вируса инфекционного гепатита собак имеется множество нуклеотидных мутаций, уникальных для вакцинного штамма «ВГНКИ», что позволило разработать высокоспецифичные оригинальные олигонуклеотидные праймеры CAV-F17628 и CAV-R17698, рассчитанные для амплификации целевого участка ДНК orf16-гена вируса инфекционного гепатита собак размером 92 п.н. и анализа максимальных значений температур плавления ПЦР-продуктов с применением тандемного флуоресцирующего красителя SuperNova v605. Впервые представлено генотипирование указанных вакцинных штаммов вируса инфекционного гепатита собак 1- и 2-го серотипов с помощью разработанного способа.
Разработанный способ характеризуется 100%-ной аналитической специфичностью. В 95%-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность для данного способа составляет 98,99-100,00%, диагностическая специфичность - 99,19-100,0%, точность - 99,55-100,00%.
Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Способ дифференциации вакцинного штамма «ВГНКИ» возбудителя аденовирусной инфекции от других штаммов и полевых изолятов с помощью анализа максимумов температур плавления ПЦР-продуктов с применением тандемного флуоресцирующего красителя SuperNova v605»:
1. Buonavoglia C, Martella V. Canine respiratory viruses. Vet Res 2007; 38: 355-373.
2. Erles K, Shiu KB, Brownlie J. Isolation and sequence analysis of canine respiratory coronavirus. Virus Res 2007; 124: 78-87.
3. Schoehn G, El Bakkouri M, Fabry CM et al Three-dimensional structure of canine adenovirus serotype 2 capsid. J Virol 2008; 82: 3192-203.
4. Carlton WW, McGavin MD. Thomson's Special Veterinary Pathology. St. Louis: Mosby , 1995; 125-195.
5. Damián M, Morales E, Salas G, Trigo FJ. Immunohistochemical detection of antigens of distemper, adenovirus and parainfluenza viruses in domestic dogs with pneumonia. J Comp Pathol 2005; 133: 289-293.
6. Benetka V, Weissenböck H, Kudielka I, Pallan C, Rothmüller G, Möstl K. Canine adenovirus type 2 infection in four puppies with neurological signs. Vet Rec 2006; 158: 91-94.
7. Yoon SS, Park JW, Jean YH, Kim HJ, Han B, Han HR. Prevalence of lymphocyte nuclear pockets in Holstein-Friesian dairy cattle infected with bovine leukemia virus in Korea. Asian-Aust J Anim Sci 2005; 18: 879-883.
8. Hu RL, Huang G, Qiu W, Zhong ZH, Xia XZ, Yin Z. Detection and differentiation of CAV-1 and CAV-2 by polymerase chain reaction. Vet Res Commun 2001; 25: 77-84.
9. Ditchfield J, Macpherson LW, Zbitnew A. Association of Canine Adenovirus (Toronto A 26/61) with an Outbreak of Laryngotracheitis (“Kennel Cough”): A Preliminary Report. Can Vet J 1962; 3: 238-47.
10. Yoon KB, Kang MI, Park NY, Han DU. Seroepidemiological survey on canine distemper, canine parvovirus, canine coronavirus, canine adenovirus type-2, canine parainfluenzavirus of dogs by indirect immunofluorescent test. Korean J Vet Res 1995; 35: 75-85.
11. Chvala S, Benetka V, Möstl K, Zeugswetter F, Spergser J, Weissenböck H. Simultaneous canine distemper virus, canine adenovirus type 2, and Mycoplasma cynos infection in a dog with pneumonia. Vet Pathol 2007; 44: 508-12.
12. Erali M, Voelkerding KV, Wittwer CT. High resolution melting applications for clinical laboratory medicine. Exp Mol Pathol. 2008 Aug;85(1):50-8.
13. Lung O, Fisher M, Beeston A, Hughes KB, Clavijo A, Goolia M, Pasick J, Mauro W, Deregt D. Multiplex RT-PCR detection and microarray typing of vesicular disease viruses. J Virol Methods. 2011 Aug;175(2):236-45.
14. Zhou L, Wang L, Palais R, Pryor R, Wittwer CT. High-resolution DNA melting analysis for simultaneous mutation scanning and genotyping in solution. Clin Chem. 2005 Oct;51(10):1770-7.
15. Shi X, Liu X, Wang Q, Das A, Ma G, Xu L, Sun Q, Peddireddi L, Jia W, Liu Y, Anderson G, Bai J, Shi J. A multiplex real-time PCR panel assay for simultaneous detection and differentiation of 12 common swine viruses. J Virol Methods. 2016 Oct;236:258-265.
16. Ambagala A, Fisher M, Goolia M, Nfon C, Furukawa-Stoffer T, Ortega Polo R, Lung O. Field-Deployable Reverse Transcription-Insulated Isothermal PCR (RT-iiPCR) Assay for Rapid and Sensitive Detection of Foot-and-Mouth Disease Virus. Transbound Emerg Dis. 2017 Oct;64(5):1610-1623.
17. Reid SM, Pierce KE, Mistry R, Bharya S, Dukes JP, Volpe C, Wangh LJ, King DP. Pan-serotypic detection of foot-and-mouth disease virus by RT linear-after-the-exponential PCR. Mol Cell Probes. 2010 Oct;24(5):250-5.
18. Liu YL, Ding YZ, Dai JF, Ma B, He JJ, Ma WM, Lv JL, Ma XY, Ou YW, Wang J, Liu YS, Chang HY, Wang YL, Zhang Q, Liu XT, Zhang YG, Zhang J. Development of a New RT-PCR with Multiple Primers for Detecting Southern African Territories Foot-and-mouth Disease Viruses. J Vet Res. 2018 Dec 31;62(4):431-437.
19. Estrada-Rivadeneyra D. Sanger sequencing. FEBS J. 2017 Dec;284(24):4174.
20. Флуоресцентные полимерные красители SuperNova. URL: https://www.beckman.co.il/ru/reagents/coulter-flow-cytometry/supernova-fluorescent-polymer-dyes. (Дата обращения: 15.07.2023).
Дизайн оригинальных специфических олигонуклеотидных праймеров для дифференциации вакцинного штамма «ВГНКИ» возбудителя аденовирусной инфекции от других штаммов и полевых изолятов с помощью разработанного способа (предлагаемое изобретение)
Физические, термодинамические параметры и температура плавления олигонуклеотидных праймеров для дифференциации вакцинного штамма «ВГНКИ» возбудителя аденовирусной инфекции от других штаммов и полевых изолятов с помощью разработанного способа (предлагаемое изобретение)
- с коррекцией концентрации солей
Примечание: термодинамические параметры разработанных олигонуклеотидных праймеров рассчитаны при условии: концентрация NaCl 1 М,
температура 25°С,
водородный показатель (рН) 7,0.
Временные и температурные режимы обратной транскрипции и ПЦР в режиме реального времени дифференциации вакцинного штамма «ВГНКИ» возбудителя аденовирусной инфекции от других штаммов и полевых изолятов с помощью разработанного способа (предлагаемое изобретение)
Примечание: градиент температур составлен на этапе плавления с шагом 0,1°С,
* - детекция сигнала.
Средние показания температур плавления, при которых достигались пиковые значения для исследуемых ампликонов штаммов и изолятов вируса аденовирусной инфекции собак (предлагаемое изобретение)
(n = 32, p<0,001)
Примечание: анализ проводили на приборе CFX-96 (Bio-Rad, США), отражены средние значения пиков температур и среднеквадратичное отклонение.
Пределы диагностических возможностей способа дифференциации вакцинного штамма «ВГНКИ» возбудителя аденовирусной инфекции от других штаммов и полевых изолятов с помощью анализа максимумов температур плавления ПЦР-продуктов с применением тандемного флуоресцирующего красителя SuperNova v605 (предлагаемое изобретение)
Примечание: DSe - диагностическая чувствительность,
DSp - диагностическая специфичность,
k-критерий - индекс Каппа Коэна,
DAc - общая точность.
--->
<?xml version="1.0" encoding="ISO-8859-1"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing SYSTEM "ST26SequenceListing_V1_3.dtd"
PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing 1.3//EN">
<ST26SequenceListing productionDate="2024-06-03"
softwareVersion="2.1.2" softwareName="WIPO Sequence" fileName="CAV-1
VGNKI diff 2024-06-03.xml" dtdVersion="V1_3">
<ApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>
<FilingDate>2023-08-23</FilingDate>
</ApplicationIdentification>
<ApplicantFileReference>535</ApplicantFileReference>
<EarliestPriorityApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>
<FilingDate>2023-08-23</FilingDate>
</EarliestPriorityApplicationIdentification>
<ApplicantName languageCode="ru">ФГБУ "Федеральный центр охраны
здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ")</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin> Federal State-Financed Institution Federal
Centre for Animal Health (FGBI ARRIAH)</ApplicantNameLatin>
<InventorName languageCode="ru">Доронин Максим
Игоревич</InventorName>
<InventorNameLatin>Doronin Maksim Igorevich </InventorNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">Способ дифференциации вакцинного
штамма «ВГНКИ» возбудителя аденовирусной инфекции от других штаммов и
полевых изолятов с помощью анализа максимумов температур плавления
ПЦР-продуктов с применением тандемного флуоресцирующего красителя
SuperNova v605</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>4</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>423</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..423</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q1">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>CAV-1</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cctccactaaccttctctaacctaggcgcgatcaagctttccacgggtgccg
gactcatcctcaaagagggaaaattagaagccaacataggaccgggtcttaccacaaatcaagaaggaca
aataactgttgaaaaagacagtgacggcctaacattcacttcccccctacacaagattgaaaacaccgta
tctctaagcataggcgaagggttagaagatgaaagtggcacactcaaagtgaatttccctagtcccccac
cccctctactattttcccctccacttgcagaggcggggggtactgtttcactacccttgcaggagtccat
gcaagtaactgaaggaaagctcggcgtaaagcctaccacctactctccgccccttcaaaaaactgaccag
caagtaagcctgcgcgtagga</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>141</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..141</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>CAV-1</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>PPLTFSNLGAIKLSTGAGLILKEGKLEANIGPGLTTNQEGQITVEKDSDGLT
FTSPLHKIENTVSLSIGEGLEDESGTLKVNFPSPPPPLLFSPPLAEAGGTVSLPLQESMQVTEGKLGVKP
TTYSPPLQKTDQQVSLRVG</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="3">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>26</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..26</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q3">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Canine Mastadenovirus </INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ggtttaatgtattacaatagtaatgg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="4">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q4">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Canine Mastadenovirus </INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tgtgtttctgtcttgcaagtc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<---
Изобретение относится к области вирусологии. Описан способ дифференциации вакцинного штамма «ВГНКИ» возбудителя аденовирусной инфекции от других штаммов и полевых изолятов с помощью анализа максимумов температур плавления ПЦР-продуктов с применением тандемного флуоресцирующего красителя SuperNova v605, предполагающий применение подобранных олигонуклеотидных праймеров. Технический результат изобретения заключается в расширении арсенала технических средств для проведения дифференциации вакцинного штамма «ВГНКИ» возбудителя аденовирусной инфекции от других штаммов и полевых изолятов возбудителя аденовирусной инфекции. 1 з.п. ф-лы, 4 ил., 6 табл., 3 пр.
1. Способ дифференциации вакцинного штамма «ВГНКИ» возбудителя аденовирусной инфекции от других штаммов и полевых изолятов с помощью анализа максимумов температур плавления ПЦР-продуктов с применением тандемного флуоресцирующего красителя SuperNova v605, предполагающий применение высокоспецифичных оригинальных олигонуклеотидных праймеров
CAV-F17628 с дизайном 5'-GGTTTAATGTATTACAATAGTAATGG-3' и CAV-R17698 с дизайном 5'-TGTGTTTCTGTCTTGCAAGTC-3', рассчитанных для целевого участка ДНК гена orf16 вируса инфекционного гепатита собак 1-го серотипа в диапазоне 17628…17719 п.н. и тандемного флуоресцирующего красителя SuperNova v605; с анализом максимумов температур плавления ПЦР-продуктов, при проведении которого определено, что для вакцинного штамма «ВГНКИ» генотипа CAV-1 он составляет 77,54±0,04°С при n=32 и p<0,005.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что аналитическая специфичность составляет 100%, диагностическая чувствительность в 95%-ном доверительном интервале – 98,99-100,00%, диагностическая специфичность – 99,19-100,0%.
| СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ТОКСИГЕННЫХ ШТАММОВ V. CHOLERAE O1, ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИХ БИОВАРА И ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ШТАММОВ БИОВАРА ЭЛЬТОР НА ТИПИЧНЫЕ И ИЗМЕНЕННЫЕ МЕТОДОМ МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ И ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ | 2011 |
|
RU2458141C1 |
| Способ дифференциации генома вакцинного штамма НИСХИ от полевых изолятов вируса оспы овец методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с анализом пиков высокого разрешения | 2022 |
|
RU2786213C1 |
| Krawczyk, B., Leibner-Ciszak, J., Mielech, A | |||
| et al | |||
| PCR melting profile (PCR MP) - a new tool for differentiation of Candida albicansstrains | |||
| BMC Infectious Diseases | |||
| Колосоуборка | 1923 |
|
SU2009A1 |
| Разборный с внутренней печью кипятильник | 1922 |
|
SU9A1 |
| Печь для непрерывного получения сернистого натрия | 1921 |
|
SU1A1 |
