КОМПОЗИЦИЯ СПЕРМИЦИДНОГО ДЕЙСТВИЯ ДЛЯ ВАГИНАЛЬНОГО ПРИМЕНЕНИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ТРИТЕРПЕНОИДНЫЕ САПОНИНЫ ИЗ STYRAX OFFICINALIS L. Российский патент 2019 года по МПК A61K36/185 A61P15/00 

Изобретение относится к фармацевтической композиции в виде вагинальных лекарственных форм с растительным экстрактом стиракса лекарственного (Styrax officinalis L.), обладающих спермицидным действием и применению состава на основе нового растительного соединения.

В последнее время рынок вагинальных контрацептивов, содержащих сильнодействующие спермициды с использованием химических активных веществ, расширился. Ноноксинол (Патентекс Овал Н, Ноноксинол, Тудэй), борная кислота (Контрацептин Т) и бензалкония хлорид (Фарматекс) - это спермициды, которые в настоящее время широко используется на рынке.

Спермицидные средства, содержащие активный компонент, нейтрализуют подвижные сперматозоиды, разрушая их наружную оболочку и способность проникать через оболочку яйцеклетки при оплодотворении.

Известно лечебно-профилактическое средство (пат. РФ 2329790), обладающее антибактериальным и спермицидным действием, выполнено в виде таблетки для интравагинального введения и содержит хлоргексидин или его соль и основу, которая в качестве главной составляющей содержит лактозу и другие фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества. Средство дополнительно может содержать регенерирующее вещество, в частности декспантенол или метилурацил, или масло облепиховое.

Известна фармакологическая композиция пролонгированного действия (пат. РФ 2201219), включающая, по крайней мере, одно активное вещество в эффективном количестве, усиливающий проникновение агент и стабилизирующий агент при заданном соотношении компонентов, отличающаяся тем, что она содержит в качестве активного вещества хлоргенсидин, а в качестве усиливающего проникновения агента - димексид, при следующем соотношении компонентов, мас. %: хлоргексидин - 0,02-0,05, димексид - 7,0-27,0 истабилизирующий агент - остальное. Композиция содержит в качестве стабилизирующего агента пленкообразующую смесь водных растворов поливинилового спирта и крахмала пищевого с глицерином.

Несмотря на известность этих препаратов, появились данные, указывающие на то, что частое использование поверхностно-активных спермицидов, может вызывать раздражение слизистой влагалища за счет ожогов и поражать эпителий, вызывать аллергические реакции/дискомфорт. Одним из самых частых осложнений является деэпителизация шейки матки и стенок влагалища, увеличивается риск развития ВИЧ-инфекции [М L Rekart. J Acquir Immune Defic Syndr.; 5: 425, 1992, RE Roddy, et al. Int J STD HIV.; 4: 165, 1993, SS Weir, et al. Genitourin Med.; 71: 78, 1995].

Часто встречающиеся во многих растениях сапонины, являющиеся природными поверхностно-активными веществами, обладают спермицидным действием. Сапонины представляют собой высокомолекулярные соединения, являющиеся гликозидами, у которых сахарная составляющая присоединена к тритерпеновому или стероидному агликону. В частности, тритерпеновые сапонины являются объектами более высокого интереса благодаря их биологическим свойствам.

Были исследованы фармакологические и биологические свойства тритерпеновых сапонинов, вырабатываемых различными видами растений, включая спермицидную и контрацептивную активности.

Известны следующие лекарственные растения, включающие сапонины и обладающие спермицидное действие:

Acacia auriculiformis (А. Cunn. ex Benth.) - смесь двух частично изолированных тритерпеноидных сапонинов, полученных из порошка семян Acacia auriculiformis (Acaciaside А и В) [Girijashankar V. Micropropagation of multipurpose medicinal tree Acacia auriculiformis // Journal of Medicinal Plants Research. - 2011. - Vol. 5 (3). - pp. 462-466].

Molluga pentaphylla (Linn.) - тритерпеноидный сапонин Моллугогенол-А -[Soni P. K. et al. Antifertility activites of traditional medicinal plants in male with emphasis on their mode of action: a review // Journal of Global Biosciences. - 2015. - Vol. 4. - pp. 1165-1179.].

Другие растения, содержащие сапонины, обладающие спермицидной активностью: Phytolacca dodecadra (L' Herit), Calendula officinalis (L.), Acacia caesia (L.), Acacia concinna (Willd.), Trigonella foenum-graecum (L.), Chenopodium album (L.) and Cestrum parqui (L' Herit) [Shah H.C., Singh K.K. Spermicidal agents // Drug Discov Ther. - 2008. - vol. 2. - №4. - pp. 200-210.].

Растение Sapindus mukorosii (Gaertn.), синонимы: reetha, рехта: препарат - CONSAP (Индия), представляет собой мукоросиевые сапонины E1, G, X, Y1, Y2, Z1 и Z2 [Suhagia В. etal. Sapindus mukorossi: an overview // International Journal of Pharmaceutical Sciences and Research. - 2011. - Vol. 2(8). - pp. 1905-1913].

Известна лекарственная композиция, включающая тритерпеноидные сапонины, выделены из Phytolacca dodecandra (endod berries) и Calendula officinalis (marigold plants) (US 3886272).

Известна композиция, включающая тритерпеноидный сапонин Acaciaside-B (Ас-В) для использования в качестве вагинального контрацептива (US 8729034). Эта композиция не является мутагенной и не вредит лактобактерии. Ас-В является превосходным ингредиентом для составов химического барьера, где требуется спермицидное свойство. Данное изобретение также относится к использованию семян Acacia auriculiformis в качестве исходных материалов для выделения тритерпеноидный сапонин Ас-В для обеспечения активного принципа получения внебиржевого (ОТС), профилактического, вагинального препарата / противозачаточного средства с анти - ВИЧ. Ас-В может использоваться отдельно или в смеси с другими природными или синтетическими веществами для подготовки составов для защиты от инфекции вируса человека (ВИЧ-1) и/или контроль нежелательной беременности. Согласно изобретению Ас-В является водорастворимым и может быть растворен или диспергирован в ряде носителей. Например, он может быть составлен в виде форм, которые включают, но не ограничиваясь ими, гели, пены, суппозитории, кремы, лосьоны, таблетки, пессарии, смазывающие вещества, пленки, спреи и тому подобное.

Тем не менее, до сих пор остается необходимость разработки альтернативных препаратов для дальнейшего использования в качестве спермицидов, оказывающих минимальные побочные эффекты, разработки эффективных спермицидов на растительном сырье, производство которых менее затратное, не требующее дорогостоящего оборудования, специальных условий и высококвалифицированного персонала.

Известен стиракс лекарственный (Styrax officinalis L.) [Styrax officinalis L. eFlore, la de TelaBotanica. - 2016. BDTFX v. 3.02]. Стиракс лекарственный широко распространен в таких восточных странах Средиземноморья как Италия, Греция, Турция, Сирия и Палестина. Многие виды стиракса служат источником ароматной бензойной смолы, применяемой в медицине и косметологии. Данная смола выделяется из ствола и применяется для лечения инфекций кожи, входит в состав лекарственных средств от кашля [Dalal Ibrahim et al., Medical Uses Of Forest Types In Al Ghab. Syria, 2011.]. В ходе изучения околоплодников стиракса были выделены тритерпеновые сапонины. Опубликованы исследования о выделении и идентификации сапонинов-стиракса (А, В, С) из околоплодников стиракса лекарственного. Их структура была изучена с помощью ЯМР и масс-спектрометрии.

- Сапонин стиракса А является аморфным порошком с молекулярной формулой C₆₁H₉₆O₂₇- Структура сапонина А была назначена как (22-O-acetyl- 21-О-tiglyl3-О-[α-L-rhamnopyranosyl (1→2)-β-D-glactopyranosyl (1→2)]-[β-D-glucopyranosyl(1→4)]-β-D-glucuronopyranosylbarringtogenol С).

- Сапонин стиракса В был выделен в виде аморфного порошка. Сапонин В имеет 22 массовые единицы больше, чем сапонин А. Молекулярная формула Сапонина В - С₆₃Н₉₄О₂₇. Структура сапонина В была преставлена как (22-O-acetyl-21-O-benzoyl-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl(1→2)-β-D-galactopyranosyl (1→2)]-[β-D-glucopyranosyl (1→4)]-β-D-glucuronopyranosylbarringtogenol С).

- Сапонин стиракса С имеет молекулярную формулу С₆₂Н₉₈О₂₇ и структуру (22-O-acetyl-21-O-(2-hexenoyl)-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl (1→2)-β-Dgalactopyranosyl (1→2)]-[β-D-glucopyranosyl(1→4)]-β-D-glucuronopyranosyl barringtogenol С) [YurdanurYayla, OzgenAlankus- et al. Saponins from Styrax officinalis. Fitoterapia 73 (2002) 320-326].

Из патентной литературы также известно использование в качестве эфирных масел масло стиракса в ароматерапевтической композиции для ванн (пат. РФ №2251408), в составе композиции для местного лечения геморроя (пат. РФ №2517466).

Задачей предлагаемого технического решения является создание нового эффективного средства на основе растительного сырья, расширение ассортимента препаратов, обладающих спермицидной активностью, пролонгированным действием d месте его применения.

Техническим результатом является создание эффективного средства удобного в применении, не оказывающего побочного действия. Техническим результатом также является получение экологически чистой, биологически активной, стабильной при хранении композиции.

Технический результат достигается при использовании композиции спермицидного действия для вагинального применения, включающей в качестве активного соединения тритерпеноидные сапонины. В качестве тритерпеноидных сапонинов используют сухой экстракт околоплодников стиракса лекарственного (styrax officinalis L.) с содержанием суммы активных соединений (А, В, С) не менее 27,64%, и количества сухого экстракта стиракса в композиции 0,0025-0,025 г на одно применение. Композиция спермицидного действия дополнительно содержит в качестве структурообразователя редкосшитый акриловый полимер или поливиниловый спирт (ПВС), в качестве пластификатора глицерин, пропиленгликоль, в качестве дисперсионной среды очищенную воду.

Изобретение иллюстрируют следующими примерами.

ПРИМЕР 1: Способ выделения и очистки сапонинов из околоплодников стиракса лекарственного

Сухой экстракт околоплодников стиракса лекарственного получают по известной технологии, применяемой при экстракции растительного сырья. Способ получения сухого экстракта осуществляют методом циркуляционной экстракции. Измельченное сырье 60,0 г помещают в патрон из фильтровальной бумаги, и экстрагируют метанолом (400 мл) в течение 10 ч. Затем экстракт упаривают на роторном испарителе при температуре 40±5°С до получения густого экстракта. После этого густой экстракт очищают этилацетатом и н-бутанолом. Густой экстракт обрабатывают этил ацетатом (1:10 вес/объем) в течение 6 часов при перемешивают, полученную смесь фильтруют. Этилацетат удаляют с помощью роторного испарителя (температура 40°С, 240 mbar). Остаток обрабатывают 10% н-бутанолом в пропорции (1:30 вес/объем) в течение 3 часов при перемешивании. Затем после удаления слоя н-бутанола проводят переосаждение сапонинов при подкислении раствором HCl до рН=1,0. Осадок сапонинов отделяли фильтрацией с последующей сушкой.

Для количественного определения сапонинов в полученном сухом экстракте была использована методика ¹Н ЯМР для количественного определения сапонинов в сухом экстракте. Исследование проводились на приборах масс-спектрометр (JEOL, Япония) «Jeol JNM-ECA 600» и «Jeol JNM-ECS 400». В результате получено содержание сапонина В=5,8±0,21%, суммы сапонинов А и С=22,5±0,45%. Содержание сапонинов А, В, С в образцах сухого экстракта стиракса лекарственного составило от 27,64 до 28,96%. Содержание суммы сапонинов в сухом экстракте стиракса лекарственного составило не менее 27,64%.

ПРИМЕР 2. Способ получения фармацевтической композиции

Способ получения композиции основан на известных методиках получения гелей, мазей, пленок путем смешения компонентов композиции в количествах, необходимых для достижения максимальной спермицидной активности и совместимых структурообразующих носителей с активным компонентом. В качестве структурообразующих веществ использовали различные растворимые в воде полимеры такие, как редкосшитый акриловый полимер (Карбополы: Carbopol ETD 2020, Carbopol ETD 2001, Carbopol 940, Carbopol 941, Ареспол, мАРС-06, FLOGEL 700 и др.), также поливиниловый спирт (ПВС), полиэтиленоксиды (ПЭО), гидроксипропилцеллюлоза (ГПЦ), метилцеллюлоза (МЦ) и Na-КМЦ -или их смеси-которые обладают различными технологическими характеристиками. Пластификаторы (например, глицерин, полиэтиленгликоль пропиленгликоль, маннитол, сорбитол, дибутилфталат, трибутилцитрата, диметилфталат, пирролидоны, а также их смеси), Разрыхлители (например, кроскармеллозу натрия, PVP), увеличивают скорость растворения, когда это требуется. В качестве дисперсионной среды структурообразующих веществ использовали очищенную воду.

Сухой измельченный экстракт стиракса, содержащий сумму сапонинов, растворяли в смеси воды с структурообразователем, масса набухала при комнатной температуре в течение 40 минут при постоянном помешивании, Затем в смесь вводили последовательно пластификатор, при необходимости нейтрализующий агент, разрыхлитель. Готовую композицию помещают в оболочку либо в виде капсулы, либо в мягкие тубы для впрыскивания во влагалище в заявляемых количествах и концентрации для одного применения.

Традиционные формы спермицидных композиций легко приготавливают в соответствии с известными способами. Такие спермицидные композиции могут иметь форму гелей, пен, желе, кремов, мазей, смазок, и так далее. Для приготовления композиций применяют традиционные носители. Спермицидные композиции могут вводиться по отдельности или в сочетании с одним или несколькими барьерными способами контрацепции, такими как диафрагма, губка или презерватив. Композиция может наноситься непосредственно на диафрагму, пленку, губку или презерватив непосредственно перед применением или может быть предварительно упакована с пленкой, губкой или презервативом.

ПРИМЕР 3. Методика качественного определения сапонинов. Показатель «Подлинность»

Для подтверждения наличия сапонинов в сумме экстрагируемых веществ околоплодников стиракса лекарственного проводились реакции идентификации.

1. Качественная реакция, основанная на физических свойствах сапонинов - реакция пенообразования: по 0,5 мл водного раствора экстракта стиракса лекарственного поместили в две пробирки (мерные, с одинаковым диаметром). В одну из пробирок налили 5 мл раствора кислоты хлористоводородной 0,1Н, в другую - 5 мл раствора натрия гидроксида 0,1Н. Обе пробирки интенсивно встряхивали в течение 1 мин. Провели измерение высоты столбика пены в обеих пробирках.

2. Качественная реакция, основанная на биологических свойствах сапонинов - реакция гемолиза. Методика: 0,2 г сухого экстракта стиракса лекарственного растворили в 5 мл изотонического раствора натрия хлорида, добавили полученный раствор к 1 мл взвеси дефибринированной крови. В контрольную пробирку к 1 мл взвеси дефибринированной крови добавили 5 мл изотонического раствора натрия хлорида.

Раствор для гемолиза готовится следующим образом: полученная от добровольца кровь обрабатывается раствором антикоагулянта - натрия стеарата 3,2% (Vacuette, greiner bio-one), подвергается центрифугированию, после чего сливается надосадочная жидкость - плазма. Далее добавляют физиологический раствор, и пробирку аккуратно переворачивают несколько раз таким образом, чтобы не допустить механического разрушения. Затем полученную смесь центрифугируют и производят замену физиологического раствора на чистый, так как предыдущий содержит белки, лейкоциты и другие компоненты крови. Процедуру воспроизводят до момента, пока надосадочная жидкость не станет прозрачной и чистой.

3. Качественные реакции, основанные на химических свойствах сапонинов - Реакция Либермана-Бурхарда. Методика: в пробирку помещают сухой экстракт стиракса лекарственного концентрированную серную кислоту и концентрированную уксусную кислоту, при наличии сапонинов, на границе раздела фаз образуется коричневое кольцо. Другие качественные реакции, основанные на химических свойствах сапонинов (Цветные реакции) мы проводили с реактивами: раствором кислоты серной H₂SO₄ концентрированной, раствором ванилина и кислоты серной H₂SO₄ концентрированной при нагревании (реакция Санье), хлороформом с кислотой серной H₂SO₄ концентрированной (реакция Сальковского).

В таблице 1. представлены результаты исследования качественного определения сапонинов в очищенном сухом экстракте стиракса лекарственного.

ПРИМЕР 4. Обоснование выбора концентрации активной фармацевтической субстанции - сухой экстракт околоплодников стиракса лекарственного

Были проведены исследования специфической активности лекарственных форм в опытах in vitro. Изучено спермицидное действие суммы сапонинов сухого экстракта околоплодников стиракса лекарственного.

В результате проведенных доклинических исследованиях (активность in vitro) была определена концентрация сухого экстракта в составе фармацевтической композиции со спермицидным действием.

Материалы исследования: эякуляты, полученные у 12 мужчин с нормозооспермией в возрасте около 30 лет. Концентрацию спермиев, число подвижных спермиев, число активно подвижных спермиев, время переживания спермиев, рН оценивали согласно лабораторному руководству ВОЗ для обследования и обработки спермы человека, пятое издание (WHO laboratory manual, 2010 г.) до и после эквилибрации спермы с водными растворами сапонинов.

Образцы семени сжижали при 37°С в течение 30 минут, затем сперму анализировали с помощью цитоморфологического метода в камере Makler для подсчета сперматозоидов (Jiangsu Joymed Tech Co., Шанхай, Китай) на световом микроскопе при ×200. В основании камеры есть отверстие с прозрачным стеклянным диском внутри, на 10 микрон ниже поверхности пластины. Когда верхняя часть устройства покрыта покровным стеклом, камера с постоянной глубиной 10 микрон готова. Камера Makler имеет глубину 0,01 мм. Площадь сетки в центре покровного стекла составляет 1 мм × 1 мм и делится на 100 меньших квадратов, каждый из которых составляет 0,1 мм × 0,1 мм.

5 мкл спермы загружали в камеру и покрывали покровным стеклом. Избыток жидкости спермы стекал вниз в зазор между донным стеклянным диском и верхней стеклянной пластиной. Чтобы обеспечить постоянный подсчет, в каждой камере по дочитывалось не менее 200 сперматозоидов.

Количество сперматозоидов определяется путем подсчета клеток в 10 или более квадратах в разных областях сетки, а затем вычисляют среднее значение, после чего, это значение умножают на 100000, чтобы получить концентрацию в миллион на мл единицы (м/мл). Принятые для исследования образцы соответствовали значениям нормального эякулята в последнем ВОЗ рекомендации (1-10-2011) (см. таблицу 2.)

После исследования нативных образцов спермиев, добавляли растворы сухого экстракта стиракса в различных количествах в физиологическом растворе хлорида натрия 0,9%. Сперма и исследуемые растворы сапонинов использовались в равных объемах. Оценивали результаты действия растворов сапонинов стиракса моментально после их добавления к спермам, затем через 30 и 60 с, далее через 10, 15 и 30 мин после инкубации. В контроле использовали физиологический раствор хлорида натрия 0,9%. Влияние растворов суммы сапонинов в сухом экстракте из стиракса лекарственного различных количествах на жизнеспособность спермиев представлены в таблице 3. Из таблицы видно, что минимальное и максимальное количества экстракта сухого стиракса лекарственного, при котором наблюдается отсутствие подвижных спермиев составляют 0,0025 г - 0,025 г. Данные количества и концентрация активного компонента являются достаточными для снижения подвижности сперматозоидов до уровня, не способного вызвать беременность.

На основании результатов исследования активности in vitro, был установлен и выбран действующий интервал сухого экстракта, содержащего суммы сапонинов для одного вагинального контрацептивного применения, этот интервал составляет от 0,0025 до 0,025 г сухого экстракта на одно применение.

Изобретение относится к фармацевтической композиции спермицидного действия для вагинального применения. Композиция спермицидного действия для вагинального применения, включающая в качестве активного соединения тритерпеноидные сапонины, при этом в качестве тритерпеноидных сапонинов используют сухой экстракт околоплодников стиракса лекарственного (Styrax officinalis L.) с содержанием суммы тритерпеновых сапонинов А, В и С не менее 27,64 мас.%, при этом количество сухого экстракта стиракса в композиции 0,0025-0,025 г на одно применение. Вышеописанная композиция обладает эффективным спермицидным действием для вагинального применения, без побочного действия, стабильная при хранении. 1 з.п. ф-лы, 3 табл., 4 пр.

1. Композиция спермицидного действия для вагинального применения, включающая в качестве активного соединения тритерпеноидные сапонины, отличающаяся тем, что в качестве тритерпеноидных сапонинов используют сухой экстракт околоплодников стиракса лекарственного (Styrax officinalis L.) с содержанием суммы тритерпеновых сапонинов А, В и С не менее 27,64 мас.%, при этом количество сухого экстракта стиракса в композиции 0,0025-0,025 г на одно применение.

2. Композиция спермицидного действия по п. 1, дополнительно содержащая в качестве структурообразователя редкосшитый акриловый полимер или поливиниловый спирт (ПВС), в качестве пластификатора - глицерин, пропиленгликоль, в качестве дисперсионной среды - очищенную воду.