Способ исследования эндотелия сосудов при плацентарной недостаточности Российский патент 2019 года по МПК G01N33/52 

Изобретение относится к акушерству, а именно к диагностике плацентарной недостаточности.

Известен способ определения маркера дисфункции эндотелия при артериальной гипертензии у пациенток в перименопаузе [автор Калоева А.Э. «Функциональные особенности течения артериальной гипертензии у женщин в перименопаузе, 2014 г], заключающийся в определении концентрации оксида азота и его стабильных метаболитов в сыворотке крови. Проводился спектрофотометрический метод определения нитрит-иона, в присутствии реактива Грисса, с которым взаимодействовали нитриты. Реактив Грисса это смесь 1% раствора сульфаниламида и 0,05% водного раствора N-нафтилэтилендиамина в уксусной кислоте. Перед этим к 1 мл плазмы добавляли 96° этиловый спирт, для достижения ее депротеинизации, далее центрифугировали 20 минут. Под действием азотистой кислоты первично ароматические амины образуют окрашенные диазосоединения. Розовая окраска образовавшегося нитрита определяется спектрофотометрическим методом. В результате определяем нитрит-ионы. Для того чтобы перевести нитраты в нитриты необходимо к нитрат-ионам добавить хлорид ванадия (III) - летучий порошок. В итоге определяем суммарный NO, количество нитритов определяли при добавлении реактива Грисса, количество нитратов, получали путем вычитания количество нитритов из концентрации суммарных метаболитов NO. Недостатком данного метода является то, что он применялся только у пациенток с артериальной гипертензией.

Также известен способ изучения содержания маркеров дисфункции эндотелия (ЭТ- 1, оксида азота, Е- селектин) в периферической крови женщин с ранними репродуктивными потерями, (автор Айени Д.О. «Современные аспекты потерь ранней беременности», 2012 г. ),

заключающийся в том, что основными признаками дисфункции эндотелия сосудов является снижение уровней оксида азота и Е-селектина и увеличение ЭТ-1. Предикторами микротромбозов в формирующемся межворсинчатом пространстве при ранних репродуктивных потерях является изменение уровне маркеров дисфункции эндотелия (оксида азота, Е-селектина, ЭТ-1) в сочетании с гетерогенностью циркулирующей популяции тромбоцитов (повышение содержания активированных клеток, увеличение их размерных параметров), что усугубляет становление адекватного маточно-плацентарного кровотока. Определены наиболее значимые корреляционные связи между морфофункциональными изменениями эндотелия спиральных артерий, маркерами его функционального состояния и нарушениями тромбоцитарного звена гемостаза. Недостатком этого метода можно считать то, что он характеризует состояние эндотелия сосудов плацентарного кровотока только в первом триместре беременности.

Наиболее близким техническим решением является (автор Мозговая Е.В. «Диагностика и медикаментозная коррекция эндотелиальной дисфункции при гестозе», 2004 г. ) определение количества циркулирующих эндотелиоцитов методом подсчета клеток в камере Горяева при фазово-контрастной микроскопии. Предварительно 1 мл плазмы смешивался с 0,2 мл натриевой соли аденозиндифосфата (АДФ) в концентрации 1 мг/мл в течение 10 минут, после чего производилось центрифугирование, полученный осадок суспензировался в 0,1 мл 0,9% раствора NaC 1 и помещался в камеру Горяева. При условии, что одна сетка камеры Горяева помещает 0,1 мл содержимого, подсчет количества эндотелиальных клеток производился из расчета • 104/ л. Результаты исследования маркеров эндотелиальюй дисфункции Количество циркулирующих в крови эндотелиоцитов. У беременных с преэклампсией выявлено достоверное повышение в крови количества свободных эндотелиальных клеток, при этом отмечено увеличение их количества при возрастании тяжести преэклампсии (г=0,71). У беременных с преэклампсией, не имеющих сочетанной патологии, количество

эндотелиоцитов было достоверно выше, чем при физиологической беременности (11,9±1,3-104/л), но несколько ниже, чем во всей группе беременных с преэклампсией в целом (соответственно 18,2±1,1 и 37,3±2,3-104/л). При преэклампсии на фоне заболеваний почек отмечен более высокий уровень десквамированных эндотелиальных клеток и при легкой преэклампсии, и при тяжелом ((нефропатия И-Ш), соответственно 22,5±1,8 и 40,1±2,0-104/л. При преэклампсии на фоне АГ этот маркер был достоверно выше, чем при чистой преэклампсии (соответственно 26,9±1,9; р<0,01 и 45,1±2,2-104/л; р<0,05). Недостатком предложенного метода являлось отсутствие данных маркеров эндотелия фетоплацентарного комплекса.

Цель изобретения - ранняя диагностика плацентарной недостаточности у беременных при помощи изучения показателей эндотелия.

Поставленная цель достигается тем, что определение концентрации оксида азота и его стабильных метаболитов в сыворотке крови при помощи спектрофотометрического метода определения нитрит-иона в присутствии реактива Грисса, который представляет собой смесь 1% раствора сульфаниламида и 0,05% водного раствора N-нафтилэтилендиамина в уксусной кислоте. Предварительно, к 1 мл плазмы добавляли 96° этиловый спирт, для достижения ее депротеинизации, затем центрифугировали в течение 20 минут. Под действием азотистой кислоты при помощи спектрофотометрического методапервично ароматические амины образуют окрашенные диазосоединения розовой окраски, в результате чего определяются нитрит-ионы. Для того чтобы перевести нитраты в нитриты необходимо к нитрат-ионам добавить хлорид ванадия (III). Таким образом, определяем суммарный NO, количество нитритов выявляли при добавлении реактива Грисса. Количество нитратов получали путем вычитания количество нитритов из концентрации суммарных метаболитов NO.

Нами было проведено комплексное обследование 50 беременных основной группы с выявленной фетоплацентарной недостаточностью во II и Ш триместре. Из них 1 подгруппу составили 25 беременных с выявленными нарушениями ФПК I степени, во 2 подгруппу вошли 25 беременных с нарушениями кровотока II степени. Контрольная группа состояла из 50 беременных, с физиологически протекающей беременностью и без нарушений в фетоплацентарной системе.

Всем пациентам проводились общеклинические, акушерско-гинекологические, микробиологические, микроскопические, иммунологические и инструментальные методы исследования (УЗИ плода, допплерометрия ФПК, кардиотокография плода). Определение количества циркулирующих эндотелиоцитов производилось методом подсчета клеток в камере Горяева при фазово-контрастной микроскопии. Предварительно 1 мл плазмы смешивался с 0,2 мл натриевой соли аденозиндифосфата (АДФ-№) в концентрации 1 мг/мл в течение 10 минут, после чего производилось центрифугирование, полученный осадок суспензировался в 0,1 мл 0,9% раствора №С1 и помещался в камеру Горяева. При условии, что одна сетка камеры Горяева помещает 0,1 мл содержимого, подсчет количества эндотелиальных клеток производился из расчета • 104/ л. Клинико-лабораторное обследование беременных, включающее клинические и биохимические анализы крови, общий анализ мочи, суточную потерю белка и функциональные почечные пробы, проводилось по общепринятым методикам. Агрегационная активность тромбоцитов определялась методом фотометрирования плазмы крови по Вогп-у.

Ультразвуковые (УЗ) исследования фето-плацентарного комплекса у пациенток исследуемых групп проводили при помощи аппаратов «Aloka - SD 500» (Япония) и «Sim - 500 Uplus» (Италия».

Определение кровотока в сосудах плода и маточной артерии проводилось при помощи ультразвукового диагностического прибора «ALOKA 2000»; основным параметром исследования являлось систоло-диастолическоеотношение (СДО) сосудов, представляющее собой отношение величин максимальной, систолической и конечной диастолической скоростей кровотока.

Кардиотокография плода осуществлялась на кардиомониторе «Partecust» фирмы «Siemens» ФРГ. Определение биофизического профиля плода включало в себя: двигательную активность плода, дыхательные движения, мышечный тонус, объем околоплодных вод, степень зрелости плаценты. Гистологическое исследование плацент проводили на микротоме (MR 2055, Leica, Германия) путем окрашивания срезов гематоксилином и эозином использовали набор реактивов SigmaDiagnosticsTrichromeStains (Masson).

Статистическая обработка результатов исследования производилась на персональном компьютере с применением стандартных пакетов программ прикладного статистического анализа (GraphPadInstat, StatisticaforWindows v.4.0, Exel 2000 и др.). Проверку гипотез о равенстве двух средних проводили с помощью t-критерия Стьюдента.

Результаты исследования.

В результате проведенной кардиотокографии было выявлено, что в основной группе беременных сердцебиение плода составило 139,4±2,0 уд./мин. (Р>0,05), частота шевелений плода за 30 мин. была 7,6±0,3 (Р<0,05), величина сердечных осцилляций равнялась 9,2±07 уд. мин. (Р<0,05), миокардиальный рефлекс составил 19,8±1,1 уд./мин. (Р<0,05). В тоже время в группе сравнения средняя частота сердцебиения плода составила 137,7±1,3 уд/мин. (Р>0,05), частота шевелений плода за 30 мин. была 7,7±0,3 (Р<0,05), величина сердечных осцилляций равнялась 9,3±06 уд./мин. (Р<0,05), миокардиальный рефлекс составил 20,8±0,8 уд./мин. (Р<0,05). Биофизический профиль плодов у беременных с фетоплацентарной недостаточностью был оценен в 7 и >баллов) в 89% случаев (Р<0,05). В группе сравнения данный показатель отмечался в 78% случаев. Анализ эхографической оценки плаценты выявил, что у беременных основной группы с высокой частотой выявлялся кальциноз плаценты различной степени выраженности (52,1%), преждевременное созревание плаценты (69,3%). Следует отметить, что у пациенток данной группы толщина плацент составляла 42,3±2,2 мм В группе сравнения показатель толщины плаценты составил 32,6±0,4 мм.

При допплерометрическом исследовании проводилось изучение характера гемодинамики с определением индексов сосудистого сопротивления, позволяющего судить о функционировании всего фетоплацентарного комплекса (табл. 1).

Примечание: р- достоверность показателей основной группы и группы сравнения с нормативными показателями

Результаты проведенного исследования выявили, что у беременных основной группы в большинстве случаев (74%), отмечались наличие двухфазных кривых с положительной диастолической скоростью кровотока (средние значения СДО-2,83±0,2; ИР-0,71±0,12; ПИ-1,5±0,63). При сопоставлении с показателями пациенток с I степенью нарушениями фетоплацентарного кровотока (r=0,54; р0,001); со II-ой степенью нарушения ФПК (r=0,71; р0,001) корреляционный анализ определил положительнную связь между NO и степенью нарушения кровотока при допплерометрическом исследовании. Известно, что прогрессирующее снижение продукции оксида азота и его метаболитов приводит к эндотелийзависимойконстрикции и, как следствие, способствует нарушению кровотока в системе мать- плацента-плод (табл. 2)

Примечание: * р>0,05; * * р0,05 степень достоверности различий между основной и контрольной группами

При определении количества циркулирующих эндотелиальных клеток (ЦЭК) в плазме крови в I группе уровень ЦЭК составил 4,23±1,7 (10⁴) (р>0,05); во II группе - 10,6±0,7(10⁴) (р0,001), что указывало на начальные признаки эндотелиальной дисфункции у беременных основной группы.

Анализ патоморфологических исследований плаценты показал, что у беременных основной группы аномалии развития последа проявлялись соответственно в 58,3% и 62,5% случаев в виде диспластического развития ворсин плаценты (34% и 42,6%), избыточного отложения межворсинчатогофибриноида и массивных кальцификатов в ткани плаценты (49,8% и 61,3%). Необходимо заметить, что распространение возбудителя в интервиллезное пространство привело к развитию виллузита (56% и 72,4% соответственно). Исходом гематогенного инфицирования являлся облитерирующий васкулит и склерозирующийвиллузит (Фиг. 1).

Гистоструктура плацент женщин группы сравнения выявила массивные фибриноидные межворсинчатые отложения и кальцификаты. (табл. 3).

Примечание: * - p<0,05; ** - р<0,01

Инфекционный компонент был представлен в основном трансмуральным воспалением плодных оболочек, диффузным или крупноочаговым интервиллезитом, базальным децидуитом и/или виллузитом, поражением спиральных артерий и сосудов ворсин, что создает благоприятные условия для реализации внутриутробного инфицирования.

Пример 1.

Беременная Е., 28 лет.

Жалобы на тянущие боли внизу живота, повышенную двигательную активность плода.

Анамнез: менструации с 16 лет, по 4-5 дней, через 28-30 дней, регулярные, умеренные, безболезненые. Половая жизнь с 23 лет. Первая беременность завершилась преждевременными родами в сроке 30 недель, гибелью плода. Настоящая беременность II, роды предстоят первые.

Данная беременность протекала в первой половине на фоне угрозы прерывания, по поводу чего находилась на стационарном лечении в сроке 10-11 недель. В сроке 33 недель выявлено нарушение маточно-плацентарного и плодово-плацентарного кровотока 2-й А степени.

Объективно: среднего телосложения, умеренного питания. Общее состояние удовлетворительное, АД-100/70 мм. рт.ст., ps 79 уд. в мин. Живот овоидной формы, увеличен за счет беременности. Матка возбудима при пальпации. Положение плода продольное, предлежит головка над входом в малый таз.

Сердцебиение плода несколько приглушено, ритмичное 140 уд. в мин. Воды целы. Отеков нет. Физиологические оправления в норме. Высота стояния дна матки 32. Окружность живота 102 см.

Гинекологический статус: НПО развиты правильно, гиперемированы; оволосение по женскому типу.

В зеркалах: шейка матки синюшного цвета. Наружный зев закрыт.Выделения слизистые.

Обследована: 17.03.15 г. Данные допплерометрии (нарушение маточно-плацентарного и плодово-плацентарного кровотока 2-й А степени), кардиотокографическое исследование (задержка внутриутробного развития плода на 2 недели, по Фишеру 6-7 баллов).

Исследование маркера (оксида азота и его стабильных метаболитов):

NO_хмкмоль/л - 27,3

NO₂ мкмоль/л - 5,1

NO₃-мкмоль/л - 22,21

Диагноз: Беременность 34 недели. Головное предлежание. Угроза преждевременных родов. Плацентарная недостаточность II ст. ЗВУР плода. ОАА (антенатальная гибель плода).

ВЫВОД. В результате собственных комплексных исследований эндотелия у беременных раскрыты ряд патогенетически важных механизмов, лежащих в основе плацентарной недостаточности (снижение продукции оксида азота и его метаболитов), что позволит проводить раннюю диагностику данного осложнения беременности с целью проведения своевременной коррекции.

Медико-социальная эффективность. Данный метод приводит к более ранней диагностике плацентарной недостаточности у беременных, и, следовательно, способствует своевременному эффективному лечению данной патологии, а так же к сокращению койко-дней (7 дней) и снижению затрат.

Изобретение относится к акушерству, а именно к диагностике плацентарной недостаточности у беременных. Предложен способ ранней диагностики плацентарной недостаточности, включающий определение маркеров дисфункции эндотелия в сыворотке крови беременной. Новым в способе является определение концентрации оксида азота и его стабильных метаболитов в сыворотке крови. При значении оксида азота менее 50 мкмоль/л судят о дисфункции эндотелия. 1 ил., 3 табл., 1 пр.

Способ ранней диагностики плацентарной недостаточности, включающий определение маркеров дисфункции эндотелия в сыворотке крови беременной, отличающийся тем, что к 1 мл сыворотки крови добавляют 1-2 мл 96% этилового спирта, центрифугируют 18-22 мин и к получившимся нитрат-ионам добавляют хлорид ванадия (III), и из полученного суммарного количества метаболитов оксида азота вычитают количество нитритов и при значении оксида азота менее 50 мкмоль/л судят о дисфункции эндотелия.