ИММУНОГЕННЫЕ КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ КОНЪЮГИРОВАННЫЕ КАПСУЛЬНЫЕ САХАРИДНЫЕ АНТИГЕНЫ, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2019 года по МПК A61K39/09 

Область изобретения

Представленное изобретение касается новых иммуногенных композиций, содержащих конъюгированные капсульные сахаридные антигены (гликоконъюгаты) и их применений. Иммуногенная композиция согласно представленному изобретению, как правило, будет содержать гликоконъюгаты, в которых сахариды представляют собой производные серотипов Streptococcus pneumoniae. Изобретение также касается вакцинации субъектов людей, в частности детей грудного возраста и пожилых людей, против пневмококковых инфекций с использованием указанных новых иммуногенных композиций.

Предпосылки создания изобретения

Инфекционные заболевания, вызванные пневмококками, являются основной причиной заболеваемости и смертности во всем мире. Пневмония, фебрильная бактериемия и менингит являются наиболее распространенными проявлениями инвазивных пневмококковых инфекций, в то время как бактериальное распространение в дыхательных путях может в результате привести к инфекции среднего уха, синуситу или рецидивирующему бронхиту. По сравнению с инвазивным заболеванием, неинвазивные проявления, как правило, являются менее серьезными, но значительно более широкораспространенными. В Европе и Соединенных Штатах, пневмококковая пневмония является наиболее распространенной внебольничный бактериальной пневмонией, которая по оценкам затрагивает приблизительно 100 на 100000 взрослых каждый год. Соответствующие цифры для фебрильной бактериемии и менингит составляют 15-19 на 100000 и 1-2 на 100000, соответственно. Риск одного или нескольких из данных проявлений значительно выше у детей и пожилых людей, а также иммунно скомпрометированных лиц какого-либо возраста. Даже в экономически развитых регионах, инвазивное пневмококковое заболевание несет высокую смертность; для взрослых с пневмококковой пневмонией уровень смертности составляет в среднем 10%-20%, в то время как он может превышать 50% в группах высокого риска. Пневмония вне всякого сомнения является наиболее распространенной причиной пневмококковой смерти во всем мире.

Этиологический агент пневмококковых заболеваний, Streptococcus pneumoniae (пневмококк), представляет собой грамположительные инкапсулированные кокки, окруженные полисахаридной капсулой. Различия в составе данной капсулы обеспечивают серологическую дифференциацию между приблизительно 91 капсульным типом, некоторые из которых часто связаны с пневмококковым заболеванием, другие реже. Инвазивные пневмококковыей инфекции включают пневмонию, менингит и фебрильную бактериемию; среди распространенных неинвазивных проявлений являются отит, синусит и бронхит.

Пневмококковые конъюгированные вакцины (PCV) представляют собой пневмококковые вакцины, используемые для защиты от заболеваний, вызванных S. pneumoniae (пневмококками). В настоящее время существует три PCV вакцины доступные на мировом рынке: PREVNAR^® (в некоторых странах называемая превенар) (гептавалентная вакцина), SYNFLORIX^® (декавалентная вакцина) и PREVNAR 13^® (тридекавалентная вакцина).

Недавняя развитие широко распространенной микробной резистентности к основным антибиотикам и возрастающее количество людей с нарушенной иммунологической реактивностью подчеркивает необходимость пневмококковых вакцин с еще более широкой защитой.

В частности, существует необходимость обратить внимание на сохраняющуюся неудовлетворенную медицинскую потребность для охвата пневмококковых заболеваний, вызванных серотипами, не найденных в PREVNAR 13^®, и потенциал для замены серотипа с течением времени. Конкретные серотипы, вызывающие заболевания, не относящиеся к 13 в PREVNAR 13^®, варьируют в зависимости от региона, населения, и могут изменяться с течением времени из-за преобритения резистентности к антибиотикам, введения пневмококковой вакцины и долговременной тенденции неизвестного происхождения. Существует потребность в иммуногенной композиции, которая может использоваться для индуцирования иммунного ответа против дополнительных серотипов Streptococcus pneumoniae у людей и, в частности, у детей в возрасте меньше 2 лет.

Задача новых иммуногенных композиций согласно представленному изобретению заключается в обеспечении соответствующей защиты против серотипов S. Pneumoniae, не найденных в PREVNAR 13^®. В одном аспекте, задача иммуногенной композиции согласно представленному изобретению заключается в обеспечении соответствующей защиты против серотипов S. Pneumoniae, не найденных в PREVNAR^® (гептавалентной вакцина), SYNFLORIX^® и/или PREVNAR 13^®, в то же время, поддерживая иммунной ответ против серотипов, покрываемых на данный момент, указанными вакцинами.

Краткое изложение сущности изобретения

Представленное изобретение касается иммуногенной композиции, содержащей, по меньшей мере, один гликоконъюгат, выбранный из группы, состоящей из гликоконъюгата из S. pneumoniae серотипа 15В, гликоконъюгата из S. pneumoniae серотипа 22F, гликоконъюгата из S. pneumoniae серотипа 33F, гликоконъюгата из S. pneumoniae серотипа 12F, гликоконъюгата из S. pneumoniae серотипа 10А, гликоконъюгата из S. pneumoniae серотипа 11А и гликоконъюгата из S. pneumoniae серотипа 8.

В одном аспекте, изобретение предусматривает иммунногенную композицию, содержащую, по меньшей мере, один гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 15В, по меньшей мере, один гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 22F, и, по меньшей мере, один гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 33F.

В другом аспекте, изобретение предусматривает иммунногенную композицию, содержащую, по меньшей мере, один гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 15В, по меньшей мере, один гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 22F, по меньшей мере, один гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 33F, по меньшей мере, один гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 12F, по меньшей мере, один гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 10А, по меньшей мере, один гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 11А и, по меньшей мере, один гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 8.

В одном аспекте указанная выше иммунногенная композиция дополнительно включает гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипов 4, 6В, 9V, 14, 18С, 19F и 23F.

В другом аспекте указанная выше иммунногенная композиция дополнительно включает гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипов 1, 5 и 7F.

В другом аспекте указанная выше иммунногенная композиция дополнительно включает гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипов 6А и 19А.

В другом аспекте указанная выше иммунногенная композиция дополнительно включает гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипа 3.

В другом аспекте указанная выше иммунногенная композиция дополнительно включает гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипа 2, 9N, 17F, 20 и/или 15С.

В одном аспекте указанная выше иммунногенная композиция не содержит капсульный сахарид из S. pneumoniae серотипа 9N, 9А и/или 9L.

В одном аспекте указанная выше иммунногенная композиция представляет собой 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20-валентную пневмококковую конъюгированную композицию. В одном аспекте указанная выше иммунногенная композиция представляет собой 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25-валентную пневмококковую конъюгированную композицию.

В одном аспекте гликоконъюгаты представляют собой индивидуально конъюгированный с белком-носителем, выбранный из группы, состоящей из DT (дифтерийного токсина), TT (столбнячный токсин), CRM₁₉₇, других DT мутантов, PD (гемофилического гриппа типа D), или их иммунологически функциональных эквивалентов.

В одном аспекте, изобретение предусматривает контейнер, заполненный какой-либо иммунногенной композицией, определенной в представленном документе.

В одном аспекте, изобретение предусматривает какую-либо иммунногенную композицию, определенную в представленном документе для применения в качестве лекарственного средства, в частности, для применения в качестве вакцины.

В одном аспекте, изобретение предусматривает способ предупреждения, лечения или ослабления инфекции, заболевания или состояния, связанного с S. pneumoniae у субъекта, включающий введение субъекту иммунологически эффективного количества какой-либо иммунногенной композиции, определенной в представленном документе.

Фигуры

Фигура 1 показывает повторяющуюся полисахаридную структуру капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 8 (Pn-8).

Фигура 2 показывает повторяющуюся полисахаридную структуру капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 10А (Pn-10А).

Фигура 3 показывает повторяющуюся полисахаридную структуру капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 11А (Pn-11А).

Фигура 4 показывает повторяющуюся полисахаридную структуру капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 12F (Pn-12F).

Фигура 5 показывает повторяющуюся полисахаридную структуру капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 15В (Pn-15В).

Фигура 6 показывает повторяющуюся полисахаридную структуру капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 22F (Pn-22F).

Фигура 7 показывает повторяющуюся полисахаридную структуру капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 33F (Pn-33F).

Фигура 8 показывает блок-схему типичного процесса активации (А) и процессов конъюгации (В), которые могут быть использованы при получении Pn-33F гликоконъюгата.

Фигура 9 показывает влияние на DO путем изменения количества NCS в реакции окисления TEMPO/NCS.

Фигура 10 показывает оценку стабильности Pn-12F гликоконъюгатов. Фигура 11 Перекрестно-функциональные ОРА ответы. Подмножество из 59 сывороток от взрослых, вакцинированных 13 валентной пневмококковой конъюгированной вакцины (исследование США 6115А1-004; Клинические исследования - правит, идентификатор: NCT00427895) оценивали в ОРА на присутствие функциональных антител против серотипов 9V, 9А, 9L и 9N. Процент образцов с ОРА положительным титром (то есть, ≥1:8) представлен для указанной выше каждой группы. Геометрические средние титры (GMT) перечислены на оси x ниже каждой группы.

Фигура 12 Перекрестно-функциональные ОРА ответы шестидесяти шести соответствующих до/после сывороток. Подмножество из 66 соответствующих панелей до- и после-вакцинирования сывороток от взрослых, вакцинированных 13 валентной пневмококковой конъюгированной вакциной (исследование 6115А1-3005; Клинические исследования - правит, идентификатор: NCT00546572) оценивали в ОРА на присутствие функциональных антител против серотипов 9V, 9А, 9L и 9N. Процент образцов с ОРА положительным титром (то есть, ≥1:8) представлен для указанной выше каждой группы. Геометрические средние титры (GMT) перечислены на оси x ниже каждой группы.

Фигура 13 Обратные кумулятивные кривые распределения (RCDC) до и после иммунизации - пневмококковый серотип 9V (Pn9V).

Обратные кумулятивные кривые распределения ОРА титров к серотипу 9V от соответствующей панели до- и после-вакцинирования сывороток (N=66), вакцинированных 13 валентной пневмококковой конъюгированной вакциной (исследование 6115А1-3005; Клинические исследования - правит. идентификатор: NCT00546572). Графики представляют процент сывороток с ОРА положительным титром (то есть, ≥1:8).

Фигура 14 Обратные кумулятивные кривые распределения (RCDC) до и после иммунизации - пневмококковый серотип 9А (Pn9А).

Обратные кумулятивные кривые распределения ОРА титров к серотипу 9А от соответствующей панели до- и после-вакцинирования сывороток (N=66), вакцинированных 13 валентной пневмококковой конъюгированной вакциной (исследование 6115А1-3005; Клинические исследования - правит, идентификатор: NCT00546572). Графики представляют процент сывороток с ОРА положительным титром (то есть, ≥1:8).

Фигура 15 Обратные кумулятивные кривые распределения (RCDC) до и после иммунизации - пневмококковый серотип 9L (Pn9L).

Обратные кумулятивные кривые распределения ОРА титров к серотипу 9L от соответствующей панели до- и после-вакцинирования сывороток (N=66), вакцинированных 13 валентной пневмококковой конъюгированной вакциной (исследование 6115А1-3005; Клинические исследования - правит, идентификатор: NCT00546572). Графики представляют процент сывороток с ОРА положительным титром (то есть, ≥1:8).

Фигура 16 Обратные кумулятивные кривые распределения (RCDC) до и после иммунизации - пневмококковый серотип 9N (Pn9N).

Обратные кумулятивные кривые распределения ОРА титров к серотипу 9N от соответствующей панели до- и после-вакцинирования сывороток (N=66) вакцинированных 13 валентной пневмококковой конъюгированной вакциной (исследование 6115А1-3005; Клинические исследования - правит, идентификатор: NCT00546572). Графики представляют процент сывороток с ОРА положительным титром (то есть, ≥1:8).

1 Иммуногенная композиция согласно изобретению

Иммуногенная композиция согласно представленному изобретению будут, как правило, содержать конъюгированные капсульные сахаридные антигены (также называемые гликоконъюгатами), в которых сахариды получены из серотипов S. pneumoniae.

Предпочтительно, количество S. pneumoniae капсульных сахаридов может находиться в диапазоне от 8 различных серотипов (или “v”, валентности) до 20 различных серотипов (20v). В одном варианте осуществления представлено 8 различных серотипов. В одном варианте осуществления представлено 9 различных серотипов. В одном варианте осуществления представлено 10 различных серотипов. В одном варианте осуществления представлено 11 различных серотипов. В одном варианте осуществления представлено 12 различных серотипов. В одном варианте осуществления представлено 13 различных серотипов. В одном варианте осуществления представлено 14 различных серотипов. В одном варианте осуществления представлено 15 различных серотипов. В одном варианте осуществления представлено 16 различных серотипов. В одном варианте осуществления представлено 17 различных серотипов. В одном варианте осуществления представлено 18 различных серотипов. В одном варианте осуществления представлено 19 различных серотипов. В одном варианте осуществления представлено 20 различных серотипов. Капсульные сахариды конъюгированы с белком-носителем с образованием гликоконъюгатов, как описано в данном документе ниже.

Если белковый носитель является одинаковым для 2-х или более сахаридов в композиции, сахариды могут быть конъюгированы с одной той же молекулой белка-носителя (молекулы носители, которые имеют 2 или больше различных сахаридов, конъюгированных с ними) [смотри, например, WO 2004/083251].

В предпочтительном варианте осуществления, несмотря на то, что сахариды, каждый по отдельности, конъюгированы с различными молекулами белкового носителя (где каждая молекула белкового носителя имеет только один тип сахарида, конъюгированного с ним). В указанном варианте осуществления, капсульные сахариды, как говорят, по отдельности, конъюгированы с белком-носителем.

Для целей изобретения термин 'гликоконъюгат' указывает капсульный сахарид, связанный ковалентно с белком-носителем. В одном варианте осуществления капсульный сахарид связан непосредственно с белком-носителем. Во втором варианте осуществления бактериальной сахарид связан с белком через спейсер/линкер.

1.1 Белок-носитель изобретения

Компонент гликоконъюгата согласно изобретению представляет собой белок-носитель, к которому сахарид конъюгирован. Термины "белковый носитель", или "белок-носитель", или "носитель" могут использоваться взаимозаменяемо в данном документе. Белки-носители должны быть пригодны для стандартных процедур конъюгации.

В предпочтительном варианте осуществления, белок-носитель гликоконъюгатов выбирают из группы, состоящей из: DT (дифтерийного токсина), TT (столбнячного токсина) или фрагмента C из TT, CRM₁₉₇ (нетоксичный, но антигенно идентичный вариант дифтерийного токсина), других DT мутантов (такие как CRM176, CRM228, CRM45 (Uchida et al. (1973) J. Biol. Chem. 218: 3838-3844), CRM9, CRM102, CRM103 или CRM107; и других мутаций, описанных Nicholls and Youle in Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Maecel Dekker lnc. (1992); делеции или мутации Glu-148 до Asp, Gin или Ser и/или Ala 158 до Gly и других мутаций, раскрытых в патентах США №№4,709,017 и 4,950,740; мутации, по меньшей мере, одного или больше остатков Lys 516, Lys 526, Phe 530 и/или Lys 534 и других мутаций, раскрытых в патентах США №№5,917,017 и 6,455,673; или фрагмента, раскрытого в патенте США №. 5,843,711, пневмококкового пневмолизина (ply) (Kuo et al. (1995) Infect Immun 63: 2706-2713), включая ply, детоксифицированный каким-либо образом, например, dPLY-GMBS (WO 2004/081515, WO 2006/032499) или dPLY-формалин, PhtX, включая PhtA, PhtB, PhtD, PhtE (последовательности PhtA, PhtB, PhtD или PhtE раскрыты в WO 00/37105 и WO 00/39299) и продукты слияния Pht белков, например PhtDE продукты слияния, PhtBE продукты слияния, Pht А-Е (WO 01/98334, WO 03/054007, WO 2009/000826), ОМРС (белок менингококковой наружной мембраны), который обычно экстрагируют из Neisseria meningitidis серогруппы B (ЕР0372501), PorB (из N. meningitidis), PD (белок D Haemophilus influenzae; смотрите, например, ЕР0594610 В), или их иммунологически функциональных эквивалентов, синтетические пептидов (ЕР0378881, ЕР0427347), белков теплового шока (WO 93/17712, WO 94/03208), коклюшных белков (WO 98/58668, ЕР0471177), цитокинов, лимфокинов, факторов роста или гормонов (WO 91/01146), искусственных белков, содержащие множественные эпитопы человеческих Т-клеток CD4+ от различных патогенных производных антигенов (Falugi et al. (2001) Eur J Immunol 31: 3816-3824), таких как N19 белок (Baraldoi et al. (2004) Infect Immun 72: 4884-4887) пневмококковой поверхностный белок PspA (WO 02/091998), белки захвата железа (WO 01/72337), токсин A или B Clostridium difficile (WO 00/61761), трансферрин-связывающие белки, пневмококковые белки адгезии (PsaA), рекомбинантный экзотоксин A Pseudomonas aeruginosa (в частности, их нетоксичные мутанты (таких как экзотоксин A несущий замещение в глутаминовой кислоте 553 (Douglas et al. (1987) J. Bacteriol. 169 (11): 4967-4971)). Другие белки, такие как овальбумин, гемоцианин лимфы улитки (KLH), бычий сывороточный альбумин (BSA) или очищенный белок, производная туберкулина (PPD) также могут быть использованы в качестве белков-носителей. Другие подходящие белки-носители включают инактивированные бактериальные токсины, такие как холерный анатоксин (например, как описано в WO 2004/083251), Escherichia coli LT, Е. coli ST, и экзотоксин А из P. aeruginosa.

В предпочтительном варианте осуществления, белок-носитель гликоконъюгатов независимо выбирают из группы, состоящей из TT, DT, DT мутантов (таких как CRM₁₉₇), белка D Н. influenzae, PhtX, PhtD, PhtDE продуктов слияния (в частности, те, которые описаны в WO 01/98334 и WO 03/054007), детоксифицированного пневмолизина, PorB, N19 белка, PspA, ОМРС, токсина А или В от С. Difficile и PsaA.

В одном варианте осуществления, белок-носитель гликоконъюгатов согласно изобретению представляет собой DT (дифтерийный анатоксин). В другом варианте осуществления, белок-носитель гликоконъюгатов согласно изобретению представляет собой TT (столбнячный токсин).

В другом варианте осуществления, белок-носитель гликоконъюгатов согласно изобретению представляет собой PD (белок D Н. influenzae; смотрите, например, ЕР 0594610 В).

В предпочтительном варианте осуществления, капсульные сахариды согласно изобретению является конъюгированным с CRM₁₉₇ белком. CRM₁₉₇ белок представляет собой нетоксическую форму дифтерийного токсина, но является иммунологически отличимыми от дифтерийного токсина. CRM₁₉₇ продуцируется Corynebacterium diphtheriae, инфицированным нетоксикогенным фагом β197^tox- созданным путем нитрозогуанидинового мутагенеза токсикогенного коринефага бета (Uchida et al. (1971) Nature New Biology 233: 8-11). CRM₁₉₇ белок имеет такую же молекулярную массу, как и дифтерийный токсин, но отличается от него за счет одного изменения основания (гуанина на аденин) в структурном гене. Данное одно изменение основания вызывает замещение аминокислоты (глутаминовой кислоты на глицин) в зрелом белке и устраняет токсические свойства дифтерийного токсина. CRM₁₉₇ белок представляет собой безопасную и эффективную Т-клетку связанную с носителем для сахаридов. Более подробная информация о CRM₁₉₇ и их получение может быть найдена, например, в патенте США №.5,614,382. В одном варианте осуществления, капсульные сахариды согласно изобретению являются конъюгированными с CRM-197 белком или цепочкой A CRM₁₉₇ (смотри CN 103495161). В одном варианте осуществления, капсульные сахариды согласно изобретению являются конъюгированными с цепочкой A CRM₁₉₇, полученной за счет экспрессии с помощью генетически рекомбинантной Е. coli (смотри CN 103495161). В одном варианте осуществления, все капсульные сахариды согласно изобретению являются конъюгированными с CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления, все капсульные сахариды согласно изобретению являются конъюгированными с цепочкой A CRM₁₉₇.

Соответственно, в многочисленных вариантах осуществления, гликоконъюгаты согласно изобретению содержат CRM₁₉₇ в качестве белка-носителя, в котором капсульный полисахарид ковалентно связан с CRM₁₉₇.

1.1 Капсульный сахарид согласно изобретению

Термин "сахарид" по всему данному описанию может обозначать полисахарид или олигосахарид и включает оба. В многочисленных вариантах осуществления, сахарид представляет собой полисахарид, в частности S. Pneumoniae капсульный полисахарид.

Капсульные полисахариды получают соглосно стандартным методикам, известным квалифицированным специалистам в данной области.

В представленном изобретении, капсульные полисахариды могут получать, например, из серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9V, 10А, 11А, 12F, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F S. pneumoniae. Как правило, капсульные полисахариды получают путем выращивания каждого серотипа S. pneumoniae в среде (например, в среде на основе сои), полисахариды затем получают из культуры бактерий, бактериальные штаммы S. Pneumoniae, импользуемые для того, чтобы получить соответствующие полисахариды, которые используются в гликоконъюгатах согласно изобретению, могут быть получены из адаптированных коллекций культур или клинических образцов.

Популяция организма (каждый серотип S. pneumoniae) часто увеличивается от виалы для выращивания посевного материала до колб для выращивания посевного материала и пассируется через один или больше ферментеров семени, при этом достигается возрастающий объем до получения увеличения объемов ферментации. В конце цикла роста клетки лизируют, и бульон лизата затем собирают для процесса последовательной переработки (очистки) (смотри, например, WO 2006/110381, WO 2008/118752, и Публикации заявок на патент США №№2006/0228380, 2006/0228381, 2008/0102498 и 2008/0286838).

Индивидуальные полисахариды, как правило, очищают, используя центрифугирование, осаждение, ультрафильтрацию и/или колоночную хроматографию (смотри, например, WO 2006/110352 и WO 2008/118752).

Очищенные полисахариды могут быть активированными (например, химически активированными) для того, чтобы сделать их способными вступать в реакцию (например, со спейсером еТЕС), и затем введенными в гликоконъюгаты согласно изобретению, как дальше описано в данном документе.

S. pneumoniae капсульные полисахариды содержат повторяющиеся олигосахаридные единицы, которые могут содержать вплоть до 8 остатков сахаров.

В одном варианте осуществления, капсульный сахарид согласно изобретению может представлять собой одну олигосахаридную единицу или короче, чем длина нативной цепи сахарида повторяющихся олигосахаридных единиц. В одном варианте осуществления, капсульный сахарид согласно изобретению представляет собой одну повторяющуюся олигосахаридную единицу соответствующего серотипа.

В одном варианте осуществления, капсульный сахарид согласно изобретению может представлять собой олигосахариды. Олигосахариды имеют низкое количество повторяющихся единиц (как правило, 5-15 повторяющихся единиц) и, как правило, их получают синтетически или путем гидролиза полисахаридов.

Предпочтительно, все из капсульных сахаридов согласно представленному изобретению и в иммуногенной композицим согласно представленному изобретению представляют собой полисахариды. Капсульные полисахариды с высокой молекулярной массой способны индуцировать определенные иммунные ответы на антитела благодаря эпитопам, присутствующим на антигенной поверхности. Выделение и очистка капсульных полисахаридов с высокой молекулярной массой предпочтительно рассматриваются для использования в конъюгатах, композициях и способах согласно представленному изобретению.

В некоторых вариантах осуществления, очищенные полисахариды перед конъюгированием имеют молекулярную массу от 10 кДа до 4000 кДа. В других таких вариантах осуществления, полисахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 4000 кДа. В следующих таких вариантах осуществления, полисахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 3500 кДа; от 50 кДа до 3000 кДа; от 50 кДа до 2500 кДа; от 50 кДа до 2000 кДа; от 50 кДа до 1750 кДа; от 50 кДа до 1500 кДа; от 50 кДа до 1250 кДа; от 50 кДа до 1000 кДа; от 50 кДа до 750 кДа; от 50 кДа до 500 кДа; от 100 кДа до 4000 кДа; от 100 кДа до 3500 кДа; от 100 кДа до 3000 кДа; от 100 кДа до 2500 кДа; от 100 кДа до 2000 кДа; от 100 кДа до 2000 кДа; от 100 кДа до 1750 кДа; от 100 кДа до 1500 кДа; от 100 кДа до 1250 кДа; от 100 кДа до 1000 кДа; от 100 кДа до 750 кДа; от 100 кДа до 500 кДа; от 200 кДа до 4000 кДа; от 200 кДа до 3500 кДа; от 200 кДа до 3000 кДа; от 200 кДа до 2500 кДа; от 200 кДа до 2000 кДа; от 200 кДа до 2000 кДа; от 200 кДа до 1750 кДа; от 200 кДа до 1500 кДа; от 200 кДа до 1250 кДа; от 200 кДа до 1000 кДа; от 200 кДа до 750 кДа; или от 200 кДа до 500 кДа. Какое-либо целое число целого числа в пределах какого-либо из диапазонов, указанных выше, предполагается в качестве варианта осуществления изобретения.

Полисахарид может стать немного меньшим в размере во время общепринятых процедур очистки. Кроме того, как описано в данном документе, полисахарид может быть подвергнут процедурам сортировки по размерам перед конъюгированием. Механическая или химическая сортировка по размерам может быть использована. Химический гидролиз могут проводить с использованием уксусной кислоты. Механическую сортировку по размерам могут проводить с использованием фрагментирования за счет гомогенизации под высоким давлением. Диапазоны молекулярной массы, указанные выше, относятся к очищенным полисахаридам перед конъюгированием (например, перед активацией).

В предпочтительном варианте осуществления очищенные полисахариды представляют собой капсульный полисахарид из серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9V, 10А, 11А, 12F, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F или 33F S. pneumoniae, где капсульный полисахарид имеет молекулярную массу, которая попадает в пределы одного из диапазонов молекулярной массы, как описано в данном документе выше.

Как использовано в данном документе, термин "молекулярная масса" полисахарида или конъюгата белок-носитель-полисахарид касается молекулярной массы, рассчитанной с использованием гель-проникающей хроматографии (SEC) в сочетании с многоракрусным детектором рассеивания лазерного излучения (MALLS).

В некоторых вариантах осуществления, пневмококковые сахариды из серотипов 9V, 18С, 11А, 15В, 22F и/или 33F согласно изобретению являются О-ацетилированными. В некоторых вариантах осуществления, пневмококковые сахариды из серотипов 9V, 11А, 15В, 22F и/или 33F согласно изобретению являются О-ацетилированными.

Очищенные полисахариды, описанные в данном документе, являются химически активированными для того, чтобы получить сахариды способные взаимодействовать с белком-носителем. Данные пневмококковые конъюгаты получают с помощью раздельных процессов и формулируют в виде одного дозированного препарата, как описано ниже.

1.1.1 Пневмококковый полисахарид из S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F

Капсульные сахариды из S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F могут получать по стандартным методикам, известным квалифицированным специалистам в данной области (смотри, например, WO 2006/110381). Капсульные полисахариды могут быть получены путем выращивания каждого S. pneumoniae серотипа в среде; в конце цикла роста клетки лизируют и бульон лизата затем собирают для процесса выделения (очистки). Отдельные полисахариды, как правило, чистят, используя центрифугирование, осаждение, ультрафильтрацию, и/или колоночную хроматографию (смотри, например, WO 2006/110352 и WO 2008/118752). Очищенные полисахариды, кроме того, могут дополнительно подвергать обработке, как описано в данном документе, чтобы получить гликоконъюгаты согласно изобретению.

В некоторых вариантах осуществления, очищенные полисахариды из S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и/или 23F перед конъюгированием имеют молекулярную массу от 10 кДа до 4000 кДа. В других таких вариантах осуществления, полисахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 4000 кДа; от 50 кДа до 3000 кДа или от 50 кДа до 2000 кДа. В следующих таких вариантах осуществления, полисахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 3500 кДа; от 50 кДа до 3000 кДа; от 50 кДа до 2500 кДа; от 50 кДа до 2000 кДа; 50 кДа до 1750 кДа; от 50 кДа до 1500 кДа; от 50 кДа до 1250 кДа; от 50 кДа до 1000 кДа; от 50 кДа до 750 кДа; от 50 кДа до 500 кДа; от 100 кДа до 4000 кДа; от 100 кДа до 3500 кДа; от 100 кДа до 3000 кДа; от 100 кДа до 2500 кДа; от 100 кДа до 2000 кДа; от 100 кДа до 1750 кДа; от 100 кДа до 1500 кДа; от 100 кДа до 1250 кДа; от 100 кДа до 1000 кДа; от 100 кДа до 750 кДа; от 100 кДа до 500 кДа; от 200 кДа до 4000 кДа; от 200 кДа до 3500 кДа; от 200 кДа до 3000 кДа; от 200 кДа до 2500 кДа; от 200 кДа до 2000 кДа; от 200 кДа до 1750 кДа; от 200 кДа до 1500 кДа; от 200 кДа до 1250 кДа; от 200 кДа до 1000 кДа; от 200 кДа до 750 кДа; или от 200 кДа до 500 кДа. Какое-либо целое число целого числа в пределах какого-либо из диапазонов, указанных выше, предполагается в качестве варианта осуществления изобретения.

Полисахарид может стать немного меньшим в размере во время общепринятых процедур очистки. Кроме того, как описано в данном документе, полисахарид может быть подвергнут процедурам сортировки по размерам перед конъюгированием. Диапазоны молекулярной массы, указанные выше, относятся к очищенным полисахаридам перед конъюгированием (например, перед активацией) после возможной стадии сортировки по размерам.

В некоторых вариантах осуществления, пневмококковые сахариды из серотипов 9V и/или 18С согласно изобретению, являются О-ацетилированными. В некоторых вариантах осуществления, пневмококковый сахарид из серотипа 9V согласно изобретению, является О-ацетилированным, и пневмококковый сахарид из серотипа 18С согласно изобретению, является де-О-ацетилированным.

1.2.2 Пневмококковый полисахарид серотипа 8

Полисахаридная повторяющаяся единица серотипа 8 состоит из линейной тетрасахаридной единицы с одной глюкуроновой кислотой (GlcpA), двумя глюкопиранозами (Glcp) и одной галактопиранозой (Galp) (Jones et al. (1957) The Journal of the American Chemical Society. 79 (11): 2787-2793). Все четыре моносахарида связаны посредством 1,4-связей как показано на фигуре 1.

Сахариды серотипа 8 могут быть получены непосредственно из бактерий с использованием процедур выделения, известных квалифицированному специалисту в данной области (смотри, например, способы, раскрытые в публикациях заявок на патент США №№2006/0228380, 2006/0228381, 2007/0184071, 2007/0184072, 2007/0231340, и 2008/0102498 и WO 2008/118752). Кроме того, они могут быть получены с использованием синтетических протоколов.

Штаммы серотипа 8 S. pneumoniae штамме могут быть получены из созданных коллекций культур (таких как, например, Streptococcal Reference Laboratory (Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA)) или клинических образцов. В некоторых вариантах осуществления, очищенные полисахариды из S. pneumoniae серотипа 8 перед конъюгированием имеют молекулярную массу от 10 кДа до 2000 кДа. В одном варианте осуществления, капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 1000 кДа. В другом варианте осуществления, капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 70 кДа до 900 кДа. В другом варианте осуществления, капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 100 кДа до 800 кДа.

В следующих вариантах осуществления, капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 100 кДа до 600 кДа; от 100 кДа до 500 кДа; от 100 кДа до 400 кДа; от 150 кДа до 600 кДа; от 150 кДа до 500 кДа; от 150 кДа до 400 кДа; от 200 кДа до 600 кДа; от 200 кДа до 500 кДа; от 200 кДа до 400 кДа; от 250 кДа до 600; от 250 кДа до 500 кДа; от 250 кДа до 400 кДа; от 250 кДа до 350 кДа; от 300 кДа до 600 кДа; от 300 кДа до 500 кДа; от 300 кДа до 400 кДа; от 400 кДа до 600 кДа; от 500 кДа до 600 кДа; и подобные диапазоны желаемой молекулярной массы. Какое-либо целое число целого числа в пределах какого-либо из диапазонов, указанных выше, предполагается в качестве варианта осуществления изобретения.

Полисахарид может стать немного меньшим в размере во время общепринятых процедур очистки. Кроме того, как описано в данном документе, полисахарид может быть подвергнут процедурам сортировки по размерам перед конъюгированием. Диапазоны молекулярной массы, указанные выше, относятся к очищенным полисахаридам перед конъюгированием (например, перед активацией) после возможной стадии сортировки по размерам.

1.2.3 Пневмококковый полисахарид серотипа 10А

Полисахаридная повторяющаяся единица серотипа 10А состоит из разветвленной гексасахаридной повторяющейся единицы с двумя галактофуранозами (Gal_f), тремя галактопиранозами (Gal_p), одним N-ацетилгалактозамином (Gal_pNAc) и скелетным фосфорибитолом (Jones, С. 2005) Carbohydrate Research 269 (1): 175-181). Существует два разветвленных моносахарида в β-GalpNAc фрагменте (β-3-Galp и β-6-Galf), как показано на фигуре 2.

Сахариды серотипа 10А могут быть получены непосредственно из бактерий с использованием процедур выделения, известных квалифицированному специалисту в данной области (смотри, например, способы, раскрытые в публикациях заявок на патент США №№2006/0228380, 2006/0228381, 2007/0184071, 2007/0184072, 2007/0231340, и 2008/0102498 и WO 2008/118752). Кроме того, они могут быть получены с использованием синтетических протоколов.

Штаммы серотипа 10А S. pneumoniae могут быть получены из созданных коллекций культур (таких как, например, Streptococcal Reference Laboratory (Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA)) или клинических образцов. В некоторых вариантах осуществления, очищенные полисахариды из S. pneumoniae серотипа 10А перед конъюгированием имеет молекулярную массу от 10 кДа до 2000 кДа. В одном варианте осуществления, капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 1000 кДа. В другом варианте осуществления, капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 70 кДа до 900 кДа. В другом варианте осуществления, капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 100 кДа до 800 кДа.

В следующих вариантах осуществления, капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 100 кДа до 600 кДа; от 100 кДа до 500 кДа; от 100 кДа до 400 кДа; от 150 кДа до 600 кДа; от 150 кДа до 500 кДа; от 150 кДа до 400 кДа; от 200 кДа до 600 кДа; от 200 кДа до 500 кДа; от 200 кДа до 400 кДа; от 250 кДа до 600 кДа; от 250 кДа до 500 кДа; от 250 кДа до 400 кДа; от 250 кДа до 350 кДа; от 300 кДа до 600 кДа; от 300 кДа до 500 кДа; от 300 кДа до 400 кДа; от 400 кДа до 600 кДа; от 500 кДа до 600 кДа; и подобные диапазоны желаемой молекулярной массы. Какое-либо целое число целого числа в пределах какого-либо из диапазонов, указанных выше, предполагается в качестве варианта осуществления изобретения.

Полисахарид может стать немного меньшим в размере во время общепринятых процедур очистки. Кроме того, как описано в данном документе, полисахарид может быть подвергнут процедурам сортировки по размерам перед конъюгированием. Диапазоны молекулярной массы, указанные выше, относятся к очищенным полисахаридам перед конъюгированием (например, перед активацией) после возможной стадии сортировки по размерам.

1.2.4 Пневмококковый полисахарид серотипа 11А

Полисахаридная повторяющаяся единица серотипа 11А состоит из линейного тетрасахаридного скелета (двух галактопираноз (Gal_p) и двух глюкопираноз (Glc_p)) и боковой фосфоглицерин (Richards et al. (1988) Adv. Exp. Med. Biol. 228: 595-597), как показано на фигуре 3. Полисахарид является О-ацетилированным в нескольких местах и, на основании представленных данных, описанных в литературе (Calix et al. (2011) J Bacteriol. 193 (19): 5271-5278), общее количество O-ацетилирование в 11 полисахариде составляет приблизительно 2,6 O-ацетильных групп на полисахаридную повторяющуюся единицу.

Сахариды серотипа 11А могут быть получены непосредственно из бактерий с использованием процедур выделения, известных квалифицированному специалисту в данной области (смотри, например, способы, раскрытые в публикациях заявок на патент США №№2006/0228380, 2006/0228381, 2007/0184071, 2007/0184072, 2007/0231340, и 2008/0102498 и WO 2008/118752). Кроме того, они могут быть получены с использованием синтетических протоколов.

Штаммы серотипа 11А S. pneumoniae могут быть получены из созданных коллекций культур (таких как, например, Streptococcal Reference Laboratory (Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA)) или клинических образцов. Выделенный капсульный полисахарид серотипа 11А, полученный путем очистки полисахарида серотипа 11 из лизата S. pneumoniae и необязательно сортировки по размерам очищеного полисахарида, может характеризоваться различными атрибутами, включая, например, молекулярную массу (М.М.) и мМ ацетата на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 11А.

В некоторых вариантах осуществления, очищенные полисахариды из S. pneumoniae серотипа 11А перед конъюгированием имеет молекулярную массу от 10 кДа до 2000 кДа. В одном варианте осуществления, капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 1000 кДа. В другом варианте осуществления, капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 70 кДа до 900 кДа. В другом варианте осуществления, капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 100 кДа до 800 кДа.

В следующих вариантах осуществления, капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 100 кДа до 600 кДа; от 100 кДа до 500 кДа; от 100 кДа до 400 кДа; от 100 кДа до 300 кДа; от 100 кДа до 200 кДа; от 150 кДа до 600 кДа; от 150 кДа до 500 кДа; от 150 кДа до 400 кДа; от 150 кДа до 300 кДа; от 150 кДа до 200 кДа; от 200 кДа до 600 кДа; от 200 кДа до 500 кДа; от 200 кДа до 400 кДа; от 250 кДа до 600 кДа; от 250 кДа до 500 кДа; от 250 кДа до 400 кДа; от 250 кДа до 350 кДа; от 300 кДа до 600 кДа; от 300 кДа до 500 кДа; от 300 кДа до 400 кДа; от 400 кДа до 600 кДа; от 500 кДа до 600 кДа; и подобные диапазоны желаемой молекулярной массы. Какое-либо целое число целого числа в пределах какого-либо из диапазонов, указанных выше, предполагается в качестве варианта осуществления изобретения.

Полисахарид может стать немного меньшим в размере во время общепринятых процедур очистки. Кроме того, как описано в данном документе, полисахарид может быть подвергнут процедурам сортировки по размерам перед конъюгированием. Диапазоны молекулярной массы, указанные выше, относятся к очищенным полисахаридам перед конъюгированием (например, перед активацией) после возможной стадии сортировки по размерам.

В одном варианте осуществления, размер очищенного полисахарида серотипа 11 уменьшается при гомогенизации под высоким давлением. Гомогенизация под высоким давлением обеспечивает высокие скорости сдвига за счет прокачивания насосом технологического потока через проточный канал с достаточно малыми размерами. Скорость сдвига увеличивается за счет использования более высокого приложенного давления гомогенизации, и время выдержки может быть увеличено путем рециркуляции потока сырья через гомогенизатор.

Процесс гомогенизации под высоким давлением является особенно подходящим для уменьшения размера очищенного полисахарида серотип 11, при этом сохраняя структурные особенности полисахарида, такие как присутствие O-ацетильных групп.

Присутствие O-ацетила в очищенном, изолированном или активированном капсульном полисахариде серотипа 11А или в конъюгате «полисахарид серотипа 11-белок-носитель» выражают как количество мМ ацетата на мМ указанного полисахарида, или как количество О-ацетильных групп на полисахаридную повторяющуюся единицу.

В предпочтительном варианте осуществления, очищенные полисахариды из S. Pneumoniae серотипа 11А имеют, по меньшей мере, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0, 1,2, 1,4 или 1,6, мкмоль ацетата на мкмоль указанного капсульного полисахарида серотипа 11А.

1.2.5 Пневмококковый полисахарид серотипа 12F

Полисахаридная повторяющаяся единица серотипа 12F состоит из линейного трисахаридного скелета (одного N-ацетилфукозамина (Fuc_pNAc), одного N-ацетилгалактозамина (Gal_pNAc) и одной N-ацетилманнуроновая кислота (Man_pNAcA)) с двумя ветвями: боковой α-галактопиранозой (Gal_p), связанной в С3 Fuc_pNAc и α-Glc_p-(1→2)-α-Glc_p дисахаридной ветвью, связанной в С3 Man_pNAcA (Leontein et al. (1983) Carbohydrate Research 114 (2): 257-266.), как показано на фигуре 4.

Штаммы серотипа 12F Streptococcus pneumoniae могут быть получены из созданных коллекций культур (таких как например Streptococcal Reference Laboratory (Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA)) или клинических образцов.

Капсульные сахариды из S. pneumoniae серотипа 12F получают по стандартным методикам, известным квалифицированным специалистам в данной области. Как правило, капсульные полисахариды получают путем выращивания каждого серотипа S. pneumoniae в среде (например, в среде на основе сои), полисахариды затем получают из культуры бактерий. Популяция организма (S. pneumoniae серотип 12F) часто увеличивается в масштабе от виалы для выращивания посевного материала до колб для выращивания посевного материала и пассируется через один или больше ферментеров семени, при этом достигается возрастающий объем до получения увеличения объемов ферментации. В конце цикла роста клетки лизируют, и бульон лизата затем собирают для процесса последовательной переработки (очистки) (смотри, например, WO 2006/110381 и WO 2008/118752, публикации заявок на патент США №№2006/0228380, 2006/0228381, 2008/0102498 и US 2008/0286838). Полисахариды, как правило, чистят, используя центрифугирование, осаждение, ультрафильтрацию и/или колоночную хроматографию (смотри, например, WO 2006/110352 и WO 2008/118752).

Очищенные полисахариды из серотипа 12F могут быть активированы (например, химически активированы), чтобы сделать их способными реагировать, и затем введены в гликоконъюгаты согласно изобретению, как дальше описано в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления, очищенные полисахариды из S. pneumoniae серотипа 12F перед конъюгированием имеют молекулярную массу от 10 кДа до 2000 кДа. В одном варианте осуществления, капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 1000 кДа. В другом варианте осуществления, капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 300 кДа. В другом варианте осуществления, капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 70 кДа до 300 кДа. В следующих вариантах осуществления, капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 90 кДа до 250 кДа; от 90 кДа до 150 кДа; от 90 кДа до 120 кДа; от 80 кДа до 120 кДа; от 70 кДа до 100 кДа; от 70 кДа до 110 кДа; от 70 кДа до 120 кДа; от 70 кДа до 130 кДа; от 70 кДа до 140 кДа; от 70 кДа до 150 кДа; от 70 кДа до 160 кДа; от 80 кДа до 110 кДа; от 80 кДа до 120 кДа; от 80 кДа до 130 кДа; от 80 кДа до 140 кДа; от 80 кДа до 150 кДа; от 80 кДа до 160 кДа; от 90 кДа до 110 кДа; от 90 кДа до 120 кДа; от 90 кДа до 130 кДа; от 90 кДа до 140 кДа; от 90 кДа до 150 кДа; от 90 кДа до 160 кДа; от 100 кДа до 120 кДа; от 100 кДа до 130 кДа; от 100 кДа до 140 кДа; от 100 кДа до 150 кДа; от 100 кДа до 160 кДа; и подобные диапазоны желаемой молекулярной массы. Какое-либо целое число целого числа в пределах какого-либо из диапазонов, указанных выше, предполагается в качестве варианта осуществления изобретения.

Полисахарид может стать немного меньшим в размере во время общепринятых процедур очистки. Кроме того, как описано в данном документе, полисахарид может быть подвергнут процедурам сортировки по размерам перед конъюгированием. Диапазоны молекулярной массы, указанные выше, относятся к очищенным полисахаридам перед конъюгированием (например, перед активацией) после возможной стадии сортировки по размерам.

1.2.6 Пневмококковый полисахарид серотипа 15В

Как показано на фигуре 5, полисахаридная повторяющаяся единица серотипа 15В состоит из разветвленного трисахаридного скелета (одного N-ацетилглюкозамина (Glc_pNAc), одной галактопиранозы (Gal_p) и одной глюкопиранозы (Glc_p)) с αGal_p-βGal_p дисахаридной ветвью, связанной с С4 гидроксильной группой Glc_pNAc. Фосфоглицерин связан с С3 гидроксильной группой остатка βGal_p в дисахаридной ветви (Jones et al. (2005) Carbohydrate Research 340 (3): 403-409). Капсульный полисахарид из серотипа 15С имеет идентичную структуру основной цепи, что и серотип 15В, но не содержит О-ацетилирование.

Полисахариды серотипа 15В могут быть получены непосредственно из бактерий с использованием процедур выделения, известных квалифицированному специалисту в данной области (смотри, например, способы, раскрытые в публикациях заявок на патент США №№2006/0228380, 2006/0228381, 2007/0184071, 2007/0184072, 2007/0231340, и 2008/0102498 и WO 2008/118752). Они также могут быть получены с использованием синтетических протоколов, известных квалифицированному специалисту в данной области.

Штаммы серотипа 15В S. pneumoniae могут быть получены из созданных коллекций культур (таких как, например, American Type Culture Collection (АТСС, Manassas, VA USA) (например, депозитный штамм № АТСС10354) или Streptococcal Reference Laboratory (Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA USA)) или из клинических образцов.

Бактериальные клетки выращивают в среде, предпочтительно в среде на основе сои. После ферментации бактериальных клеток, которые продуцируют капсульные полисахариды серотипа 15В S. pneumoniae, бактериальные клетки лизируют, чтобы получить клеточный лизат. Полисахарид серотипа 15В затем могут выделять из клеточного лизата с использованием методов очистки, известных в данной области, включая использование центрифугирования, глубинной фильтрации, осаждения, ультрафильтрации, обработки активированным углем, диафильтрации и/или колоночной хроматографии (смотрите, например, публикации заявок на патент США №№2006/0228380, 2006/0228381, 2007/0184071, 2007/0184072, 2007/0231340, и 2008/0102498 и WO 2008/118752). Чистый капсульный полисахарид серотипа 15В затем могут использовать для получения иммуногенных конъюгатов.

Выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В, полученный путем очистки полисахарида серотипа 15В из лизата S. pneumoniae и, необязательно, сортировки по размерам очищенноно полисахарида, может быть охарактеризован используя различные параметры, включая, например, молекулярную массу (М.М.), мМ ацетата на мМ зазначеного капсульного полисахарида серотипа 15В та мМ глицерину на мМ зазначеного капсульного полисахарида серотипа 15В.

Предпочтительно, для того, чтобы генерировать 15В конъюгаты с преимущественными характеристиками фильтруемости и/или выходами, сортировку по размерам полисахарида в диапазоне целевой молекулярной массы, осуществляют перед конъюгацией с белком-носителем. Преимущественно, размер очищенного полисахарида серотипа 15В уменьшается, при этом сохраняя критические особенности структуры полисахарида, такие как, например, присутствие O-ацетильных групп. Предпочтительно, размер очищенного полисахарида серотипа 15В уменьшается за счет механической гомогенизации.

В предпочтительном варианте осуществления, размер очищенного полисахарида серотипа 15В уменьшается при гомогенизации под высоким давлением. Гомогенизация под высоким давлением достигает высокие скорости сдвига за счет прокачивания насосом технологического потока через проточный канал с достаточно малыми размерами. Скорость сдвига увеличивается за счет использования более высокого приложенного давления гомогенизации, и время выдержки может быть увеличено путем рециркуляции потока сырья через гомогенизатор.

Процесс гомогенизации под высоким давлением является особенно подходящим для уменьшения размера очищенного полисахарида серотипа 15В при этом, сохраняя структурные особенности полисахарида, такие как присутствие O-ацетильных групп.

В предпочтительном варианте осуществления, выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В имеет молекулярную массу от 5 кДа до 500 кДа, от 50 кДа до 500 кДа, от 50 кДа до 450кДа, от 100 кДа до 400кДа, и от 100 кДа до 350 кДа. В предпочтительном варианте осуществления, выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В имеет молекулярную массу от 100 кДа до 350 кДа. В предпочтительном варианте осуществления, выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В имеет молекулярную массу от 100 кДа до 300 кДа. В предпочтительном варианте осуществления, выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В имеет молекулярную массу от 150 кДа до 300 кДа. В предпочтительном варианте осуществления, выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В имеет молекулярную массу от 150 кДа до 350 кДа. В следующих вариантах осуществления, капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 100 кДа до 500 кДа; от 100 кДа до 400 кДа; от 100 кДа до 300 кДа; от 100 кДа до 200 кДа; от 150 кДа до 500 кДа; от 150 кДа до 400 кДа; от 150 кДа до 300 кДа; от 150 кДа до 200 кДа; от 200 кДа до 500 кДа; от 200 кДа до 400 кДа; от 250 кДа до 500 кДа; от 250 кДа до 400 кДа; от 250 кДа до 350 кДа; от 300 кДа до 500 кДа; от 300 кДа до 400 кДа; и подобные диапазоны желаемой молекулярной массы. Какое-либо целое число целого числа в пределах какого-либо из диапазонов, указанных выше, предполагается в качестве варианта осуществления изобретения.

Полисахарид серотипа 15В является O-ацетилированным и общее количество O-ацетилирования приблизительно составляет 0,8-0,9 O-ацетильных групп на полисахаридную повторяющуюся единицу. Степень O-ацетилирования полисахарида может быть определена используя какой-либо способ, известный в данной области, например, используя протонный ЯМР (смотри, например, Lemercinier et al. (1996) Carbohydrate Research 296: 83-96; Jones et al. (2002) J. Pharmaceutical and Biomedical Analysis 30: 1233-1247; WO 2005/033148 и WO 00/56357). Другой часто используемый способ описан в Hestrin, S. (1949) J. Biol. Chem. 180: 249-261. Предпочтительно, присутствие О-ацетильных групп определяют, используя ионно-ВЭЖХ анализ.

Присутствие O-ацетила в очищенном, выделенном или активированном капсульном полисахариде серотипа 15В или в полисахариде конъюгата белок серотипа 15В-носитель выражают как количество мМ ацетата на мМ указанного полисахарида или как количество O-ацетильных групп на полисахаридную повторяющуюся единицу.

В предпочтительном варианте осуществления, выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В содержит, по меньшей мере, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 или 0,8 мМ ацетата на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном варианте осуществления, выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В содержит, по меньшей мере, 0,5, 0,6 или 0,7 мМ ацетата на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном варианте осуществления, выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В содержит, по меньшей мере, 0,6 мМ ацетата на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном варианте осуществления, выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В содержит, по меньшей мере, 0,7 мМ ацетата на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В.

Присутствие глицерофосфатных боковых цепей определяют путем измерения глицерина с использованием высокоэффективной анионно-обменной хроматографии с импульсным амперометрическим обнаружением (HPAEC-PAD) после высвобождения его при обработке полисахарида плавиковой кислотой (HF). Присутствие глицерина в очищенном, выделенном или активированном полисахариде серотипа 15В или в полисахариде конъюгата белок серотипа 15В-носитель выражают как количество мМ глицерина на мМ полисахарида серотипа 15В.

В предпочтительном варианте осуществления, выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В содержит, по меньшей мере, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 или 0,8 мМ глицерина на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном варианте осуществления, выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В содержит, по меньшей мере, 0,5, 0,6 или 0,7 мМ глицерина на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном варианте осуществления, выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В содержит, по меньшей мере, 0,6 мМ глицерина на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном варианте осуществления, выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В содержит, по меньшей мере, 0,7 мМ глицерина на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В.

В предпочтительном варианте осуществления, выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В имеет молекулярную массу от 100 кДа до 350 кДа и содержит, по меньшей мере, 0,6 мМ ацетата на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В.

В предпочтительном варианте осуществления, выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В имеет молекулярную массу от 100 кДа до 350 кДа и содержит, по меньшей мере, 0,6 мМ глицерина на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В.

В предпочтительном варианте осуществления, выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В имеет молекулярную массу от 150 кДа до 300 кДа и содержит, по меньшей мере, 0,6 мМ ацетата на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В.

В предпочтительном варианте осуществления, выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В имеет молекулярную массу от 150 кДа до 300 кДа и содержит, по меньшей мере, 0,6 мМ глицерина на мМ указанного капсульного полисахарид серотипа 15В.

В предпочтительном варианте осуществления, выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В имеет молекулярную массу от 150 кДа до 350 кДа и содержит, по меньшей мере, 0,6 мМ ацетата на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В.

В предпочтительном варианте осуществления, выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В имеет молекулярную массу от 150 кДа до 350 кДа и содержит, по меньшей мере, 0,6 мМ глицерина на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В.

В предпочтительном варианте осуществления, выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В содержит, по меньшей мере, 0,6 мМ ацетата на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В и, по меньшей мере, 0,6 мМ глицерина на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В.

В предпочтительном варианте осуществления, выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В имеет молекулярную массу от 100 кДа до 350 кДа и содержит, по меньшей мере, 0,6 мМ ацетата на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В и, по меньшей мере, 0,6 мМ глицерина на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В.

В предпочтительном варианте осуществления, выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В имеет молекулярную массу от 150 кДа до 300 кДа и содержит, по меньшей мере, 0,6 мМ ацетата на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В и, по меньшей мере, 0,6 мМ глицерина на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В.

В предпочтительном варианте осуществления, выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В имеет молекулярную массу от 150 кДа до 350 кДа и содержит, по меньшей мере, 0,6 мМ ацетата на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В и, по меньшей мере, 0,6 мМ глицерина на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В.

1.2.7 Пневмококковый полисахарид серотипа 22F

Как показано на фигуре 6, полисахаридная повторяющаяся единица серотипа 22F состоит из разветвленного пентасахаридного скелета (одной глюкуроновой кислоты (Glc_pA), одной глюкопиранозы (Glc_p), одной галактофуранозы (Gal_f) и двух рамнопираноз (Rha_p)) с αGlc_p ветвью, связанной с С3 гидроксильной группой βRha_p (Richards et al. (1989) Canadian Journal of Chemistry 67 (6): 1038-1050). Приблизительно 80% C2 гидроксильных групп остатка βRha_p в полисахаридной повторяющейся единице, являются O-ацетилированными.

Полисахариды серотипа 22F могут быть получены непосредственно из бактерий с использованием процедур выделения, известных квалифицированному специалисту в данной области (смотри, например, способы, раскрытые в публикациях заявок на патент США №№2006/0228380, 2006/0228381, 2007/0184071, 2007/0184072, 2007/0231340, и 2008/0102498 и WO 2008/118752). Кроме того, они могут быть получены с использованием синтетических протоколов.

Штаммы серотипа 22F S. pneumoniae могут быть получены из созданных коллекций культур (таких как, например, Streptococcal Reference Laboratory (Centers. for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA)) или клинических образцов. Выделенный капсульный полисахарид серотипа 22F, полученный путем очистки полисахарида серотипа 22F из лизата S. pneumoniae и, необязательно, сортировки по размерам очищенноно полисахарида, может быть охарактеризован различными параметрами, включая, например, молекулярную массу (М.М.) и мМ ацетата на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 22F.

Предпочтительно, для того, чтобы генерировать конъюгаты серотипа 22F с преимущественными характеристиками фильтруемости и/или выходами, сортировку по размерам полисахарида в диапазоне целевой молекулярной массы осуществляют перед конъюгацией с белком-носителем. Преимущественно, размер очищенного полисахарида серотипа 22F уменьшается, при этом сохраняя критические особенности структуры полисахарида, такие как, например, присутствие O-ацетильной группы. Предпочтительно, размер очищенного полисахарида серотипа 22F уменьшается за счет механической гомогенизации.

В предпочтительном варианте осуществления, размер очищенноно полисахарида уменьшается при гомогенизации под высоким давлением. Гомогенизация под высоким давлением достигает высокие скорости сдвига за счет прокачивания насосом технологического потока через проточный канал с достаточно малыми размерами. Скорость сдвига увеличивается за счет использования более высокого приложенного давления гомогенизации, и время выдержки может быть увеличено путем рециркуляции потока сырья через гомогенизатор.

Процесс гомогенизации под высоким давлением является особенно подходящим для уменьшения размера очищенного полисахарида серотипа 22F, при этом сохраняя структурные особенности полисахарида, такие как присутствие O-ацетильных групп.

В некоторых вариантах осуществления, очищенные полисахариды из S. pneumoniae серотипа 22F перед конъюгированием имеет молекулярную массу от 10 кДа до 2000 кДа. В одном варианте осуществления, капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 1000 кДа. В другом варианте осуществления, капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 70 кДа до 900 кДа. В другом варианте осуществления, капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 100 кДа до 800 кДа. В другом варианте осуществления, капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 200 кДа до 600 кДа. В другом варианте осуществления, капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 400 кДа до 700 кДа.

В следующих вариантах осуществления, капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 100 кДа до 1000 кДа; от 100 кДа до 900 кДа; от 100 кДа до 800 кДа; от 100 кДа до 700 кДа; от 100 кДа до 600 кДа; от 100 кДа до 500 кДа; от 100 кДа до 400 кДа; от 100 кДа до 300 кДа; от 150 кДа до 1000 кДа; от 150 кДа до 900 кДа; от 150 кДа до 800 кДа; от 150 кДа до 700 кДа; от 150 кДа до 600 кДа; от 150 кДа до 500 кДа; от 150 кДа до 400 кДа; от 150 кДа до 300 кДа; от 200 кДа до 1000 кДа; от 200 кДа до 900 кДа; от 200 кДа до 800 кДа; от 200 кДа до 700 кДа; от 200 кДа до 600 кДа; от 200 кДа до 500 кДа; от 200 кДа до 400 кДа; от 200 кДа до 300 кДа; от 250 кДа до 1000 кДа; от 250 кДа до 900 кДа; от 250 кДа до 800 кДа; от 250 кДа до 700 кДа; от 250 кДа до 600 кДа; от 250 кДа до 500 кДа; от 250 кДа до 400 кДа; от 250 кДа до 350 кДа; от 300 кДа до 1000 кДа; от 300 кДа до 900 кДа; от 300 кДа до 800кДа; от 300 кДа до 700 кДа; от 300 кДа до 600 кДа; от 300 кДа до 500 кДа; от 300 кДа до 400 кДа; от 400 кДа до 1000 кДа; от 400 кДа до 900 кДа; от 400 кДа до 800 кДа; от 400 кДа до 700 кДа; от 400 кДа до 600 кДа; от 500 кДа до 600 кДа; и подобные диапазоны желаемой молекулярной массы. Какое-либо целое число целого числа в пределах какого-либо из диапазонов, указанных выше, предполагается в качестве варианта осуществления изобретения.

Полисахарид может стать немного меньшим в размере во время общепринятых процедур очистки. Кроме того, как описано выше в данном документе, полисахарид 22F может быть подвергнут процедурам сортировки по размерам перед конъюгированием. Диапазоны молекулярной массы, указанные выше, относятся к очищенным полисахаридам перед конъюгированием (например, перед активацией) после возможной стадии сортировки по размерам. Степень O-ацетилирования полисахарида может быть определена, используя какой-либо способ, известный в данной области, например, используя протонный ЯМР (Lemercinier et al. (1996) Carbohydrate Research 296: 83-96; Jones et al. (2002) J. Pharmaceutical and Biomedical Analysis 30: 1233-1247; WO 2005/033148 и WO 00/56357). Другой часто используемый способ описан в Hestrin, S. (1949) J. Biol. Chem. 180: 249-261. Предпочтительно, присутствие О-ацетильных групп определяют, используя ионно-ВЭЖХ анализ.

Присутствие O-ацетила в очищенном, выделенном или активированном капсульном полисахариде серотипа 22F или в конъюгате полисахарид серотипа 22F-белок-носитель выражают как количество мМ ацетата на мМ указанного полисахарида или как количество O-ацетильных групп на полисахаридную повторяющуюся единицу.

В предпочтительном варианте осуществления, очищенные полисахариды из S. pneumoniae серотипа 22F имеет, по меньшей мере, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8,1, 1,2, 1,4 или 1,6, мкмоль ацетата на мкмоль указанного капсульного полисахарида серотипа 22F.

1.2.8 Пневмококковый полисахарид серотипа 33F

Как показано на фигуре 7, полисахаридная повторяющаяся единица серотипа 33F состоит из разветвленного пентасахаридного скелета (двух галактопираноз (Gal_p), двух галактофураноз (Gal_f) и одной глюкопиранозы (Glc_p) с терминальной αGal_p, связанной с С2 гидроксильной группой остатка αGal_p в пределах скелета (Lemercinier et al. (2006) Carbohydrate Research 341 (1): 68-74.). В литературе сообщалось, что С2 гидроксильная группа скелета остатка 3-β-Gal_f является О-ацетилированной.

Полисахариды серотипа 33F могут быть получены непосредственно из бактерий с использованием процедур выделения, известных квалифицированному специалисту в данной области (смотри, например, способы, раскрытые в публикациях заявок на патент США №№2006/0228380, 2006/0228381, 2007/0184071, 2007/0184072, 2007/0231340, и 2008/0102498 и WO 2008/118752). Кроме того, они могут быть получены с использованием синтетических протоколов.

Штаммы серотипа 33F S. pneumoniae могут быть получены из созданных коллекций культур (таких как, например, Streptococcal Reference Laboratory (Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA)) или клинических образцов. Очищенные полисахариды из серотипа 33F могут быть активированы (например, химически активированы), чтобы сделать их способными реагировать, а затем введены в гликоконъюгаты согласно изобретению, как дальше описано в данном документе.

Выделенный капсульный полисахарид серотипа 33F, полученный путем очистки полисахарида серотипа 33F от лизата S. pneumoniae и, необязательно, сортировки по размерам очищенноно полисахарида, может быть охарактеризован используя различные параметры, включая, например, молекулярную массу и мМ ацетата на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 33F.

В некоторых вариантах осуществления, очищенные полисахариды из S. pneumoniae серотипа 33F перед конъюгированием имеют молекулярную массу от 10 кДа до 2000 кДа. В других таких вариантах осуществления, сахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 2000 кДа. В следующих таких вариантах осуществления, сахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 1750 кДа; от 50 кДа до 1500 кДа; от 50 кДа до 1250 кДа; от 50 кДа до 1000 кДа; от 50 кДа до 750 кДа; от 50 кДа до 500 кДа; от 100 кДа до 2000 кДа; от 100 кДа до 1750 кДа; от 100 кДа до 1500 кДа; от 100 кДа до 1250 кДа; от 100 кДа до 1000 кДа; от 100 кДа до 750 кДа; от 100 кДа до 500 кДа; от 200 кДа до 2000 кДа; от 200 кДа до 1750 кДа; от 200 кДа до 1500 кДа; от 200 кДа до 1250 кДа; от 200 кДа до 1000 кДа; от 200 кДа до 750 кДа; или от 200 кДа до 500 кДа. Какое-либо целое число целого числа в пределах какого-либо из диапазонов, указанных выше, предполагается в качестве варианта осуществления изобретения.

Полисахарид может стать немного меньшим в размере во время общепринятых процедур очистки. Кроме того, как описано в данном документе, полисахарид может быть подвергнут процедурам сортировки по размерам перед конъюгированием. Диапазоны молекулярной массы, указанные выше, относятся к очищенным полисахаридам перед конъюгированием (например, перед активацией) после возможной стадии сортировки по размерам.

Присутствие O-ацетила в очищенном, выделенном или активированном капсульном полисахариде серотипа 33F или в конъюгате полисахарид серотипа 33F-белок-носитель выражают как количество мМ ацетата на мМ указанного полисахарида или как количество O-ацетильных групп на полисахаридную повторяющуюся единицу.

В предпочтительном варианте осуществления, очищенные полисахариды из S. pneumoniae серотипа 33F имеет, по меньшей мере, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0, 1,2, 1,4 или 1,6, мкмоль ацетата на мкмоль указанного капсульного полисахарида серотипа 33F.

1.3. Гликоконъюгаты согласно изобретению

Очищенные сахариды химически активируют для того, чтобы сделать сахариды (то есть, активированный сахариды) способными реагировать с белком-носителем. После того, как активируют, каждый капсульный сахарид отдельно конъюгируют с белком-носителем для того, чтобы получить гликоконъюгат. В одном варианте осуществления, каждый капсульный сахарид является конъюгированным с одним и тем же белком-носителем. Химическая активация сахаридов и последующая конъюгация с белком-носителем может быть достигнута с использованием способов активации и конъюгации, раскрытых в данном документе.

1.3.1. Гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипа 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F

Капсульные полисахариды из серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F S. Pneumoniae получают по стандартным методикам, известным квалифицированным специалистам в данной области (смотри, например, WO 2006/110381, WO 2008/118752, WO 2006/110352, и публикации заявок на патент США №№2006/0228380, 2006/0228381, 2008/0102498 и 2008/0286838).

В одном варианте осуществления, полисахариды активируются тетрафторборатом 1-циано-4-диметиламинопиридиния (CDAP) с образованием цианатного сложного эфира. Активированный полисахарид затем соединяют непосредственно или через спейсерную (линкерную) группу с аминогруппой на белке-носителе (предпочтительно CRM₁₉₇). Например, спейсер может представлять собой цистамин или цистеамин для того, чтобы получить тиолированный полисахарид, который может быть соединен с носителем через тиоэфирную связь, полученную после реакции с малеимид-активированным белком-носителем (например, используя N-[γ-малеимидобутирилокси]сукцинимидный сложный эфир (GMBS)) или галогенацетилированным белком-носителем (например, используя йодацетамид, N-сукцинимидил бромацетат (SBA; SIB), N-сукцинимидил(4-йодацетил)аминобензоат (SIAB), сульфосукцинимидил(4-йодацетил)аминобензоат (сульфо-SIAB), N-сукцинимидил йодацетат (SIA) или сукцинимидил 3-[бромацетамидо]пропионат (SBAP)). Предпочтительно, цианатный сложный эфир (необязательно, полученный с применением CDAP химии) соединяют с гександиамином или гидразидом адипиновой кислоты (ADH), и амино-дериватизированный сахарид конъюгируют с белком-носителем (например, CRM₁₉₇) с использованием карбодиимидной (например, EDAC или EDC) химии через карбоксильную группу на белковом носителе. Такие конъюгаты описаны, например, в WO 93/15760, WO 95/08348 и WO 96/129094.

Другие подходящие способы конъюгации используют карбодиимиды, гидразиды, активные сложные эфиры, норборан, п-нитробензойную кислоту, N-гидроксисукцинимид, S-NHS, EDC, TSTU. Многие из них описаны в публикации международной заявки на патент № WO 98/42721. Конъюгирование может включать карбонильный линкер, который может образовываться в результате реакции свободной гидроксильной группы сахарида с 1,1'-карбонилдиимидазолом (CDI) (смотри, Bethell et al. (1979) J. Biol. Chern. 254: 2572-2574; Hearn et al. (1981) J. Chromatogr. 218: 509-518) с последующей реакцией с белком с образованием карбаматной связи. Это может включать восстановление аномерного конца до первичной гидроксильной группы, необязательное введение защиты/снятие защиты первичной гидроксильной группы, взаимодействие первичной гидроксильной группы с CDI с образованием CDI карбаматного промежуточного соединения и взаимодействие CDI карбаматного промежуточного соединения с аминофуппой на белке.

В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере, один из капсульных полисахаридов из серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F из S. pneumoniae конъюгируют с белком-носителем посредством восстановительного аминирования (такого как, описано в публикациях заявок на патент США №№2006/0228380,2007/0231340, 2007/0184071 и 2007/0184072, WO 2006/110381, WO 2008/079653, и WO 2008/143709). В предпочтительном варианте осуществления, капсульные полисахариды из серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F из S. Pneumoniae все являются конъюгированными с белком-носителем посредством восстановительного аминирования.

Восстановительное аминирование включает две стадии, (1) окисление полисахарида, (2) восстановление активированного полисахарида и белка-носителя с образованием конъюгата. Перед окислением, полисахарид необязательно гидролизуют. Механический или химический гидролиз может быть использован. Химический гидролиз могут проводить с использованием уксусной кислоты. Стадия окисления может включать реакцию с перйодатом. Для целей представленного изобретения, термин "перйодат" включает как перйодат, так и перйодную кислоту; термин также включает как метаперйодат (IO₄^-), так и ортоперйодат (IO₆^5-) и различные соли перйодата (например, натрия перйодат и калия перйодат).

В одном варианте осуществления капсульный полисахарид из серотипа 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F или 23F из S. pneumoniae окисляют в присутствии метаперйодата, предпочтительно в присутствии натрия перйодата (NaIO₄). В другом варианте осуществления капсульный полисахарид из серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F из S. pneumoniae окисляют в присутствии ортоперйодата, предпочтительно в присутствии перйодной кислоты.

После стадии окисления полисахарида, полисахарид, как указывалось, активируют и называют как "активированный полисахарид" в данном документе ниже. Активированный полисахарид и белок-носитель могут быть лиофилизированными (высушенными при заморозке), или независимо друг от друга (отдельная лиофилизация) или вместе (совместно лиофилизированный). В одном варианте осуществления активированный полисахарид и белок-носитель являются совместно лиофилизированными. В другом варианте осуществления активированный полисахарид и белок-носитель являются лиофилизированными независимо друг от друга.

В одном варианте осуществления лиофилизация происходит в присутствии невосстанавливающего сахара, возможно невосстанавливающие сахара включают сахарозу, трегалозу, рафинозу, стахиозу, мелецитозу, декстран, маннит, лактит и палатинит.

Вторая стадия процесса конъюгации представляет собой восстановление активированного полисахарида и белка-носителя с образованием конъюгата (так называемое восстановительное аминирование), с использованием восстанавливающего агента. Восстанавливающие агенты, которые являются приемлемыми, включают цианоборгидриды, такие как натрия цианоборгидрид, боран-пиридин, или боргидрид-обменная смола. В одном варианте осуществления восстанавливающий агент представляет собой натрия цианоборгидрид.

В одном варианте осуществления, восстановительную реакцию проводят в водном растворителе, в другом варианте осуществления реакцию проводят в апротонном растворителе. В одном варианте осуществления, восстановительную реакцию проводят в ДМСО (диметилсульфоксиде) или в ДМФ (диметилформамиде) растворителе. Растворитель ДМСО или ДМФ может быть использован для восстановления активированного полисахарида и белка-носителя, который был лиофилизирован.

По окончании восстановительной реакции непрореагировавшие альдегидные группы могут оставаться в конъюгатах, они могут быть блокированы приемлемым блокирующим агентом. В одном варианте осуществления данный блокирующий агент представляет собой натрия боргидрид (NaBH₄). После конъюгирования (восстановительной реакции и необязательно блокирования), гликоконъюгаты могут быть очищены. Гликоконъюгаты могут быть очищены посредством диафильтрации и/или ионно-обменной хроматографии и/или гель-проникающей хроматографии. В одном варианте осуществления, гликоконъюгаты чистят с использованием диафильтрации, или ионно-обменной хроматографии, или гель-проникающей хроматографии. В одном варианте осуществления гликоконъюгаты подвергают стерилизующему фильтрованию.

В некоторых вариантах осуществления, гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипов 9V и/или 18С содержит сахарид, который имеет степень О-ацетилирования от 10% до 100%, от 20% до 100%, от 30% до 100%, от 40% до 100%, от 50% до 100%, от 60% до 100%, от 70% до 100%, от 75% до 100%, от 80% до 100%, от 90% до 100%, от 50% до 90%, от 60% до 90%, от 70% до 90% или от 80% до 90%. В других вариантах осуществления, степень О-ацетилирования составляет ≥10%, ≥20%, ≥30%, ≥40%, ≥50%, ≥60%, ≥70%, ≥80%, или ≥90%, или приблизительно 100%.

В некоторых вариантах осуществления, гликоконъюгат из S. Pneumoniae серотипов 9V и/или 18С согласно изобретению являются О-ацетилированными. В некоторых вариантах осуществления, гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 9V является О-ацетилированным, и гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 18С является де-О-ацетилированным.

1.3.2, Гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипа 22F

В одном варианте осуществления, гликоконъюгаты серотипа 22F получают посредством активирования полисахарида с тетрафторборатом 1-циано-4-диметиламинопиридиния (CDAP) с образованием цианатного сложного эфира. Активированный полисахарид может быть присоединен непосредственно или через спейсерную (линкерную) группу к аминогруппе на белке-носителе. Например, спейсер может представлять собой цистамин или цистеамин, давая тиолированный полисахарид, который может быть присоединен к носителю посредством тиоэфирной связи, полученной после реакции с активированным малеимидом белком-носителем (например, с использованием GMBS) или галогенацетилированным белком-носителем (например, с использованием йодацетамида, SIB, SIAB, сульфо-SIAB, SIA, или SBAP). Предпочтительно, цианатный сложный эфир (необязательно полученный с использованием CDAP химии) соединяют с гександиамином или гидразидом адипиновой кислоты (ADH), и амино-дериватизированный сахарид конъюгируют с белком-носителем с использованием карбодиимидной (например, EDAC или EDC) химии через карбоксильную группу на белковом носителе. Такие конъюгаты описаны, например, в WO 93/15760, WO 95/08348 и WO 96/129094.

Другие приемлемые способы используют карбодиимиды, гидразиды, активные сложные эфиры, норборан, п-нитробензойную кислота, N-гидроксисукцинимид, S-NHS, EDC, TSTU. Многие из них описаны в публикации международной заявки на патент № WO 98/42721. Конъюгация может включать карбонильный линкер, который может образовываться в результате реакции свободной гидроксильной группы сахарида с CDI (смотри, Bethell et al. (1979) J. Biol. Chern. 254: 2572-2574; Hearn et al. (1981) J. Chromatogr. 218: 509-518), с последующей реакцией с белком с образованием карбаматной связи. Это может включать восстановление аномерного конца до первичной гидроксильной группы, необязательное введение защиты/снятие защиты первичной гидроксильной группы, взаимодействие первичной гидроксильной группы с CDI с образованием CDI карбаматного промежуточного соединения, и взаимодействие CDI карбаматного промежуточного соединения с аминогруппой на белке.

В предпочтительных вариантах осуществления, гликоконъюгаты серотипа 22F согласно изобретению получают с использованием восстановительного аминирования. Восстановительное аминирование включает две стадии, (1) окисление полисахарида с образованием альдегидных функциональных групп из вицинальных диолов в индивидуальной гексасахаридной единице, (2) восстановление активированного полисахарида и белка-носителя (например, CRM₁₉₇) с образованием конъюгата.

Предпочтительно, перед окислением, осуществляют сортировку по размерам полисахарида серотипа 22F в диапазоне целевой молекулярной массы (М.М.). Преимущественно, размер очищенного полисахарида серотипа 22F уменьшается, при этом сохраняя критические особенности структуры полисахарида, такие как, например, присутствие O-ацетильных групп. Предпочтительно, размер очищенного полисахарида серотипа 22F уменьшается, используя механическую гомогенизацию (смотри раздел 1.2.7 выше).

В одном варианте осуществления, серотип полисахарид активируют (окисляют) согласно способу, включающему стадию:

(а) взаимодействия выделенного полисахарида серотипа 22F с окислительным агентом;

(b) гашение окислительной реакции посредством добавления гасящего агента, что в результате приводит к активированному полисахариду серотипа 22F.

В предпочтительном варианте осуществления, окислительный агент представляет собой перйодат. Для целей представленного изобретения, термин "перйодат" включает как перйодат, так и перйодную кислоту; термин также включает как метаперйодат (IO₄^-), так и ортоперйодат (IO₆^5-) и различные соли перйодата (например, натрия перйодат и калия перйодат). В предпочтительном варианте осуществления, окислительный агент представляет собой натрия перйодат. В предпочтительном варианте осуществления, перйодат, использованный для окисления полисахарида серотипа 22F, представляет собой метаперйодат. В предпочтительном варианте осуществления перйодат, использованный для окисления полисахарида серотипа 22F, представляет собой натрия метаперйодат.

В одном варианте осуществления, гасящий агент выбирают из вицинальных диолов, 1,2-аминоспиртов, аминокислот, глютатиона, сульфита, бисульфата, дитионита, метабисульфита, тиосульфата, фосфитов, гипофосфитов или фосфористой кислоты.

В одном варианте осуществления, гасящий агент представляет собой 1,2-аминоспирты формулы (I):

где R¹ выбирают из Н, метила, этила, пропила или изопропила.

В одном варианте осуществления, гасящий агент выбирают из солей натрия и калия - сульфита, бисульфата, дитионита, метабисульфита, тиосульфата, фосфитов, гипофосфитов или солей фосфористой кислоты.

В одном варианте осуществления, гасящий агент представляет собой аминокислоту. В таких вариантах осуществления, указанная аминокислота может быть выбрана из серина, треонина, цистеина, цистина, метионина, пролина, гидроксипролина, триптофана, тирозина и гистидина.

В одном варианте осуществления, гасящий агент представляет собой сульфит, такой как бисульфат, дитионит, метабисульфит, тиосульфат.

В одном варианте осуществления, гасящий агент представляет собой соединение, содержащее две вицинальные гидроксильные группы (вицинальные диолы), то есть, две гидроксильные группы, ковалентно связанные с двумя соседними атомами углерода.

Предпочтительно, гасящий агент представляет собой соединение формулы (II):

в которой каждый R¹ и R² независимо выбирают из Н, метила, этила, пропила или изопропила.

В предпочтительном варианте осуществления, гасящий агент представляет собой глицерин, этиленгликоль, пропан-1,2-диол, бутан-1,2-диол или бутан-2,3-диол, или аскорбиновую кислоту. В предпочтительном варианте осуществления, гасящий агент представляет собой бутан-2,3-диол.

В предпочтительном варианте осуществления, выделенный полисахарид серотипа 22F активируют согласно способу, включающему стадию:

(a) взаимодействия выделенного полисахарида серотипа 22F с перйодатом;

(b) гашения окислительной реакции посредством добавления бутан-2,3-диола, что в результате приводит к активированному полисахариду серотипа 22F.

После стадии окисления полисахарида, полисахарид, как указывалось, активируют и называют в данном документе ниже как "активированный полисахарид".

В предпочтительном варианте осуществления, активированный полисахарид серотипа 22F чистят. Активированный полисахарид серотипа 22F чистят в соответствии со способами, известными квалифицированному специалисту в данной области, такими как гель-проникающая хроматография (GPC), диализ или ультрафильтрация/диафильтрация. Например, активированный полисахарид 22F чистят путем концентрирования и диафильтрации с использованием устройства для ультрафильтрации.

В предпочтительном варианте осуществления степень окисления активированного полисахарида серотипа 22F составляет от 2 до 30, от 2 до 25, от 2 до 20, от 2 до 15, от 2 до 10, от 2 до 5, от 5 до 30, от 5 до 25, от 5 до 20, от 5 до 15, от 5 до 10, от 10 до 30, от 10 до 25, от 10 до 20, от 10 до 15, от 15 до 30, от 15 до 25, от 15 до 20, от 20 до 30, или от 20 до 25. В предпочтительном варианте осуществления степень окисления активированного полисахарида серотипа 22F составляет от 2 до 10, от 4 до 8, от 4 до 6, от 6 до 8, от 6 до 12, от 8 до 14, от 9 до 11, от 10 до 16, от 12 до 16, от 14 до 18, от 16 до 20, от 16 до 18, от 18 до 22, или от 18 до 20.

В предпочтительном варианте осуществления, активированный полисахарид серотипа 22F имеет молекулярную массу от 25 кДа до 1000 кДа, от 100 кДа до 1000 кДа, от 300 кДа до 800 кДа, от 300 кДа до 700 кДа, от 300 кДа до 600 кДа, от 400 кДа до 1000 кДа, от 400 кДа до 800 кДа, от 400 кДа до 700 кДа или от 400 кДа до 600 кДа. В одном варианте осуществления, активированный полисахарид серотипа 22F имеет молекулярную массу от 300 кДа до 800кДа. В одном варианте осуществления, активированный полисахарид серотипа 22F имеет молекулярную массу от 400 кДа до 600 кДа. В предпочтительном варианте осуществления, активированный полисахарид серотипа 22F имеет молекулярную массу от 400 кДа до 600 кДа, и степень окисление от 10 до 25, от 10 до 20, от 12 до 20 или от 14 до 18. В предпочтительном варианте осуществления, активированный полисахарид серотипа 22F имеет молекулярную массу от 400 кДа до 600 кДа и степень окисление от 10 до 20.

В предпочтительном варианте осуществления, активированный полисахарид серотипа 22F содержит, по меньшей мере, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6 или 0,7 или приблизительно 0,8 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F. В предпочтительном варианте осуществления, активированный полисахарид серотипа 22F содержит, по меньшей мере, 0,5, 0,6 или 0,7 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F. В предпочтительном варианте осуществления, активированный полисахарид серотипа 22F содержит, по меньшей мере, 0,6 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F.

В предпочтительном варианте осуществления, активированный полисахарид серотипа 22F содержит, по меньшей мере, 0,7 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F. В предпочтительном варианте осуществления, активированный полисахарид серотипа 22F имеет молекулярную массу от 400 кДа до 800 кДа и содержит, по меньшей мере 0,6 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F.

В предпочтительном варианте осуществления, активированный полисахарид серотипа 22F имеет молекулярную массу от 400 кДа до 800 кДа, степень окисление от 12 до 20 и содержит, по меньшей мере, 0,6 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F.

Активированный полисахарид и/или белок-носитель могут быть лиофилизированными (высушенными при заморозке), или независимо друг от друга (отдельная лиофилизация) или вместе (совместно лиофилизированный).

В одном варианте осуществления, активированный полисахарид серотипа 22F лиофилизируют, необязательно в присутствии сахарида. В предпочтительном варианте осуществления, сахарид выбирают из сахарозы, трегалозы, рафинозы, стахиозы, мелецитозы, декстрана, маннита, лактита и палатинита. В предпочтительном варианте осуществления, сахарид представляет собой сахарозу. В одном варианте осуществления, лиофилизированный активированный полисахарид затем смешивают с раствором, содержащим белок-носитель.

В другом варианте осуществления активированный полисахарид и белок-носитель совместно лиофилизируют. В таких вариантах осуществления, активированный полисахарид серотипа 22F смешивают с белком-носителем и лиофилизируют необязательно в присутствии сахарида. В предпочтительном варианте осуществления, сахарид выбирают из сахарозы, трегалозы, рафинозы, стахиозы, мелецитозы, декстрана, маннита, лактита и палатинита. В предпочтительном варианте осуществления, сахарид представляет собой сахарозу. Совместно лиофилизированный полисахарид и белок-носитель затем могут повторно суспендировать в растворе, и подвергать взаимодействию с восстанавливающим агентом.

Вторая стадия процесса конъюгирования представляет собой восстановление активированного полисахарида и белка-носителя с образованием конъюгата (восстановительного аминирования), с использованием восстанавливающего агента.

Активированный полисахарид серотипа 22F может быть конъюгированным с белком-носителем согласно способу, включающему стадию:

(c) смешивания активированного полисахарида серотипа 22F с белком-носителем; и

(d) взаимодействия компаундированного активированного полисахарида серотипа 22F и белка-носителя с восстанавливающим агентом с образованием конъюгата полисахарид серотипа 22F-белок-носитель.

В одном варианте осуществления, восстановительную реакцию проводят в водном растворителе, в другом варианте осуществления реакцию проводят в апротонном растворителе. В одном варианте осуществления, восстановительную реакцию проводят в ДМСО (диметилсульфоксиде) или в ДМФ (диметилформамиде)) растворителе. Растворитель ДМСО или ДМФ может быть использован для восстановления активированного полисахарида и белка-носителя, который был лиофилизирован.

Конъюгирование активированного полисахарида серотипа 22F с белковым носителем посредством восстановительного аминирования в диметилсульфоксиде (ДМСО) приемлемо для сохранения содержания O-ацетила полисахарида по сравнению, например, с восстановительным аминированием в водной фазе, где уровень O-ацетилирования полисахарида может быть значительно уменьшен. Поэтому в предпочтительном варианте осуществления, стадию (с) и стадию (d) осуществляют в ДМСО.

В одном варианте осуществления, восстанавливающий агент представляет собой натрия цианоборгидрид, натрия триацетоксиборгидрид, натрия или цинка боргидрид в присутствии кислот Бренстеда или Льюиса, аминоборанов, таких как пиридин-боран, 2-пиколин-боран, 2,6-диборан-метанол, диметиламин-боран, t-BuMeⁱPrN-ВН₃, бензиламин-ВН₃ или 5-этил-2-метилпиридин-боран (РЕМВ). В предпочтительном варианте осуществления, восстанавливающий агент представляет собой натрия цианоборгидрид.

По окончании восстановительной реакции, в конъюгатах могут оставаться непрореагировавшие альдегидные группы, они могут быть блокированы приемлемым блокирующим агентом. В одном варианте осуществления данный блокирующий агент представляет собой натрия боргидрид (NaBH₄).

После конъюгирования полисахарида серотипа 22F с белком-носителем, гликоконъюгат может быть очищен (обогащенный по отношению к количеству конъюгата полисахарид-белок) используя различные способы, известные квалифицированному специалисту. Данные способы включают диализ, операции концентрирования/диафильтрации, фильтрование тангенциальным потоком, осаждение/элюирование, колоночную хроматографию (DEAE или хроматографию с гидрофобным взаимодействием), и глубинную фильтрацию.

В некоторых вариантах осуществления, гликоконъюгаты серотипа 22F согласно представленному изобретению содержат сахарид, имеющий молекулярную массу от 10 кДа до 2000 кДа. В других таких вариантах осуществления, сахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 1000 кДа. В других таких вариантах осуществления, сахарид имеет молекулярную массу от 70 кДа до 900 кДа. В других таких вариантах осуществления, сахарид имеет молекулярную массу от 100 кДа до 800 кДа. В других таких вариантах осуществления, сахарид имеет молекулярную массу от 200 кДа до 600 кДа. В следующих таких вариантах осуществления, сахарид имеет молекулярную массу от 100 кДа до 1000 кДа; от 100 кДа до 900 кДа; от 100 кДа до 800 кДа; от 100 кДа до 700 кДа; от 100 кДа до 600 кДа; от 100 кДа до 500 кДа; от 100 кДа до 400 кДа; от 100 кДа до 300 кДа; от 150 кДа до 1000 кДа; от 150 кДа до 900 кДа; от 150 кДа до 800 кДа; от 150 кДа до 700 кДа; от 150 кДа до 600 кДа; от 150 кДа до 500 кДа; от 150 кДа до 400 кДа; от 150 кДа до 300 кДа; от 200 кДа до 1000 кДа; от 200 кДа до 900 кДа; от 200 кДа до 800 кДа; от 200 кДа до 700 кДа; от 200 кДа до 600 кДа; от 200 кДа до 500 кДа; от 200 кДа до 400 кДа; от 200 кДа до 300 кДа; от 250 кДа до 1000 кДа; от 250 кДа до 900 кДа; от 250 кДа до 800 кДа; от 250 кДа до 700 кДа; от 250 кДа до 600 кДа; от 250 кДа до 500 кДа; от 250 кДа до 400 кДа; от 250 кДа до 350 кДа; от 300 кДа до 1000 кДа; от 300 кДа до 900 кДа; от 300 кДа до 800 кДа; от 300 кДа до 700 кДа; от 300 кДа до 600 кДа; от 300 кДа до 500 кДа; от 300 кДа до 400 кДа; от 400 кДа до 1000 кДа; от 400 кДа до 900 кДа; от 400 кДа до 800 кДа; от 400 кДа до 700 кДа; от 400 кДа до 600 кДа; от 500 кДа до 600 кДа. Какое-либо целое число целого числа в пределах какого-либо из диапазонов, указанных выше, предполагается в качестве варианта осуществления изобретения. В некоторых таких вариантах осуществления, гликоконъюгаты серотипа 22F получают с использованием восстановительного аминирования.

В некоторых вариантах осуществления, гликоконъюгат серотипа 22F согласно изобретению имеет молекулярную массу от 400 кДа до 15000 кДа; от 500 кДа до 10000 кДа; от 2000 кДа до 10,000 кДа; от 3000 кДа до 8,000 кДа; или от 3000 кДа до 5,000 кДа. В других вариантах осуществления, гликоконъюгат серотипа 22F имеет молекулярную массу от 500 кДа до 10000 кДа. В других вариантах осуществления, гликоконъюгат серотипа 22F имеет молекулярную массу от 1000 кДа до 8000 кДа. В еще других вариантах осуществления, гликоконъюгат серотипа 22F имеет молекулярную массу от 2000 кДа до 8000 кДа или от 3000 кДа до 7000 кДа. В следующих вариантах осуществления, гликоконъюгат серотипа 22F согласно изобретению имеет молекулярную массу от 200 кДа до 20000 кДа; от 200 кДа до 15000 кДа; от 200 кДа до 10000 кДа; от 200 кДа до 7500 кДа; от 200 кДа до 5000 кДа; от 200 кДа до 3000 кДа; от 200 кДа до 1000 кДа; от 500 кДа до 20000 кДа; от 500 кДа до 15000 кДа; от 500 кДа до 12500 кДа; от 500 кДа до 10000 кДа; от 500 кДа до 7500 кДа; от 500 кДа до 6000 кДа; от 500 кДа до 5000 кДа; от 500 кДа до 4000 кДа; от 500 кДа до 3000 кДа; от 500 кДа до 2000 кДа; от 500 кДа до 1500 кДа; от 500 кДа до 1000 кДа; от 750 кДа до 20000 кДа; от 750 кДа до 15000 кДа; от 750 кДа до 12500 кДа; от 750 кДа до 10000 кДа; от 750 кДа до 7500 кДа; от 750 кДа до 6000 кДа; от 750 кДа до 5000 кДа; от 750 кДа до 4000 кДа; от 750 кДа до 3000 кДа; от 750 кДа до 2000 кДа; от 750 кДа до 1500 кДа; от 1000 кДа до 15000 кДа; от 1000 кДа до 12500 кДа; от 1000 кДа до 10000 кДа; от 1000 кДа до 7500 кДа; от 1000 кДа до 6000 кДа; от 1000 кДа до 5000 кДа; от 1000 кДа до 4000 кДа; от 1000 кДа до 2500 кДа; от 2000 кДа до 15000 кДа; от 2000 кДа до 12500 кДа; от 2000 кДа до 10000 кДа; от 2000 кДа до 7500 кДа; от 2000 кДа до 6000 кДа; от 2000 кДа до 5000 кДа; от 2000 кДа до 4000 кДа; или от 2000 кДа до 3000 кДа.

В следующих вариантах осуществления, гликоконъюгат серотипа 22F согласно изобретению имеет молекулярную массу от 3000 кДа до 20000 кДа; от 3000 кДа до 15000 кДа; от 3000 кДа до 10000 кДа; от 3000 кДа до 7500 кДа; от 3000 кДа до 5000 кДа; от 4000 кДа до 20000 кДа; от 4000 кДа до 15000 кДа; от 4000 кДа до 12500 кДа; от 4000 кДа до 10000 кДа; от 4000 кДа до 7500 кДа; от 4000 кДа до 6000 кДа; или от 4000 кДа до 5000 кДа.

В следующих вариантах осуществления, гликоконъюгат серотипа 22F согласно изобретению имеет молекулярную массу от 5000 кДа до 20000 кДа; от 5000 кДа до 15000 кДа; от 5000 кДа до 10000 кДа; от 5000 кДа до 7500 кДа; от 6000 кДа до 20000 кДа; от 6000 кДа до 15000 кДа; от 6000 кДа до 12500 кДа; от 6000 кДа до 10000 кДа или от 6000 кДа до 7500 кДа.

Молекулярную массу гликоконъюгата измеряют, используя SEC-MALLS. Какое-либо целое число целого числа в пределах какого-либо из диапазонов, указанных выше, предполагается в качестве варианта осуществления изобретения.

В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат серотипа 22F согласно изобретению содержит, по меньшей мере, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6 или 0,7 или приблизительно 0,8 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F. В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат содержит, по меньшей мере, 0,5, 0,6 или 0,7 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F. В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат содержит, по меньшей мере, 0,6 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F. В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат содержит, по меньшей мере, 0,7 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F.

В предпочтительном варианте осуществления, соотношение мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F в гликоконъюгате к мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F в выделенном полисахариде составляет, по меньшей мере, 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9 или 0,95. В предпочтительном варианте осуществления, соотношение мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F в гликоконъюгате к мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F в выделенном полисахариде составляет, по меньшей мере, 0,7. В предпочтительном варианте осуществления, соотношение мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F в гликоконъюгате к мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F в выделенном полисахариде составляет, по меньшей мере, 0,9.

В предпочтительном варианте осуществления, соотношение мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F в гликоконъюгате к мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F в активированном полисахариде составляет, по меньшей мере, 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, или 0,95. В предпочтительном варианте осуществления, соотношение мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F в гликоконъюгате к мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F в активированном полисахариде составляет, по меньшей мере, 0,7. В предпочтительном варианте осуществления, соотношение мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F в гликоконъюгате к мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F в активированном полисахариде составляет, по меньшей мере, 0,9. Другой способ охарактеризовать гликоконъюгаты серотипа 22F согласно изобретению представляет собой количество лизиновых остатков в белке-носителе (например, CRM₁₉₇), которые становятся конъюгированными с сахаридом, которое может быть охарактеризовано как диапазон конъюгированных лизинов (степень конъюгации). Доказательство лизиновой модификации белка-носителя, за счет ковалентных связей с полисахаридами, могут быть получены с помощью аминокислотного анализа с использованием стандартных способов, известных квалифицированному специалисту в данной области. Конъюгация в результате приводит к уменьшению количества лизиновых остатков, восстановленных по сравнению с исходным материалом белка CRM₁₉₇, использованным для образования материалов конъюгата. В предпочтительном варианте осуществления, степень конъюгации гликоконъюгата серотипа 22F согласно изобретению составляет от 2 до 15, от 2 до 13, от 2 до 10, от 2 до 8, от 2 до 6, от 2 до 5, от 2 до 4, от 3 до 15, от 3 до 13, от 3 до 10, от 3 до 8, от 3 до 6, от 3 до 5, от 3 до 4, от 5 до 15, от 5 до 10, от 8 до 15, от 8 до 12, от 10 до 15 или от 10 до 12. В одном варианте осуществления, степень конъюгации гликоконъюгата серотипа 22F согласно изобретению составляет приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4, приблизительно 5, приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11, приблизительно 12, приблизительно 13, приблизительно 14 или приблизительно 15. В предпочтительном варианте осуществления, степень конъюгации гликоконъюгата серотипа 22F согласно изобретению составляет от 4 до 7. В некоторых таких вариантах осуществления, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇.

Гликоконъюгаты серотипа 22F согласно изобретению также могут быть охарактеризованы соотношением (масса/масса) сахарида к белку-носителю. В некоторых вариантах осуществления, соотношение полисахарида серотипа 22F к белку-носителю в гликоконъюгате (масс./масс.) составляет от 0,5 до 3,0 (например, приблизительно 0,5, приблизительно 0,6, приблизительно 0,7, приблизительно 0,8, приблизительно 0,9, приблизительно 1,0, приблизительно 1,1, приблизительно 1,2, приблизительно 1,3, приблизительно 1,4, приблизительно 1,5, приблизительно 1,6, приблизительно 1,7, приблизительно 1,8, приблизительно 1,9, приблизительно 2,0, приблизительно 2,1, приблизительно 2,2, приблизительно 2,3, приблизительно 2,4, приблизительно 2,5, приблизительно 2,6, приблизительно 2,7, приблизительно 2,8, приблизительно 2,9, или приблизительно 3,0). В других вариантах осуществления, соотношение сахарида к белку-носителю (масс./масс.) составляет от 0,5 до 2,0, от 0,5 до 1,5, от 0,8 до 1,2, от 0,5 до 1,0, от 1,0 до 1,5 или от 1,0 до 2,0. В следующих вариантах осуществления, соотношение сахарида к белку-носителю (масс./масс.) составляет от 0,8 до 1,2. В предпочтительном варианте осуществления, соотношение капсульного полисахарида серотипа 22F к белку-носителю в конъюгате составляет от 0,9 до 1,1. В некоторых таких вариантах осуществления, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇.

Гликоконъюгаты серотипа 22F и иммуногенная композиция согласно изобретению могут содержать свободный сахарид, который не является ковалентно конъюгированным с белком-носителем, но, тем не менее, присутствует в гликоконъюгатной композиции. Свободный сахарид может быть нековалентно ассоциированным с (то есть, нековалентно связанным с, адсорбированным на, или заключенным в или с) гликоконъюгатом.

В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат серотипа 22F содержит меньше, чем приблизительно 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20% или 15% свободного полисахарида серотипа 22F по сравнению с общим количеством полисахарида серотипа 22F. В предпочтительном варианте осуществления гликоконъюгат серотипа 22F содержит меньше, чем приблизительно 40% свободного полисахарида серотипа 22F по сравнению с общим количеством полисахарида серотипа 22F. В предпочтительном варианте осуществления гликоконъюгат серотипа 22F содержит меньше, чем приблизительно 25% свободного полисахарида серотипа 22F по сравнению с общим количеством полисахарида серотипа 22F. В предпочтительном варианте осуществления гликоконъюгат серотипа 22F содержит меньше, чем приблизительно 20% свободного полисахарида серотипа 22F по сравнению с общим количеством полисахарида серотипа 22F. В предпочтительном варианте осуществления гликоконъюгат серотипа 22F содержит меньше, чем приблизительно 15% свободного полисахарида серотипа 22F по сравнению с общим количеством полисахарида серотипа 22F.

Гликоконъюгаты серотипа 22F также могут быть охарактеризованы распределением по их молекулярным размерам (K_d). Гель-проникающей хроматография сред (CL-4B) может быть использована для определения распределения по относительным молекулярным размерам конъюгата. Гель-проникающую хроматографию (SEC) используют в колонках с подачей самотеком к профилю распределения по молекулярным размерам конъюгатов. Большие молекулы, исключенные из пор в средах, элюируют более быстро, чем малые молекулы. Сборники для фракций используются для сбора элюата колонки. Фракции исследуют колориметрически, используя сахаридный анализ. Для определения K_d, колонки калибруют, чтобы установить фракцию, в которой молекулы полностью исключены (V₀), (K_d=0), и фракцию, которая представляет собой максимальное удерживание (V_i), (K_d=1). Фракция, в которой достигается указанная характеристика образца (V_e), связана с K_d выражением, K_d=(V_e-V₀)/(V_i-V₀).

В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере, 30% гликоконъюгата серотипа 22F имеет K_d меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере, 40% гликоконъюгата имеет K_d меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, или 85% гликоконъюгата серотипа 22F имеет K_d меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере, 60% гликоконъюгата серотипа 22F имеет K_d меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, от 50% до 80% гликоконъюгата серотипа 22F имеет K_d меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, от 65% до 80% гликоконъюгата серотипа 22F имеет K_d меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B.

1.3.3. Гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипа 33F

В одном варианте осуществления, гликоконъюгаты серотипа 33F получают посредством активирования полисахарида тетрафторборатом 1-циано-4-диметиламино пиридиния (CDAP) с образованием цианатного сложного эфира. Активированный полисахарид может быть присоединен непосредственно или через спейсерную (линкерную) группу к аминогруппе на белке-носителе. Например, спейсер может представлять собой цистамин или цистеамин, дающий тиолированный полисахарид, который может быть соединен с носителем посредством тиоэфирной связи, полученной после реакции с активированным малеимидом белком-носителем (например, с использованием GMBS) или галогенацетилированным белком-носителем (например, с использованием йодацетамида, SIB, SIAB, сульфо-SIAB, SIA, или SBAP). Предпочтительно, цианатный сложный эфир (необязательно полученный с использованием CDAP химии) соединен с гександиамином или гидразидом адипиновой кислоты (ADH), и амино-дериватизированный сахарид конъюгируют с белком-носителем с использованием карбодиимидной (например, EDAC или EDC) химии через карбоксильную группу на белковом носителе. Такие конъюгаты описаны, например, в WO 93/15760, WO 95/08348 и WO 96/129094.

Другие приемлемые способы используют карбодиимиды, гидразиды, активные сложные эфиры, норборан, п-нитробензойную кислота, N-гидроксисукцинимид, S-NHS, EDC, TSTU. Многие из них описаны в публикации международной заявки на патент № WO 98/42721. Конъюгация может включать карбонильный линкер, который может образовываться в результате реакции свободной гидроксильной группы сахарида с CDI (смотри, Bethell et al. (1979) J. Biol. Chern. 254: 2572-2574; Hearn et al. (1981) J. Chromatogr. 218: 509-518), с последующей реакцией с белком с образованием карбаматной связи. Это может включать восстановление аномерного конца до первичной гидроксильной группы, необязательное введение защиты/снятие защиты первичной гидроксильной группы, взаимодействие первичной гидроксильной группы с CDI с образованием CDI карбаматного промежуточного соединения и взаимодействие CDI карбаматного промежуточного соединения с аминогруппой на белке.

В определенных вариантах осуществления, гликоконъюгаты серотипа 33F согласно изобретению получают с использованием восстановительного аминирования. В таком варианте осуществления, гликоконъюгаты серотипа 33F согласно изобретению могут быть получены с использованием восстановительного аминирования в водной фазе (RAG/вода). Восстановительное аминирование в водной фазе успешно использовали для того, чтобы получить пневмококковую конъюгатную вакцину (смотрите, например, WO 2006/110381). Предпочтительно не смотря на то, что при использовании восстановительного аминирования, гликоконъюгаты серотипа 33F получают посредством восстановительного аминирования в ДМСО (RAC/ДМСО). Принимая во внимание проблемы, связанные с сохранением O-ацетильных функциональных групп при использовании процесса в RAC/воде, восстановительное аминирование в ДМСО является предпчтительным. RAC/ДМСО успешно использовали для того, чтобы получить пневмококковую конъюгатную вакцину (смотрите, например, WO 2006/110381).

В предпочтительных вариантах осуществления, гликоконъюгаты серотипа 33F согласно изобретению получают с использованием еТЕС конъюгация (далее в данном документе "еТЕС связанные гликоконъюгаты серотипа 33F"), такой как описанная в примерах 1, 2 и 3 и в WO 2014/027302. Указанные гликоконъюгаты 33F содержат сахарид, ковалентно конъюгированный с белком-носителем с помощью одного или больше еТЕС спейсеров, где сахарид является ковалентно конъюгированным с еТЕС спейсером посредством карбаматной связи, и где белок-носитель является ковалентно конъюгированным с еТЕС спейсер посредством амидной связи. еТЕС связанные гликоконъюгаты согласно изобретению могут быть представлены общей формулой (III):

где атомы, которые содержат еТЕС спейсер, содержатся в центральном блоке. еТЕС спейсер включает семь линейных атомов (то есть, -C(O)NH(CH₂)₂SCH₂C(O)-) и предусматривает стабильные тиоэфирные и амидные связи между сахаридом и белком-носителем.

Синтез еТЕС связанного гликоконъюгата включает взаимодействие активированной гидроксильной группы сахарида с аминогруппой тиоалкиламинного реагента, например, цистамина или цистеинамина, или их соли, образуя карбаматную связь с сахаридом, обеспечивая тиолированный сахарид. Образование одной или больше свободных сульфгидрильных групп осуществляется в результате реакции с восстанавливающим агентом, обеспечивая активированный тиолированный сахарид. Реакция свободных сульфгидрильных групп активированного тиолированного сахарида с активированным белком-носителем, имеющим одну или больше α-галогенацетамидных групп на амине, содержащем остатки, формирует тиоэфирную связь с образованием конъюгата, где белок-носитель присоединен к еТЕС спейсеру посредством амидной связи.

В гликоконъюгатах серотипа 33F согласно изобретению, сахарид может представлять собой полисахарид или олигосахарид. Белок-носитель может быть выбран из какого-либо приемлемого носителя, как описано в данном документе, или, известных квалифицированному специалисту в данной области. В многочисленных вариантах осуществления, сахарид представляет собой полисахарид. В некоторых таких вариантах осуществления, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇. В некоторых таких вариантах осуществления, еТЕС связанный гликоконъюгат содержит капсульный полисахарид S. Pneumoniae серотипа 33F.

В особенно предпочтительных вариантах осуществления, еТЕС связанный гликоконъюгат содержит Pn-33F капсульный полисахарид, который является ковалентно конъюгированным с CRM₁₉₇ через еТЕС спейсер (еТЕС связанные гликоконъюгаты серотипа 33F).

В некоторых вариантах осуществления, гликоконъюгаты серотипа 33F согласно представленному изобретению содержат сахарид, имеющий молекулярную массу от 10 кДа до 2000 кДа. В других таких вариантах осуществления, сахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 2000 кДа. В следующих таких вариантах осуществления, сахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 1750 кДа; от 50 кДа до 1500 кДа; от 50 кДа до 1250 кДа; от 50 кДа до 1000 кДа; от 50 кДа до 750 кДа; от 50 кДа до 500 кДа; от 100 кДа до 2000 кДа; от 100 кДа до 1750 кДа; от 100 кДа до 1500 кДа; от 100 кДа до 1250 кДа; от 100 кДа до 1000 кДа; от 100 кДа до 750 кДа; от 100 кДа до 500 кДа; от 200 кДа до 2000 кДа; от 200 кДа до 1750 кДа; от 200 кДа до 1500 кДа; от 200 кДа до 1250 кДа; от 200 кДа до 1000 кДа; от 200 кДа до 750 кДа; или от 200 кДа до 500 кДа. Какое-либо целое число целого числа в пределах какого-либо из диапазонов, указанных выше, предполагается в качестве варианта осуществления изобретения.

В некоторых вариантах осуществления, гликоконъюгат серотипа 33F согласно изобретению имеет молекулярную массу от 50 кДа до 20000 кДа. В других вариантах осуществления, гликоконъюгат серотипа 33F имеет молекулярную массу от 500 кДа до 10000 кДа. В других вариантах осуществления, гликоконъюгат серотипа 33F имеет молекулярную массу от 200 кДа до 10000 кДа. В еще других вариантах осуществления, гликоконъюгат серотипа 33F имеет молекулярную массу от 1000 кДа до 3000 кДа.

В следующих вариантах осуществления, гликоконъюгат серотипа 33F согласно изобретению имеет молекулярную массу от 200 кДа до 20000 кДа; от 200 кДа до 15000 кДа; от 200 кДа до 10000 кДа; от 200 кДа до 7500 кДа; от 200 кДа до 5000 кДа; от 200 кДа до 3000 кДа; от 200 кДа до 1000 кДа; от 500 кДа до 20000 кДа; от 500 кДа до 15000 кДа; от 500 кДа до 12500 кДа; от 500 кДа до 10000 кДа; от 500 кДа до 7500 кДа; от 500 кДа до 6000 кДа; от 500 кДа до 5000 кДа; от 500 кДа до 4000 кДа; от 500 кДа до 3000 кДа; от 500 кДа до 2000 кДа; от 500 кДа до 1500 кДа; от 500 кДа до 1000 кДа; от 750 кДа до 20000 кДа; от 750 кДа до 15000 кДа; от 750 кДа до 12500 кДа; от 750 кДа до 10000 кДа; от 750 кДа до 7500 кДа; от 750 кДа до 6000 кДа; от 750 кДа до 5000 кДа; от 750 кДа до 4000 кДа; от 750 кДа до 3000 кДа; от 750 кДа до 2000 кДа; от 750 кДа до 1500 кДа; от 1000 кДа до 15000 кДа; от 1000 кДа до 12500 кДа; от 1000 кДа до 10000 кДа; от 1000 кДа до 7500 кДа; от 1000 кДа до 6000 кДа; от 1000 кДа до 5000 кДа; от 1000 кДа до 4000 кДа; от 1000 кДа до 2500 кДа; от 2000 кДа до 15000 кДа; от 2000 кДа до 12500 кДа; от 2000 кДа до 10000 кДа; от 2000 кДа до 7500 кДа; от 2000 кДа до 6000 кДа; от 2000 кДа до 5000 кДа; от 2000 кДа до 4000 кДа; от 2000 кДа до 3000 кДа; от 3000 кДа до 20000 кДа; от 3000 кДа до 15000 кДа; от 3000 кДа до 12500 кДа; от 3000 кДа до 10000 кДа; от 3000 кДа до 9000 кДа; от 3000 кДа до 8000 кДа; от 3000 кДа до 7000 кДа; от 3000 кДа до 6000 кДа; от 3000 кДа до 5000 кДа или от 3000 кДа до 4000 кДа. Какое-либо целое число целого числа в пределах какого-либо из диапазонов, указанных выше, предполагается в качестве варианта осуществления изобретения.

Другой способ охарактеризовать гликоконъюгаты серотипа 33F согласно изобретению представляет собой количество лизиновых остатков в белке-носителе (например, CRM₁₉₇), которые становятся конъюгированными с сахаридом, которое может быть охарактеризован, как диапазон конъюгированных лизинов (степень конъюгации).

В предпочтительном варианте осуществления, степень конъюгации гликоконъюгата серотипа 33F согласно изобретению составляет от 2 до 20, от 4 до 16, от 2 до 15, от 2 до 13, от 2 до 10, от 2 до 8, от 2 до 6, от 2 до 5, от 2 до 4, от 3 до 15, от 3 до 13, от 3 до 10, от 3 до 8, от 3 до 6, от 3 до 5, от 3 до 4, от 5 до 15, от 5 до 10, от 8 до 15, от 8 до 12, от 10 до 15 или от 10 до 12. В одном варианте осуществления, степень конъюгации гликоконъюгата серотипа 33F согласно изобретению составляет приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4, приблизительно 5, приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11, приблизительно 12, приблизительно 13, приблизительно 14, приблизительно 15, приблизительно 16, приблизительно 17, приблизительно 18, приблизительно 19 или приблизительно 20. В предпочтительном варианте осуществления, степень конъюгации гликоконъюгата серотипа 33F согласно изобретению составляет от 4 до 16. В некоторых таких вариантах осуществления, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇.

В предпочтительном варианте осуществления, белок-носитель содержит CRM₁₉₇, который содержит 39 лизиновых остатков. В некоторых таких вариантах осуществления, CRM₁₉₇ может содержать от 4 до 16 лизиновых остатков из 39 ковалентно связанных с сахаридом. Другой способ выразить данный параметр состоит в том, что от приблизительно 10% до приблизительно 41% лизинов CRM-197 ковалентно связаны с сахаридом. В другом таком варианте осуществления, CRM₁₉₇ может содержать от 2 до 20 лизиновых остатков из 39 ковалентно связанных с сахаридом. Другой способ выразить данный параметр состоит в том, что от приблизительно 5% до приблизительно 50% лизинов CRM₁₉₇ ковалентно связаны с сахаридом. В некоторых вариантах осуществления, CRM₁₉₇ может содержать приблизительно 4, приблизительно 5, приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11, приблизительно 12, приблизительно 13, приблизительно 14, приблизительно 15, или приблизительно 16 лизиновых остатков из 39 ковалентно связанных с сахаридом.

В многочисленных вариантах осуществления, белок-носитель является ковалентно конъюгированным с еТЕС спейсером посредством амидной связи с одной или больше ε-аминогруппами лизиновых остатков на белке-носителе. В некоторых таких вариантах осуществления, белок-носитель содержит от 2 до 20 лизиновых остатков, ковалентно конъюгированных с сахаридом. В других таких вариантах осуществления, белок-носитель содержит от 4 до 16 лизиновых остатков, ковалентно конъюгированных с сахаридом.

Гликоконъюгаты серотипа 33F согласно изобретению также могут быть охарактеризованы соотношением (масса/масса) сахарида к белку-носителю. В некоторых вариантах осуществления, соотношение сахарида к белку-носителю (масс./масс.) составляет от 0,2 до 4,0 (например, приблизительно 0,2, приблизительно 0,3, приблизительно 0,4, приблизительно 0,5, приблизительно 0,6, приблизительно 0,7, приблизительно 0,8, приблизительно 0,9, приблизительно 1,0, приблизительно 1,1, приблизительно 1,2, приблизительно 1,3, приблизительно 1,4, приблизительно 1,5, приблизительно 1,6, приблизительно 1,7, приблизительно 1,8, приблизительно 1,9, приблизительно 2,0, приблизительно 2,1, приблизительно 2,2, приблизительно 2,3, приблизительно 2,4, приблизительно 2,5, приблизительно 2,6, приблизительно 2,7, приблизительно 2,8, приблизительно 2,9, приблизительно 3,0, приблизительно 3,1, приблизительно 3,2, приблизительно 3,3, приблизительно 3,4, приблизительно 3,5, приблизительно 3,6, приблизительно 3,7, приблизительно 3,8, приблизительно 3,9 или приблизительно 4,0). В других вариантах осуществления, соотношение сахарида к белку-носителю (масс./масс.) составляет от 1,0 до 2,5. В следующих вариантах осуществления, соотношение сахарида к белку-носителю (масс./масс.) составляет от 0,4 до 1,7. В некоторых таких вариантах осуществления, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇.

Частота присоединений сахаридной цепи к лизину на белке-носителе представляет собой еще один параметр для охарактеризования гликоконъюгатов серотипа 33F согласно изобретению. Например, в некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере, одна ковалентная связь между белком-носителем и полисахаридом осуществляется на каждые 4 сахаридные повторяющиеся единицы полисахарида. В другом варианте осуществления, ковалентная связь между белком-носителем и полисахаридом осуществляется, по меньшей мере, один раз на каждые 10 сахаридных повторяющихся единиц полисахарида. В другом варианте осуществления, ковалентная связь между белком-носителем и полисахаридом осуществляется, по меньшей мере, один раз на каждые 15 сахаридных повторяющихся единиц полисахарида. В следующем варианте осуществления, ковалентная связь между белком-носителем и полисахаридом осуществляется, по меньшей мере, один раз на каждые 25 сахаридных повторяющихся единиц полисахарида.

В многочисленных вариантах осуществления, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇, и ковалентная связь через еТЕС спейсер между CRM₁₉₇ и полисахаридом осуществляется, по меньшей мере, один раз на каждые 4, 10, 15 или 25 сахаридных повторяющихся единиц полисахарида.

В других вариантах осуществления, конъюгат содержит, по меньшей мере, одну ковалентную связь между белком-носителем и сахаридом на каждые от 5 до 10 сахаридных повторяющихся единиц; на каждые от 2 до 7 сахаридных повторяющихся единиц; на каждые от 3 до 8 сахаридных повторяющихся единиц; на каждые от 4 до 9 сахаридных повторяющихся единиц; на каждые от 6 до 11 сахаридных повторяющихся единиц; на каждые от 7 до 12 сахаридных повторяющихся единиц; на каждые от 8 до 13 сахаридных повторяющихся единиц; на каждые от 9 до 14 сахаридных повторяющихся единиц; на каждые от 10 до 15 сахаридных повторяющихся единиц; на каждые от 2 до 6 сахаридных повторяющихся единиц, на каждые от 3 до 7 сахаридных повторяющихся единиц; на каждые от 4 до 8 сахаридных повторяющихся единиц; на каждые от 6 до 10 сахаридных повторяющихся единиц; на каждые от 7 до 11 сахаридных повторяющихся единиц; на каждые от 8 до 12 сахаридных повторяющихся единиц; на каждые от 9 до 13 сахаридных повторяющихся единиц; на каждые от 10 до 14 сахаридных повторяющихся единиц; на каждые от 10 до 20 сахаридных повторяющихся единиц; на каждые от 4 до 25 сахаридных повторяющихся единиц или на каждые от 2 до 25 сахаридных повторяющихся единиц. В многочисленных вариантах осуществления, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇.

В другом варианте осуществления, по меньшей мере, одна связь между белком-носителем и сахаридом осуществляется на каждые 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 сахаридных повторяющихся единиц полисахарида. В одном варианте осуществления, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇. Какое-либо целое число целого числа в пределах какого-либо из диапазонов, указанных выше, предполагается в качестве варианта осуществления изобретения.

Важным фактором в процессе конъюгации является разработка условий, позволяющих удерживание потенциально малоустойчивых несахаридных заместительных функциональных групп отдельных компонентов, таких как O-ацильные, фосфатные или глицеринфосфатные боковые цепи, которые могут образовывать часть сахаридных эпитопов.

В одном варианте осуществления, гликоконъюгаты серотипа 33F согласно изобретению содержат сахарид, который имеет степень О-ацетилирования от 10% до 100%. В некоторых таких вариантах осуществления, сахарид имеет степень О-ацетилирования от 50% до 100%. В других таких вариантах осуществления, сахарид имеет степень О-ацетилирования от 75% до 100%. В следующих вариантах осуществления, сахарид имеет степень О-ацетилирования больше, чем или равную 70% (≥70%).

В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат серотипа 33F согласно изобретению содержит, по меньшей мере, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 или 0,8 мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 33F. В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат содержит, по меньшей мере, 0,5, 0,6 или 0,7 мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 33F. В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат содержит, по меньшей мере, 0,6 мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 33F. В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат содержит, по меньшей мере, 0,7 мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 33F. В предпочтительном варианте осуществления, присутствие O-ацетильных групп определяют, используя ионно-ВЭЖХ анализ.

В предпочтительном варианте осуществления, соотношение мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 33F в гликоконъюгате к мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 33F в выделенном полисахариде составляет, по меньшей мере, 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, или 0,95. В предпочтительном варианте осуществления, соотношение мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 33F в гликоконъюгате к мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 33F в выделенном полисахариде составляет, по меньшей мере, 0,7. В предпочтительном варианте осуществления, соотношение мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 33F в гликоконъюгате к мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 33F в выделенном полисахариде составляет, по меньшей мере, 0,9.

В предпочтительном варианте осуществления, соотношение мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 33F в гликоконъюгате к мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 33F в активированном полисахариде составляет, по меньшей мере, 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, или 0,95. В предпочтительном варианте осуществления, соотношение мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 33F в гликоконъюгате к мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 33F в активированном полисахариде составляет, по меньшей мере, 0,7. В предпочтительном варианте осуществления, соотношение мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 33F в гликоконъюгате к мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 33F в активированном полисахариде составляет, по меньшей мере, 0,9. Гликоконъюгаты серотипа 33F и иммуногенная композиция согласно изобретению могут содержать свободный сахарид, который не является ковалентно конъюгированным с белком-носителем, но тем не менее, присутствует в гликоконъюгатной композиции. Свободный сахарид может быть нековалентно ассоциированным с (то есть, нековалентно связанным с, адсорбированным на, или заключенным в или с) гликоконъюгатом.

В некоторых вариантах осуществления, гликоконъюгаты серотипа 33F согласно изобретению содержат меньше, чем приблизительно 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% или 5% свободного полисахарида серотипа 33F по сравнению с общим количеством полисахарида серотипа 33F. Предпочтительно, гликоконъюгат серотипа 33F содержит меньше, чем 15% Свободный сахарид, более предпочтительно меньше, чем 10% Свободный сахарид, и еще более предпочтительно, меньше, чем 5% Свободный сахарид. В предпочтительном варианте осуществления гликоконъюгат серотипа 33F содержит меньше, чем приблизительно 25% свободного полисахарида серотипа 33F по сравнению с общим количеством полисахарида серотипа 33F. В предпочтительном варианте осуществления гликоконъюгат серотипа 33F содержит меньше, чем приблизительно 20% свободного полисахарида серотипа 33F по сравнению с общим количеством полисахарида серотипа 33F. В предпочтительном варианте осуществления гликоконъюгат серотипа 33F содержит меньше, чем приблизительно 15% свободного полисахарида серотипа 33F по сравнению с общим количеством полисахарида серотипа 33F.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, изобретение предусматривает гликоконъюгат серотипа 33F, имеющий одну или больше из следующих особенностей самостоятельно или в комбинации: полисахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 2000 кДа; гликоконъюгат имеет молекулярную массу от 500 кДа до 10000 кДа; белок-носитель содержит от 2 до 20 лизиновых остатков, ковалентно связанных с сахаридом; соотношение сахарида к белку-носителю (масс./масс.) составляет от 0,2 до 4,0; гликоконъюгат содержит, по меньшей мере, ковалентную связь между белком-носителем и полисахаридом на каждые 4, 10, 15 или 25 сахаридных повторяющихся единицы полисахарида; сахарид имеет степень О-ацетилирования от 75% до 100%; конъюгат содержит меньше, чем приблизительно 15% свободного полисахарида по отношению к общему полисахариду; белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇.

Гликоконъюгаты серотипа 33F также могут быть охарактеризованы распределением по их молекулярным размерам (K_d). Гель-проникающая хроматография сред (CL-4B) может быть использована для определения распределения по относительным молекулярным размерам конъюгата, как указано выше.

В одном варианте осуществления, по меньшей мере 15% гликоконъюгатов серотипа 33F согласно изобретению имеют K_d меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В одном варианте осуществления, по меньшей мере, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% гликоконъюгатов серотипа 33F согласно изобретению имеют K_d меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B.

В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере, 35% гликоконъюгатов серотипа 33F согласно изобретению имеют K_d меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительных вариантах осуществления, по меньшей мере, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, или 85% гликоконъюгатов серотипа 33F согласно изобретению имеют K_d меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере, 60% гликоконъюгатов серотипа 33F согласно изобретению имеют K_d меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере, 70% гликоконъюгатов серотипа 33F согласно изобретению имеют K_d меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B.

В предпочтительном варианте осуществления, от 40% до 90% гликоконъюгатов серотипа 33F имеют K_d меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, от 50% до 90% гликоконъюгатов серотипа 33F имеют K_d меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, от 65% до 80% гликоконъюгатов серотипа 33F имеют K_d меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B.

1.3.4. Гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипа 15В

В одном варианте осуществления, гликоконъюгаты серотипа 15В получают посредством активирования полисахарида тетрафторборатом 1-циано-4-диметиламино пиридиния (CDAP) с образованием цианатного сложного эфира. Активированный полисахарид может быть присоединен непосредственно или через спейсерную (линкерную) группу к аминогруппе на белке-носителе. Например, спейсер может представлять собой цистамин или цистеамин, давая тиолированный полисахарид, который может быть присоединен к носителю посредством тиоэфирной связи, полученной после реакции с активированным малеимидом белком-носителем (например, с использованием GMBS) или галогенацетилированным белком-носителем (например, с использованием йодацетамида, SIB, SIAB, сульфо-SIAB, SIA, или SBAP). Предпочтительно, цианатный сложный эфир (необязательно полученный с использованием CDAP химии) соединен с гександиамином или гидразидом адипиновой кислоты (ADH), и амино-дериватизированный сахарид конъюгируют с белком-носителем с использованием карбодиимидной (например, EDAC или EDC) химии через карбоксильную группу на белковом носителе. Такие конъюгаты описаны, например, в WO 93/15760, WO 95/08348 и WO 96/129094.

Другие приемлемые способы используют карбодиимиды, гидразиды, активные сложные эфиры, норборан, п-нитробензойную кислоту, N-гидроксисукцинимид, S-NHS, EDC, TSTU. Многие из них описаны в публикации международной заявки на патент №WO 98/42721. Конъюгация может включать карбонильный линкер, который может образовываться в результате реакции свободной гидроксильной группы сахарида с CDI (смотри, Bethell et al. (1979) J. Biol. Chern. 254: 2572-2574; Hearn et al. (1981) J. Chromatogr, 218: 509-518), с последующей реакцией с белком с образованием карбаматной связи. Это может включать восстановление аномерного конца до первичной гидроксильной группы, необязательное введение защиты/снятие защиты первичной гидроксильной группы, взаимодействие первичной гидроксильной группы с CDI с образованием CDI карбаматного промежуточного соединения и взаимодействие CDI карбаматного промежуточного соединения с аминогруппой на белке.

В предпочтительных вариантах осуществления, гликоконъюгаты серотипа 15В согласно изобретению получают с использованием восстановительного аминирования. Восстановительное аминирование включает две стадии, (1) окисление полисахарида с образованием альдегидных функциональных групп из вицинальных диолов в индивидуальной гексасахаридной единице, (2) восстановление активированного полисахарида и белка-носителя с образованием конъюгата.

Предпочтительно, перед окислением осуществляют сортировку по размерам полисахарида серотипа 15В в диапазоне целевой молекулярной массы (М.М.). Преимущественно, размер очищенного полисахарида серотипа 15В уменьшается, при этом сохраняя критические особенности структуры полисахарида, такие как, например, присутствие O-ацетильных групп. Предпочтительно, размер очищенного полисахарида серотипа 15В уменьшается, при использовании механической гомогенизации (смотри, раздел 1, 2, 6 выше).

Стадия окисления может включать реакцию с перйодатом. Для целей представленного изобретения, термин "перйодат" включает как перйодат, так и перйодную кислота; термин также включает как метаперйодат (IO₄^-), так и ортоперйодат (IO₆^5-) и различные соли перйодата (например, натрия перйодат и калия перйодат). В предпочтительном варианте осуществления перйодат, использованный для окисления капсульного полисахарида серотипа 15В, представляет собой метаперйодат. В предпочтительном варианте осуществления перйодат, использованный для окисления капсульного полисахарида серотипа 15В, представляет собой натрия метаперйодат.

В предпочтительном варианте осуществления, полисахарид подвергается взаимодействию с от 0,01 до 10,0, от 0,05 до 5,0, от 0,1 до 1,0, от 0,5 до 1,0, от 0,7 до 0,8, от 0,05 до 0,5, от 0,1 до 0,3 молярными эквивалентами окислительного агента. В предпочтительном варианте осуществления, полисахарид подвергается взаимодействию с приблизительно 0,1, 0,15, 0,2, 0,25, 0,3, 0,35, 0,4,0,45, 0,5, 0,55, 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, 0,95 молярными эквивалентами окислительного агента. В предпочтительном варианте осуществления, полисахарид подвергается взаимодействию с приблизительно 0,15 молярными эквивалентами окислительного агента. В предпочтительном варианте осуществления, полисахарид подвергается взаимодействию с приблизительно 0,25 молярными эквивалентами окислительного агента. В предпочтительном варианте осуществления, полисахарид подвергается взаимодействию с приблизительно 0,5 молярными эквивалентами окислительного агента. В предпочтительном варианте осуществления, полисахарид подвергается взаимодействию с приблизительно 0,6 молярными эквивалентами окислительного агента. В предпочтительном варианте осуществления, полисахарид подвергается взаимодействию с приблизительно 0,7 молярными эквивалентами окислительного агента.

В предпочтительном варианте осуществления, продолжительность реакции составляет от 1 часа до 50 часов, от 10 часов до 30 часов, от 15 часов до 20 часов, от 15 часов и до 17 часов или около 16 часов.

В предпочтительном варианте осуществления, температура реакции поддерживается в интервале от 15°C до 45°C, от 15°C до 30°C, от 20°C до 25°C. В предпочтительном варианте осуществления, температура реакции поддерживается на уровне приблизительно 23°C.

В предпочтительном варианте осуществления, окислительную реакцию проводят в буфере, выбранном из натрия фосфата, калия фосфата, 2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты (MES) или Bis-Tris. В предпочтительном варианте осуществления, буфер представляет собой калия фосфат.

В предпочтительном варианте осуществления, буфер имеет концентрацию от 1 мМ до 500 мМ, от 1 мМ до 300 мМ, или от 50 мМ до 200 мМ. В предпочтительном варианте осуществления буфер имеет концентрацию приблизительно 100 мМ.

В предпочтительном варианте осуществления, окислительную реакцию проводят при pH от 4,0 до 8,0, от 5,0 до 7,0, или от 5,5 до 6,5. В предпочтительном варианте осуществления, рН составляет приблизительно 6,0.

В предпочтительном варианте осуществления, активированный капсульный полисахарид серотипа 15В получают за счет взаимодействия 0,5 мг/мл до 5 мг/мл выделенного капсульного полисахарида серотипа 15В с от 0,2 до 0,3 молярными эквивалентами перйодата при температуре от 20°C до 25°C.

В предпочтительном варианте осуществления, активированный капсульный полисахарид серотипа 15В чистят. Активированный капсульный полисахарид серотипа 15В чистят в соответствии со способами, известными квалифицированному специалисту в данной области, такими как гель-проникающая хроматография (GPC), диализ или ультрафильтрация/диафильтрация. Например, активированный капсульный полисахарид чистят путем концентрирования и диафильтрации с использованием устройства для ультрафильтрации.

В предпочтительном варианте осуществления, степень окисления активированного капсульного полисахарида серотипа 15В составляет от 2 до 20, от 2 до 15, от 2 до 10, от 2 до 5, от 5 до 20, от 5 до 15, от 5 до 10, от 10 до 20, от 10 до 15, или от 15 до 20. В предпочтительном варианте осуществления степень окисления активированного капсульного полисахарида серотипа 15В составляет от 2 до 10, от 4 до 8, от 4 до 6, от 6 до 8, от 6 до 12, от 8 до 12, от 9 до 11, от 10 до 16, от 12 до 16, от 14 до 18, от 16 до 20, от 16 до 18, или от 18 до 20.

В предпочтительном варианте осуществления, активированный капсульный полисахарид серотипа 15В имеет молекулярную массу от 5 кДа до 500 кДа, от 50 кДа до 500 кДа, от 50 кДа до 450 кДа, от 100 кДа до 400 кДа, от 100 кДа до 350 кДа. В предпочтительном варианте осуществления, активированный капсульный полисахарид серотипа 15В имеет молекулярную массу от 100 кДа до 350 кДа. В предпочтительном варианте осуществления, активированный капсульный полисахарид серотипа 15В имеет молекулярную массу от 100 кДа до 300 кДа. В предпочтительном варианте осуществления, активированный капсульный полисахарид серотипа 15В имеет молекулярную массу от 100 кДа до 250 кДа.

В предпочтительном варианте осуществления, активированный капсульный полисахарид серотипа 15В содержит, по меньшей мере, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 или 0,8 мМ ацетата на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном варианте осуществления, активированный капсульный полисахарид серотипа 15В содержит, по меньшей мере, 0,5, 0,6 или 0,7 мМ ацетата на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном варианте осуществления, активированный капсульный полисахарид серотипа 15В содержит, по меньшей мере, 0,6 мМ ацетата на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном варианте осуществления, активированный капсульный полисахарид серотипа 15В содержит, по меньшей мере, 0,7 мМ ацетата на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В.

В предпочтительном варианте осуществления, активированный капсульный полисахарид серотипа 15В содержит, по меньшей мере, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 или 0,8 мМ глицерина на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном варианте осуществления, активированный капсульный полисахарид серотипа 15В содержит, по меньшей мере, 0,5, 0,6 или 0,7 мМ глицерина на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном варианте осуществления, активированный капсульный полисахарид серотипа 15В содержит, по меньшей мере, 0,6 мМ глицерина на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном варианте осуществления, активированный капсульный полисахарид серотипа 15В содержит, по меньшей мере, 0,7 мМ глицерина на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В.

В предпочтительном варианте осуществления, активированный капсульный полисахарид серотипа 15В имеет молекулярную массу от 100 кДа до 250 кДа и содержит, по меньшей мере, 0,6 мМ ацетата на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В.

В предпочтительном варианте осуществления, активированный капсульный полисахарид серотипа 15В имеет молекулярную массу от 100 кДа до 250 кДа и содержит, по меньшей мере, 0,6 мМ глицерина на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В.

В предпочтительном варианте осуществления, активированный капсульный полисахарид серотипа 15В содержит, по меньшей мере, 0,6 мМ ацетата на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В и, по меньшей мере, 0,6 мМ глицерина на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В.

В предпочтительном варианте осуществления, активированный капсульный полисахарид серотипа 15В имеет молекулярную массу от 100 кДа до 250 кДа и содержит, по меньшей мере, 0,6 мМ ацетата на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В и, по меньшей мере, 0,6 мМ глицерина на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В.

В одном варианте осуществления, активированный капсульный полисахарид серотипа 15В лиофилизируют, необязательно в присутствии сахарида. В предпочтительном варианте осуществления, сахарид выбирают из сахарозы, трегалозы, рафинозы, стахиозы, мелецитозы, декстрана, маннита, лактита и палатинита. В предпочтительном варианте осуществления, сахарид представляет собой сахарозу. Лиофилизированный активированный капсульный полисахарид затем может быть смешан с раствором, содержащим белок-носитель.

В другом варианте осуществления, активированный капсульный полисахарид серотипа 15В смешивают с белком-носителем и лиофилизируют необязательно в присутствии сахарида. В предпочтительном варианте осуществления, сахарид выбирают из сахарозы, трегалозы, рафинозы; стахиозы, мелецитозы, декстрана, маннита, лактита и палатинита. В предпочтительном варианте осуществления, сахарид представляет собой сахарозу. Совместно лиофилизированный полисахарид и белок-носитель затем могут повторно суспендировать в растворе, и подвергать взаимодействию с восстанавливающим агентом.

Активированный капсульный полисахарид серотипа 15В может быть конъюгированным с белком-носителем согласно способу, включающему стадию:

(a) смешивания активированного капсульного полисахарида серотипа 15В с белком-носителем, и

(b) взаимодействие компаундированного активированного капсульного полисахарида серотипа 15В и белка-носителя с восстанавливающим агентом с образованием конъюгата капсульный полисахарид белка серотипа 15В-носитель. Конъюгирование активированного капсульного полисахарида серотипа 15В с белковым носителем посредством восстановительного аминирования в диметилсульфоксиде (ДМСО) приемлемо для сохранения содержания О-ацетила полисахарида по сравнению с, например, восстановительным аминированием в водном растворе, где уровень О-ацетилирования полисахарида в значительной степени снижается. В предпочтительном варианте осуществления, стадию (а) и стадию (b) осуществляют в ДМСО.

В предпочтительном варианте осуществления, стадия (а) включает растворение лиофилизированного капсульного полисахарида серотипа 15В в растворе, содержащем белок-носитель и ДМСО. В предпочтительном варианте осуществления, стадия (а) включает растворение совместно лиофилизированного капсульного полисахарида серотипа 15В и белка-носителя в ДМСО.

Когда стадии (а) и (b) осуществляют в водном растворе, стадии (а) и (b) осуществляют в буфере, предпочтительно выбранном из PBS, MES, HEPES, Bis-tris, ADA, PIPES, MOPSO, BES, MOPS, DIPSO, MOBS, HEPPSO, POPSO, TEA, EPPS, Бицин или НЕРВ, при pH от 6,0 до 8,5, от 7,0 до 8,0 или от 7,0 до 7,5. В предпочтительном варианте осуществления буфер представляет собой PBS. В предпочтительном варианте осуществления рН составляет приблизительно 7,3.

В предпочтительном варианте осуществления, концентрация активированного капсульного полисахарида серотипа 15В на стадии (b) составляет от 0,1 мг/мл до 10 мг/мл, от 0,5 мг/мл до 5 мг/мл, или от 0,5 мг/мл до 2 мг/мл. В предпочтительном варианте осуществления, концентрация активированного капсульного полисахарида серотипа 15В на стадии (b) составляет приблизительно 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9 или 3,0 мг/мл.

В предпочтительном варианте осуществления начальное входное соотношение (масса по массе) активированного капсульного полисахарида серотипа 15В к белку-носителю составляет от 5:1 до 0,1:1, от 2:1 до 0,1:1, от 2:1 до 1:1, от 1,5:1 до 1:1, от 0,1:1 до 1:1, от 0,3:1 до 1:1, или от 0,6:1 до 1:1.

В предпочтительном варианте осуществления начальное входное соотношение активированного капсульного полисахарида серотипа 15В к белку-носителю составляет приблизительно от 0,6:1 до 1:1. В другом предпочтительном варианте осуществления начальное входное соотношение активированного капсульного полисахарида серотипа 15В к белку-носителю составляет приблизительно от 0,6:1 до 1,5:1. Такое начальное входное соотношение особенно приемлемо для получения низких уровней свободного полисахарида в гликоконъюгате.

В предпочтительном варианте осуществления начальное входное соотношение активированного капсульного полисахарида серотипа 15В к белку-носителю составляет приблизительно 0,4:1, 0,5:1, 0,6:1, 0,7:1, 0,8:1, 0,9:1, 1:1, 1,1:1, 1,2:1, 1,3:1, 1,4:1, 1,5:1, 1,6:1, 1,7:1, 1,8:1, 1,9:1 или 2:1.

В одном варианте осуществления, восстанавливающий агент представляет собой натрия цианоборгидрид, натрия триацетоксиборгидрид, натрия или цинка боргидрид в присутствии кислот Бренстеда или Льюиса, аминобораны, такие как пиридин-боран, 2-пиколин-боран, 2,6-диборан-метанол, диметиламин-боран, t-BuMeiPrN-ВН3, бензиламин-ВН₃ или 5-этил-2-метилпиридин боран (РЕМВ). В предпочтительном варианте осуществления, восстанавливающий агент представляет собой натрия цианоборгидрид. В предпочтительном варианте осуществления, восстанавливающий агент представляет собой натрия 2-пиколин-боран.

В предпочтительном варианте осуществления, количество восстанавливающего агента, использованного на стадии (b), составляет от приблизительно 0,1 до 10,0 молярных эквивалентов, от 0,5 до 5,0 молярных эквивалентов, или от 1,0 до 2,0 молярных эквивалентов. В предпочтительном варианте осуществления, количество восстанавливающего агента, использованного на стадии (b), составляет приблизительно 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9 или 2,0 молярных эквивалента.

В предпочтительном варианте осуществления, продолжительность стадии (b) составляет от 1 часа до 60 часов, от 10 часов до 50 часов, от 40 часов до 50 часов, или от 42 часов до 46 часов. В предпочтительном варианте осуществления, продолжительность стадии (b) составляет приблизительно 44 часа.

В предпочтительном варианте осуществления, температура реакции на стадии (b) поддерживается от 10°C до 40°C, от 15°C до 30°C или от 20°C до 26°C. В предпочтительном варианте осуществления, температура реакции на стадии (b) поддерживается на уровне приблизительно 23°C.

В предпочтительном варианте осуществления, способ получения гликоконъюгата, содержащего капсульный полисахарид S. pneumoniae серотипа 15В, ковалентно связанный с белком-носителем, дополнительно включает стадию (стадию (с)) блокирования непрореагировавшего альдегид (погашенного) посредством добавления NaBH₄.

В предпочтительном варианте осуществления, количество NaBH₄, использованного на стадии (с), составляет от 0,1 до 10 молярных эквивалентов, от 0,5 до 5,0 молярных эквивалентов или от 1,0 до 3,0 молярных эквивалентов. В предпочтительном варианте осуществления, количество NaBH₄, использованное на стадии (с), составляет приблизительно 2 молярных эквивалентов.

В предпочтительном варианте осуществления, продолжительность стадии (с) составляет от 0,1 часов до 10 часов, 0,5 часов до 5 часов, или от 2 часов до 4 часов. В предпочтительном варианте осуществления, продолжительность стадии (с) составляет приблизительно 3 часа.

В предпочтительном варианте осуществления, температура реакции на стадии (с) поддерживается от 15°C до 45°C, от 15°C до 30°C или от 20°C до 26°C. В предпочтительном варианте осуществления, температура реакции на стадии (с) поддерживается на уровне приблизительно 23°C.

В предпочтительном варианте осуществления выход на стадии конъюгирования составляет больше, чем 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% или 90%. В предпочтительном варианте осуществления выход на стадии конъюгирования (стадии b) составляет больше, чем 60%. В предпочтительном варианте осуществления выход на стадии конъюгирования (стадии b) составляет больше, чем 70%. Выход представляет собой количество полисахарида серотипа 15В в конъюгате × 100) / количество активированного полисахарида, использованного на стадии конъюгирования.

В предпочтительном варианте осуществления, способ получения гликоконъюгата, содержащего капсульный полисахарид S. pneumoniae серотипа 15В ковалентно связанный с белком-носителем, включает стадии:

(a) сортировки по размерам очищенного полисахарида серотипа 15В при гомогенизации под высоким давлением;

(b) взаимодействия размерного полисахарида серотипа 15В с окислительным агентом;

(c) смешивания активированного полисахарида серотипа 15В с белком-носителем;

(d) взаимодействие компаундированного активированного полисахарида серотипа 15В и белка-носителя с восстанавливающим агентом с образованием полисахаридного конъюгата белок серотипа 15В-носитель; и

(e) блокирование непрореагировавшего альдегида (гашения) посредством добавления NaBH₄.

В предпочтительном варианте осуществления выход на стадии конъюгирования (стадии d) указанного выше способа составляет больше, чем 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% или 90%. В предпочтительном варианте осуществления выход на стадии конъюгирования (стадии d) составляет больше, чем 60%. В предпочтительном варианте осуществления выход на стадии конъюгирования (стадии d) составляет больше, чем 70%. Выход представляет собой количество полисахарида серотипа 15В в конъюгате × 100) / количество активированного полисахарида, использованного на стадии конъюгирования.

После конъюгации капсульного полисахарида серотипа 15В с белком-носителем, конъюгат полисахарид-белок может быть очищен (обогащен по отношению к количеству конъюгата полисахарид-белок), используя различные способы, известные квалифицированному специалисту. Данные способы включают диализ, операции концентрирования/диафильтрации, фильтрование тангенциальным потоком, осаждение/элюирование, колоночную хроматографию (DEAE или хроматографию с гидрофобным взаимодействием), и глубинную фильтрацию.

В одном варианте осуществления белок-носитель является таким, как определено в разделе 1.1. В одном варианте осуществления белок-носитель выбирают из группы, состоящей из: DT (дифтерийный токсин), TT (столбнячный токсин), CRM₁₉₇, другие DT мутанты, PD (белка D гемофильной палочки), или их иммунологически функциональных эквивалентов. В одном варианте осуществления белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇.

В некоторых вариантах осуществления, гликоконъюгаты серотипа 15В согласно представленному изобретению являются конъюгированными с белком-носителем (например, CRM₁₉₇) и содержат сахарид, имеющий молекулярную массу от 5 кДа до 1500 кДа. В других таких вариантах осуществления, сахарид имеет молекулярную массу от 10 кДа до 1500 кДа. В следующих таких вариантах осуществления, сахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 1500 кДа; от 50 кДа до 1250 кДа; от 50 кДа до 1000 кДа; от 50 кДа до 750 кДа; от 50 кДа до 500 кДа; от 50 кДа до 250 кДа; от 100 кДа до 1500 кДа; от 100 кДа до 1250 кДа; от 100 кДа до 1000 кДа; от 100 кДа до 750 кДа; от 100 кДа до 500 кДа; от 100 кДа до 250 кДа; от 200 кДа до 1500 кДа; от 200 кДа до 1250 кДа; от 200 кДа до 1000 кДа; от 200 кДа до 750 кДа; или от 200 кДа до 500 кДа; или от 200 кДа до 400 кДа. Какое-либо целое число целого числа в пределах какого-либо из диапазонов, указанных выше, предполагается в качестве варианта осуществления изобретения. В некоторых вариантах осуществления, гликоконъюгат серотипа 15В согласно изобретению имеет молекулярную массу от 50 кДа до 20000 кДа. В некоторых вариантах осуществления, гликоконъюгат серотипа 15В согласно изобретению имеет молекулярную массу от 1000 кДа до 20000 кДа. В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат серотипа 15В согласно изобретению имеет молекулярную массу от 3000 кДа до 20000 кДа, от 5000 кДа до 10000 кДа, от 5000 кДа до 20000 кДа, от 8000 кДа до 20000 кДа, от 8000 кДа до 16000 кДа или от 10000 кДа до 16000 кДа.

В следующих вариантах осуществления, гликоконъюгат серотипа 15В согласно изобретению имеет молекулярную массу приблизительно 1000 кДа, приблизительно 1500 кДа, приблизительно 2000 кДа, приблизительно 2500 кДа, приблизительно 3000 кДа, приблизительно 3500 кДа, приблизительно 4000 кДа, приблизительно 4500 кДа, приблизительно 5000 кДа, приблизительно 5500 кДа, приблизительно 6000 кДа, приблизительно 6 500 кДа, приблизительно 7000 кДа, приблизительно 7500 кДа, приблизительно 8000 кДа, приблизительно 8500 кДа, приблизительно 9000 кДа, приблизительно 9500 кДа приблизительно 10000 кДа, приблизительно 10500 кДа, приблизительно 11000 кДа, приблизительно 11500 кДа, приблизительно 12000 кДа, приблизительно 12500 кДа, приблизительно 13000 кДа, приблизительно 13500 кДа, приблизительно 14000 кДа, приблизительно 14500 кДа, приблизительно 15000 кДа, приблизительно 15500 кДа, приблизительно 16000 кДа, приблизительно 16 500 кДа, приблизительно 17000 кДа, приблизительно 17500 кДа, приблизительно 18000 кДа, приблизительно 18500 кДа приблизительно 19000 кДа, приблизительно 19500 кДа или приблизительно 20000 кДа.

В следующих вариантах осуществления, гликоконъюгат серотипа 15В согласно изобретению имеет молекулярную массу от 1000 кДа до 20000 кДа; от 1000 кДа до 15000 кДа; от 1000 кДа до 10000 кДа; от 1000 кДа до 7500 кДа; от 1000 кДа до 5000 кДа; от 1000 кДа до 4000 кДа; от 1000 кДа до 3000 кДа; от 2000 кДа до 20000 кДа; от 2000 кДа до 15000 кДа; от 2000 кДа до 12500 кДа; от 2000 кДа до 10000 кДа; от 2000 кДа до 7500 кДа; от 2000 кДа до 6000 кДа; от 2000 кДа до 5000 кДа; от 2000 кДа до 4000 кДа; или от 2000 кДа до 3000 кДа.

В следующих вариантах осуществления, гликоконъюгат серотипа 15В согласно изобретению имеет молекулярную массу от 3000 кДа до 20000 кДа; от 3000 кДа до 15000 кДа; от 3000 кДа до 10000 кДа; от 3000 кДа до 7500 кДа; от 3000 кДа до 5000 кДа; от 3000 кДа до 4000 кДа; от 4000 кДа до 20000 кДа; от 4000 кДа до 15000 кДа; от 4000 кДа до 12500 кДа; от 4000 кДа до 10000 кДа; от 4000 кДа до 7500 кДа; от 4000 кДа до 6000 кДа или от 4000 кДа до 5000 кДа. В следующих вариантах осуществления, гликоконъюгат серотипа 15В согласно изобретению имеет молекулярную массу от 5000 кДа до 20000 кДа; от 5000 кДа до 15000 кДа; от 5000 кДа до 10000 кДа; от 5000 кДа до 7500 кДа; от 6000 кДа до 20000 кДа; от 6000 кДа до 15000 кДа; от 6000 кДа до 12500 кДа; от 6000 кДа до 10000 кДа или от 6000 кДа до 7500 кДа.

Молекулярную массу гликоконъюгата измеряют, используя SEC-MALLS. Какое-либо целое число целого числа в пределах какого-либо из диапазонов, указанных выше, предполагается в качестве варианта осуществления изобретения. В одном варианте осуществления, указанный гликоконъюгат серотипа 15В получают, используя восстановительное аминирование.

Гликоконъюгаты серотипа 15В согласно изобретению также могут быть охарактеризованы соотношением (масса/масса) сахарида к белку-носителю. В предпочтительном варианте осуществления, соотношение (масса по массе) капсульного полисахарида серотипа 15В к белку-носителю в конъюгате составляет от 0,5 до 3,0 (например, приблизительно 0,5, приблизительно 0,6, приблизительно 0,7, приблизительно 0,8, приблизительно 0,9, приблизительно 1,0, приблизительно 1,1, приблизительно 1,2, приблизительно 1,3, приблизительно 1,4, приблизительно 1,5, приблизительно 1,6, приблизительно 1,7, приблизительно 1,8, приблизительно 1,9, приблизительно 2,0, приблизительно 2,1, приблизительно 2,2, приблизительно 2,3, приблизительно 2,4, приблизительно 2,5, приблизительно 2,6, приблизительно 2,7, приблизительно 2,8, приблизительно 2,9 или приблизительно 3,0). В предпочтительном варианте осуществления, соотношение капсульного полисахарида серотипа 15В к белку-носителю в конъюгате составляет от 0,4 до 2. В предпочтительном варианте осуществления, соотношение капсульного полисахарида серотипа 15В к белку-носителю в конъюгате составляет от 0,5 до 2,0, от 0,5 до 1,5, от 0,5 до 1,0, от 1,0 до 1,5, от 1,0 до 2,0. В предпочтительном варианте осуществления, соотношение капсульного полисахарида серотипа 15В к белку-носителю в конъюгате составляет от 0,7 до 0,9.

Гликоконъюгаты серотипа 15В и иммуногенная композиция согласно изобретению могут содержать свободный сахарид, который не является ковалентно конъюгированным с белком-носителем, но тем не менее, присутствует в гликоконъюгатной композиции. Свободный сахарид может быть нековалентно ассоциированным с (то есть, нековалентно связанным с, адсорбированным на, или заключенным в или с) гликоконъюгатом.

В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат серотипа 15В согласно изобретению содержит меньше, чем приблизительно 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20% или 15% свободного капсульного полисахарида серотипа 15В по сравнению с общим количеством капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном варианте осуществления гликоконъюгат серотипа 15В согласно изобретению содержит меньше, чем приблизительно 25% свободного капсульного полисахарида серотипа 15В по сравнению с общим количеством капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном варианте осуществления гликоконъюгат серотипа 15В согласно изобретению содержит меньше, чем приблизительно 20% свободного капсульного полисахарида серотипа 15В по сравнению с общим количеством капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном варианте осуществления гликоконъюгаты серотипа 15В согласно изобретению содержат меньше, чем приблизительно 15% свободного капсульного полисахарида серотипа 15В по сравнению с общим количеством капсульного полисахарида серотипа 15В.

Гликоконъюгаты серотипа 15В также могут быть охарактеризованы распределением по их молекулярным размерам (K_d). Гель-проникающая хроматография сред (CL-4B) может быть использована для определения распределения по относительным молекулярным размерам конъюгата, как указано выше.

В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере, 20% гликоконъюгатов серотипа 15В согласно изобретению имеют Kd меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере, 30% иммуногенного конъюгата имеет Kd меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере, 40% гликоконъюгатов серотипа 15В согласно изобретению имеют K_d меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, или 85% гликоконъюгатов серотипа 15 согласно изобретению имеют K_d меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере, 60% гликоконъюгатов серотипа 15В согласно изобретению имеют K_d меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере, 70% гликоконъюгатов серотипа 15В согласно изобретению имеют K_d меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B.

В предпочтительном варианте осуществления, от 40% до 90% гликоконъюгатов серотипа 15В имеют K_d меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, от 50% до 90% гликоконъюгатов серотипа 15В имеют K_d меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, от 65% до 80% гликоконъюгатов серотипа 15В имеют K_d меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B.

В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат серотипа 15В согласно изобретению содержит, по меньшей мере, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 или 0,8 мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат содержит, по меньшей мере, 0,5, 0,6 или 0,7 мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат содержит, по меньшей мере, 0,6 мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат содержит, по меньшей мере, 0,7 мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном варианте осуществления, присутствие O-ацетильных групп определяют, используя ионно-ВЭЖХ анализ.

В предпочтительном варианте осуществления, соотношение мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 15В в гликоконъюгате серотипа 15В к мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 15В в выделенном полисахариде составляет, по меньшей мере, 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, или 0,95. В предпочтительном варианте осуществления, соотношение мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 15В в гликоконъюгате серотипа 15В к мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 15В в выделенном полисахариде составляет, по меньшей мере, 0,7. В предпочтительном варианте осуществления, соотношение мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 15В в гликоконъюгате серотипа 15В к мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 15В в выделенном полисахариде составляет, по меньшей мере, 0,9. В предпочтительном варианте осуществления, присутствие O-ацетильных групп определяют, используя ионно-ВЭЖХ анализ.

В предпочтительном варианте осуществления, соотношение мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 15В в гликоконъюгате серотипа 15В к мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 15В в активированном полисахариде составляет, по меньшей мере, 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, или 0,95. В предпочтительном варианте осуществления, соотношение мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 15В в гликоконъюгате серотипа 15В к мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 15В в активированном полисахариде составляет, по меньшей мере, 0,7. В предпочтительном варианте осуществления, соотношение мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 15В в гликоконъюгате серотипа 15В к мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 15В в активированном полисахариде составляет, по меньшей мере, 0,9. В предпочтительном варианте осуществления, присутствие O-ацетильных групп определяют, используя ионно-ВЭЖХ анализ.

В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат серотипа 15В согласно изобретению содержит, по меньшей мере, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 или 0,8 мМ глицерина на мМ капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат серотипа 15В согласно изобретению содержит, по меньшей мере, 0,5, 0,6 или 0,7 мМ глицерина на мМ капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат серотипа 15В согласно изобретению содержит, по меньшей мере, 0,6 мМ глицерина на мМ капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат серотипа 15В согласно изобретению содержит, по меньшей мере, 0,7 мМ глицерина на мМ капсульного полисахарида серотипа 15В.

Другой способ для того, чтобы охарактеризовать гликоконъюгаты серотипа 15В согласно изобретению представляет собой количество лизиновых остатков в белке-носителе (например, CRM₁₉₇), которые становятся конъюгированными с сахаридом, которое может быть охарактеризовано как диапазон конъюгированных лизинов (степень конъюгации). Доказательства лизиновой модификации белка-носителя, за счет ковалентных связей с полисахаридами, могут быть получены с помощью аминокислотного анализа с использованием стандартных способов, известных квалифицированному специалисту в данной области. Конъюгация в результате приводит к уменьшению количества лизиновых остатков, восстановленных по сравнению с исходным материалом белка CRM₁₉₇, использованным для образования материалов конъюгата.

В предпочтительном варианте осуществления, степень конъюгации гликоконъюгата серотипа 15В согласно изобретению составляет от 2 до 15, от 2 до 13, от 2 до 10, от 2 до 8, от 2 до 6, от 2 до 5, от 2 до 4, от 3 до 15, от 3 до 13, от 3 до 10, от 3 до 8, от 3 до 6, от 3 до 5, от 3 до 4, от 5 до 15, от 5 до 10, от 8 до 15, от 8 до 12, от 10 до 15 или от 10 до 12. В одном варианте осуществления, степень конъюгации гликоконъюгата серотипа 15В согласно изобретению составляет приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4, приблизительно 5,приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11, приблизительно 12, приблизительно 13, приблизительно 14 или приблизительно 15. В предпочтительном варианте осуществления, степень конъюгации гликоконъюгата серотипа 15В согласно изобретению составляет от 2 до 5.

1.3.5. Гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипа 12F

В гликоконъюгатах из S. pneumoniae серотипа 12F согласно представленному изобретению, сахарид является выбранным из группы, состоящей из полисахарида и олигосахарида, и белок-носитель выбирают из какого-либо приемлемого носителя, как описано в данном документе, или известного квалифицированному специалисту в данной области. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, сахарид представляет собой полисахарид серотипа 12F из S. pneumoniae.

В одном варианте осуществления, гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипа 12F получают с использованием CDAP. Полисахариды активируют тетрафторборатом 1-циано-4-диметиламино пиридиния (CDAP) с образованием цианатного сложного эфира. Активированный полисахарид затем присоединяют непосредственно или через спейсерную (линкерную) группу к аминогруппе на белке-носителе (предпочтительно CRM₁₉₇). Например, спейсер может представлять собой цистамин или цистеамин, дающий тиолированный полисахарид, который может быть присоединен к носителю посредством тиоэфирной связи, полученной после реакции с активированным малеимидом белком-носителем (например с использованием GMBS) или галогенацетилированным белком-носителем (например с использованием йодацетамида, SIB, SIAB, сульфо-SIAB, SIA, или SBAP). Предпочтительно, цианатный сложный эфир (необязательно полученный с использованием CDAP химии) соединен с гександиамином или гидразидом адипиновой кислоты (ADH), и амино-дериватизированный сахарид конъюгируется с белком-носителем (например, CRM₁₉₇) с использованием карбодиимидной (например, EDAC или EDC) химии через карбоксильную группу на белковом носителе.

Другие способы конъюгирования используют карбодиимиды, гидразиды, активные сложные эфиры, норборан, п-нитробензойную кислота, N-гидроксисукцинимид, S-NHS, EDC, TSTU. Многие из них описаны в публикации международной заявки на патент № WO 98/42721. Конъюгация может включать карбонильный линкер, который может образовываться в результате реакции свободной гидроксильной группы сахарида с CDI (смотри, Bethell et al. (1979) J. Biol. Chern. 254: 2572-2574; Hearn et al. (1981) J. Chromatogr, 218: 509-518), с последующей реакцией с белком с образованием карбаматной связи. Это может включать восстановление аномерного конца до первичной гидроксильной группы, необязательное введение защиты/снятие защиты первичной гидроксильной группы, взаимодействие первичной гидроксильной группы с CDI с образованием CDI карбаматного промежуточного соединения и взаимодействие CDI карбаматного промежуточного соединения с аминогруппой на белке.

В одном варианте осуществления, капсульные полисахариды из серотипов 12F S. pneumoniae являются конъюгированными с белком-носителем посредством восстановительного аминирования. Восстановительное аминирование включает две стадии, (1) окисление полисахарида с образованием альдегидных функциональных групп из вицинальных диолов в индивидуальной гексасахаридной единице, (2) восстановление активированного полисахарида и белка-носителя с образованием конъюгата.

Перед окислением, полисахарид серотипа 12F необязательно гидролизуют (сортируют по размерам). Механический или химический гидролиз может быть использован. Химический гидролиз могут проводить с использованием уксусной кислоты.

В одном варианте осуществления, окислительный агент представляет собой перйодат. Термин "перйодат" включает как перйодат, так и перйодную кислоту (смотри ниже).

В предпочтительном варианте осуществления, окислительный агент представляет собой 2,2,6,6-тетраметил-1-пиперидинилокси (TEMPO) свободный радикал и N-хлорсукцинимид (NCS) в качестве совместного окислителя. В таком варианте осуществления, гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипа 12F получают с использованием 2,2,6,6-тетраметил-1-пиперидинилокси (TEMPO) свободного радикала, для того чтобы окислить первичные спирты сахарида до альдегидов с использованием N-хлорсукцинимида (NCS) в качестве совместного окислителя (в данном документе далее "TEMPO/NCS окисление"), такого как описанный в примере 7 и в WO 2014/097099. Поэтому в одном аспекте, гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипа 12F могут быть получены по способу, включающему стадии: а) взаимодействия сахарида 12F с 2,2,6,6-тетраметил-1-пиперидинилокси (TEMPO) и N-хлорсукцинимидом (NCS) в водном растворителе, с получением активированного сахарида; и b) взаимодействия активированного сахарида с белком-носителем, содержащим одну или больше аминогруппы (в данном документе далее "TEMPO/NCS-восстановительное аминирование"). В одном аспекте, гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипа 12F получают согласно указанному способу. В одном варианте осуществления, степень окисление активированного сахарида 12F находится в диапазоне от 1 до 50, от 1 до 40, от 1 до 30, от 1 до 20, от 1 до 10, от 1 до 5, от 3 до 40, от 3 до 30, от 3 до 20, от 3 до 10, от 4 до 40, от 4 до 30, от 4 до 20, от 4 до 10, от 5 до 30, от 5 до 25, от 5 до 20, от 5 до 10, от 6 до 50, от 6 до 40, от 6 до 30, от 6 до 20, от 6 до 15, от 6 до 14, от 6 до 13, от 6 до 12, от 6 до 11, от 6 до 10, от 7 до 40, от 7 до 30, от 7 до 20, от 7 до 15, от 7 до 14, от 7 до 13, от 7 до 12, от 7 до 11, от 7 до 10, от 8 до 40, от 8 до 30, от 8 до 20, от 8 до 15, от 8 до 14, от 8 до 13, от 8 до 13, от 8 до 12, от 8 до 11, от 8 до 10, от 9 до 40, от 9 до 30, от 9 до 20, от 9 до 15, от 10 до 40, от 10 до 30, от 10 до 20, или от 10 до 15. В следующем аспекте, степень окисления активированного сахарида составляет 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, или 40. Предпочтительно, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇.

В одном варианте осуществления, перед стадией а), сахарид 12F гидролизуют до молекулярной массы, находящейся в диапазоне от 100 кДа до 400 кДа. Например, в одном аспекте, диапазоны молекулярной массы составляют от 100 кДа до 350 кДа, от 100 кДа до 300 кДа, от 100 кДа до 250 кДа, от 100 кДа до 200 кДа, от 100 кДа до 150 кДа, от 200 кДа до 400 кДа, от 200 кДа до 350 кДа, от 200 кДа до 300 кДа, от 200 кДа до 250 кДа, от 300 кДа до 400 кДа, или от 300 кДа до 350 кДа.

В следующем аспекте, способ дополнительно включает стадию очистки активированного полисахарида перед стадией b). В следующем аспекте, способы дополнительно включают стадию добавление восстанавливающего агента после стадии b). В одном аспекте восстанавливающий агент представляет собой NaCNBH₃. В следующем аспекте, способы дополнительно включают стадию добавление NaBH₄ после добавления NaCNBH₃. В следующем аспекте, способ включают стадию очистки после добавления NaBH₄.

В другом аспекте, представленное изобретение предусматривает гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 12F, полученный, или может быть получен по какому-либо из способов, раскрытых выше в данном документе. Например, в одном аспекте представленное изобретение предусматривает гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 12F, содержащий сахарид, конъюгированный с белком-носителем, который получают или может быть получен согласно способу, включающему стадии: а) взаимодействия сахарида с 2,2,6,6-тетраметил-1-пиперидинилокси (TEMPO) и N-хлорсукцинимидом (NCS) в водном растворителе, в результате которого получают активированный сахарид; и b) взаимодействия активированного сахарида с белком-носителем, содержащим одну или больше аминных групп.

В одном варианте осуществления, гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 12F согласно представленному изобретению имеет молекулярную массу от приблизительно 50 кДа до приблизительно 20000 кДа. В другом варианте осуществления, гликоконъюгат имеет молекулярную массу от приблизительно 200 кДа до приблизительно 10000 кДа. В другом варианте осуществления, гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 12F имеет молекулярную массу от приблизительно 500 кДа до приблизительно 5000 кДа. В одном варианте осуществления, гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 12F имеет молекулярную массу от приблизительно 1000 кДа до приблизительно 3000 кДа. В других вариантах осуществления гликоконъюгат из S. pneumoniae серотип 12F имеет молекулярную массу от приблизительно 600 кДа до приблизительно 2800 кДа; от приблизительно 700 кДа до приблизительно 2700 кДа; от приблизительно 1000 кДа до приблизительно 2000 кДа; от приблизительно 1800 кДа до приблизительно 2500 кДа; от приблизительно 1100 кДа до приблизительно 2200 кДа; от приблизительно 1900 кДа до приблизительно 2700 кДа; от приблизительно 1200 кДа до приблизительно 2400 кДа; от приблизительно 1700 кДа до приблизительно 2600 кДа; от приблизительно 1300 кДа до приблизительно 2600 кДа; от приблизительно 1600 кДа до приблизительно 3000 кДа.

В следующих вариантах осуществления, гликоконъюгат серотипа 12F согласно изобретению имеет молекулярную массу от 1000 кДа до 20000 кДа; от 1000 кДа до 15000 кДа; от 1000 кДа до 10000 кДа; от 1000 кДа до 7500 кДа; от 1000 кДа до 5000 кДа; от 1000 кДа до 4000 кДа; от 1000 кДа до 3000 кДа; от 2000 кДа до 20000 кДа; от 2000 кДа до 15000 кДа; от 2000 кДа до 12500 кДа; от 2000 кДа до 10000 кДа; от 2000 кДа до 7500 кДа; от 2000 кДа до 6000 кДа; от 2000 кДа до 5000 кДа; от 2000 кДа до 4000 кДа; или от 2000 кДа до 3000 кДа. Какое-либо целое число целого числа в пределах какого-либо из диапазонов, указанных выше, предполагается в качестве варианта осуществления изобретения. В некоторых таких вариантах осуществления, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇. В некоторых таких вариантах осуществления, гликоконъюгат серотипа 12F конъюгируют с белком-носителем, используя TEMPO/NCS-восстановительное аминирование.

Другой способ для того, чтобы охарактеризовать гликоконъюгаты серотипа 12F согласно изобретению, представляет собой количество лизиновых остатков в белке-носителе (например, CRM₁₉₇), которые становятся конъюгированными с сахаридом, которое может быть охарактеризовано как диапазон конъюгированных лизинов (степень конъюгации).

В предпочтительном варианте осуществления, степень конъюгации гликоконъюгата серотипа 12F согласно изобретению составляет от 2 до 20, от 4 до 16, от 4 до 15, от 2 до 15, от 2 до 13, от 2 до 10, от 2 до 8, от 2 до 6, от 2 до 5, от 2 до 4, от 3 до 15, от 3 до 13, от 3 до 10, от 3 до 8, от 3 до 6, от 3 до 5, от 3 до 4, от 5 до 15, от 5 до 10, от 8 до 15, от 8 до 12, от 10 до 15 или от 10 до 12. В одном варианте осуществления, степень конъюгации гликоконъюгата серотипа 12F согласно изобретению составляет приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4, приблизительно 5, приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11, приблизительно 12, приблизительно 13, приблизительно 14, приблизительно 15, приблизительно 16, приблизительно 17, приблизительно 18, приблизительно 19 или приблизительно 20.

Количество лизиновых остатков в белке-носителе, конъюгированном с сахаридом, также может быть выражено как молярное соотношение. Например, в гликоконъюгате, в котором от 4 до 15 лизиновых остатков CRM₁₉₇ ковалентно связаны с сахаридом, молярное соотношение конъюгированных лизинов с CRM₁₉₇ в гликоконъюгате составляет от приблизительно 10:1 до приблизительно 40:1. В иммунногенной композиции, в которой от 2 до 20 лизиновых остатков CRM₁₉₇ ковалентно связаны с сахаридом, молярное соотношение конъюгированных лизинов с CRM₁₉₇ в гликоконъюгате, составляет от приблизительно 5:1 до приблизительно 50:1. В одном варианте осуществления, в гликоконъюгате из S. pneumoniae серотипа 12F согласно представленному изобретению молярное соотношение конъюгированных лизинов к белку-носителю составляет от приблизительно 10:1 до приблизительно 25:1. В некоторых таких вариантах осуществления, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇. В некоторых вариантах осуществления, CRM₁₉₇ может содержать приблизительно 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, или 16 лизиновых остатков из 39, ковалентно связанных с сахаридом. В некоторых таких вариантах осуществления, гликоконъюгат серотипа 12F конъюгируют с белком-носителем, используя TEMPO/NCS-восстановительное аминирование.

В одном варианте осуществления, соотношение сахарида к белку-носителю (масс./масс.) составляет от 0,2 до 4 в гликоконъюгате из S. pneumoniae серотипа 12F (например, приблизительно 0,2, приблизительно 0,3, приблизительно 0,4, приблизительно 0,5, приблизительно 0,6, приблизительно 0,7, приблизительно 0,8, приблизительно 0,9, приблизительно 1,0, приблизительно 1,1, приблизительно 1,2, приблизительно 1,3, приблизительно 1,4, приблизительно 1,5, приблизительно 1,6, приблизительно 1,7, приблизительно 1,8, приблизительно 1,9, приблизительно 2,0, приблизительно 2,1, приблизительно 2,2, приблизительно 2,3, приблизительно 2,4, приблизительно 2,5, приблизительно 2,6, приблизительно 2,7, приблизительно 2,8, приблизительно 2,9, приблизительно 3,0, приблизительно 3,1, приблизительно 3,2, приблизительно 3,3, приблизительно 3,4, приблизительно 3,5, приблизительно 3,6, приблизительно 3,7, приблизительно 3,8, приблизительно 3,9 или приблизительно 4,0). В другом варианте осуществления, соотношение сахарида к белку-носителю (масс./масс.) составляет от 1,1 до 1,7 в гликоконъюгате из S. pneumoniae серотипа 12F. В других вариантах осуществления, соотношение сахарида к белку-носителю (масс./масс.) составляет от 0,8 до 1,8 (например, приблизительно 0,8, приблизительно 0,9, приблизительно 1,0, приблизительно 1,1, приблизительно 1,2, приблизительно 1,3, приблизительно 1,4, приблизительно 1,5, приблизительно 1,6, приблизительно 1,7 или приблизительно 1,8). В некоторых таких вариантах осуществления, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇. В некоторых таких вариантах осуществления, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇. В некоторых таких вариантах осуществления, гликоконъюгат серотипа 12F конъюгируют с белком-носителем, используя TEMPO/NCS-восстановительное аминирование.

Частота присоединений сахаридной цепи к лизину на белке-носителе является еще одним параметром для охарактеризования гликоконъюгатов серотипа 12F согласно раскрытию. Например, в одном варианте осуществления, по меньшей мере, одна ковалентная связь между белком-носителем и полисахаридом приходится на каждые 100 сахаридных повторяющихся единиц полисахарида. В одном варианте осуществления, по меньшей мере, одна ковалентная связь между белком-носителем и полисахаридом приходится на каждые 50 сахаридных повторяющихся единиц полисахарида. В одном варианте осуществления, по меньшей мере, одна ковалентная связь между белком-носителем и полисахаридом приходится на каждые 25 сахаридных повторяющихся единиц полисахарида. В другом варианте осуществления, ковалентная связь между белком-носителем и полисахаридом осуществляется, по меньшей мере, один раз на каждые 4 сахаридные повторяющиеся единицы полисахарида. В другом варианте осуществления, ковалентная связь между белком-носителем и полисахаридом осуществляется, по меньшей мере, один раз на каждые 10 сахаридных повторяющихся единиц полисахарида. В следующем варианте осуществления, ковалентная связь между белком-носителем и полисахаридом осуществляется, по меньшей мере, один раз на каждые 15 сахаридных повторяющихся единиц полисахарида. В многочисленных вариантах осуществления, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇, и ковалентная связь между CRM₁₉₇ и полисахаридом осуществляется, по меньшей мере, один раз на каждые 4, 10, 15 или 25 сахаридных повторяющихся единиц полисахарида.

В других вариантах осуществления, конъюгат содержит, по меньшей мере, ковалентная связь между белком-носителем и сахаридом на каждые от 5 до 10 сахаридных повторяющихся единиц; на каждые от 2 до 7 сахаридных повторяющихся единиц; на каждые от 3 до 8 сахаридных повторяющихся единиц; на каждые от 4 до 9 сахаридных повторяющихся единиц; на каждые от 6 до 11 сахаридных повторяющихся единиц; на каждые от 7 до 12 сахаридных повторяющихся единиц; на каждые от 8 до 13 сахаридных повторяющихся единиц; на каждые от 9 до 14 сахаридных повторяющихся единиц; на каждые от 10 до 15 сахаридных повторяющихся единиц; на каждые от 2 до 6 сахаридных повторяющихся единиц, на каждые от 3 до 7 сахаридных повторяющихся единиц; на каждые от 4 до 8 сахаридных повторяющихся единиц; на каждые от 6 до 10 сахаридных повторяющихся единиц; на каждые от 7 до 11 сахаридных повторяющихся единиц; на каждые от 8 до 12 сахаридных повторяющихся единиц; на каждые от 9 до 13 сахаридных повторяющихся единиц; на каждые от 10 до 14 сахаридных повторяющихся единиц; на каждые от 10 до 20 сахаридных повторяющихся единиц; на каждые от 4 до 25 сахаридных повторяющихся единиц или на каждые от 2 до 25 сахаридных повторяющихся единиц. В многочисленных вариантах осуществления, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇.

В другом варианте осуществления, по меньшей мере, связь между CRM₁₉₇ и сахаридом осуществляется на каждые 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 сахаридные повторяющиеся единицы полисахарида. В некоторых таких вариантах осуществления, гликоконъюгат серотипа 12F конъюгируют с белком-носителем, используя TEMPO/NCS-восстановительное аминирование.

В одном варианте осуществления, гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 12F согласно изобретению содержит, по меньшей мере, ковалентную связь между белком-носителем и полисахаридом на каждые 25 сахаридных повторяющихся единиц полисахарида. В другом варианте осуществления, ковалентная связь между белком-носителем и полисахаридом осуществляется, по меньшей мере, один раз на каждые 4 сахаридные повторяющиеся единицы полисахарида. В другом варианте осуществления, ковалентная связь между белком-носителем и полисахаридом осуществляется, по меньшей мере, один раз на каждые 10 сахаридных повторяющихся единиц полисахарида. В следующем варианте осуществления, ковалентная связь между белком-носителем и полисахаридом осуществляется, по меньшей мере, один раз на каждые 15 сахаридных повторяющихся единиц полисахарида. В некоторых таких вариантах осуществления, гликоконъюгат серотипа 12F конъюгируется с белком-носителем, используя TEMPO/NCS-восстановительное аминирование. Гликоконъюгаты серотипа 12F и иммуногенная композиция согласно изобретению могут содержать свободный сахарид, который не является ковалентно конъюгированным с белком-носителем, но, тем не менее, присутствует в гликоконъюгатной композиции. Свободный сахарид может быть нековалентно ассоциированным с (то есть, нековалентно связанным с, адсорбированным на, или заключенным в или с) гликоконъюгатом.

В некоторых вариантах осуществления, гликоконъюгаты серотипа 12F согласно изобретению содержат меньше, чем приблизительно 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% или 5% свободного полисахарида серотипа 12F по сравнению с общим количеством полисахарида серотипа 12F. В одном варианте осуществления, гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 12F содержит меньше, чем приблизительно 50% свободного полисахарида серотипа 12F по сравнению с общим количеством полисахарида серотипа 12F. В одном варианте осуществления, гликоконъюгат из S. pneumoniae серотип 12F содержит меньше, чем приблизительно 45% свободного полисахарида серотипа 12F по сравнению с общим количеством полисахарида серотипа 12F. В другом варианте осуществления, гликоконъюгат содержит меньше, чем приблизительно 30% свободного полисахарида серотипа 12F по сравнению с общим количеством полисахарида серотипа 12F. В другом варианте осуществления, гликоконъюгат из S. pneumoniae серотип 12F содержит меньше, чем приблизительно 20% свободного полисахарида серотипа 12F по сравнению с общим количеством полисахарида серотипа 12F. В следующем варианте осуществления, гликоконъюгат содержит меньше, чем приблизительно 10% свободного полисахарида серотипа 12F по сравнению с общим количеством полисахарида серотипа 12F. В другом варианте осуществления, гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 12F содержит меньше, чем приблизительно 5% свободного полисахарида серотипа 12F по сравнению с общим количеством полисахарида серотипа 12F. В некоторых таких вариантах осуществления, гликоконъюгат серотипа 12F конъюгируют с белком-носителем, используя TEMPO/NCS-восстановительное аминирование.

В некоторых вариантах осуществления, гликоконъюгат серотипа 12F согласно представленному изобретению содержит сахарид, имеющий молекулярную массу от 10 кДа до 2000 кДа. В других таких вариантах осуществления, сахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 2000 кДа. В следующих таких вариантах осуществления, сахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 1750 кДа; от 50 кДа до 1500 кДа; от 50 кДа до 1250 кДа; от 50 кДа до 1000 кДа; от 50 кДа до 750 кДа; от 50 кДа до 500 кДа; от 100 кДа до 2000 кДа; от 100 кДа до 1750 кДа; от 100 кДа до 1500 кДа; от 100 кДа до 1250 кДа; от 100 кДа до 1000 кДа; от 100 кДа до 750 кДа; от 100 кДа до 500 кДа; от 200 кДа до 2000 кДа; от 200 кДа до 1750 кДа; от 200 кДа до 1500 кДа; от 200 кДа до 1250 кДа; от 200 кДа до 1000 кДа; от 200 кДа до 750 кДа; или от 200 кДа до 500 кДа; или от 200 кДа до 400 кДа. В некоторых таких вариантах осуществления, гликоконъюгат серотипа 12F конъюгируют с белком-носителем, используя TEMPO/NCS-восстановительное аминирование.

Гликоконъюгаты серотипа 12F также могут быть охарактеризованы распределением по их молекулярным размерам (K_d). Гель-проникающая хроматография сред (CL-4B) может быть использована для определения распределения по относительным молекулярным размерам конъюгата, как указанные выше.

В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере, 35% гликоконъюгатов серотипа 12F согласно изобретению имеют K_d меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, или 85% гликоконъюгатов серотипа 12F согласно изобретению имеют K_d меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере, 60% гликоконъюгатов серотипа 12F согласно изобретению имеют K_d меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере, 70% гликоконъюгатов серотипа 12F согласно изобретению имеют K_d меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B.

В предпочтительном варианте осуществления, от 40% до 90% гликоконъюгатов серотипа 12F имеют K_d меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, от 50% до 90% гликоконъюгатов серотипа 12F имеют K_d меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, от 65% до 80% гликоконъюгатов серотипа 12F имеют K_d меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B.

1.3.6. Гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипа 10А

В одном варианте осуществления, гликоконъюгаты серотипа 10А получают посредством активирования полисахарида тетрафторборатом 1-циано-4-диметиламинопиридиния (CDAP) с образованием цианатного сложного эфира. Активированный полисахарид может быть присоединен непосредственно или через спейсерную (линкерную) группу к аминогруппе на белке-носителе. Например, спейсер может представлять собой цистамин или цистеамин, дающий тиолированный полисахарид, который может быть присоединен к носителю посредством тиоэфирной связи, полученной после реакции с активированным малеимидом белком-носителем (например с использованием GMBS) или галогенацетилированным белком-носителем (например, с использованием йодацетамида, SIB, SIAB, сульфо-SIAB, SIA, или SBAP). Предпочтительно, цианатный сложный эфир (необязательно полученный с использованием CDAP химии) соединен с гександиамином или гидразидом адипиновой кислоты (ADH), и амино-дериватизированный сахарид конъюгируют с белком-носителем с использованием карбодиимидной (например, EDAC или EDC) химии через карбоксильную группу на белковом носителе. Такие конъюгаты описаны, например, в WO 93/15760, WO 95/08348 и WO 96/129094.

Другие приемлемые способы используют карбодиимиды, гидразиды, активные сложные эфиры, норборан, п-нитробензойную кислота, N-гидроксисукцинимид, S-NHS, EDC, TSTU. Многие из них описаны в публикации международной заявки на патент №WO 98/42721. Конъюгация может включать карбонильный линкер, который может образовываться в результате реакции свободной гидроксильной группы сахарида с CDI (смотри Bethell et al. (1979) J. Biol. Chern. 254:2572-2574; Hearn et al. (1981) J. Chromatogr, 218: 509-518), с последующей реакцией с белком с образованием карбаматной связи. Это может включать восстановление аномерного конца до первичной гидроксильной группы, необязательное введение защиты/снятие защиты первичной гидроксильной группы, взаимодействие первичной гидроксильной группы с CDI с образованием CDI карбаматного промежуточного соединения и взаимодействие CDI карбаматного промежуточного соединения с аминогруппой на белке.

В предпочтительных вариантах осуществления, гликоконъюгаты серотипа 10А согласно изобретению получают с использованием восстановительного аминирования. Восстановительное аминирование включает две стадии, (1) окисления полисахарида с образованием альдегидных функциональных групп из вицинальных диолов в индивидуальной гексасахаридной единице, (2) восстановления активированного полисахарида и белка-носителя с образованием конъюгата.

Перед окислением, полисахарид серотипа 10А необязательно гидролизуют (сортируют по размерам). Механический или химический гидролиз может быть использован. Химический гидролиз могут проводить с использованием уксусной кислоты.

В одном варианте осуществления, серотип полисахарид активируют (окисляют) согласно способу, включающему стадию:

(a) взаимодействия выделенного полисахарида серотипа 10А с окислительным агентом;

(b) гашения окислительной реакции посредством добавления гасящего агента, что в результате приводит к активированному полисахариду серотипа 10А.

В предпочтительном варианте осуществления, окислительный агент представляет собой перйодат. Для целей согласно представленному изобретению, термин "перйодат" включает как перйодат, так и перйодную кислоту, термин также включает как метаперйодат (IO₄^-), так и ортоперйодат (IO₆^5-) и различные соли перйодата (например, натрия перйодат и калия перйодат). В предпочтительном варианте осуществления, окислительный агент представляет собой натрия перйодат. В предпочтительном варианте осуществления, перйодат, использованный для окисления полисахарид серотипа 10А представляет собой метаперйодат. В предпочтительном варианте осуществления перйодат, использованный для окисления полисахарид серотипа 10А, представляет собой натрия метаперйодат.

В одном варианте осуществления, гасящий агент выбирают из вицинальных диолов, 1,2-аминоспиртов, аминокислот, глютатиона, сульфита, бисульфата, дитионита, метабисульфита, тиосульфата, фосфитов, гипофосфитов или фосфористой кислоты.

В одном варианте осуществления, гасящий агент представляет собой 1,2-аминоспирты формулы (I):

где R¹ выбирают из Н, метила, этила, пропила или изопропила.

В одном варианте осуществления, гасящий агент выбирают из солей натрия и калия сульфита, бисульфата, дитионита, метабисульфита, тиосульфата, фосфитов, гипофосфитов или солей фосфористой кислоты.

В одном варианте осуществления, гасящий агент представляет собой аминокислоту. В таких вариантах осуществления, указанная аминокислота может быть выбрана из серина, треонина, цистеина, цистина, метионина, пролина, гидроксипролина, триптофана, тирозина, и гистидина.

В одном варианте осуществления, гасящий агент представляет собой сульфит, такой как бисульфат, дитионит, метабисульфит, тиосульфат.

В одном варианте осуществления, гасящий агент представляет собой соединение, содержащее две вицинальные гидроксильные группы (вицинальные диолы), то есть, две гидроксильные группы, ковалентно связанные с двумя соседними атомами углерода.

Предпочтительно, гасящий агент представляет собой соединение формулы (II):

где R¹ и R² каждый независимо выбирают из Н, метила, этила, пропила или изопропила.

В предпочтительном варианте осуществления, гасящий агент представляет собой глицерин, этиленгликоль, пропан-1,2-диол, бутан-1,2-диол или бутан-2,3-диол, аскорбиновую кислоту. В предпочтительном варианте осуществления, гасящий агент представляет собой бутан-2,3-диол.

В предпочтительном варианте осуществления, выделенный полисахарид серотипа 10А активируют согласно способу, включающему стадию:

(a) взаимодействия выделенного полисахарида серотипа 10А с перйодатом;

(b) гашения окислительной реакции посредством добавления бутан-2,3-диола, что в результате приводит к активированному полисахариду серотипа 10A.

После стадии окисления полисахарида, полисахарид, как указывалось, активируют и в данном документе далее называют как "активированный полисахарид".

В предпочтительном варианте осуществления, активированный полисахарид серотипа 10А чистят. Активированный полисахарид серотипа 10А чистят в соответствии со способами, известными квалифицированному специалисту в данной области, такими как гель-проникающая хроматография (GPC), диализ или ультрафильтрация/диафильтрация. Например, активированный полисахарид 10А чистят путем концентрирования и диафильтрация с использованием устройства для ультрафильтрации.

В предпочтительном варианте осуществления степень окисления активированного полисахарида серотипа 10А составляет от 2 до 30, от 2 до 25, от 2 до 20, от 2 до 15, от 2 до 10, от 2 до 5, от 5 до 30, от 5 до 25, от 5 до 20, от 5 до 15, от 5 до 10, от 10 до 30, от 10 до 25, от 10 до 20, от 10 до 15, от 15 до 30, от 15 до 25, от 15 до 20, от 20 до 30, или от 20 до 25. В предпочтительном варианте осуществления степень окисления активированного полисахарида серотипа 10А составляет от 2 до 10, от 4 до 8, от 4 до 6, от 6 до 8, от 6 до 12, от 8 до 14, от 9 до 11, от 10 до 16, от 12 до 16, от 14 до 18, от 16 до 20, от 16 до 18, от 18 до 22, или от 18 до 20.

В предпочтительном варианте осуществления, активированный полисахарид серотипа 10А имеет молекулярную массу от 50 кДа до 400 кДа, от 50 кДа до 350 кДа, от 50 кДа до 300 кДа, от 50 кДа до 250 кДа, от 50 кДа до 200 кДа, от 100 кДа до 300 кДа, от 100 кДа до 250 кДа или от 100 кДа до 200 кДа. В предпочтительном варианте осуществления, активированный полисахарид серотипа 10А имеет молекулярную массу от 50 кДа до 300 кДа. В предпочтительном варианте осуществления, активированный полисахарид серотипа 10А имеет молекулярную массу от 100 кДа до 200 кДа. В предпочтительном варианте осуществления, активированный полисахарид серотипа 10А имеет молекулярную массу от 100 кДа до 200 кДа и степень окисление от 5 до 20, от 5 до 15, от 8 до 14, от 8 до 12 или от 9 до 11. В предпочтительном варианте осуществления, активированный полисахарид серотипа 10А имеет молекулярную массу от 100 кДа до 200 кДа и степень окисление от 9 до 11.

Активированный полисахарид и/или белок-носитель могут быть лиофилизированными (высушенными при заморозке), или независимо друг от друга (отдельная лиофилизация) или вместе (совместно лиофилизированный). В одном варианте осуществления, активированный полисахарид серотипа 10А лиофилизируют, необязательно в присутствии сахарида. В предпочтительном варианте осуществления, сахарид выбирают из сахарозы, трегалозы, рафинозы, стахиозы, мелецитозы, декстрана, маннита, лактита и палатинита. В предпочтительном варианте осуществления, сахарид представляет собой сахарозу. В одном варианте осуществления, лиофилизированный активированный полисахарид затем смешивают с раствором, содержащим белок-носитель.

В другом варианте осуществления активированный полисахарид и белок-носитель совместно лиофилизируют. В таких вариантах осуществления, активированный полисахарид серотипа 10А смешивают с белком-носителем и лиофилизируют необязательно в присутствии сахарида. В предпочтительном варианте осуществления, сахарид выбирают из сахарозы, трегалозы, рафинозы, стахиозы, мелецитозы, декстрана, маннита, лактита и палатинита. В предпочтительном варианте осуществления, сахарид представляет собой сахарозу. Совместно лиофилизированный полисахарид и белок-носитель затем могут повторно суспендировать в растворе и подвергать взаимодействию с восстанавливающим агентом.

Вторая стадия процесса конъюгирования представляет собой восстановление активированного полисахарида и белка-носителя с образованием конъюгата (восстановительное аминирование), с использованием восстанавливающего агента.

Активированный полисахарид серотипа 10А может быть конъюгированным с белком-носителем согласно способу, включающему стадию:

(c) смешивания активированного полисахарида серотипа 10А с белком-носителем; и

(d) взаимодействия компаундированного активированного полисахарида серотипа 10А и белка-носителя с восстанавливающим агентом с образованием конъюгата полисахарид серотипа 10А - белок-носитель.

В одном варианте осуществления, восстановительную реакцию проводят в водном растворителе, в другом варианте осуществления реакцию проводят в апротонном растворителе. В одном варианте осуществления, восстановительную реакцию проводят в ДМСО (диметилсульфоксиде) или в ДМФ (диметилформамиде) растворителе. Растворитель ДМСО или ДМФ может быть использован для восстановления активированного полисахарида и белка-носителя, которые были лиофилизированы.

В одном варианте осуществления, восстанавливающий агент представляет собой натрия цианоборгидрид, натрия триацетоксиборгидрид, натрия или цинка боргидрид в присутствии кислот Бренстеда или Льюиса, аминобораны, таких как пиридин-боран, 2-пиколин-боран, 2,6-диборан-метанол, диметиламин-боран, t-BuMeiPrN-ВН₃, бензиламин-BH3 или 5-этил-2-метилпиридин-боран (РЕМВ). В предпочтительном варианте осуществления, восстанавливающий агент представляет собой натрия цианоборгидрид.

По окончании восстановительной реакции, в конъюгатах могут оставаться непрореагировавшие альдегидные группы, они могут быть блокированы приемлемым блокирующим агентом. В одном варианте осуществления данный блокирующий агент представляет собой натрия боргидрид (NaBH₄).

После конъюгирования полисахарида серотипа 10А с белком-носителем, гликоконъюгат может быть очищен (обогащенный по отношению к количеству конъюгата полисахарид-белок), используя различные способы, известные квалифицированному специалисту. Данные способы включают диализ, операции концентрирования/диафильтрации, фильтрование тангенциальным потоком осаждение/элюирование, колоночную хроматографию (DEAE или хроматографию с гидрофобным взаимодействием), и глубинную фильтрацию.

В некоторых вариантах осуществления, гликоконъюгаты серотипа 10А согласно представленному изобретению содержат сахарид, имеющий молекулярную массу от 10 кДа до 2000 кДа. В других таких вариантах осуществления, сахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 2000 кДа. В следующих таких вариантах осуществления, сахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 1750 кДа; от 50 кДа до 1500 кДа; от 50 кДа до 1250 кДа; от 50 кДа до 1000 кДа; от 50 кДа до 750 кДа; от 50 кДа до 500 кДа; от 100 кДа до 2000 кДа; от 100 кДа до 1750 кДа; от 100 кДа до 1500 кДа; от 100 кДа до 1250 кДа; от 100 кДа до 1000 кДа; от 100 кДа до 750 кДа; от 100 кДа до 500 кДа; от 200 кДа до 2000 кДа; от 200 кДа до 1750 кДа; от 200 кДа до 1500 кДа; от 200 кДа до 1250 кДа; от 200 кДа до 1000 кДа; от 200 кДа до 750 кДа; или от 200 кДа до 500 кДа; или от 200 кДа до 400 кДа. В некоторых таких вариантах осуществления, гликоконъюгаты серотипа 10А получают с использованием восстановительного аминирования.

В некоторых вариантах осуществления, гликоконъюгат серотипа 10А согласно изобретению имеет молекулярную массу от 50 кДа до 20000 кДа. В других вариантах осуществления, гликоконъюгат серотипа 10А имеет молекулярную массу от 50 кДа до 15000 кДа. В других вариантах осуществления, гликоконъюгат серотипа 10А имеет молекулярную массу от 500 кДа до 15000 кДа, от 500 кДа до 10000 кДа; от 2000 кДа до 10000 кДа; или от 3000 кДа до 8,000 кДа. В других вариантах осуществления, гликоконъюгат серотипа 10А имеет молекулярную массу от 1000 кДа до 10000 кДа. В других вариантах осуществления, гликоконъюгат серотипа 10А имеет молекулярную массу от 1000 кДа до 8000 кДа. В еще других вариантах осуществления, гликоконъюгат серотипа 10А имеет молекулярную массу от 2000 кДа до 8000 кДа или от 3000 кДа до 7000 кДа. В следующих вариантах осуществления, гликоконъюгат серотипа 10А согласно изобретению имеет молекулярную массу от 200 кДа до 20000 кДа; от 200 кДа до 15000 кДа; от 200 кДа до 10000 кДа; от 200 кДа до 7500 кДа; от 200 кДа до 5000 кДа; от 200 кДа до 3000 кДа; от 200 кДа до 1000 кДа; от 500 кДа до 20000 кДа; от 500 кДа до 15000 кДа; от 500 кДа до 12500 кДа; от 500 кДа до 10000 кДа; от 500 кДа до 7500 кДа; от 500 кДа до 6000 кДа; от 500 кДа до 5000 кДа; от 500 кДа до 4000 кДа; от 500 кДа до 3000 кДа; от 500 кДа до 2000 кДа; от 500 кДа до 1500 кДа; от 500 кДа до 1000 кДа; от 750 кДа до 20000 кДа; от 750 кДа до 15000 кДа; от 750 кДа до 12500 кДа; от 750кДа до 10000 кДа; от 750кДа до 7500 кДа; от 750 кДа до 6000 кДа; от 750 кДа до 5000 кДа; от 750 кДа до 4000 кДа; от 750 кДа до 3000 кДа; от 750 кДа до 2000 кДа; от 750 кДа до 1500 кДа; от 1000 кДа до 15000 кДа; от 1000 кДа до 12500 кДа; от 1000 кДа до 10000 кДа; от 1000 кДа до 7500 кДа; от 1000 кДа до 6000 кДа; от 1000 кДа до 5000 кДа; от 1000 кДа до 4000 кДа; от 1000 кДа до 2500 кДа; от 2000 кДа до 15000 кДа; от 2000 кДа до 12500 кДа; от 2000 кДа до 10000 кДа; от 2000 кДа до 7500 кДа; от 2000 кДа до 6000 кДа; от 2000 кДа до 5000 кДа; от 2000 кДа до 4000 кДа; или от 2000 кДа до 3000 кДа.

В следующих вариантах осуществления, гликоконъюгат серотипа 10А согласно изобретению имеет молекулярную массу от 3000 кДа до 20000 кДа; от 3000 кДа до 15000 кДа; от 3000 кДа до 10000 кДа; от 3000 кДа до 7500 кДа; от 3000 кДа до 5000 кДа; от 4000 кДа до 20000 кДа; от 4000 кДа до 15000 кДа; от 4000 кДа до 12500 кДа; от 4000 кДа до 10000 кДа; от 4000 кДа до 7500 кДа; от 4000 кДа до 6000 кДа; или от 4000 кДа до 5000 кДа. В следующих вариантах осуществления, гликоконъюгат серотипа 10А согласно изобретению имеет молекулярную массу от 5000 кДа до 20000 кДа; от 5000 кДа до 15000 кДа; от 5000 кДа до 10000 кДа или от 5000 кДа до 7500 кДа. В следующих вариантах осуществления, гликоконъюгат серотипа 10А согласно изобретению имеет молекулярную массу от 6000 кДа до 20000 кДа; от 6000 кДа до 15000 кДа; от 6000 кДа до 10000 кДа или от 6000 кДа до 7500 кДа. В следующих вариантах осуществления, гликоконъюгат серотипа 10А согласно изобретению имеет молекулярную массу от 7000 кДа до 20000 кДа; от 7000 кДа до 15000 кДа; от 7000 кДа до 10000 кДа или от 7000 кДа до 8000 кДа. В следующих вариантах осуществления, гликоконъюгат серотипа 10А согласно изобретению имеет молекулярную массу от 8000 кДа до 20000 кДа; от 8000 кДа до 15000 кДа; или от 8000 кДа до 10000 кДа.

Какое-либо целое число целого числа в пределах какого-либо из диапазонов, указанных выше, предполагается в качестве варианта осуществления изобретения. Молекулярную массу гликоконъюгата измеряют, используя SEC-MALLS.

Другой способ для того, чтобы охарактеризовать гликоконъюгаты серотипа 10А согласно изобретению, представляет собой количество лизиновых остатков в белке-носителе (например, CRMw), которые становятся конъюгированными с сахаридом, которое может быть охарактеризовано как диапазон конъюгированных лизинов (степень конъюгации). Доказательства лизиновой модификации белка-носителя, за счет ковалентных связей с полисахаридами, могут быть получены с помощью аминокислотного анализа с использованием стандартных способов, известных квалифицированному специалисту в данной области. Конъюгация в результате приводит к уменьшению количества восстановленных лизиновых остатков по сравнению с исходным материалом белка CRM₁₉₇, использованным для образования материалов конъюгата.

В предпочтительном варианте осуществления, степень конъюгации гликоконъюгата серотипа 10А составляет от 2 до 15, от 2 до 13, от 2 до 10, от 2 до 8, от 2 до 6, от 2 до 5, от 2 до 4, от 3 до 15, от 3 до 13, от 3 до 10, от 3 до 8, от 3 до 6, от 3 до 5, от 3 до 4, от 5 до 15, от 5 до 10, от 8 до 15, от 8 до 12, от 10 до 15 или от 10 до 12. В предпочтительном варианте осуществления, степень конъюгации гликоконъюгата серотипа 10А составляет от 6 до 8. В предпочтительном варианте осуществления, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇

Гликоконъюгаты серотипа 10А согласно изобретению также могут быть охарактеризованы соотношением (масса/масса) сахарида к белку-носителю. В некоторых вариантах осуществления, соотношение сахарида к белку-носителю (масс./масс.) составляет от 0,5 до 3,0 (например, приблизительно 0,5, приблизительно 0,6, приблизительно 0,7, приблизительно 0,8, приблизительно 0,9, приблизительно 1,0, приблизительно 1,1, приблизительно 1,2, приблизительно 1,3, приблизительно 1,4, приблизительно 1,5, приблизительно 1,6, приблизительно 1,7, приблизительно 1,8, приблизительно 1,9, приблизительно 2,0, приблизительно 2,1, приблизительно 2,2, приблизительно 2,3, приблизительно 2,4, приблизительно 2,5, приблизительно 2,6, приблизительно 2,7, приблизительно 2,8, приблизительно 2,9 или приблизительно 3,0). В предпочтительном варианте осуществления, соотношение сахарида серотипа 10А к белку-носителю в конъюгате составляет от 0,5 до 2,0, от 0,5 до 1,5, от 0,5 до 1,0, от 1,0 до 1,5 или от 1,0 до 2,0. В предпочтительном варианте осуществления, соотношение полисахарида серотипа 10А к белку-носителю в конъюгате составляет от 0,8 до 1,4. В предпочтительном варианте осуществления, соотношение капсульного полисахарида серотипа 10А к белку-носителю в конъюгате составляет от 0,8 до 1,2 (например, приблизительно 0,8, приблизительно 0,9 приблизительно 1,0, приблизительно 1,1, или приблизительно 1,2). В некоторых таких вариантах осуществления, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇.

Гликоконъюгаты серотипа 10А и иммуногенная композиция согласно изобретению могут содержать свободный сахарид который не является ковалентно конъюгированным с белком-носителем, но, тем не менее, присутствует в гликоконъюгатной композиции. Свободный сахарид может быть нековалентно ассоциированным с (то есть, нековалентно связанным с, адсорбированным на, или заключенным в или с) гликоконъюгатом.

В некоторых вариантах осуществления, гликоконъюгаты серотипа 10А согласно изобретению содержат меньше, чем приблизительно 50% Свободный сахарид, меньше, чем приблизительно 45% Свободный сахарид, меньше, чем приблизительно 40% Свободный сахарид, меньше, чем „ приблизительно 35% Свободный сахарид, меньше, чем приблизительно 30% Свободный сахарид, меньше, чем приблизительно 25% Свободный сахарид, меньше, чем приблизительно 20% Свободный сахарид, меньше, чем приблизительно 15% Свободный сахарид, меньше, чем приблизительно 10% Свободный сахарид, или меньше, чем приблизительно 5% Свободный сахарид по отношению к общему количеству сахарида 10А. Предпочтительно, гликоконъюгат серотипа 10А содержит меньше, чем 15% Свободный сахарид, более предпочтительно меньше, чем 10% Свободный сахарид, е еще более предпочтительно, меньше, чем 5% Свободный сахарид.

Гликоконъюгаты серотипа 10А также могут быть охарактеризованы распределением по их молекулярным размерам (K_d). Гель-проникающая хроматография сред (CL-4B) может быть использована для определения распределения по относительным молекулярным размерам конъюгата, как указано выше.

В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере 30% гликоконъюгатов серотипа 10А согласно изобретению имеют K_d меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере, 40% гликоконъюгатов серотипа 10А согласно изобретению имеют K_d меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, или 85% гликоконъюгатов серотипа 10А согласно изобретению имеют K_d меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере, 60% гликоконъюгатов серотипа 10А имеют K_d меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, от 50% до 80% гликоконъюгатов серотипа 10А согласно изобретению имеют K_d меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B.

1.3.7. Гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипа 11А

В одном варианте осуществления, гликоконъюгаты серотипа 11А получают посредством активирования полисахарида тетрафторборатом 1-циано-4-диметиламинопиридиния (CDAP) с образованием цианатного сложного эфира. Активированный полисахарид может быть присоединен непосредственно или через спейсерную (линкерную) группу к аминогруппе на белке-носителе. Например, спейсер может представлять собой цистамин или цистеамин, дающий тиолированный полисахарид, который может быть присоединен к носителю посредством тиоэфирной связи, полученной после реакции с активированным малеимидом белком-носителем (например, с использованием GMBS) или галогенацетилированным белком-носителем (например, с использованием йодацетамида, SIB, SIAB, сульфо-SIAB, SIA, или SBAP). Предпочтительно, цианатный сложный эфир (необязательно полученный с использованием CDAP химии) соединен с гександиамином или гидразидом адипиновой кислоты (ADH), и амино-дериватизированный сахарид конъюгируют с белком-носителем с использованием карбодиимидной (например, EDAC или EDC) химии через карбоксильную группу на белковом носителе. Такие конъюгаты описаны, например, в WO 93/15760, WO 95/08348 и WO 96/129094.

Другие приемлемые способы используют карбодиимиды, гидразиды, активные сложные эфиры, норборан, п-нитробензойную кислота, N-гидроксисукцинимид, S-NHS, EDC, TSTU. Многие из них описаны в публикации международной заявки на патент № WO 98/42721. Конъюгация может включать карбонильный линкер, который может образовываться в результате реакции свободной гидроксильной группы сахарида с CDI (смотри Bethell et al. (1979). Biol. Chern. 254: 2572-2574; Hearn et al. (1981) J. Chromatogr, 218: 509-518) с последующей реакцией с белком с образованием карбаматной связи. Это может включать восстановление аномерного конца до первичной гидроксильной группы, необязательное введение защиты/снятие защиты первичной гидроксильной группы, взаимодействие первичной гидроксильной группы с CDI с образованием CDI карбаматного промежуточного соединения и взаимодействие CDI карбаматного промежуточного соединения с аминогруппой на белке.

В предпочтительных вариантах осуществления, гликоконъюгаты серотипа 11А согласно изобретению получают с использованием восстановительного аминирования. Восстановительное аминирование включает две стадии, (1) окисление полисахарида с образованием альдегидных функциональных групп из вицинальных диолов в индивидуальной гексасахаридной единице, (2) восстановление активированного полисахарида и белка-носителя с образованием конъюгата.

Перед окислением, полисахарид серотипа 11А необязательно гидролизуют для того, чтобы уменьшить его вязкость. Механический или химический гидролиз может быть использован. Химический гидролиз могут проводить с использованием уксусной кислоты. Механическую сортировку по размерам могут проводить с использованием фрагментирования за счет гомогенизации под высоким давлением.

Стадия окисления может включать реакцию с перйодатом. Для целей согласно представленному изобретению, термин "перйодат" включает как перйодат, так и перйодную кислота; термин также включает как метаперйодат (IO₄^-), так и ортоперйодат (IO₆^5-) и различные соли перйодата (например, натрия перйодат и калия перйодат). В одном варианте осуществления капсульный полисахарид серотипа 11А из S. pneumoniae окисляют в присутствии метаперйодата, предпочтительно в присутствии натрия перйодата (NaIO₄). В другом варианте осуществления капсульный полисахарид из серотипа 11А окисляют в присутствии ортоперйодата, предпочтительно в присутствии перйодной кислоты.

После стадии окисления полисахарида, полисахарид, как указывалось, активируют и в данном документе ниже называют как "активированный полисахарид". Активированный полисахарид может быть очищенным и лиофилизированным (высушенным при заморозке).

Активированный полисахарид и белок-носитель могут быть лиофилизированными (высушенными при заморозке), или независимо друг от друга (отдельная лиофилизация) или вместе (совместно лиофилизированный). В одном варианте осуществления активированный полисахарид и белок-носитель являются совместно лиофилизированными. В другом варианте осуществления активированный полисахарид и белок-носитель являются лиофилизированными независимо друг от друга.

В одном варианте осуществления лиофилизация происходит в присутствии невосстанавливающего сахара, возможно невосстанавливающие сахара включают сахарозу, трегалозу, рафинозу, стахиозу, мелецитозу, декстран, маннит, лактит и палатинит.

Вторая стадия процесса конъюгирования представляет собой восстановление активированного полисахарида и белка-носителя с образованием конъюгата (восстановительное аминирование), с использованием восстанавливающего агента. Восстанавливающие агенты, которые являются приемлемыми, включают цианоборгидриды, такие как натрия цианоборгидрид, боран-пиридин, или боргидрид-обменная смола. В одном варианте осуществления восстанавливающего агента представляет собой натрия цианоборгидрид.

В одном варианте осуществления, восстановительную реакцию проводят в водном растворителе, в другом варианте осуществления реакцию проводят в апротонном растворителе. В одном варианте осуществления, восстановительную реакцию проводят в ДМСО (диметилсульфоксиде) или в ДМФ (диметилформамиде), как растворителе. Растворитель ДМСО или ДМФ может быть использован для восстановления активированного полисахарида и белка-носителя, которые были лиофилизированы.

В одном варианте осуществления от 0,1 до 3,0, от 0,15 до 2,0, от 0,2 до 2,0, или от 0,5 до 1,5 молярных эквивалентов натрия цианоборгидрида используют в восстановительной реакции. В одном варианте осуществления приблизительно 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,9 или 3,0 молярных эквивалентов натрия цианоборгидрида используют в восстановительной реакции.

В одном варианте осуществления восстанавливающий агент представляет собой натрия триацетоксиборгидрид, в следующем варианте осуществления от 1,0 до 6,0 молярных эквивалентов, от 2,0 до 5,0 молярных эквивалентов или приблизительно 3,0 молярных эквивалентов натрия триацетоксиборгидрида используют в восстановительной реакции.

По окончании восстановительной реакции, в конъюгатах могут оставаться непрореагировавшие альдегидные группы, они могут быть блокированы приемлемым блокирующим агентом. В одном варианте осуществления данный блокирующий агент представляет собой натрия боргидрид (NaBH₄). В одном варианте осуществления блокирование достигается за счет смешивания восстановительной реакции с от 0,5 до 5,0 молярными эквивалентами NaBH₄, например, приблизительно 1, 1,5, 2, 2,5 или 3 молярными эквивалентами NaBH₄.

После конъюгирования (восстановительная реакция и необязательно блокирование), гликоконъюгаты могут быть очищены. Гликоконъюгаты могут быть очищены с использованием диафильтрации и/или ионно-обменной хроматографии и/или гель-проникающей хроматографии. В одном варианте осуществления, гликоконъюгаты чистят с использованием диафильтрации и/или ионно-обменной хроматографии и/или гель-проникающей хроматографии.

В одном варианте осуществления гликоконъюгаты подвергают стерилизующему фильтрованию.

В некоторых вариантах осуществления, гликоконъюгаты серотипа 11А согласно представленному изобретению являются конъюгированными с белком-носителем (например, CRM₁₉₇) и содержат сахарид, имеющий молекулярную массу от 10 кДа до 2000 кДа. В других таких вариантах осуществления, сахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 2000 кДа. В следующих таких вариантах осуществления, сахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 1750 кДа; от 50 кДа до 1500 кДа; от 50 кДа до 1250 кДа; от 50 кДа до 1000 кДа; от 50 кДа до 750 кДа; от 50 кДа до 500 кДа; от 50 кДа до 400 кДа; от 50 кДа до 300 кДа; от 50 кДа до 200 кДа; от 50 кДа до 100 кДа; от 100 кДа до 2000 кДа; от 100 кДа до 1750 кДа; от 100 кДа до 1500 кДа; от 100 кДа до 1250 кДа; от 100 кДа до 1000 кДа; от 100 кДа до 750 кДа; от 100 кДа до 500 кДа; от 100 кДа до 400 кДа от; от 100 кДа до 300 кДа; от 100 кДа до 200 кДа; от 200 кДа до 2000 кДа; от 200 кДа до 1750 кДа; от 200 кДа до 1500 кДа; от 200 кДа до 1250 кДа; от 200 кДа до 1000 кДа; от 200 кДа до 750 кДа; или от 200 кДа до 500 кДа; от 200 кДа до 400 кДа или от 200 кДа до 300 кДа.

В некоторых вариантах осуществления, гликоконъюгат серотипа 11А согласно изобретению имеет молекулярную массу от 50 кДа до 20000 кДа. В других вариантах осуществления, гликоконъюгат серотипа 11А имеет молекулярную массу от 50 кДа до 15000 кДа. В других вариантах осуществления, гликоконъюгат серотипа 11А имеет молекулярную массу от 500 кДа до 10000 кДа. В других вариантах осуществления, гликоконъюгат серотипа 11А имеет молекулярную массу от 200 кДа до 10000 кДа. В еще других вариантах осуществления, гликоконъюгат серотипа 11А имеет молекулярную массу от 1000 кДа до 8000 кДа или от 2000 кДа до 8000 кДа.

В следующих вариантах осуществления, гликоконъюгат серотипа 11А согласно изобретению имеет молекулярную массу от 200 кДа до 20000 кДа; от 200 кДа до 17500 кДа; от 200 кДа до 15000 кДа; от 200 кДа до 10000 кДа; от 200 кДа до 7500 кДа; от 200 кДа до 5000 кДа; от 200 кДа до 3000 кДа; от 200 кДа до 2000 кДа; от 200 кДа до 1000 кДа; от 500 кДа до 20000 кДа; от 500 кДа до 17500 кДа; от 500 кДа до 15000 кДа; от 500 кДа до 12500 кДа; от 500 кДа до 10000 кДа; от 500 кДа до 7500 кДа; от 500 кДа до 6000 кДа; от 500 кДа до 5000 кДа; от 500 кДа до 4000 кДа; от 500 кДа до 3000 кДа; от 500 кДа до 2000 кДа; от 500 кДа до 1500 кДа; от 500 кДа до 1000 кДа; от 700 кДа до 20000 кДа; от 700 кДа до 17500 кДа; от 700 кДа до 15000 кДа; от 700 кДа до 12500 кДа; от 700 кДа до 10000 кДа; от 700 кДа до 7500 кДа; от 700 кДа до 6000 кДа; от 700 кДа до 5000 кДа; от 700 кДа до 4 500 кДа; от 700 кДа до 4000 кДа; от 700 кДа до 3500 кДа; от 700 кДа до 3000 кДа; от 700 кДа до 2000 кДа; от 700 кДа до 1500 кДа; от 1000 кДа до 20000 кДа; от 1000 кДа до 17500 кДа; от 1000 кДа до 15000 кДа; от 1000 кДа до 12500 кДа; от 1000 кДа до 10000 кДа; от 1000 кДа до 7500 кДа; от 1000 кДа до 6000 кДа; от 1000 кДа до 5000 кДа; от 1000 кДа до 4000 кДа; от 1000 кДа до 2500 кДа; от 2000 кДа до 20000 кДа; от 2000 кДа до 17500 кДа; от 2000 кДа до 15000 кДа; от 2000 кДа до 12500 кДа; от 2000 кДа до 10000 кДа; от 2000 кДа до 7500 кДа; от 2000 кДа до 6000 кДа; от 2000 кДа до 5000 кДа; от 2000 кДа до 4000 кДа; или от 2000 кДа до 3000 кДа.

В одном варианте осуществления, указанный гликоконъюгат серотипа 11А получают с использованием восстановительного аминирования.

В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат серотипа 11А согласно изобретению содержит, по меньшей мере, 0,3, 0,5, 0,6, 1,0, 1,4, 1,8, 2,2, 2,6, 3,0, 3,4, 3,8, 4,2, 4,6 или 5 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 11А. В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат серотипа 11А содержит, по меньшей мере, 1,8, 2,2 или 2,6 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 11А. В одном варианте осуществления, гликоконъюгат содержит, по меньшей мере, 0,6 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 11А. В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат серотипа 11А согласно изобретению содержит, по меньшей мере, 0,6, 1, 1,4, 1,8, 2,2, 2,6, 3, 3,4, 3,8, 4,2 или 4,6 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 11А и меньше, чем приблизительно 5 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 11А. В одном варианте осуществления, гликоконъюгат серотипа 11А согласно изобретению содержит, по меньшей мере, 0,6, 1,0, 1,4, 1,8, 2,2, 2,6, или 3,0 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 11А, и меньше, чем приблизительно 3,4 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 11А. В одном варианте осуществления, гликоконъюгат серотипа 11А согласно изобретению содержит, по меньшей мере, 0,6, 1, 1,4, 1,8, 2,2, 2,6, или приблизительно 3,0 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 11А, и меньше, чем приблизительно 3,3 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 11А. Какое-либо из указанного выше количества предполагается в качестве варианта осуществления изобретения.

В предпочтительном варианте осуществления, соотношение мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 11А в гликоконъюгате серотипа 11А к мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 11А в выделенном полисахариде составляет, по меньшей мере, 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, или 0,95. В предпочтительном варианте осуществления, соотношение мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 11А в гликоконъюгате серотипа 11А к мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 11А в выделенном полисахариде составляет, по меньшей мере, 0,7. В предпочтительном варианте осуществления, соотношение мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 11А в гликоконъюгате серотипа 11А к мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 11А в выделенном полисахариде составляет, по меньшей мере, 0,9. В предпочтительном варианте осуществления, присутствие O-ацетильных групп определяют, используя ионно-ВЭЖХ анализ.

В предпочтительном варианте осуществления, соотношение мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 11А в гликоконъюгате серотипа 11А к мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 11А в активированном полисахариде составляет, по меньшей мере, 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, или 0,95. В предпочтительном варианте осуществления, соотношение мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 11А в гликоконъюгате серотипа 11А к мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 11А в активированном полисахариде составляет, по меньшей мере, 0,7. В предпочтительном варианте осуществления, соотношение мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 11А в гликоконъюгате серотипа 11А к мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 11А в активированном полисахариде составляет, по меньшей мере, 0,9. В предпочтительном варианте осуществления, присутствие O-ацетильных групп определяют, используя ионно-ВЭЖХ анализ.

В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат серотипа 11А согласно изобретению содержит, по меньшей мере, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1,0 мМ глицерина на мМ полисахарида серотипа 11А. В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат серотипа 11А содержит, по меньшей мере, 0,2, 0,3 или 0,4 мМ глицерина на мМ полисахарида серотипа 11А. В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат серотипа 11А согласно изобретению содержит, по меньшей мере, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 или 0,9 мМ глицерина на мМ полисахарида серотипа 11А и меньше, чем приблизительно 1,0 мМ глицерина на мМ полисахарида серотипа 11А. В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат серотипа 11А согласно изобретению содержит, по меньшей мере, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, или 0,7 мМ глицерина на мМ полисахарида серотипа 11А и меньше, чем приблизительно 0,8 мМ глицерина на мМ полисахарида серотипа 11А. Какое-либо из указанного выше количества предполагается в качестве варианта осуществления изобретения.

Другой способ для того, чтобы охарактеризовать гликоконъюгаты серотипа 11А согласно изобретению, представляет собой количество лизиновых остатков в белке-носителе (например, CRM₁₉₇), которые становятся конъюгированными с сахаридом, которое может быть охарактеризовано, как диапазон конъюгированных лизинов (степень конъюгации).

Доказательство лизиновой модификации белка-носителя, за счет ковалентных связей с полисахаридами, могут быть получены с помощью аминокислотного анализа с использованием стандартных способов, известных квалифицированному специалисту в данной области. Конъюгация в результате приводит к уменьшению количества восстановленных лизиновых остатков по сравнению с исходным материалом белка CRM197, использованным для образования материалов конъюгата.

В предпочтительном варианте осуществления, степень конъюгации гликоконъюгата серотипа 11А согласно изобретению составляет от 1 до 15, от 1 до 13, от 1 до 10, от 1 до 8, от 1 до 6, от 1 до 5, от 1 до 4, от 2 до 15, от 2 до 13, от 2 до 10, от 2 до 8, от 2 до 6, от 2 до 5, от 2 до 4, от 5 до 15, от 5 до 10, от 8 до 15, от 8 до 12,от 10 до 15 или от 10 до 12. В одном варианте осуществления, степень конъюгации гликоконъюгата серотипа 11А согласно изобретению составляет приблизительно 1, приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4, приблизительно 5, приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11, приблизительно 12, приблизительно 13, приблизительно 14 или приблизительно 15. В предпочтительном варианте осуществления, степень конъюгации гликоконъюгата серотипа 11А согласно изобретению составляет от 1 до 6 или от 2 до 5. В некоторых таких вариантах осуществления, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇.

Гликоконъюгаты серотипа 11А согласно изобретению также могут быть охарактеризованы соотношением (масса/масса) сахарида к белку-носителю. В некоторых вариантах осуществления, соотношение сахарида к белку-носителю (масс./масс.) составляет от 0,2 до 4 (например, приблизительно 0,2, приблизительно 0,3, приблизительно 0,4, приблизительно 0,5, приблизительно 0,6, приблизительно 0,7, приблизительно 0,8, приблизительно 0,9, приблизительно 1,0, приблизительно 1,1, приблизительно 1,2, приблизительно 1,3, приблизительно 1,4, приблизительно 1,5, приблизительно 1,6, приблизительно 1,7, приблизительно 1,8, приблизительно 1,9, приблизительно 2,0, приблизительно 2,1, приблизительно 2,2, приблизительно 2,3, приблизительно 2,4, приблизительно 2,5, приблизительно 2,6, приблизительно 2,7, приблизительно 2,8, приблизительно 2,9, приблизительно 3,0, приблизительно 3,1, приблизительно 3,2, приблизительно 3,3, приблизительно 3.4, приблизительно 3,5, приблизительно 3,6, приблизительно 3,7, приблизительно 3,8, приблизительно 3,9 или приблизительно 4,0). В других вариантах осуществления, соотношение сахарида к белку-носителю (масс./масс.) составляет от 0,7 до 2,5, от 0,8 до 2,0, от 0,7 до 2,0, от 0,8 до 1,5, от 0,7 до 1,5, 0,7 до 1,4, от 0,8 до 1,4, от 0,7 до 1,45 или от 0,8 до 1,45. В следующих вариантах осуществления, соотношение сахарида к белку-носителю (масс./масс.) составляет от 0,8 до 1,6 (например, приблизительно 0,8, приблизительно 0,9 приблизительно 1,0, приблизительно 1,1, приблизительно 1,2, приблизительно 1,3, приблизительно 1,4, приблизительно 1,5 или приблизительно 1,6). В некоторых таких вариантах осуществления, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления, указанные гликоконъюгаты серотипа 11А получают с использованием восстановительного аминирования.

Гликоконъюгаты серотипа 11А и иммуногенная композиция согласно изобретению могут содержать свободный сахарид, который не является ковалентно конъюгированным с белком-носителем, но, тем не менее, присутствует в гликоконъюгатной композиции. Свободный сахарид может быть нековалентно ассоциированным с (то есть, нековалентно связанным с, адсорбированным на, или заключенным в или с) гликоконъюгатом.

В некоторых вариантах осуществления, гликоконъюгаты серотипа 11А согласно изобретению содержат меньше, чем приблизительно 50% свободного капсульного полисахарида серотипа 11А по сравнению с общим количеством капсульного полисахарида серотипа 11А, меньше, чем приблизительно 45% Свободный сахарид, меньше, чем приблизительно 40% Свободный сахарид, меньше, чем приблизительно 35% Свободный сахарид, меньше, чем приблизительно 30% Свободный сахарид, меньше, чем приблизительно 25% Свободный сахарид, меньше, чем приблизительно 20% Свободный сахарид, меньше, чем приблизительно 15% Свободный сахарид, меньше, чем приблизительно 10% Свободный сахарид, или меньше, чем приблизительно 5% свободного капсульного полисахарида серотипа 11А по сравнению с общим количеством капсульного полисахарида серотипа 11А. Предпочтительно, гликоконъюгат серотипа 11А содержит меньше, чем 15% Свободный сахарид, более предпочтительно меньше, чем 10% Свободный сахарид, и еще более предпочтительно, меньше, чем 5% Свободный сахарид.

Гликоконъюгаты серотипа 11А также могут быть охарактеризованы распределением по их молекулярным размерам (K_d). Гель-проникающая хроматография сред (CL-4B) может быть использована для определения распределения по относительным молекулярным размерам конъюгата, как указано выше.

В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере 30% гликоконъюгатов серотипа 11А согласно изобретению имеет K_d меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, или 85% гликоконъюгатов серотипа 11А согласно изобретению имеет K_d меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере, 60% гликоконъюгатов серотипа 11А согласно изобретению имеет K_d меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере, 65% гликоконъюгатов серотипа 11А согласно изобретению имеет K_d меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B.

1.3.8. Гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипа 8

В одном варианте осуществления, гликоконъюгаты серотипа 8 получают посредством активирования полисахарида тетрафторборатом 1-циано-4-диметиламинопиридиния (CDAP) с образованием цианатного сложного эфира. Активированный полисахарид может быть присоединен непосредственно или через спейсерную (линкерную) группу к аминогруппе на белке-носителе. Например, спейсер может представлять собой цистамин или цистеамин, дающий тиолированный полисахарид, который может быть присоединен к носителю посредством тиоэфирной связи, полученной после реакции с активированным малеимидом белком-носителем (например, с использованием GMBS) или галогенацетилированным белком-носителем (например, с использованием йодацетамида, SIB, SIAB, сульфо-SIAB, SIA, или SBAP). Предпочтительно, цианатный сложный эфир (необязательно полученный с использованием CDAP химии) соединен с гександиамином или гидразидом адипиновой кислоты (ADH), и амино-дериватизированный сахарид конъюгируют с белком-носителем с использованием карбодиимидной (например, EDAC или EDC) химии через карбоксильную группу на белковом носителе. Такие конъюгаты описаны, например, в WO 93/15760, WO 95/08348 и WO 96/129094.

Другие приемлемые способы используют карбодиимиды, гидразиды, активные сложные эфиры, норборан, n-нитробензойную кислота, N-гидроксисукцинимид, S-NHS, EDC, TSTU. Многие из них описаны в публикации международной заявки на патент № WO 98/42721. Конъюгация может включать карбонильный линкер, который может образовываться в результате реакции свободной гидроксильной группы сахарида с CDI (смотри Bethell et al. (1979) J. Biol. Chern. 254: 2572-2574; Hearn et al. (1981) J. Chromatogr,218: 509-518) с последующей реакцией с белком с образованием карбаматной связи. Это может включать восстановление аномерного конца до первичной гидроксильной группы, необязательное введение защиты/снятие защиты первичной гидроксильной группы, взаимодействие первичной гидроксильной группы с CDI с образованием CDI карбаматного промежуточного соединения и взаимодействие CDI карбаматного промежуточного соединения с аминогруппой на белке.

В предпочтительных вариантах осуществления, гликоконъюгаты серотипа 8 согласно изобретению получают с использованием восстановительного аминирования. Восстановительное аминирование включает две стадии, (1) окисление полисахарида с образованием альдегидных функциональных групп из вицинальных диолов в индивидуальной гексасахаридной единице, (2) восстановление активированного полисахарида и белка-носителя с образованием конъюгата.

Перед окислением, серотип 8 полисахарида необязательно гидролизуют для того, чтобы уменьшить его вязкость. Механический или химический гидролиз может быть использован. Химический гидролиз могут проводить с использованием уксусной кислоты.

Стадия окисления может включать реакцию с перйодатом. Для целей согласно представленному изобретению, термин "перйодат" включает как перйодат, так и перйодную кислота; термин также включает как метаперйодат (IO₄^-), так и ортоперйодат (IO₆^5-) и различные соли перйодата (например, натрия перйодат и калия перйодат). В одном варианте осуществления капсульный полисахарид серотип 8 из S. pneumoniae окисляют в присутствии метаперйодата, предпочтительно в присутствии натрия перйодата (NaIO₄). В другом варианте осуществления капсульный полисахарид серотипа 8 окисляют в присутствии ортоперйодата, предпочтительно в присутствии перйодной кислоты.

После стадии окисления полисахарида, полисахарид, как указывалось, активируют и в данном документе ниже называют как "активированный полисахарид". Активированный полисахарид может быть очищенным и Лиофилизированным (высушенными при заморозке).

Активированный полисахарид и белок-носитель могут быть лиофилизированными (высушенными при заморозке), или независимо друг от друга (отдельная лиофилизация) или вместе (совместно лиофилизированный). В одном варианте осуществления активированный полисахарид и белок-носитель лиофилизируют совместно. В другом варианте осуществления активированный полисахарид и белок-носитель лиофилизируют независимо друг от друга.

В одном варианте осуществления лиофилизация происходит в присутствии невосстанавливающего сахара, возможно невосстанавливающие сахара включают сахарозу, трегалозу, рафинозу, стахиозу, мелецитозу, декстран, маннит, лактит и палатинит.

Вторая стадия процесса конъюгирования представляет собой восстановление активированного полисахарида и белка-носителя с образованием конъюгата (восстановительное аминирование), с использованием восстанавливающего агента. Восстанавливающие агенты, которые являются приемлемыми, включают цианоборгидриды, такие как натрия цианоборгидрид, боран-пиридин, или боргидрид-обменная смола. В одном варианте осуществления восстанавливающий агент представляет собой натрия цианоборгидрид.

В одном варианте осуществления, восстановительную реакцию проводят в водном растворителе, в другом варианте осуществления реакцию проводят в апротонном растворителе. В одном варианте осуществления, восстановительную реакцию проводят в ДМСО (диметилсульфоксиде) или в ДМФ (диметилформамиде) как растворителе. Растворитель ДМСО или ДМФ может быть использован для восстановления активированного полисахарида и белка-носителя, которые были лиофилизирован.

В одном варианте осуществления от 0,1 до 3,0, от 0,15 до 2,0, от 0,2 до 1,0, или от 0,25 до 0,5 молярных эквивалентов натрия цианоборгидрида используют в восстановительной реакции. В одном варианте осуществления приблизительно 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,9 или 3,0 молярных эквивалентов натрия цианоборгидрида используют в восстановительной реакции.

В одном варианте осуществления восстанавливающий агент представляет собой натрия триацетоксиборгидрид. В следующем варианте осуществления от 1,0 до 6,0 молярных эквивалентов, от 2,0 до 5,0 молярных эквивалентов или приблизительно 3,0 молярных эквивалентов натрия триацетоксиборгидрида используют в восстановительной реакции.

По окончании восстановительной реакции, в конъюгатах могут оставаться непрореагировавшие альдегидные группы, они могут быть блокированы приемлемым блокирующим агентом. В одном варианте осуществления данный блокирующий агент представляет собой натрия боргидрид (NaBH₄). В одном варианте осуществления блокирование достигается путем смешивания восстановительной реакции с от 0,5 до 5,0 молярными эквивалентами NaBH₄, например, приблизительно 1,0, 1,5, 2,0, 2,5 или 3,0 молярными эквивалентами NaBH₄.

После конъюгирования (восстановительной реакции и необязательно блокирования), гликоконъюгаты могут быть очищены. Гликоконъюгаты могут быть очищены с использованием диафильтрации и/или ионно-обменной хроматографии и/или гель-проникающей хроматографии. В одном варианте осуществления, гликоконъюгаты чистят с использованием диафильтрации и/или ионно-обменной хроматографии и/или гель-проникающей хроматографии.

В одном варианте осуществления гликоконъюгаты подвергают стерилизующему фильтрованию.

В некоторых вариантах осуществления, гликоконъюгаты серотипа 8 согласно представленному изобретению являются конъюгированными с белком-носителем (например, CRM₁₉₇) и содержат сахарид, имеющий молекулярную массу от 10 кДа до 2000 кДа. В других таких вариантах осуществления, сахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 2000 кДа. В следующих таких вариантах осуществления, сахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 1750 кДа; от 50 кДа до 1500 кДа; от 50 кДа до 1250 кДа; от 50 кДа до 1000 кДа; от 50 кДа до 750 кДа; от 50 кДа до 500 кДа; от 100 кДа до 2000 кДа; от 100 кДа до 1750 кДа; от 100 кДа до 1500 кДа; от 100 кДа до 1250 кДа; от 100 кДа до 1000 кДа; от 100 кДа до 750 кДа; от 100 кДа до 500 кДа; от 200 кДа до 2000 кДа; от 200 кДа до 1750 кДа; от 200 кДа до 1500 кДа; от 200 кДа до 1250 кДа; от 200 кДа до 1000 кДа; от 200 кДа до 750 кДа; или от 200 кДа до 500 кДа; или от 200 кДа до 400 кДа. В одном варианте осуществления, указанные гликоконъюгаты серотипа 8 получают с использованием восстановительного аминирования.

В некоторых вариантах осуществления, гликоконъюгат серотипа 8 согласно изобретению имеет молекулярную массу от 50 кДа до 20000 кДа. В других вариантах осуществления, гликоконъюгат серотипа 8 имеет молекулярную массу от 50 кДа до 15000 кДа. В других вариантах осуществления, гликоконъюгат серотипа 8 имеет молекулярную массу от 500 кДа до 10000 кДа. В других вариантах осуществления, гликоконъюгат серотипа 8 имеет молекулярную массу от 200 кДа до 10000 кДа. В еще других вариантах осуществления, гликоконъюгат серотипа 8 имеет молекулярную массу от 1000 кДа до 8000 кДа или от 2000 кДа до 8000 кДа.

В следующих вариантах осуществления, гликоконъюгат серотипа 8 согласно изобретению имеет молекулярную массу от 200 кДа до 20000 кДа; от 200 кДа до 15000 кДа; от 200 кДа до 10000 кДа; от 200 кДа до 7500 кДа; от 200 кДа до 5000 кДа; от 200 кДа до 3000 кДа; от 200 кДа до 1000 кДа; от 500 кДа до 20000 кДа; от 500 кДа до 15000 кДа; от 500 кДа до 12500 кДа; от 500 кДа до 10000 кДа; от 500 кДа до 7500 кДа; от 500 кДа до 6000 кДа; от 500 кДа до 5000 кДа; от 500 кДа до 4000 кДа; от 500 кДа до 3000 кДа; от 500 кДа до 2000 кДа; от 500 кДа до 1500 кДа; от 500 кДа до 1000 кДа; от 750 кДа до 20000 кДа; от 750 кДа до 15000 кДа; от 750кДа до 12500 кДа; от 750кДа до 10000 кДа; от 750 кДа до 7500 кДа; от 750 кДа до 6000 кДа; от 750 кДа до 5000 кДа; от 750 кДа до 4000 кДа; от 750 кДа до 3000 кДа; от 750 кДа до 2000 кДа; от 750 кДа до 1500 кДа; от 1000 кДа до 15000 кДа; от 1000 кДа до 12500 кДа; от 1000 кДа до 10000 кДа; от 1000 кДа до 7500 кДа; от 1000 кДа до 6000 кДа; от 1000 кДа до 5000 кДа; от 1000 кДа до 4000 кДа; от 1000 кДа до 2500 кДа; от 2000 кДа до 15000 кДа; от 2000 кДа до 12500 кДа; от 2000 кДа до 10000 кДа; от 2000 кДа до 7500 кДа; от 2000 кДа до 6000 кДа; от 2000 кДа до 5000 кДа; от 2000 кДа до 4000 кДа; или от 2000 кДа до 3000 кДа.

В следующих вариантах осуществления, гликоконъюгат серотипа 8 согласно изобретению имеет молекулярную массу от 3000 кДа до 20000 кДа; от 3000 кДа до 15000 кДа; от 3000 кДа до 10000 кДа; от 3000 кДа до 7500 кДа; от 3000 кДа до 5000 кДа; от 4000 кДа до 20000 кДа; от 4000 кДа до 15000 кДа; от 4000 кДа до 12500 кДа; от 4000 кДа до 10000 кДа; от 4000 кДа до 7500 кДа; от 4000 кДа до 6000 кДа; или от 4000 кДа до 5000 кДа. В следующих вариантах осуществления, гликоконъюгат серотипа 8 согласно изобретению имеет молекулярную массу от 5000 кДа до 20000 кДа; от 5000 кДа до 15000 кДа; от 5000 кДа до 10000 кДа или от 5000 кДа до 7500 кДа. В следующих вариантах осуществления, гликоконъюгат серотипа 8 согласно изобретению имеет молекулярную массу от 6000 кДа до 20000 кДа; от 6000 кДа до 15000 кДа; от 6000 кДа до 10000 кДа или от 6000 кДа до 7500 кДа.

В следующих вариантах осуществления, гликоконъюгат серотипа 8 согласно изобретению имеет молекулярную массу от 7000 кДа до 20000 кДа; от 7000 кДа до 15000 кДа; от 7000 кДа до 10000 кДа или от 7000 кДа до 8000 кДа. В следующих вариантах осуществления, гликоконъюгат серотипа 8 согласно изобретению имеет молекулярную массу от 8000 кДа до 20000 кДа; от 8000 кДа до 15000 кДа; или от 8000 кДа до 10000 кДа.

В одном варианте осуществления, указанные гликоконъюгаты серотипа 8 получают с использованием восстановительного аминирования.

Другой способ для того, чтобы охарактеризовать гликоконъюгаты серотипа 8 согласно изобретению, представляет собой количество лизиновых остатков в белке-носителе (например, CRM₁₉₇), которые становятся конъюгированными с сахаридом, которое может быть охарактеризовано как диапазон конъюгированных лизинов (степень конъюгации).

Доказательство лизиновой модификации белка-носителя, за счет ковалентных связей с полисахаридами, могут быть получены с помощью аминокислотного анализа с использованием стандартных способов, известных квалифицированному специалисту в данной области. В многочисленных вариантах осуществления, белок-носитель является ковалентно конъюгированным с активированным полисахаридом посредством аминной связи с одной или больше ε-аминогрупп лизиновых остатков на белке-носителе. В некоторых таких вариантах осуществления, белок-носитель содержит от 2 до 20 лизиновых остатков ковалентно конъюгированных с сахаридом. В других таких вариантах осуществления, белок-носитель содержит от 4 до 16 или от 6 до 14 лизиновых остатков ковалентно конъюгированных с сахаридом.

В предпочтительном варианте осуществления, степень конъюгации гликоконъюгата серотипа 8 согласно изобретению составляет от 2 до 20, от 2 до 15, от 2 до 13,от 2 до 10, от 2 до 8,от 2 до 6, от 2 до 5, от 2 до 4, от 3 до 15,от 3 до 13, от 3 до 10, от 3 до 8, от 3 до 6, от 3 до 5, от 3 до 4, от 5 до 15,от 5 до 10, от 8 до 15, от 8 до 12,от 10 до 15 или от 10 до 12. В одном варианте осуществления, степень конъюгации гликоконъюгата серотипа 8 согласно изобретению составляет приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4, приблизительно 5, приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11, приблизительно 12, приблизительно 13, приблизительно 14 или приблизительно 15. В предпочтительном варианте осуществления, степень конъюгации гликоконъюгата серотипа 8 согласно изобретению составляет от 4 до 16 или от 6 до 14. В некоторых таких вариантах осуществления, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇.

В предпочтительном варианте осуществления, белок-носитель содержит CRM₁₉₇, который содержит 39 лизиновых остатков. В некоторых таких вариантах осуществления, CRM₁₉₇ может содержать от 4 до 16 или от 6 до 14 лизиновых остатков из 39, ковалентно связанных с сахаридом. Другой способ выразить данный параметр состоит в том, что от приблизительно 10% до приблизительно 41% или от приблизительно 15% до приблизительно 36% лизинов CRM₁₉₇ ковалентно связаны с сахаридом. В другом таком варианте осуществления, CRM₁₉₇ может содержать от 2 до 20 лизиновых остатков из 39, ковалентно связанных с сахаридом. Другой способ выразить данный параметр состоит в том, что от приблизительно 5% до приблизительно 50% лизинов CRM₁₉₇ являются ковалентно связанными с сахаридом. В некоторых таких вариантах осуществления, CRM₁₉₇ может содержать приблизительно 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, или 16 лизиновых остатков из 39, ковалентно связанных с сахаридом.

Гликоконъюгаты серотипа 8 согласно изобретению также могут быть охарактеризованы соотношением (масса/масса) сахарида к белку-носителю. В некоторых вариантах осуществления, соотношение сахарида к белку-носителю (масс./масс.) составляет от 0,2 до 4,0 (например, приблизительно 0,2, приблизительно 0,3, приблизительно 0,4, приблизительно 0,5, приблизительно 0,6, приблизительно 0,7, приблизительно 0,8, приблизительно 0,9, приблизительно 1,0, приблизительно 1,1, приблизительно 1,2, приблизительно 1,3, приблизительно 1,4, приблизительно 1,5, приблизительно 1,6, приблизительно 1,7, приблизительно 1,8, приблизительно 1,9, приблизительно 2,0, приблизительно 2,1, приблизительно 2,2, приблизительно 2,3, приблизительно 2,4, приблизительно 2,5, приблизительно 2,6, приблизительно 2,7, приблизительно 2,8, приблизительно 2,9, приблизительно 3,0, приблизительно 3,1, приблизительно 3,2, приблизительно 3,3, приблизительно 3,4, приблизительно 3,5, приблизительно 3,6, приблизительно 3,7, приблизительно 3,8, приблизительно 3,9 или приблизительно 4,0). В других вариантах осуществления, соотношение сахарида к белку-носителю (масс./масс.) составляет от 0,7 до 2,5. В следующих вариантах осуществления, соотношение сахарида к белку-носителю (масс./масс.) составляет от 0,8 до 1,5 (например, приблизительно 0,8, приблизительно 0,9 приблизительно 1,0, приблизительно 1,1, приблизительно 1,2, приблизительно 1,3, приблизительно 1,4 или приблизительно 1,5). В некоторых таких вариантах осуществления, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления, указанные гликоконъюгаты серотипа 8 получают с использованием восстановительного аминирования.

Гликоконъюгаты серотипа 8 и иммуногенная композиция согласно изобретению могут содержать свободный сахарид, который не является ковалентно конъюгированным с белком-носителем, но, тем не менее, присутствует в гликоконъюгатной композиции. Свободный сахарид может быть нековалентно ассоциированным с (то есть, нековалентно связанным с, адсорбированным на, или заключенным в или с) гликоконъюгатом.

В некоторых вариантах осуществления, гликоконъюгаты серотипа 8 согласно изобретению содержат меньше, чем приблизительно 50% Свободный сахарид, меньше, чем приблизительно 45% Свободный сахарид, меньше, чем приблизительно 40% Свободный сахарид, меньше, чем приблизительно 35% Свободный сахарид, меньше, чем приблизительно 30% Свободный сахарид, меньше, чем приблизительно 25% Свободный сахарид, меньше, чем приблизительно 20% Свободный сахарид, меньше, чем приблизительно 15% Свободный сахарид, меньше, чем приблизительно 10% Свободный сахарид, или меньше, чем приблизительно 5% Свободный сахарид по отношению к общему количеству сахарида серотипа 8. Предпочтительно, гликоконъюгат серотипа 8 содержит меньше, чем 15% Свободный сахарид, более предпочтительно меньше, чем 10% Свободный сахарид, и еще более предпочтительно, меньше, чем 5% Свободный сахарид.

Гликоконъюгаты серотипа 8 также могут быть охарактеризованы распределением по их молекулярным размерам (K_d). Гель-проникающая хроматография сред (CL-4В) может быть использована для определения распределения по относительным молекулярным размерам конъюгата. Гель-проникающую хроматографию (SEC) используют в колонках с подачей самотеком к профилю распределения по молекулярным размерам конъюгатов. Большие молекулы, исключенные из пор, в средах элюируются более быстро, чем малые молекулы. Сборники для фракций используются для сбора элюата колонки. Фракции исследуют колориметрически, используя сахаридный анализ. Для определения K_d, колонки калибруют, чтобы установить фракцию, в которой молекулы полностью исключены (V₀), (K_d=0), и фракцию, которая представляет собой максимальное удерживание (V_i), (K_d=1). Фракция, в которой достигается указанная характеристика образца (V_e), связана с K_d выражением, K_d=(V_e-V₀)/(V_i-V₀).

В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере, 40% гликоконъюгатов серотипа 8 согласно изобретению имеют K_d меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, или 85% гликоконъюгатов серотипа 8 согласно изобретению имеют K_d меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере, 60% гликоконъюгатов серотипа 8 согласно изобретению имеют K_d меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере, 70% гликоконъюгатов серотипа 8 согласно изобретению имеют K_d меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B.

В предпочтительном варианте осуществления, от 40% до 90% гликоконъюгатов серотипа 8 имеют K_d меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, от 50% до 90% гликоконъюгатов серотипа 8 имеют K_d меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B. В предпочтительном варианте осуществления, от 65% до 80% гликоконъюгатов серотипа 8 имеют K_d меньшее или равное 0,3 в колонке CL-4B.

1.4 Комбинации гликоконъюгатов согласно изобретению

В одном варианте осуществления иммунногенная композиция согласно изобретению содержит какой-либо из гликоконъюгатов, раскрытых в данном документе.

В одном варианте осуществления иммунногенная композиция согласно изобретению содержит, по меньшей мере, один гликоконъюгат, выбранный из группы, состоящей из гликоконъюгата из S. pneumoniae серотипа 15В (такого как гликоконъюгаты из раздела 1.3.4 выше), гликоконъюгата из S. pneumoniae серотипа 22F (такого как гликоконъюгаты из раздела 1.3.2 выше), гликоконъюгата из S. pneumoniae серотип 33F (такого как гликоконъюгаты из раздела 1.3.3 выше), гликоконъюгата из S. pneumoniae серотип 12F (такого как гликоконъюгаты из раздела 1.3.5 выше), гликоконъюгата из S. pneumoniae серотипа 10А (такого как гликоконъюгаты из раздела 1.3.6 выше), гликоконъюгата из S. pneumoniae серотипа 11А (такого как гликоконъюгаты из раздела 1.3.7 выше) и гликоконъюгата из S. pneumoniae серотипа 8 (такого как гликоконъюгаты из раздела 1.3.8 выше).

В одном варианте осуществления иммунногенная композиция согласно изобретению содержит, по меньшей мере, один гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 15В, такой как гликоконъюгат из раздела 1.3.4 выше. В одном варианте осуществления иммунногенная композиция согласно изобретению содержит, по меньшей мере, один гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 22F, такой как те, которые раскрыты в разделе 1.3.2 выше. В одном варианте осуществления иммунногенная композиция согласно изобретению содержит, по меньшей мере, один гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 33F, такой как те, которые раскрыты в разделе 1.3.3 выше. В одном варианте осуществления иммунногенная композиция согласно изобретению содержит, по меньшей мере, один гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 12F, такой как те, которые раскрыты в разделе 1.3.5 выше. В одном варианте осуществления иммунногенная композиция согласно изобретению содержит, по меньшей мере, один гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 10А, такой как те, которые раскрыты в разделе 1.3.6 выше. В одном варианте осуществления иммунногенная композиция согласно изобретению содержит, по меньшей мере, один гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 11А, такой как те, которые раскрыты в разделе 1.3.7 выше. В одном варианте осуществления иммунногенная композиция согласно изобретению содержит, по меньшей мере, один гликоконъюгат из S. Pneumoniae серотипаа 8, такой как те, которые раскрыты в разделе 1.3.8 выше.

В одном варианте осуществления иммунногенная композиция согласно изобретению содержит, по меньшей мере, один гликоконъюгат каждого из двух S. Pneumoniae серотипов, выбранных из группы, состоящей из: 15В и 22F, 15В и 33F, 15В и 12F, 15В и 10А, 15В и 11А, 15В и 8, 22F и 33F, 22F и 12F, 22F и 10А, 22F и 11А, 22F и 8, 33F и 12F, 33F и 10А, 33F и 11А, 33F и 8, 12F и 10А, 12F и 11А, 12F и 8, 10А и 11А, 10А и 8, и 11А и 8.

В одном варианте осуществления иммунногенная композиция согласно изобретению содержит, по меньшей мере, один гликоконъюгат каждого из трех следующих S. Pneumoniae серотипов:

15B и 22F и 33F,

15B и 22F и 12F,

15B и 22F и 10A,

15B и 22F и 11A,

15B и 22F и 8,

15B и 33F и 12F,

15B и 33F и 10A,

15В и 33F и 11А,

15B и 33F и 8,

15В и 12F и 10A,

15B и 12F и 11A,

15B и 12F и 8,

15В и 10А и 11A,

15В и 10А и 8,

15В и 11А и 8,

22F и 33F и 12F,

22F и 33F и 10А,

22F и 33F и 11А,

22F и 33F и 8,

22F и 12F и 10А,

22F и 12F и 11А,

22F и 12F и 8,

22F и 10А и 11А,

22F и 10А и 8,

22F и 11A и 8,

33F и 12F и 10А,

33F и 12F и 11A,

33F и 12F и 8,

33F и 10А и 11А,

33F и 10А и 8,

33F и 11A и 8,

12F и 10A и 11A,

12F и 10А и 8,

12F и 11А и 8, или

10А и 11А и 8.

В одном варианте осуществления иммунногенная композиция согласно изобретению содержит, по меньшей мере, один гликоконъюгат каждого из четырех следующих S. Pneumoniae серотипов:

15В и 22F и 33F и 12F,

15В и 22F и 33F и 10А,

15B и 22F и 33F и 11A,

15B и 22F and 33F и 8,

15B и 22F и 12А и 10А,

15В и 22F и 12F и 11А,

15B и 22F и 12F и 8,

15В и 22F и 10А и 11А,

15B и 22F и 10А и 8,

15В и 22F и 11А и 8,

15В и 33F и 12F и 10А,

15В и 33F и 12F и 11А,

15В и 33F и 12F и 8,

15В и 33F и 10А и 11А,

15В и 33F и 10А и 8,

15В и 33F и 11А и 8,

15В и 12F и 10А и 11А,

15В и 12F и 10А и 8,

15В и 12F и 11А и 8,

15В и 10А и 11А и 8,

22F и 33F и 12F и 10А,

22F и 33F и 12F и 11А,

22F и 33F и 12F и 8,

22F и 33F и 10А и 11А,

22F и 33F и 10А и 8,

22F и 33F и 11А и 8,

22F и 12F и 10А и 11А,

22F и 12F и 10А и 8,

22F и 12F и 11А и 8,

22F и 10А и 11А и 8,

33F и 12F и 10A и 11A,

33F и 12F и 10A и 8,

33F и 12F и 11А и 8,

33F и 10A и 11А и 8 или

12F и 10А и 11А и 8.

В одном варианте осуществления иммунногенная композиция согласно изобретению содержит, по меньшей мере, один гликоконъюгат каждого из пяти следующих S. pneumoniae серотипов:

15В и 22F и 33F и 12F и 10А,

15B и 22F и 33F и 12F и 11А,

15В и 22F и 33F и 12F и 8,

15В и 22F и 33F и 10А и 11А,

15В и 22F и 33F и 10А и 8,

15В и 22F и 33F и 11А и 8,

15В и 22F и 12F и 10А и 11А,

15В и 22F и 12F и 10А и 8,

15В и 22F и 12F и 11А и 8,

15B и 22F и 10А и 11А и 8,

15B и 33F и 12F и 10А и 11А,

15B и 33F и 12F и 10А и 8,

15В и 33F и 12F и 11А и 8,

15В и 33F и 10А и 11А и 8,

15В и 12F и 10А и 11А и 8,

22F и 33F и 12F и 10А и 11А,

22F и 33F и 12F и 10A и 8,

22F и 33F и 12F и 11А и 8,

22F и 33F и 10A и 11А и 8,

22F и 12F и 10А и 11А и 8 или

33F и 12F и 10А и 11А и 8.

В одном варианте осуществления иммунногенная композиция согласно изобретению содержит, по меньшей мере, один гликоконъюгат каждого из шести следующих S. pneumoniae серотипов:

15В и 22F и 33F и 12F и 10А и 11А,

15В и 22F и 33F и 12F и 10А и 8,

15B и 22F и 33F и 12F и 11А и 8,

15В и 22F и 33F и 10А и 11А и 8,

15В и 22F и 12F и 10А и 11А и 8,

15В и 33F и 12F и 10А и 11А и 8 or

22F и 33F и 12F и 10А и 11А и 8.

В одном варианте осуществления иммунногенная композиция согласно изобретению содержит, по меньшей мере, один гликоконъюгат каждого из семи следующих S. pneumoniae серотипов: 15В и 22F и 33F и 12F и 10А и 11А и 8.

В одном варианте осуществления гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипов 15В, 22F, 33F, 12F, 10А, 11А и/или 8 какой-либо из иммунногенных композиций определенных в данном разделе являются такими, как раскрыто в разделах с 1.3.2 по 1.3.8 выше.

В одном варианте осуществления какая-либо из иммуногенных композиций, указанных выше, содержит, кроме того, гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипов 4, 6В, 9V, 14, 18С, 19F и 23F (такие как гликоконъюгаты из раздела 1.3.1 выше).

В одном варианте осуществления какая-либо из иммуногенных композиций, указанных выше, содержит, кроме того, гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипов 1, 5 и 7F (такие как гликоконъюгаты из раздела 1.3.1 выше).

В одном варианте осуществления какая-либо из иммуногенных композиций, указанных выше, содержит, кроме того, гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипов 6А и 19А (таких как гликоконъюгаты из раздела 1.3.1 выше).

В одном варианте осуществления какая-либо из иммуногенных композиций, указанных выше, содержит, кроме того, гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипа 3 (такого как гликоконъюгаты из раздела 1.3.1 выше).

Предпочтительно, все гликоконъюгаты из указанной выше иммуногенной композиции, являются по отдельности конъюгированными с белком-носителем.

В одном варианте осуществления какой-либо из указанных выше иммуногенных композиций, гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипа 22F конъюгируют с CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления какой-либо из указанных выше иммуногенных композиций, гликоконъюгаты из S. Pneumoniae серотипа 33F конъюгируют с CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления какой-либо из указанных выше иммуногенных композиций, гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипа 15В конъюгируют с CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления какой-либо из указанных выше иммуногенных композиций, гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипа 12F конъюгируют с CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления какой-либо из указанных выше иммуногенных композиций, гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипа 10A конъюгируют с CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления какой-либо из указанных выше иммуногенных композиций, гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипа 11А конъюгируют с CRM₁₉₇ . В одном варианте осуществления какой-либо из указанных выше иммуногенных композиций, гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипа 8 конъюгируют с CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления какой-либо из указанных выше иммуногенных композиций, гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипов 4, 6В, 9V, 14, 18С, 19F и 23F являются конъюгированными с CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления какой-либо из указанных выше иммуногенных композиций, гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипов 1, 5 и 7F являются конъюгированными с CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления какой-либо из указанных выше иммуногенных композиций, гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипов 6А и 19А являются конъюгированными с CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления какой-либо из указанных выше иммуногенных композиций, гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипа 3 конъюгируют с CRM₁₉₇.

В одном варианте осуществления, гликоконъюгаты какой-либо из указанных выше иммуногенных композиций все по-отдельности конъюгированы с CRM₁₉₇.

В одном варианте осуществления, гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14 и/или 23F какой-либо из указанных выше иммуногенных композиций по-отдельности конъюгированы с PD.

В одном варианте осуществления, гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 18С какой-либо из указанных выше иммуногенных композиций конъюгирован с ТТ.

В одном варианте осуществления, гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 19F какой-либо из указанных выше иммуногенных композиций конъюгирован с DT.

В одном варианте осуществления, гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14 и/или 23F какой-либо из указанных выше иммуногенных композиций по-отдельности конъюгированы с PD, гликоконъюгат из S. pneumoniae серотип 18С конъюгирован с ТТ, и гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 19F конъюгирован с DT.

В одном варианте осуществления указанная выше иммуногенная композиция содержит от 8 до 20 различных серотипов из S. pneumoniae. В одном варианте осуществления указанная выше иммуногенная композиция содержит гликоконъюгаты из 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 различных серотипов. В одном варианте осуществления указанная выше иммуногенная композиция содержит гликоконъюгаты из 16 или 20 различных серотипов.

В одном варианте осуществления указанная выше иммуногенная композиция представляет собой 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20-валентные пневмококковые конъюгированные композиции. В одном варианте осуществления указанная выше иммуногенная композиция представляет собой 14, 15, 16, 17, 18 или 19-валентные пневмококковые конъюгированные композиции. В одном варианте осуществления указанная выше иммуногенная композиция представляет собой 16-валентные пневмококковые конъюгированные композиции. В одном варианте осуществления указанная выше иммуногенная композиция представляет собой 19-валентные пневмококковые конъюгированные композиции.

1. В одном варианте осуществления иммунногенная композиция согласно изобретению содержит, по меньшей мере, один гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 15В, такой как гликоконъюгаты из раздела 1.3.4 выше.

2. В другом варианте осуществления иммунногенная композиция согласно изобретению содержит в дополнение к пункту 1, указанному выше, по меньшей мере, один гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 22F, такой как те, которые раскрыты в разделе 1.3.2 выше.

3. В другом варианте осуществления иммунногенная композиция согласно изобретению содержит в дополнение к пункту 1 или 2, указанному выше, по меньшей мере, один гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 33F, такой как те, которые раскрыты в разделе 1.3.3 выше.

4. В другом варианте осуществления иммунногенная композиция согласно изобретению содержит в дополнение к пункту 1, 2 или 3, указанному выше, по меньшей мере, один гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 12F, такой как те, которые раскрыты в разделе 1.3.5 выше.

5. В другом варианте осуществления иммунногенная композиция согласно изобретению содержит в дополнение к пункту 1,2,3 или 4, указанному выше, по меньшей мере, один гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 10А, такой как те, которые раскрыты в разделе 1.3.6 выше.

6. В другом варианте осуществления иммунногенная композиция согласно изобретению содержит в дополнение к пункту 1, 2, 3, 4 или 5, указанному выше, по меньшей мере, один гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 11А, такой как те, которые раскрыты в разделе 1.3.7 выше.

7. В другом варианте осуществления иммунногенная композиция согласно изобретению содержит в дополнение к пункту 1, 2, 3, 4, 5 или 6, указанному выше, по меньшей мере, один гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 8, такой как те, которые раскрыты в разделе 1.3.8 выше.

8. В другом варианте осуществления иммунногенная композиция согласно изобретению содержит в дополнение к пункту 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7, указанному выше, гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипов 4, 6В, 9V, 14, 18С, 19F и 23F, такие как гликоконъюгаты из раздела 1.3.1 выше.

9. В другом варианте осуществления иммунногенная композиция согласно изобретению содержит в дополнение к пункту 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8, указанному выше, гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипов 1, 5 и 7F, такие как гликоконъюгаты из раздела 1.3.1 выше.

10. В другом варианте осуществления иммунногенная композиция согласно изобретению содержит в дополнение к пункту 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9, указанному выше, гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипов 6А и 19А, такие как гликоконъюгаты из раздела 1.3.1 выше.

11. В другом варианте осуществления иммунногенная композиция согласно изобретению содержит в дополнение к пункту 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10, указанному выше, гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипа 3, такие как гликоконъюгаты из раздела 1.3.1 выше.

В одном варианте осуществления, иммунногенная композиция согласно изобретению содержит гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипов 1,3,4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F.

В одном варианте осуществления, иммунногенная композиция согласно изобретению содержит гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F.

В одном варианте осуществления, иммунногенная композиция согласно изобретению содержит конъюгированные сахариды из S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9V, 10А, 11А, 12F, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F.

В одном варианте осуществления, иммунногенная композиция согласно изобретению содержит конъюгированные сахариды из S. pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9V, 10А, 11А, 12F, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F.

В одном варианте осуществления, гликоконъюгаты иммунногенной композиции согласно изобретению содержат гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F. В одном варианте осуществления, гликоконъюгаты иммунногенной композиции согласно изобретению содержат гликоконъюгаты серотипов 1, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F. В одном варианте осуществления, гликоконъюгаты иммунногенной композиции согласно изобретению содержат гликоконъюгаты серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9V, 10А, 11А, 12F, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F. В одном варианте осуществления, гликоконъюгаты иммунногенной композиции согласно изобретению содержат гликоконъюгаты от 1, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9V, 10А, 11А, 12F, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F.

Предпочтительно, все гликоконъюгаты иммунногенной композиции согласно изобретению (например, по какому-либо из пунктов 1-11, указанных выше) являются по-отдельности конъюгированными с белком-носителем.

В одном варианте осуществления, гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14 и/или 23F по какому-либо из пунктов 8-11, указанных выше, являются по-отдельности конъюгированными с PD.

В одном варианте осуществления, гликоконъюгат из S. Pneumoniae серотипа 18С по какому-либо из пунктов 8-11, указанных выше, конъюгирован с ТТ.

В одном варианте осуществления, гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 19F по какому-либо из пунктов 8-11, указанных выше, конъюгирован с DT.

В одном варианте осуществления по какому-либо из пунктов 8-11, указанных выше, гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14 и/или 23F по-отдельности конъюгированы с PD, гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 18С конъюгирован с ТТ, и гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 19F конъюгирован с DT.

В одном варианте осуществления по какому-либо из пунктов 1-11, указанных выше, гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 22F конъюгирован с CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления по какому-либо из пунктов 2-11, указанных выше, гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 33F конъюгирован с CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления по какому-либо из пунктов 3-11, указанных выше, гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 15В конъюгирован с CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления по какому-либо из пунктов 4-11, указанных выше, гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 12F конъюгирован с CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления по какому-либо из пунктов 5-11, указанных выше, гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 10А конъюгирован с CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления по какому-либо из пунктов 6-11, указанных выше, гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 11А конъюгирован с CRM₁₉₇ . В одном варианте осуществления по какому-либо из пунктов 7-11, указанных выше, гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 8 конъюгирован с CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления по какому-либо из пунктов 8-11, указанных выше, гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипов 4, 6В, 9V, 14, 18С, 19F и 23F являются конъюгированными с CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления по какому-либо из пунктов 9-11, указанных выше, гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипов 1, 5 и 7F являются конъюгированными с CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления по какому-либо из пунктов 10 или 11, указанных выше, гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипов 6А и 19А являются конъюгированными с CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления по пункту 11, указанному выше, гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 3 конъюгирован с CRM₁₉₇.

В одном варианте осуществления тжоюнъютэгт имтаунногенной композиции по пунктам 1-11, указанным выше по-отдельности конъюгированы с CRM₁₉₇.

В одном варианте осуществления иммунногенная композиция согласно изобретению содержит от 12 до 20 различных серотипов S. pneumoniae. В одном варианте осуществления иммунногенная композиция согласно изобретению содержит гликоконъюгаты из 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 различных серотипов. В одном варианте осуществления иммунногенная композиция согласно изобретению содержит гликоконъюгаты из 16 или 20 различных серотипов.

В одном варианте осуществления иммунногенная композиция по пунктам 1-11, указанным выше, представляет собой 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20-валентную пневмококковую конъюгированную композицию. В одном варианте осуществления иммунногенная композиция по пунктам 1-11, указанным выше, представляет собой 15, 16, 17, 18 или 19-валентную пневмококковую конъюгированную композицию. В одном варианте осуществления иммунногенная композиция по пунктам 1-11, указанным выше, представляет собой 16-валентную пневмококковую конъюгированную композицию. В одном варианте осуществления иммунногенная композиция по пунктам 1-11, указанным выше представляет собой 19-валентную пневмококковую конъюгированную композицию.

После конъюгирования капсульного полисахарида с белком-носителем, гликоконъюгаты чистят (обогащают по отношению к количеству конъюгата полисахарид-белок), используя различные способы. Данные способы включают операции концентрирования/диафильтрации, осаждения/элюирования, колоночную хроматографию, и глубинную фильтрацию (смотри, например, публикацию заявки на патент США №2007/0184072 или WO 2008/079653). После того, как индивидуальные гликоконъюгаты чистят, их смешивают для того, чтобы сформулировать иммунногенную композицию согласно представленному изобретению.

1.5 Дополнительные комбинации гликоконъюгатов согласно изобретению

В одном варианте осуществления какая-либо иммуногенная композиция, определенная в разделе 1.4, указанном выше, дополнительно содержит, по меньшей мере, один гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 9V.

В одном варианте осуществления какая-либо иммуногенная композиция, определенная в разделе 1.4, указанном выше, дополнительно содержит, по меньшей мере, один гликоконъюгат каждого из двух S. pneumoniae серотипов, выбранных из группы, состоящей из: 9V и 4, 9V и 6В, 9V и 14, 9V и 18С, 9V и 19F, 9V и 23F.

В одном варианте осуществления какая-либо иммуногенная композиция, определенная в разделе 1.4, указанном выше, дополнительно содержит, по меньшей мере, один гликоконъюгат каждого из семи следующих S. pneumoniae серотипов: 9V, 4, 6В, 14, 18С, 19F и 23F.

В одном варианте осуществления какая-либо иммуногенная композиция, определенная в разделе 1.4, указанном выше дополнительно содержит, по меньшей мере, один гликоконъюгат каждого из восьми следующих S. pneumoniae серотипов:

9V и 1 и 4 и 6В и 14 и 18С и 19F и 23F,

9V и 4 и 5 и 6В и 14 и 18С и 19F и 23F, или

9V и 4 и 6В и 7F и 14 и 18С и 19F и 23F.

В одном варианте осуществления какая-либо иммуногенная композиция, определенная в разделе 1.4, указанном выше, дополнительно содержит, по меньшей мере, один гликоконъюгат каждого из десяти следующих S. pneumoniae серотипов: 9V, 1, 5, 4, 6В, 7F, 14, 18С, 19F и 23F.

В одном варианте осуществления какая-либо иммуногенная композиция, определенная в разделе 1.4, указанном выше, дополнительно содержит, по меньшей мере, один гликоконъюгат каждого из одиннадцати следующих S. pneumoniae серотипов:

9V и 1 и 4 и 5 и 6А и 6В и 7F и 14 и 18С и 19F и 23F or

9V и 1 и 4 и 5 и 6В и 7F и 14 и 18С и 19А и 19F и 23F.

В одном варианте осуществления какая-либо иммуногенная композиция, определенная в разделе 1.4, указанном выше, дополнительно содержит, по меньшей мере, один гликоконъюгат каждого из двенадцати следующих S. pneumoniae серотипов: 9V, 1, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 14, 18С, 19А, 19F и 23F.

В одном варианте осуществления какая-либо иммуногенная композиция, определенная в разделе 1.4, указанном выше, дополнительно содержит, по меньшей мере, один гликоконъюгат каждого из тринадцати следующих S. pneumoniae серотипов: 9V, 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 14, 18С, 19А, 19F и 23F.

В одном варианте осуществления какая-либо иммуногенная композиция, определенная в разделе 1.4, указанном выше, содержит, кроме того, по меньшей мере, один гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 2.

В одном варианте осуществления какая-либо иммуногенная композиция, определенная в разделе 1.4, указанном выше, содержит, кроме того, по меньшей мере, один гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 17F.

В одном варианте осуществления какая-либо иммуногенная композиция, определенная в разделе 1.4, указанном выше, содержит, кроме того, по меньшей мере, один гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 20.

В одном варианте осуществления какая-либо иммуногенная композиция, определенная в разделе 1.4, указанном выше, содержит, кроме того, по меньшей мере, один гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 15С.

В одном варианте осуществления какая-либо иммуногенная композиция, определенная в разделе 1.4, указанном выше, содержит, кроме того, по меньшей мере, один гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 9N.

Предпочтительно, все гликоконъюгаты указанной выше иммуногенной композиции являются по-отдельности конъюгированными с белком-носителем.

В одном варианте осуществления какой-либо из указанных выше иммуногенных композиций, гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 9V конъюгирован с CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления какой-либо из указанных выше иммуногенных композиций, гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипов 4, 6В, 14, 18С, 19F и 23F являются конъюгированными с CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления какой-либо из указанных выше иммуногенных композиций, гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипов 1, 5 и 7F являются конъюгированными с CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления какой-либо из указанных выше иммуногенных композиций, гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипов 6А и 19А являются конъюгированными с CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления какой-либо из указанных выше иммуногенных композиций, гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 3 конъюгирован с CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления какой-либо из указанных выше иммуногенных композиций, гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 2 конъюгирован с CRM₁₉₇ . В одном варианте осуществления какой-либо из указанных выше иммуногенных композиций, гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 17F конъюгирован с CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления какой-либо из указанных выше иммуногенных композиций, гликоконъюгат из S. Pneumoniae серотипа 20 конъюгирован с CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления какой-либо из указанных выше иммуногенных композиций, гликоконъюгат из S. Pneumoniae серотипа 15С конъюгирован с CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления какой-либо из указанных выше иммуногенных композиций, гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 9N конъюгирован с CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления, гликоконъюгаты указанной выше иммуногенной композиции все по-отдельности конъюгированы с CRM₁₉₇.

В другом варианте осуществления, гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 9V какой-либо из указанных выше иммуногенных композиций отдельно конъюгирован cPD.

В одном варианте осуществления, гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14 и/или 23F какой-либо из указанных выше иммуногенных композиций являются по-отдельности конъюгированными с PD.

В одном варианте осуществления, гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 18С какой-либо из указанных выше иммуногенных композиций конъюгирован с ТТ.

В одном варианте осуществления, гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 19F какой-либо из указанных выше иммуногенных композиций конъюгирован с DT.

В одном варианте осуществления, гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14 и/или 23F какой-либо из указанных выше иммуногенных композиций являются по-отдельности конъюгированными с PD, гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 18С конъюгирован с ТТ, и гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 19F конъюгирован с DT.

В одном варианте осуществления указанная выше иммуногенная композиция содержит от 7 до 25 различных серотипов S. pneumoniae. В одном варианте осуществления указанная выше иммуногенная композиция содержит гликоконъюгаты из 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 различных серотипов. В одном варианте осуществления указанная выше иммуногенная композиция содержит гликоконъюгаты из 16 или 20 различных серотипов.

В одном варианте осуществления указанная выше иммуногенная композиция представляет собой 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20-валентные пневмококковые конъюгированные композиции. В одном варианте осуществления указанная выше иммуногенная композиция представляет собой 14, 15, 16, 17, 18 или 19-валентные пневмококковые конъюгированные композиции. В одном варианте осуществления указанная выше иммуногенная композиция представляет собой 16-валентные пневмококковые конъюгированные композиции. В одном варианте осуществления указанная выше иммуногенная композиция представляет собой 19-валентные пневмококковые конъюгированные композиции. В одном варианте осуществления указанная выше иммуногенная композиция представляет собой 20-валентные пневмококковые конъюгированные композиции. После конъюгирования капсульного полисахарида с белком-носителем, гликоконъюгаты чистят (обогащают по отношению к количеству конъюгата полисахарид-белок), используя различные способы. Данные способы включают операции концентрирования/диафильтрации, осаждения/элюирования, колоночную хроматографию, и глубинную фильтрацию (смотри, например, публикации заявок на патент США №2007/0184072 или WO 2008/079653. После того, как отдельные гликоконъюгаты чистят, их смешивают для того, чтобы сформулировать иммунногенную композицию согласно представленному изобретению.

1.6 Конкретные комбинации гликоконъюгатов согласно изобретению

В одном варианте осуществления какая-либо иммуногенная композиция, определенная в разделе 1.4 или 1.5, указанном выше, не содержит капсульный сахарид из S. pneumoniae серотипа 9N.

В одном варианте осуществления какая-либо иммуногенная композиция, определенная в разделе 1.4 или 1.5, указанном выше, не содержит капсульный сахарид из S. pneumoniae серотипа 9А.

В одном варианте осуществления какая-либо иммуногенная композиция, определенная в разделе 1.4 или 1,5, указанном выше, не содержит капсульный сахарид из S. pneumoniae серотипа 9L.

В одном варианте осуществления какая-либо иммуногенная композиция, определенная в разделе 1.4 или 1.5, указанном выше, не содержит капсульный сахарид из S. pneumoniae серотипов 9N и 9А.

В одном варианте осуществления какая-либо иммуногенная композиция, определенная в разделе 1.4 или 1.5, указанном выше, не содержит капсульный сахарид из S. pneumoniae серотипов 9N и 9L.

В одном варианте осуществления какая-либо иммуногенная композиция, определенная в разделе 1.4 или 1.5, указанном выше, не содержит капсульный сахарид из S. pneumoniae серотипов 9А и 9L.

В одном варианте осуществления какая-либо иммуногенная композиция, определенная в разделе 1.4 или 1.5, указанном выше, не содержит капсульный сахарид из S. pneumoniae серотипов 9N, 9А и 9L.

2 Дозировка иммуногенной композиции

Количество гликоконъюгата(ов) в каждой дозе выбирают как количество, которое индуцирует иммунозащитный ответ без значительных, неблагоприятных побочных эффектов у типичных вакцин. Такое количество будет варьироваться в зависимости от того, какой конкретный иммуноген используется, и как он представлен.

2.1 Количество гликоконъюгата

Количество конкретного гликоконъюгата в иммунногенной композиции может быть рассчитанной на основе общего полисахарида для этого конъюгата (конъюгированного и неконъюгированного). Например, гликоконъюгат с 20% свободного полисахарида будет иметь приблизительно 80 мкг конъюгированного полисахарид и приблизительно 20 мкг неконъюгированного полисахарид в 100 мкг дозы полисахарида. Количество гликоконъюгата может варьироваться в зависимости от пневмококкового серотипа. Концентрация сахарида может быть определена с помощью анализа уроновой кислоты.

"Иммуногенное количество" различных полисахаридных компонентов в иммунногенной композиции, может отклоняться и каждый может содержать приблизительно 1 мкг, приблизительно 2 мкг, приблизительно 3 мкг, приблизительно 4 мкг, приблизительно 5 мкг, приблизительно 6 мкг, приблизительно 7 мкг, приблизительно 8 мкг, приблизительно 9 мкг, приблизительно 10 мкг, приблизительно 15 мкг, приблизительно 20 мкг, приблизительно 30 мкг, приблизительно 40 мкг, приблизительно 50 мкг, приблизительно 60 мкг, приблизительно 70 мкг, приблизительно 80 мкг, приблизительно 90 мкг, или приблизительно 100 мкг какого-либо конкретного полисахаридного антигена.

Как правило, каждая доза будет содержать от 0,1 мкг до 100 мкг полисахарида для данного серотипа, конкретно от 0,5 мкг до 20 мкг, более конкретно от 1,0 мкг до 10 мкг, и еще более конкретно от 2,0 мкг до 5,0 мкг. Какое-либо целое число целого числа в пределах какого-либо из диапазонов, указанных выше, предполагается в качестве варианта осуществления изобретения.

В одном варианте осуществления, каждая доза будет содержать приблизительно 1.0 мкг, приблизительно 1,2 мкг, приблизительно 1,4 мкг, приблизительно 1,6 мкг, приблизительно 1,8 мкг, приблизительно 2,0 мкг, приблизительно 2,2 мкг, приблизительно 2,4 мкг, приблизительно 2,6 мкг, приблизительно 2,8 мкг, приблизительно 3,0 мкг, приблизительно 3,2 кг, приблизительно 3,4 мкг, приблизительно 3,6 мкг, приблизительно 3,8 мкг, приблизительно 4,0 мкг, приблизительно 4,2 мкг, приблизительно 4,4 мкг, приблизительно 4,6 мкг, приблизительно 4,8 мкг, приблизительно 5,0 мкг, приблизительно 5,2 мкг, приблизительно 5,4 мкг, приблизительно 5,6 мкг, приблизительно 5,8 мкг или приблизительно 6,0 мкг полисахарида для каждого конкретного гликоконъюгата.

В одном варианте осуществления, каждая доза будет содержать приблизительно 1.1 мкг, приблизительно 1,2 мкг, приблизительно 1,3 мкг, приблизительно 1,4 мкг, приблизительно 1,5 мкг, приблизительно 1,6 мкг, приблизительно 1,7 мкг, приблизительно 1,8 мкг, приблизительно 1,9 мкг, приблизительно 2,0 мкг, приблизительно 2,1 мкг, приблизительно 2,2 мкг, приблизительно 2,3 мкг, приблизительно 2,4 мкг, приблизительно 2,5 мкг, приблизительно 2,6 мкг, приблизительно 2,7 мкг, приблизительно 2,8 мкг, приблизительно 2,9 мкг, или приблизительно 3,0 мкг полисахарида для гликоконъюгатов из S. Pneumoniae серотипа 1, 3, 4, 5, 6А, 7F, 8, 9V, 10А, 11A, 12F, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и/или 33F.

В одном варианте осуществления, каждая доза будет содержать приблизительно приблизительно 1,1 мкг, приблизительно 1,2 мкг, приблизительно 1,3 мкг, приблизительно 1,4 мкг, приблизительно 1,5 мкг, приблизительно 1,6 мкг, приблизительно 1,7 мкг, приблизительно 1,8 мкг, приблизительно 1,9 мкг, приблизительно 2,0 мкг, приблизительно 2,1 мкг, приблизительно 2,2 мкг, приблизительно 2,3 мкг, приблизительно 2,4 мкг, приблизительно 2,5 мкг, приблизительно 2,6 мкг, приблизительно 2,7 мкг, приблизительно 2,8 мкг, приблизительно 2,9 мкг, или приблизительно 3,0 мкг полисахарида для гликоконъюгатов из S. Pneumoniae серотипа 1, 4, 5, 6А, 7F, 8, 9V, 10А, 11A, 12F, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и/или 33F.

В одном варианте осуществления, каждая доза будет содержать приблизительно 2,0 мкг, приблизительно 2,2 мкг, приблизительно 2,4 мкг, приблизительно 2,6 мкг, приблизительно 2,8 мкг, приблизительно 3,0 мкг, приблизительно 3,2 мкг, приблизительно 3,4 мкг, приблизительно 3,6 мкг, приблизительно 3,8 мкг, приблизительно 4,0 мкг, приблизительно 4,2 мкг, приблизительно 4,4 мкг, приблизительно 4,6 мкг, приблизительно 4,8 мкг, приблизительно 5,0 мкг, приблизительно 5,2 мкг, приблизительно 5,4 мкг, приблизительно 5,6 мкг, приблизительно 5,8 мкг или приблизительно 6,0 мкг полисахарида для гликоконъюгатов из S. Pneumoniae серотипа 6В.

В одном варианте осуществления, каждая доза будет содержать от приблизительно 1,5 мкг до приблизительно 3,0 мкг полисахарида для каждого гликоконъюгата из S. Pneumoniae серотипа 1, 3, 4, 5, 6А, 7F, 8, 9V, 10А, 11A, 12F, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F, и от приблизительно 3,0 мкг до приблизительно 6,0 мкг полисахарида для гликоконъюгата из S. Pneumoniae серотипа 6В.

В одном варианте осуществления, каждая доза будет содержать от приблизительно 2,0 мкг до приблизительно 2,5 мкг полисахарида для каждого гликоконъюгата из S. Pneumoniae серотипа 1, 3, 4, 5, 6А, 7F, 8, 9V, 10А, 11 A, 12F, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F, и от приблизительно 4,0 мкг до приблизительно 4,8 мкг полисахарида для гликоконъюгата из S. Pneumoniae серотипа 6В.

В одном варианте осуществления, каждая доза будет содержать приблизительно 2,2 мкг полисахарида для каждого гликоконъюгата из S. Pneumoniae серотипа 1, 3, 4, 5, 6А, 7F, 8, 9V, 10А, 11A, 12F, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F, и приблизительно 4,4 мкг полисахарида для гликоконъюгата из S. Pneumoniae серотипа 6В.

В одном варианте осуществления, каждая доза будет содержать от приблизительно 1,5 мкг до приблизительно 3,0 мкг полисахарида для каждого гликоконъюгат из S. Pneumoniae серотипа 1, 3, 4, 5, 6А, 7F, 9V, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F, и от приблизительно 3 мкг до приблизительно 6 мкг полисахарида для гликоконъюгат из S. Pneumoniae серотипа 6В.

В одном варианте осуществления, каждая доза будет содержать от приблизительно 2,0 мкг до приблизительно 2,5 мкг полисахарида для каждого гликоконъюгат из S. Pneumoniae серотипа 1, 3, 4, 5, 6А, 7F, 9V, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F, и от приблизительно 4,0 мкг до приблизительно 4,8 мкг полисахарида для гликоконъюгата из S. Pneumoniae серотипа 6 В.

В одном варианте осуществления, каждая доза будет содержать приблизительно 2,2 мкг полисахарида каждого гликоконъюгата из S. pneumoniae серотипа 1, 3, 4, 5, 6А, 7F, 9V, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F, и приблизительно 4,4 мкг полисахарида для гликоконъюгата из S. Pneumoniae серотипа 6В.

В одном варианте осуществления, каждая доза будет содержать от приблизительно 1,5 мкг до приблизительно 3,0 мкг полисахарида для каждого гликоконъюгат из S. Pneumoniae серотипа 1, 4, 5, 6А, 7F, 8, 9V, 10А, 11 A, 12F, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F, и от приблизительно 3,0 мкг до приблизительно 6,0 мкг полисахарида для гликоконъюгата из S. Pneumoniae серотипа 6В.

В одном варианте осуществления, каждая доза будет содержать от приблизительно 2,0 мкг до приблизительно 2,5 мкг полисахарида для каждого гликоконъюгата из S. Pneumoniae серотипа 1, 4, 5, 6А, 7F, 8, 9V, 10А, 11 A, 12F, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F, и от приблизительно 4,0 мкг до приблизительно 4,8 мкг полисахарида для гликоконъюгата из S. Pneumoniae серотипа 6В.

В одном варианте осуществления, каждая доза будет содержать приблизительно 2,2 мкг полисахарида каждого гликоконъюгата из S. pneumoniae серотипа 1, 4, 5, 6А, 7F, 8, 9V, 10А, 11А, 12F, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F, и приблизительно 4,4 мкг полисахарида для гликоконъюгата из S. Pneumoniae серотипа 6В.

В одном варианте осуществления, каждая доза будет содержать от приблизительно 1,5 мкг до приблизительно 3,0 мкг полисахарида для каждого гликоконъюгата из S. Pneumoniae серотипа 1, 4, 5, 6А, 7F, 9V, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F, и от приблизительно 3,0 мкг до приблизительно 6,0 мкг полисахарида для гликоконъюгата из S. Pneumoniae серотипа 6 В.

В одном варианте осуществления, каждая доза будет содержать от приблизительно 2,0 мкг до приблизительно 2,5 мкг полисахарида для каждого гликоконъюгат из S. Pneumoniae серотипа 1, 4, 5, 6А, 7F, 9V, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F, и от приблизительно 4,0 мкг до приблизительно 4,8 мкг полисахарида для гликоконъюгата из S. Pneumoniae серотипа 6В. В одном варианте осуществления, каждая доза будет содержать приблизительно 2,2 мкг полисахарида каждого гликоконъюгата из S. pneumoniae серотипа 1,4,5, 6А, 7F, 9V, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F, и приблизительно 4,4 мкг полисахарида для гликоконъюгата из S. Pneumoniae серотипа 6В.

2.2 Количество носителя

Как правило, каждая доза будет содержать от 10 мкг до 150 мкг белка-носителя, конкретно от 15 мкг до 100 мкг белка-носителя, более конкретно от 25 мкг до 75 мкг белка-носителя, и еще более конкретно от 40 мкг до 60 мкг белка-носителя. В одном варианте осуществления, указанный белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇.

В одном варианте осуществления, каждая доза будет содержать приблизительно 25 мкг, приблизительно 26 мкг, приблизительно 27 мкг, приблизительно 28 мкг, приблизительно 29 мкг, приблизительно 30 мкг, приблизительно 31 мкг, приблизительно 32 мкг, приблизительно 33 мкг, приблизительно 34 мкг, приблизительно 35 мкг, приблизительно 36 мкг, приблизительно 37 мкг, приблизительно 38 мкг, приблизительно 39 мкг, приблизительно 40 мкг, приблизительно 41 мкг, приблизительно 42 мкг, приблизительно 43 мкг, приблизительно 44 мкг, приблизительно 45 мкг, приблизительно 46 мкг, приблизительно 47 мкг, приблизительно 48 мкг, приблизительно 49 мкг, приблизительно 50 мкг, приблизительно 51 мкг, приблизительно 52 мкг, приблизительно 53 мкг, приблизительно 54 мкг, приблизительно 55 мкг, приблизительно 56 мкг, приблизительно 57 мкг, приблизительно 58 мкг, приблизительно 59 мкг, приблизительно 60 мкг, приблизительно 61 мкг, приблизительно 62 мкг, приблизительно 63 мкг, приблизительно 64 мкг, приблизительно 65 мкг, приблизительно 66 мкг, приблизительно 67 мкг, приблизительно 68 мкг, приблизительно 69 мкг, приблизительно 70 мкг, приблизительно 71 мкг, приблизительно 72 мкг, приблизительно 73 мкг, приблизительно 74 мкг или приблизительно 75 мкг белка-носителя. В одном варианте осуществления, указанный белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇.

3 Дополнительные антигены

Иммуногенная композиция согласно изобретению содержит конъюгированные S. pneumoniae сахаридные антигены (гликоконъюгаты). Они также могут дополнительно включать антигены из других патогенов, конкретно из бактерий и/или вирусов. Предпочтительные дополнительные антигены выбирают из: дифтерийного анатоксина (D), столбнячного анатоксина (Т), коклюшного антигена (Р), который, как правило, является бесклеточным (Ра), поверхностного антигена (HBsAg) вируса гепатита B (HBV), антигена вируса гепатита A (HAV), конъюгированного капсульного сахарида Haemophilus influenzae типа b (Hib), инактивированной полиомиелитной вакцины (IPV).

В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция согласно изобретению содержит D-T-Pa. В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция согласно изобретению содержит D-T-Pa-Hib, D-T-Pa-IPV или D-T-Pa-HBsAg. В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция согласно изобретению содержит D-T-Pa-HBsAg-IPV или D-T-Pa-HBsAg-Hib. В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция согласно изобретению содержи D-T-Pa-HBsAg-IPV-Hib.

Коклюшные антигены: Bordetella pertuss вызывает коклюш. Коклюшные антигены в вакцинах являются либо клеточными (целые клетки, в виде инактивированных клеток B.pertussis) или бесклеточными. Получение клеточных антигенов коклюша хорошо документировано (например, он может быть получен путем термической инактивации фазы I культуры B.pertussis). Предпочтительно, однако, изобретение использует бесклеточные антигены. Когда используются бесклеточные антигены, предпчтительным является использовать один, два или (предпочтительно) три следующих антигенов: (1) детоксифицированный коклюшный токсин (коклюшный анатоксин, или РТ); (2) филаментный гемагтлютинин (FHA); (3) пертактин (также известный как 69 килоДальтон белок наружной мембраны). FHA и пертактин могут быть обработаны формальдегидом перед использованием в соответствии с данным изобретением. РТ представляет собой предпочтительно детоксифицированный обработкой формальдегидом и/или глутаральдегидом. Бесклеточные коклюшные антигены предпочтительно адсорбируют на одном или больше адьювантов из соли алюминия. В качестве альтернативы, они могут быть добавлены в неадсорбированном состоянии. Когда добавляется пертактин, то он, предпочтительно, всегда адсорбирован на адьюванте из гидроксида алюминия. РТ и FHA могут быть адсорбированными на адьюванте из гидроксида алюминия или фосфата алюминия. Адсорбция всех из РТ, FHA и пертактина на гидроксиде алюминия является наиболее предпочтительной.

Инактивированной полиомиелитной вакцины: полиовирус вызывает полиомиелит. Вместо того, чтобы использовать пероральную полиовирусную вакцину, предпочтительные варианты осуществления согласно изобретению используют IPV. Перед введением пациентам, полиовирусы должны быть инактивированными, и это может быть достигнуто путем обработки формальдегидом. Полиомиелит может быть вызван одним из трех типов полиовируса. Данные три типа похожи и вызывают одинаковые симптомы, но они являются антигенно разными, и инфекция по одному типу не защищает от инфекции по другим. Поэтому, предпочтительным является использовать в изобретении три полиовирусных антигена: полиовирус типа 1 (например, штамм Mahoney), полиовирус типа 2 (например, штамм MEF-1), и полиовирус типа 3 (например, штамм Saukett). Вирусы предпочтительно выращивают, очищают и инактивируют по отдельности, и затем комбинируют, получая объемную трехвалентного смесь для использования по настоящему изобретению.

Дифтерийный анатоксин: Corynebacterium diphtheriae вызывает дифтерию. Дифтерийный токсин может быть обработан (например, с использованием формалина или формальдегида), для удаления токсичности, сохраняя при этом способность индуцировать специфические анти-токсиновые антитела после инъекции. Данные дифтерийные анатоксины используются в вакцине против дифтерии. Предпочтительные дифтерийные анатоксины представляют собой те, которые получены обработкой формальдегидом. Дифтерийный анатоксин может быть получен путем выращивания C. diphthehae в среде для роста, с последующей обработкой формальдегидом, ультрафильтрацией и осаждением. Анатоксиновый материал затем может быть обработан согласно способу, включающему стерильную фильтрацию и/или диализ. Дифтерийный анатоксин предпочтительно адсорбирован на адъюванте на основе гидроксида алюминия.

Столбнячный анатоксин: Clostridium tetani вызывает столбняк. Столбнячный токсин может быть обработан для того, чтобы получить защитный анатоксин. Анатоксины используются в вакцинах против столбняка. Предпочтительные столбнячные анатоксины представляют собой те, которые получены обработкой формальдегидом. Столбнячный анатоксин может быть получен путем выращивания С. tetani в среде для роста, с последующей обработкой формальдегидом, ультрафильтрацией и осаждением. Материал затем может быть обработан согласно способу, включающему стерильную фильтрацию и/или диализ.

Антигены вируса гепатита A: Вирус гепатита A (HAV) является одним из известных агентов, которые вызывают вирусный гепатит. Предпочтительный HAV компонент основан на инактивированном вирусе, и инактивация может быть достигнута за счет обработки формалином.

Вирус гепатита B (HBV) является одним из известных агентов, которые вызывают вирусный гепатит. Основным компонентом капсида является белок, известный как поверхностный антиген HBV, или, более общепринято, HBsAg, который, как правило, представляет собой полипептид из 226 аминокислот с молекулярной массой ~24 кДа. Все существующие вакцины против гепатита B содержат HBsAg, и когда данный антиген вводят в нормальной вакцине, он стимулирует продуцирование анти-HBsAg антител, которые защищают от HBV-инфекции.

Для производства вакцины, HBsAg был получен двумя способами: очисткой антигена в дисперсной форме из плазмы носителей хронического гепатита B или экспрессией белка, используя рекомбинантные ДНК способы (например, рекомбинантную экспрессию в клетках дрожжей). В отличие от нативного HBsAg (то есть, как в очищенном продукте из плазмы), экспрессированный дрожжами HBsAg, как правило, является негликозилированным, и это представляет собой наиболее предпочтительную форму HBsAg для использования настоящим изобретением.

Конъюгированные антигены Haemophilus influenzae типа b: Haemophilus influenzae типа b (Hib) вызывает бактериальный менингит. Hib вакцины, как правило, основываются на капсульном сахаридном антигене, получение которого хорошо документировано. Hib сахарид может быть конъюгированным с белком-носителем для того, чтобы повысить его иммуногенность, особенно у детей. Типичные белки-носители представляют собой столбнячный анатоксин, дифтерийный анатоксин, CRM₁₉₇, H. influenzae белок D, и комплекс белка внешней мембраны из менингококка серогруппы В. Сахаридный фрагмент конъюгата может содержать полной длины олирибосилрибитолфосфат (PRP), как полученный из Hib бактерий, и/или фрагментов полной длины PRP. Hib конъюгаты могут или не могут быть адсорбированными на адъюванте на основе соли алюминия.

В одном варианте осуществления иммуногенная композиция согласно изобретению дополнительно включает конъюгированный капсульный сахарид N. meningitidis серогруппы Y (MenY), и/или конъюгированного капсульный сахарид N. meningitidis серогруппы C (MenC).

В одном варианте осуществления иммуногенная композиция согласно изобретению дополнительно включает конъюгированный капсульный сахарид N. meningitidis серогруппы A (MenА), конъюгированный капсульный сахарид N. meningitidis серогруппы W135 (MenW135), конъюгированный капсульный сахарид N. meningitidis серогруппы Y (MenY), и/или конъюгированный капсульный сахарид N. meningitidis серогруппы C (MenC).

В одном варианте осуществления иммуногенная композиция согласно изобретению дополнительно включает конъюгированный капсульный сахарид N. meningitidis серогруппы W135 (MenW135), конъюгированный капсульный сахарид N. meningitidis серогруппы Y (MenY), и/или конъюгированный капсульный сахарид N. meningitidis серогруппы C (MenC).

4 Адъювант(ы)

В некоторых вариантах осуществления, иммуногенная композиция, раскрытая в данном документе может дополнительно содержать, по меньшей мере, два или три адъюванта. Термин "адъювант" касается соединения или смеси, которая усиливает иммунный ответ на антиген. Антигены могут действовать в первую очередь в качестве системы доставки, в первую очередь в качестве иммуномодулятора или имеют сильные признаки обоих. Приемлемые адъюванты включают такие, которые приемлемы для применения у млекопитающих, включая людей.

Примеры известных приемлемых адъювантов типа системы доставки, которые могут быть использованы в организме человека, включают, но не ограничиваются этим, алюминиевые квасцы (например, фосфат алюминия, сульфат алюминия или гидроксид алюминия), фосфат кальция, липосомы, эмульсии масло-в-воде, такие как MF59 (4,3% мас./об. сквалена, 0,5% мас./об. полисорбата 80 (Tween 80), 0,5% мас./об. сорбитана триолеата (Span 85)), эмульсии вода-в-масле, такие как Montanide, и микрочастицы или наночастицы поли(D,L-лактид-со-гликолида) (PLG).

В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция, раскрытая в данном документе, содержит соли алюминия (алюминиевые квасцы) в качестве адъюванта (например, фосфат алюминия, сульфат алюминия или гидроксид алюминия). В предпочтительном варианте осуществления, иммуногенная композиция, раскрытая в данном документе, содержит фосфат алюминия или гидроксид алюминия в качестве адъюванта. В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция, раскрытая в данном документе, содержит от 0,1 мг/мл до 1 мг/мл или от 0,2 мг/мл до 0,3 мг/мл элементарного алюминия в виде фосфата алюминия. В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция, раскрытая в данном документе, содержит приблизительно 0,25 мг/мл элементарного алюминия в виде фосфата алюминия.

Примеры известных приемлемых адъювантов иммунно-модуляторного типа, которые могут быть использованы у людей включают, но не ограничиваются этим, сапониновые экстракты из коры дерева Aquilla (QS21, Quil А), агонисты TLR4, такие как MPL (монофосфориллипид A), 3DMPL (3-O-деацилированный MPL) или GLA-AQ, LT/CT мутанты, цитокины, такие как различные интерлейкины (например, IL-2, IL-12) или GM-CSF, и тому подобное.

Примеры известных приемлемых адъювантов иммунно-модуляторного типа как с функцией доставки, так и иммунно-модуляторными функциями, которые могут быть использованы у людей включают, но не ограничиваются этим, ISCOMS (смотрите, например, et al. (1998) J. Leukocyte Biol. 64:713; WO 90/03184, WO 96/11711, WO 00/48630, WO 98/36772, WO 00/41720, WO 2006/134423 и WO 2007/026190) или GLA-EM, которые представляют собой комбинацию агониста TLR4 и эмульсии масло-в-воде.

Для применений в ветеринарии, включая, но не ограничиваясь этим, эксперименты на животных, можно использовать полный адъювант Фрейнда (CFA), неполный адъювант Фрейнда (IFA), Emulsigen, N-ацетил-мурамил-L-треонил-D-изоглутамин (thr-MDP), N-ацетил-нор-мурамил-L-аланил-D-изоглутамин (CGP 11637, называемый как nor-MDP), N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутаминил-L-аланин-2-(1'-2'-дипалмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)-этиламин (CGP 19835А, называемый как МТР-РЕ), и RIBI, который содержит три компонента, экстрагированные из бактерий, монофосфориллипид A, трегалозы димиколат и скелет клеточной стенки (MPL+TDM+CWS) в 2% эмульсии сквален/Тween 80.

Дополнительные примеры адъювантов для повышения эффективности пневмококковых вакцин, как раскрыто в данном документе, включают, но не ограничиваются этим: (1) эмульсионные композиции масло-в-воде (с или без других специфических иммуностимулирующих агентов, таких как мурамилпептиды (смотри ниже) или компоненты стенки бактериальной клетки), такие как например (a) SAF, содержащий 10% сквален, 0,4% Tween 80, 5% плюроник-блокированный полимер L121, и thr-MDP либо микрофлуидизированный в субмикронной эмульсии, или встряхиваемый для образования эмульсии с большим размером частиц, и (b) адъювантная система RIBI™ (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) содержащая 2% сквален, 0,2% Tween 80, и один или больше компонентов стенки бактериальной клетки, такие как монофосфориллипид A (MPL), трегалозы димиколат (TDM), и скелет клеточной стенки (CWS), предпочтительно MPL+CWS (DETOX™); (2) сапониновые адъюванты, такие как QS21, STIMULON™ (Cambridge Bioscience, Worcester, MA), ABISCO® (Isconova, Sweden), или ISCOMATRIX® (Commonwealth Serum Laboratories, Australia), могут быть использованы, или частицы, образованные ими, такие как ISCOM (иммуностимулирующие комплексы), в которых ISCOMS может быть лишен дополнительного детергента (например, WO 00/07621); (3) полный адъювант Фрейнда (CFA) и неполный адъювант Фрейнда (IFA); (4) цитокины, такие как интерлейкины (например, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 (например, WO 99/44636)), интерфероны (например, гамма-интерферон), колониестимулирующий фактор макрофагов (M-CSF), фактор некроза опухолей (TNF), и т.д.; (5) монофосфориллипид A (MPL) или 3-О-деацилированный MPL (3dMPL) (смотрите, например, GB-2220221, EP 0689454), необязательно в основном при отсутствии алюминиевых квасцов при использовании с пневмококковыми сахаридами (смотрите, например, WO 00/56358); (6) комбинации 3dMPL с, например, QS21 и/или эмульсиями масло-в-воде (смотрите, например, EP 0835318, EP 0735898, EP 0761231); (7) полиоксиэтиленовые простые эфиры или полиоксиэтиленовые сложные эфиры (смотрите, например, WO 99/52549); (8) поверхностно-активное вещество - сложный эфир полиоксиэтилена и сорбитана в комбинации с октоксинолом (например, WO 01/21207) или поверхностно-активное вещество - полиоксиэтиленалкыиловый простой эфир или сложный эфир в комбинации с, по меньшей мере, одним дополнительным неионным поверхностно-активным веществом, таким как октоксинол (например, WO 01/21152); (9) сапонин и an иммуностимулирующий олигонуклеотид (например, CpG олигонуклеотид) (например, WO 00/62800); (10) иммуностимулятор и частица соли металла (смотрите, например, WO 00/23105); (11) сапонин и эмульсия масло-в-воде (например, WO 99/11241); (12) сапонин (например, QS21) + 3dMPL + IM2 (необязательно+стерол) (например, WO 98/57659); (13) другие вещества, которые действуют в качестве иммуностимулирующих агентов, для повышения эффективности композиции. Мурамилпептиды включают N-ацетил-мурамил-L-треонил-D-изоглутамин (thr-MDP), N-25 ацетил-нор-мурамил-L-аланил-D-изоглутамин (nor-MDP), N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглуглутарнинил-L-аланин-2-(1'-2'-дипалмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)-этиламин МТР-РЕ), и т.д.

В одном варианте осуществления согласно представленному изобретению, иммуногенная композиция, как раскрыто в данном документе, содержит CpG олигонуклеотид в качестве адъювант. CpG олигонуклеотид, как использовано в данном документе, касается иммуностимулирующего CpG олигодезоксинуклеотида (CpG ODN), и, соответственно, данные термины используются взаимозаменяемо, если не указано иное.

Иммуностимулирующие CpG олигодезоксинуклеотиды содержат один или больше иммуностимулирующие CpG мотивов, которые представляют собой неметилированные цитозин-гуаниновые динуклеотиды, при необходимости в определенных предпочтительных основных контекстах. Статус метилирования иммуностимулирующего мотива CpG, как правило, касается цитозинового остатка в динуклеотиде. Иммуностимулирующий олигонуклеотид, содержащий, по меньшей мере, один неметилированный CpG динуклеотид, представляет собой олигонуклеотид, который содержит 5' неметилированный цитозин, связанный фосфатной связью с 3' гуанином, и который активирует иммунную систему посредством связывания с Toll-подобным рецептором 9 (TLR-9). В другом варианте осуществления иммуностимулирующий олигонуклеотид может содержать один или больше метилированные CpG динуклеотиды, которые будут активировать иммунную систему посредством TLR9, но не так сильно, как если бы CpG мотив(ы) был/были неметилированным(ми).

CpG иммуностимулирующие олигонуклеотиды могут содержать один или больше палиндромов, что, в свою очередь, может включать CpG динуклеотид. CpG олигонуклеотиды были описаны в ряде выданных патентов, опубликованных патентных заявок и других публикаций, в том числе патентах США №№6,194,388; 6,207,646; 6,214,806; 6,218,371; 6,239,116; и 6,339,068.

В одном варианте осуществления согласно представленному изобретению, иммуногенная композиция, как раскрыто в данном документе, содержит какой-либо из CpG олигонуклеотидов, описанных на со страницы 3, строка 22, до страницы 12, строка 36, WO 2010/125480.

Идентифицированными были различные классы CpG иммуностимулирующих олигонуклеотидов. Они называются как A, В, С и P класс, и описаны более подробно со страницы 3, строка 22, до страницы 12, строка 36, WO 2010/125480. Способы, согласно изобретению, охватывают использование данных различных классов CpG иммуностимулирующих олигонуклеотидов.

В одном варианте осуществления согласно представленному изобретению, иммуногенная композиция, как раскрыто в данном документе, содержит олигонуклеотид CpG класса А. Предпочтительно, олигонуклеотид CpG "класса А", согласно изобретению, имеет следующую последовательность нуклеиновых кислот: 5' GGGGACGACGTCGTGGGGGGG 3' (SEQ ID NO: 1). Некоторые неограничивающие примеры олигонуклеотидов А-класса включают: 5' G*G*G_G_A_C_G_A_C_G_T_C_G_T_G_G*G*G*G*G*G 3' (SEQ ID NO: 2); где ^"*" касается фосфоротиоатной связи и "_" касается фосфодисложноэфирной связи. В одном варианте осуществления согласно представленному изобретению, иммуногенная композиция, как раскрыто в данном документе, содержит олигонуклеотид CpG класса В. В одном варианте осуществления, CpG олигонуклеотид для использования в представленном изобретении представляет собой олигонуклеотид CpG класса В, представленный, по меньшей мере формулой:

5' X₁X₂CGX₃X₄ 3',

где Х1, Х2, Х3, и Х4 представляют собой нуклеотиды. В одном варианте осуществления, X₂ представляет собой аденин, гуанин, или тимин. В другом варианте осуществления, Х₃ представляет собой цитозин, аденин, или тимин.

Последовательности олигонуклеотида CpG класса B согласно изобретению представляют собой те, которые в общих чертах описаны выше, а также раскрыты в WO 96/02555, WO 98/18810 и патентах США №№6,194,388; 6,207,646; 6,214,806; 6,218,371; 6,239,116 и 6,339,068. Примеры последовательностей включают, но не ограничиваются этим, те, которые раскрыты в данных последних заявках и патентах.

В одном варианте осуществления, олигонуклеотид CpG "В-класса" согласно изобретению имеет следующую последовательность нуклеиновых кислот:

или

или

или

или

В какой-либо из данных последовательностей, все связи могут быть фосфортиоатными связями. В другом варианте осуществления, в какой-либо из данных последовательностей, одна или больше связей могут быть фосфодисложноэфирными, предпочтительно из "С" и "G" мотива CpG, создавая полумягкий CpG олигонуклеотид. В какой-либо из данных последовательностей, этил-уридин или галоген может замещать 5' Т; примеры галоген-замещений включают, но не ограничиваются этим, бром-уридин или йод-уридин замещения. Некоторые неограничивающие примеры олигонуклеотидов В-класса включают:

или

или

или

или

где ^"*" касается фосфортиоатной связи.

В одном варианте осуществления согласно представленному изобретению, иммуногенная композиция, как раскрыто в данном документе, содержит олигонуклеотид CpG класса С. В одном варианте осуществления, олигонуклеотиды CpG "С-класса", согласно изобретению, имеют следующую последовательность нуклеиновых кислот:

или

или

или

или

или

или

или

или

или

или

или

или

В какой-либо из данных последовательностей, все связи могут быть фосфортиоатными связями. В другом варианте осуществления, в какой-либо из данных последовательностей, одна или больше из связей могут быть фосфодисложноэфирными, предпочтительно из "С" и "G" мотива CpG, создавая полумягкий CpG олигонуклеотид.

Некоторые неограничивающие примеры олигонуклеотидов С-класса включают:

или

или

или

или

или

или

или

или

или

или

или

или

где ^"*" касается фосфортиоатной связи и "_" касается фосфодисложноэфирной связи.

В какой-либо из данных последовательностей, этил-уридин или галоген может замещать 5' Т; примеры галоген-замещений включают, но не ограничиваются этим, бром-уридин или йод-уридин замещения.

В одном варианте осуществления согласно представленному изобретению, иммуногенная композиция, как раскрыто в данном документе, содержит олигонуклеотид CpG класса Р. В одном варианте осуществления, CpG олигонуклеотид для использования в представленном изобретении представляет собой олигонуклеотид CpG класса P, содержащий 5' TLR домен активации и, по меньшей мере, две палиндромных области, где одна палиндромная область представляет собой 5' палиндромную область, по меньшей мере, из 6 нуклеотидов в длину и связанную с 3' палиндромной областью, по меньшей мере, из 8 нуклеотидов в длину, или непосредственно, или посредством спейсера, где олигонуклеотид включает, по меньшей мере, динуклеотид YpR. В одном варианте осуществления, указанный олигонуклеотид не представляет собой T*C_G*T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G (SEQ ID NO: 27). В одном варианте осуществления олигонуклеотид CpG класса P включает, по меньшей мере, неметилированный CpG динуклеотид. В другом варианте осуществления TLR домен активации представляет собой TCG, TTCG, TTTCG, TYpR, TTYpR, TTTYpR, UCG, UUCG, UUUCG, TTT, или TTTT. В еще другом варианте осуществления TLR домен активации находится в пределах 5' палиндромной области. В другом варианте осуществления TLR домен активации находится непосредственно в 5' к 5' палиндромной области.

В одном варианте осуществления, олигонуклеотиды CpG "Р-класса" согласно изобретению имеют следующую последовательность нуклеиновых кислот: 5' TCGTCGACGATCGGCGCGCGCCG 3' (SEQ ID NO: 39).

В указанных последовательностях, все связи могут быть фосфортиоатными связями. В другом варианте осуществления, одна или больше связей могут быть фосфодисложноэфирными, предпочтительно из "С" и "G" мотива CpG, создавая полумягкий CpG олигонуклеотид. В какой-либо из данных последовательностей, этил-уридин или галоген может замещать 5' Т; примеры галоген-замещений включают, но не ограничиваются этим, бром-уридин или йод-уридин замещения. Неограничивающий пример олигонуклеотидов Р-класса включает: 5' T*C_G*T*C_G*A*C_G*A*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 40)

где ^"*" касается фосфортиоатной связи и "_" касается фосфодисложноэфирной связью.

В одном варианте осуществления олигонуклеотид включает, по меньшей мере, фосфортиоатную связь. В другом варианте осуществления все межнуклеотидные связи олигонуклеотида являются фосфортиоатными связями. В другом варианте осуществления олигонуклеотид включает, по меньшей мере, фосфодисложноэфирно-подобную связь. В другом варианте осуществления фосфодисложноэфирно-подобная связь представляет собой фосфодисложноэфирную связь. В другом варианте осуществления липофильная группа конъюгирована с олигонуклеотидом. В одном варианте осуществления липофильная группа представляет собой холестерин.

В одном варианте осуществления, все межнуклеотидные связи олигонуклеотидов CpG, раскрытых в данном документе, представляют собой фосфодисложноэфирные связи ("мягкие" олигонуклеотиды, как описано в WO 2007/026190). В другом варианте осуществления, олигонуклеотиды CpG, согласно изобретению, оказываются устойчивыми к разрушению (например, являются стабилизированный). "Стабилизированный олигонуклеотид" касается олигонуклеотида который относительно устойчив к разложению in vivo (например, с участием экзо- или эндо-нуклеазы). Стабилизация нуклеиновой кислоты может быть осуществлена за счет модификаций скелета. Олигонуклеотиды, имеющие фосфортиоатные связи обеспечивают максимальную активность и защиту олигонуклеотиду от разрушения внутриклеточными экзо- и эндо-нуклеазами.

Иммуностимулирующие олигонуклеотиды могут иметь химерный скелет, который имеет комбинации фосфодисложноэфирных и фосфортиоатных связей. Для целей настоящего изобретения, химерный скелет касается частично стабилизированного скелета, где, по меньшей мере, одна межнуклеотидная связь является фосфодисложноэфирной или фосфодисложноэфирно-подобной, и где, по меньшей мере, одна другая межнуклеотидная связь представляет собой стабилизированную межнуклеотидную связь, где, по меньшей мере, одна фосфодисложноэфирная или фосфодисложноэфирно-подобная связь и, по меньшей мере, одна стабилизированная связь различны. Когда фосфодисложноэфирная связь преимущественно находится в пределах мотива CpG, такие молекулы называются "полумягкими", как описано в WO 2007/026190.

Другие модифицированные олигонуклеотиды включают комбинации из фосфодисложноэфирных, фосфортиоатных, метилфосфонатных, метилфосфортиоатных, фосфордитиоатных, и/или п-этокси связей.

Смешанный скелет, модифицированный ODN, могут быть синтезированы, как описано в WO 2007/026190.

Размер олигонуклеотида CpG (то есть, количество нуклеотидных остатков вдоль длины олигонуклеотида) также может внести свой вклад в стимулирующую активность олигонуклеотида. Для облегчения поступления в клетки, олигонуклеотид CpG, согласно изобретению, предпочтительно имеет минимальную длину из 6 нуклеотидных остатков. Олигонуклеотиды какого-либо размера, больше чем 6 нуклеотидов (даже много тысяч пар нуклеотидов длиной) способны индуцировать иммунный ответ, если присутствует достаточное количество иммуностимулирующих мотивов, поскольку более крупные олигонуклеотиды разрушаются внутри клеток. В определенных вариантах осуществления, олигонуклеотиды CpG имеют длину от 6 до 100 нуклеотидов, предпочтительно от 8 до 30 нуклеотидов длиной. В важных вариантах осуществления, нуклеиновые кислоты и олигонуклеотиды, согласно изобретению, не являются плазмидами или векторами экспрессии.

В одном варианте осуществления, CpG олигонуклеотид, раскрытый в данном документе, содержит замещения или модификации, такие как в основаниях и/или сахарах, как описано в параграфах 134-147 WO 2007/026190.

В одном варианте осуществления, CpG олигонуклеотид согласно представленному изобретению является химически модифицированным. Примеры химических модификаций известны квалифицированному специалисту и описаны, например, в Uhlmann et al. (1990) Chem. Rev. 90: 543; S. Agrawal, Ed., Humana Press, Totowa, USA 1993; Crooke et al. (1996) Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 36: 107-129; и Hunziker et al. (1995) Mod. Synth. Способы 7: 331-417. Олигонуклеотид в соответствии с изобретением может иметь одну или больше модификаций, где каждая модификация расположена в конкретном фосфодисложноэфирном межнуклеозидном мостике, и/или в определенной β-D-рибозной единице, и/или в конкретном положении природного нуклеозидного основания по сравнению с олигонуклеотидом одной и той же последовательности, которая составлена из природной ДНК или РНК.

В некоторых вариантах осуществления согласно изобретению, CpG-содержащие нуклеиновые кислоты могут быть просто смешаны с иммуногенными носителями в соответствии со способами, известными квалифицированным специалистам в данной области (смотрите, например, WO 03/024480).

В конкретном варианте осуществления согласно представленному изобретению, какая-либо иммуногенная композиция, раскрытая в данном документе, содержит от 2 мкг до 100 мг CpG олигонуклеотида, предпочтительно от 0,1 мг до 50 мг CpG олигонуклеотида, предпочтительно от 0,2 мг до 10 мг CpG олигонуклеотида, предпочтительно от 0,3 мг до 5 мг CpG олигонуклеотида, предпочтительно от 0,3 мг до 5 мг CpG олигонуклеотида, более предпочтительно от 0,5 до 2 мг CpG олигонуклеотида, более предпочтительно от 0,75 до 1,5 мг CpG олигонуклеотида. В предпочтительном варианте осуществления, какая-либо иммунногенная композиция, раскрытая в данном документе, содержит приблизительно 1 мг CpG олигонуклеотида.

5 Формуляция

Иммуногенная композиция согласно изобретению может быть сформулирована в жидкой форме (то есть, в виде растворов или суспензий) или в лиофилизированной форме. Жидкие препараты преимущественно могут вводиться непосредственно из их упакованной формы и, таким образом, идеально подходит для инъекций без необходимости восстановления в водной среде как в противном случае требуется для лиофилизированных композиций согласно изобретению.

Формуляция иммунногенной композиции согласно представленному изобретению может осуществляться с использованием способов, общепринятых в данной области. Например, отдельные пневмококковые конъюгаты могут быть сформулированы с физиологически приемлемым носителем для получения композиции. Примеры таких носителей включают, но не ограничиваются этим, воду, буферный солевой раствор, полиолы (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль) и растворы декстрозы.

Представленное изобретение предусматривает иммунногенную композицию, содержащую какую-либо комбинацию гликоконъюгатов, раскрытых в данном документе, и фармацевтически приемлемый эксципиент, носитель, или разбавитель.

В одном варианте осуществления, иммунногенная композиция, согласно изобретению, находится в жидкой форме, предпочтительно в водной жидкой форме.

Иммуногенная композиция, согласно раскрытию, может содержать один или больше из буфера, соли, двухвалентного катиона, неионогенного деиергента, криопротектора, такого как сахар, и антиоксиданта, такого как ловушка свободного радикала, или хелатирующего агента, или какую-либо из нескольких их комбинаций.

В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция, согласно изобретению, содержит буфер. В одном варианте осуществления, указанный буфер имеет рKа от приблизительно 3,5 до приблизительно 7,5. В некоторых вариантах осуществления, буфер представляет собой фосфат, сукцинат, гистидин или цитрат. В определенных вариантах осуществления, буфер представляет собой сукцинат с конечной концентрацией от 1 мМ до 10 мМ. В одном конкретном варианте осуществления, конечная концентрация сукцинатного буфера составляет приблизительно 5 мМ.

В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция, согласно изобретению, содержит соль. В некоторых вариантах осуществления, соль выбирают из группы, состоящей из хлорида магния, хлорида калия, хлорида натрия и их комбинации. В одном конфетном варианте осуществления, соль представляет собой хлорид натрия. В одном конкретном варианте осуществления, иммуногенная композиция, согласно изобретению, содержит хлорид натрия в количестве 150 мМ.

В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция, согласно изобретению, содержит поверхностно-активное вещество. В одном варианте осуществления, поверхностно-активное вещество выбрано из группы, состоящей из полисорбата 20 (TWEEN™20), полисорбата 40 (TWEEN™40), полисорбата 60 (TWEEN™60), полисорбата 65 (TWEEN™65), полисорбата 80 (TWEEN™80), полисорбата 85 (TWEEN™85), TRITON™ N-101, TRITON™ X-100, окстоксинола 40, ноноксинола-9, триэтаноламина, триэтаноламинполипептидолеата, полиоксиэтилен-660 гидроксистеарата (PEG-15, Solutol Н 15), полиоксиэтилен-35-рицинолеата (CREMOPHOR® EL), соевого лецитина и полоксамера. В одном конкретном варианте осуществления, поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 80. В некоторых указанных вариантах осуществления, конечная концентрация полисорбата 80 в препарате составляет, по меньшей мере, от 0,0001% до 10% полисорбата 80 масса к массе (масс./масс.). В некоторых указанных вариантах осуществления, конечная концентрация полисорбата 80 в препарате составляет, по меньшей мере, от 0,001% до 1% полисорбата 80 масса к массе (масс./масс). В некоторых указанных вариантах осуществления, конечная концентрация полисорбата 80 в препарате составляет, по меньшей мере, от 0,01% до 1% полисорбата 80 масса к массе (масс./масс.). В других вариантах осуществления, конечная концентрация полисорбата 80 в препарате составляет 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09% или 0,1% полисорбата 80 (масс./масс.). В другом варианте осуществления, конечная концентрация полисорбата 80 в препарате составляет 1% полисорбата 80 (масс./масс.).

В определенных вариантах осуществления, иммунногенная композиция, согласно изобретению, имеет рН от 5,5 до 7,5, более предпочтительно рН от 5,6 до 7,0, еще более предпочтительно рН от 5,8 до 6,0.

В одном варианте осуществления, представленное изобретение предусматривает контейнер, наполненный какой-либо иммуногенной композицией, раскрытой в данном документе. В одном варианте осуществления, контейнер выбирают из группы, состоящей из флакона, шприца, колбы, ферментера, биореактора, мешка, банки, ампулы, картриджа и одноразовой ручки. В определенных вариантах осуществления, контейнер является силиконизированным.

В одном варианте осуществления, контейнер согласно представленному изобретению изготовлен из стекла, металлов (например, стали, нержавеющей стали, алюминия и т.д.) и/или полимеров (например, термопластов, эластомеров, термопластичных эластомеров). В одном варианте осуществления, контейнер согласно представленному изобретению изготовлен из стекла.

В одном варианте осуществления, представленное изобретение предусматривает шприц, наполненный какой-либо иммуногенной композицией, раскрытой в данном документе. В определенных вариантах осуществления, шприц является силиконизированным и/или изготовлен из стекла.

Типичная доза иммунногенной композиции, согласно изобретению, для инъекций имеет объем от 0,1 мл до 2 мл, более предпочтительно от 0,2 мл до 1 мл, еще более предпочтительно объем приблизительно 0,5 мл.

Поэтому контейнер или шприц, как определено выше, наполняется объемом от 0,1 мл до 2 мл, более предпочтительно от 0,2 мл до 1 мл, еще более предпочтительно объемом приблизительно 0,5 мл какой-либо иммуногенной композиции, определенной в данном документе.

6 Применение иммуногенных композиций согласно изобретению

В одном варианте осуществления, иммуногенные композиции, раскрытые в данном документе, предназначены для использования в качестве лекарственного средства.

Иммуногенная композиция, описанная в данном документе, может быть использована в различных терапевтических или профилактических способах для предупреждения, лечения или ослабления бактериальной инфекции, заболевания или состояния у субъекта. В частности, иммуногенная композиция, описанная в данном документе, может быть использована для предупреждения, лечения или ослабления S. Pneumoniae инфекции, заболевания или состояния у субъекта.

Таким образом, в одном аспекте, изобретение предусматривает способ предупреждения, лечения или ослабления инфекции, заболевания или состояния, связанного с S. Pneumoniae у субъекта, включающий введение субъекту иммунологически эффективного количества иммунногенной композиции согласно изобретению.

В некоторых таких вариантах осуществления, инфекция, заболевание или состояние является выбранным из группы, состоящей из пневмонии, синусита, отита среднего уха, острого отита среднего уха, менингита, бактериемии, сепсиса, эмпиемы плевры, конъюнктивита, остеомиелита, септического артрита, эндокардита, перитонита, перикардита, мастоидита, целлюлит, инфекции мягких тканей и абсцесса мозга.

В одном варианте осуществления, изобретение предусматривает способ индуцирования иммунного ответа к S. pneumoniae у субъекта, включающий введение субъекту иммунологически эффективного количества иммунногенной композиции согласно изобретению.

В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция, раскрытая в данном документе, предназначена для использования в качестве вакцины. В таких вариантах осуществления иммуногенная композиция, описанная в данном документе, может быть использован для предупреждения S. pneumoniae инфекции у субъекта. Таким образом, в одном аспекте, изобретение предусматривает способ предупреждения инфекции S. pneumoniae у субъекта, включающий введение субъекту иммунологически эффективного количества иммунногенной композиции согласно изобретению. В некоторых таких вариантах осуществления, инфекции является выбранной из группы, состоящей из пневмонии, синусита, отита среднего уха, острого отита среднего уха, менингита, бактериемии, сепсиса, эмпиемы плевры, конъюнктивита, остеомиелита, септического артрита, эндокардита, перитонита, перикардита, мастоидита, целлюлита, инфекции мягких тканей и абсцесса мозга. В одном аспекте, субъект подлежащий вакцинации представляет собой млекопитающее, такое как человек, кошка, овца, свинья, лошадь, корова или собака.

В одном аспекте, иммуногенная композиция, раскрытая в данном документе, предназначена для использования в способе предупреждения, лечения или ослабления инфекции, заболевания или состояния, связанного с S. pneumoniae у субъекта. В некоторых таких вариантах осуществления, инфекцию, заболевание или состояние выбирают из группы, состоящей из пневмонии, синусита, отита среднего уха, острого отита среднего уха, менингита, бактериемии, сепсиса, эмпиемы плевры, конъюнктивита, остеомиелита, септического артрита, эндокардита, перитонита, перикардита, мастоидита, целлюлита, инфекции мягких тканей и абсцесса мозга.

В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция, раскрытая в данном документе, предназначена для использования в качестве вакцины. В таких вариантах осуществления иммуногенная композиция, описанная в данном документе, может быть использован для предупреждения S. pneumoniae инфекции у субъекта. Таким образом в одном аспекте, иммуногенная композиция, раскрытая в данном документе предназначена для использования в способе предупреждения, инфекции S. pneumoniae у субъекта. В некоторых таких вариантах осуществления, инфекцию выбирают из группы, состоящей из пневмонии, синусита, отита среднего уха, острого отита среднего уха, менингита, бактериемии, сепсиса, эмпиемы плевры, конъюнктивита, остеомиелита, септического артрита, эндокардита, перитонита, перикардита, мастоидита, целлюлита, инфекции мягких тканей и абсцесса мозга. В одном аспекте, субъект, подлежащий вакцинации, представляет собой млекопитающее, такое как человек, кошка, овца, свинья, лошадь, корова или собака.

Иммуногенная композиция согласно представленному изобретению может быть использованы для защиты или лечения человека, страдающего от пневмококковой инфекции, путем введения иммуногенний композиции, используя системное введение или через слизистую. В одном варианте осуществления, иммуногенную композицию, раскрытую в данном документе, вводят by внутримышечным, внутрибрюшинным, внутрикожным или подкожным способами. В одном варианте осуществления, иммуногенную композицию, раскрытую в данном документе, вводят, используя внутримышечную, внутрибрюшинную, внутрикожную или подкожную инъекцию. В одном варианте осуществления, иммуногенную композицию, раскрытую в данном документе, вводят, используя внутримышечную или подкожную инъекцию.

В одном варианте осуществления, иммунногенная композиция согласно представленному изобретению содержащая, по меньшей мере, один гликоконъюгат из S. Pneumoniae серотипа 15В (такого как гликоконъюгаты из раздела 1.3.4, указанного выше), при введении субъекту, способна индуцировать образование антител, способных к связыванию с S. pneumoniae серотипа 15В, 15А и/или 15С как измерено с использованием стандартного ИФА анализа. В одном варианте осуществления, иммунногенная композиция согласно представленному изобретению, содержащая, по меньшей мере, один гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 15В (такого как гликоконъюгаты из раздела 1.3.4, указанного выше), при введении субъекту, способна индуцировать образование антител, способных к связыванию с S. pneumoniae серотипа 15В и 15С, как измерено с использованием стандартного ИФА анализа.

В ИФА (твердофазном иммуноферментном анализе) способе, антитела из сывороток вакцинированных субъектов инкубируют с полисахаридами, которые адсорбированы на твердом носителе. Связанные антитела детектировали с использованием фермент-конъюгированные антитела вторичного обнаружения.

В одном варианте осуществления указанный стандартный ИФА анализ представляет собой стандартизированный (ВОЗ) ИФА анализ как это определено ВОЗ в учебном пособии 'Training manual for Enzyme linked immunosorbent assay for the quantitation of Streptococcus pneumoniae serotype specific IgG (Pn PS ELISA).' (accessible at http://www.vaccine.uab.edu/ELISA%20protocol.pdf; accessed on March 31^st, 2014).

ИФА определяет типовые антитела к конкретному IgG анти-S. pneumoniae капсульному полисахариду (PS), присутствующие в сыворотке крови человека. При разбавлениях сыворотки крови человека добавляют в тип-специфические капсульные PS-покрытые планшеты для микротитрования, антитела специфичные для этого капсульного PS связываются с планшетами для микротитрования. Антитела, связанные с планшетами, детектируют с использованием козьего античеловеческого IgG меченого щелочной фосфатазой антитела, с последующим использованием п-нитрофенилфосфатного субстрата. Оптическая плотность окрашенного конечного продукта пропорциональна количеству анти-капсульного PS антитела, присутствующего в сыворотке.

В одном варианте осуществления, иммунногенная композиция согласно представленному изобретению, содержащая, по меньшей мере, один гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 15В (такой как гликоконъюгаты из раздела 1.3.4, указанного выше) способна вызывать IgG антитела у человека, котрые способны связываться с полисахаридом S. pneumoniae серотипа 15В при концентрации, по меньшей мере, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,35, 0,4 или 0,5 мкг/мл, как определено с помощью ИФА анализа.

В одном варианте осуществления, иммунногенная композиция согласно представленному изобретению, содержащая, по меньшей мере, один гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 15В (такой как гликоконъюгаты из раздела 1.3.4, указанного выше), способна вызывать IgG антитела у человека, котрые способны связываться с полисахаридом S. pneumoniae серотипа 15С при концентрации, по меньшей мере, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,35, 0,4 или 0,5 мкг/мл, как определено с помощью ИФА анализа.

В одном варианте осуществления, иммунногенная композиция согласно представленному изобретению, содержащая, по меньшей мере, один гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 15В (такой как гликоконъюгаты из раздела 1.3.4, указанного выше), способна вызывать IgG антитела у человека, котрые способны связываться с полисахаридом S. pneumoniae серотипов 15В и 15С при концентрации, по меньшей мере, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,35, 0,4 или 0,5 мкг/мл, как определено с помощью ИФА анализа.

В одном варианте осуществления, иммунногенная композиция согласно представленному изобретению, содержащая, по меньшей мере, один гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 15В (такой как гликоконъюгаты из раздела 1.3.4, указанного выше), при введении субъекту, способна индуцировать образование антител, способных к уничтожению S. pneumoniae серотипа 15В анализе опсонофагоцитирующей активности, как раскрыто в данном документе (например, в ОРА анализе примера 12).

В одном варианте осуществления, иммунногенная композиция согласно представленному изобретению, содержащая, по меньшей мере, один гликоконъюгат из S. Pneumoniae серотипа 15В (такой как гликоконъюгаты из раздела 1.3.4, указанного выше), при исследовании в ОРА анализе, как раскрыто в данном документе (например, в ОРА анализе примера 12), имеет ОРА титр больший, чем ОРА титр, полученный с неконъюгированным нативным капсульным полисахаридом S. pneumoniae серотипа 15В.

В одном варианте осуществления, иммунногенная композиция согласно представленному изобретению, содержащая, по меньшей мере, один гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 15В (такой как гликоконъюгаты из раздела 1.3.4, указанного выше), при введении субъекту, способна индуцировать образование антител, способных к уничтожению S. pneumoniae серотипа 15С анализе опсонофагоцитирующей активности, как раскрыто в данном документе (например, в ОРА анализе примера 12). В одном варианте осуществления, иммунногенная композиция согласно представленному изобретению, содержащая, по меньшей мере, один гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 15В (такой как гликоконъюгаты из раздела 1.3.4, указанного выше), при исследовании в ОРА анализе, как раскрыто в данном документе (например, в ОРА анализе примера 12), имеет ОРА титр больший, чем ОРА титр, полученный с неконъюгированным нативным капсульным полисахаридом S. pneumoniae серотипа 15В.

Пневмококковый анализ опсонофагоцитирующей активности (ОРА), который измеряет уничтожение S. pneumoniae клеток с использованием фагоцитарных эффекторных клеток в присутствии функционального антитела и комплемента, как считается, является важным суррогатом для оценки эффективности пневмококковых вакцин.

Анализ опсонофагоцитирующей активности (ОРА) могут проводить путем инкубирования вместе смеси клеток Streptococcus pneumoniae, инактивированной при нагревании сыворотки человек, которую следует исследовать, дифференцированных HL-60 клеток (фагоцитов) и источника экзогенного комплемента (например, комплемента детеныша кролика). Опсонофагоцитоз протекает в процессе инкубирования, и бактериальные клетки, которые покрываются антителом и комплементом, погибают при опсонофагоцитозе. Колониеобразующие единицы (КОЕ) выживших бактерий, которые покидают опсонофагоцитоз, определяют путем высевания смеси для анализа. ОРА титр определяют как обратное разведение, которое в результате приводит к 50% уменьшению количества бактерий по сравнению с контрольными лунками без исследуемой сыворотки. ОРА титр интерполируется от от двух разведений, которые охватывают данное 50% отсечение уничтожения.

Конечная точка титра 1:8 или больше считается положительным результатом в данном типе ОРА уничтожения.

В одном варианте осуществления, иммунногенная композиция согласно представленному изобретению, содержащая, по меньшей мере, один гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 15В (такой как гликоконъюгаты из раздела 1.3.4, указанного выше), способна вызывать титр, по меньшей мере, 1:8 против S. pneumoniae серотипа 15В у, по меньшей мере, 50% субъектов как определено согласно анализу опсонофагоцитирующей активности уничтожения (ОРА). В одном варианте осуществления, иммунногенная композиция согласно представленному изобретению, содержащая, по меньшей мере, один гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 15В (такой как гликоконъюгаты из раздела 1.3.4, указанного выше) способна вызывать титр, по меньшей мере, 1:8 против S. pneumoniae серотипа 15В у, по меньшей мере, 60%, 70%, 80%, 90%, или, по меньшей мере, 93% субъектов, как определено согласно анализу опсонофагоцитирующей активности уничтожения (ОРА).

В одном варианте осуществления, иммунногенная композиция согласно представленному изобретению содержащая, по меньшей мере, один гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 15В (такой как гликоконъюгаты из раздела 1.3.4, указанного выше), способна вызывать титр, по меньшей мере, 1:8 против S. pneumoniae серотипа 15С у, по меньшей мере, 50% субъектов, как определено согласно анализу опсонофагоцитирующей активности уничтожения (ОРА). В одном варианте осуществления, иммунногенная композиция согласно представленному изобретению содержащая, по меньшей мере, один гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 15В (такой как гликоконъюгаты из раздела 1.3.4, указанного выше), способна вызывать титр, по меньшей мере, 1:8 против S. pneumoniae серотипа 15С у, по меньшей мере, 60%, 70%, 80%, 90%, или, по меньшей мере, 95% субъектов, как определено согласно анализу опсонофагоцитирующей активности уничтожения (ОРА).

В следующем аспекте, представленное изобретение предусматривает способ лечения или предупреждения S. Pneumoniae инфекции, заболевания или состояния, связанного с S. Pneumoniae серотипа 15А, 15В и/или 15С у субъекта, где способ включает стадию введения терапевтически или профилактически эффективного количество какой-либо иммуногенной композиции согласно представленному изобретению, содержащей, по меньшей мере, один гликоконъюгат из S. Pneumoniae серотипа 15В (такой как гликоконъюгаты из раздела 1.3.4, указанного выше). В одном варианте осуществления, иммунногенная композиция согласно представленному изобретению, содержащая, по меньшей мере, один гликоконъюгат из S. Pneumoniae серотипа 15В (такой как гликоконъюгаты из раздела 1.3.4, указанного выше), при введении субъекту, индуцирует образование антител способных к связыванию с S. pneumoniae серотипа 15В, 15А и/или 15С. В одном варианте осуществления, иммунногенная композиция согласно представленному изобретению содержащая, по меньшей мере, один гликоконъюгат из S. Pneumoniae серотипа 15В (такой как гликоконъюгаты из раздела 1.3.4, указанного выше), при введении субъекту, индуцирует образование антител, способных к уничтожению S. Pneumoniae серотипа 15В, 15С и/или 15А в анализе опсонофагоцитирующей активности, как раскрыто в данном документе (например, в ОРА анализе примера 12).

Один вариант осуществления, согласно раскрытию, предусматривает способ защиты субъекта против инфекции S. Pneumoniae серотипа 15С, или способ предупреждения инфекции S. Pneumoniae серотипа 15С, или способ уменьшения тяжести или задержки возникновения, по меньшей мере, одного симптома, связанного с инфекцией, вызванной S. Pneumoniae серотипа 15С, где способы включают введение субъекту иммуногенного количества какой-либо из иммунногенных композиций согласно представленному изобретению, содержащих, по меньшей мере, один гликоконъюгат из S. Pneumoniae серотипа 15В (такой как гликоконъюгаты из раздела 1.3.4, указанного выше). Один вариант осуществления согласно раскрытию предусматривает способ лечения или предупреждения S. pneumoniae инфекции, заболевания или состояния, связанного с S. Pneumoniae серотипа 15А, 15В и/или 15С (предпочтительно 15В и/или 15С, более предпочтительно 15В) у субъекта, где способ включает стадию введения терапевтически или профилактически эффективного количество какой-либо из иммунногенных композиций согласно представленному изобретению, содержащих, по меньшей мере, один гликоконъюгат из S. Pneumoniae серотипа 15В (такой как гликоконъюгаты из раздела 1.3.4, указанного выше) субъекту. Другой вариант осуществления предусматривает способ лечения или предупреждения S. pneumoniae инфекции, заболевания или состояния, связанного с S. Pneumoniae серотипа 15А, 15В и/или 15С (предпочтительно 15В и/или 15С, более предпочтительно 15В) у субъекта, где способ включает генерирование препарата поликлонального или моноклонального антитела из какой-либо из иммунногенных композиций согласно представленному изобретению, содержащих, по меньшей мере, один гликоконъюгат из S. Pneumoniae серотипа 15В (такой как гликоконъюгаты из раздела 1.3.4, указанного выше), и использование указанного препарата антитела для предоставления пассивного иммунитета субъекту.

В одном варианте осуществления, раскрытие касается использования какой-либо из иммунногенных композиций согласно представленному изобретению содержащей, по меньшей мере, один гликоконъюгат из S. Pneumoniae серотипа 15В (такой как гликоконъюгаты из раздела 1.3.4, указанного выше) для производства лекарственного средства для защиты субъекта против инфекции S. pneumoniae, и/или предупреждения инфекции S. pneumoniae, и/или уменьшения тяжести или задержки возникновения, по меньшей мере, одного симптома, связанного с инфекцией, вызванной S. pneumoniae, и/или защиты субъекта против инфекции S. Pneumoniae серотипа 15А, 15В и/или 15С (предпочтительно 15В и/или 15С, более предпочтительно 15В), и/или предупреждения инфекции S. Pneumoniae серотипа 15А, 15В и/или 15С (предпочтительно 15В и/или 15С, более предпочтительно 15В), и/или уменьшения тяжести или задержки возникновения, по меньшей мере одного симптома, связанного с инфекцией, вызванной S. Pneumoniae серотипа 15А, 15В и/или 15С (предпочтительно 15В и/или 15С, более предпочтительно 15В).

В одном варианте осуществления, раскрытие касается использования какой-либо из иммунногенных композиций согласно представленному изобретению, содержащей, по меньшей мере, один гликоконъюгат из S. Pneumoniae серотипа 15В (такой как гликоконъюгаты из раздела 1.3.4, указанного выше) для защиты субъекта против инфекции S. pneumoniae, и/или предупреждения инфекции S. pneumoniae, и/или уменьшения тяжести или задержки возникновения, по меньшей мере, одного симптома, связанного с инфекцией, вызванной S. pneumoniae, и/или защиты субъекта против инфекции S. Pneumoniae серотипа 15А, 15В и/или 15С (предпочтительно 15В и/или 15С, более предпочтительно 15В) и/или предупреждения инфекции S. Pneumoniae серотипа 15А, 15В и/или 15С (предпочтительно 15В и/или 15С, более предпочтительно 15В), и/или уменьшения тяжести или задержки возникновения, по меньшей мере, одного симптома, связанного с инфекцией, вызванной S. Pneumoniae серотипа 15А, 15В и/или 15С (предпочтительно 15В и/или 15С, более предпочтительно 15В).

7 Субъект, подвергаемый лечению иммуногенной композицией согласно изобретению

Как раскрыто в данном документе, иммуногенная композиция, описанная в данном документе, может быть использована в различных терапевтических или профилактических способах для предупреждения, лечения или ослабления бактериальной инфекции, заболевания или состояния у субъекта.

В предпочтительном варианте осуществления, указанным субъектом является человек. В наиболее предпочтительном варианте осуществления, указанный субъект является новорожденным (то есть, в возрасте до трех месяцев), младенцем (то есть, в возрасте от 3 месяцев до одного года) или малышом (то есть, в возрасте от одного года до четырех лет).

В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция, раскрытая в данном документе, предназначена для использования в качестве вакцины.

В таком варианте осуществления, субъект, подлежащий вакцинации, может быть в возрасте меньше 1 года. Например, субъект, подлежащий вакцинации, может иметь возрасть приблизительно 1, приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4, приблизительно 5, приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11 или приблизительно 12 месяцев. В одном варианте осуществления, субъект, подлежащий вакцинации, имеет возраст приблизительно 2, приблизительно 4 или приблизительно 6 месяцев. В другом варианте осуществления, субъект, подлежащий вакцинации, имеет возраст меньше 2 лет. Например, субъект, подлежащий вакцинации, может быть в возрасте от приблизительно 12 до приблизительно 15 месяцев. В некоторых случаях, необходимой является всего навсего одна доза иммунногенной композиции в соответствии с изобретением, но в некоторых случаях, вторая, третья или четвертая дозы могут быть даны (смотри раздел 8 ниже).

В одном варианте осуществления согласно представленному изобретению, субъект, подлежащий вакцинации, является взрослым человеком в возрасте 50 лет или старше, более предпочтительно взрослым человеком в возрасте 55 лет или старше. В одном варианте осуществления, субъект, подлежащий вакцинации, является взрослым человеком в возрасте 65 лет или старше, в возрасте 70 лет или старше, в возрасте 75 лет или старше, или в возрасте 80 лет или старше.

В одном варианте осуществления субъект, подлежащий вакцинации, является индивидуумом с нарушенной иммунологической реактивностью, в частности, человеком. Индивидуум с нарушенной иммунологической реактивностью, как правило, определяется как личность, которая демонстрирует ослабленную или сниженную способность поддерживать нормальную гуморальную или клеточную защиту, чтобы вызвать иммунность инфекционными агентами.

В одном варианте осуществления согласно представленному изобретению, субъект с нарушенной иммунологической реактивностью, которого следует вакцинировать, страдает от заболевания или состояния, которое ухудшает иммунную систему и в результате приводит к антительному ответу, который недостаточен для защиты против или лечения пневмококковых заболеванией.

В одном варианте осуществления, указанное заболевание представляет собой первичное иммунодефицитное растройство. Предпочтительно, указанное первичное иммунодефицитное растройство выбирают из группы, состоящей из: комбинированного Т- и В-клеточных иммунодефицитов, дефицитов антитела, хорошо определенных синдромов, иммунных дисрегуляционных заболеваний, расстройств фагоцитов, врожденных дефицитов иммунитета, аутовоспалительных расстройств, и комплемента дефектов. В одном варианте осуществления, указанное первичное иммунодефицитное растройство выбирают из тех, которые раскрыты на странице 24, строка 11, до страницы 25, строка 19, из WO 2010/125480.

В конкретном варианте осуществления представленного изобретения, субъект с нарушенной иммунологической реактивностью, которого следует вакцинировать, страдает от заболевания, выбранного из группы состоящей из: ВИЧ-инфекции, синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИДа), рака, хронической сердечной или легочной недостаточности, застойной сердечной недостаточности, сахарного диабета, хронического заболевания печени, алкоголизма, цирроза печени, спинального протекания жидкости, кардиомиопатии, хронического бронхита, эмфиземы, хронического обструктивного заболевания легких (ХОЗЛ), дисфункции селезенки (например, серповидно-клеточной анемии), отсутствия функции селезенке (асплении), малигнизации крови, лейкоза, множественной миеломы, болезни Ходжкина, лимфомы, почечной недостаточности, нефротического синдрома и астмы.

В одном варианте осуществления согласно представленному изобретению, субъект с нарушенной иммунологической реактивностью, которого следует вакцинировать, страдает от недостаточного питания.

В конкретном варианте осуществления представленного изобретения, субъект с нарушенной иммунологической реактивностью, которого следует вакцинировать, принимает лекарство или лечение, которое снижает устойчивость организма к инфекции. В одном варианте осуществления, указанное лекарственное средство выбирают из одного из раскрытых на странице 26, строка 33, до страницы 26, строка 4, из WO 2010/125480.

В конфетном варианте осуществления представленного изобретения, субъект с нарушенной иммунологической реактивностью, которого следует вакцинировать, является курильщиком.

В конфетном варианте осуществления представленного изобретения, субъект с нарушенной иммунологической реактивностью, которого следует вакцинировать, имеет количество белых фовяных клеток (количество лейкоцитов) ниже 5×10⁹ клеток на литр, или ниже 4×10⁹ клеток на литр, или ниже 3×10⁹ клеток на литр, или ниже 2×10⁹ клеток на литр, или ниже 1×10⁹ клеток на литр, или ниже 0,5×10⁹ клеток на литр, или ниже 0,3×10⁹ клеток на литр, или ниже 0,1×10⁹ клеток на литр.

Количество белых кровяных клеток (количество лейкоцитов): Количество белых кровяных клеток (WBC) в крови. WBC, как правило, измеряют как часть СВС (полного анализа крови). Белые кровяные клетки представляют собой клетки в крови, борющиеся с инфекцией и отличаются от фасных (переносящих кислород) кровяных клеток, известных как эритроциты. Существуют различные типы белых кровяных клеток, включая нейтрофилы (полиморфноядерные лейкоциты; PMN), ленточные клетки (слегка незрелые нейтрофилы), Т-типа лимфоциты (Т-клетки), В-типа лимфоциты (В-клетки), моноциты, эозинофилы, и базофилы. Все типы белых кровяных клеток отражаются в количестве белых кровяных клеток. Нормальный диапазон для количества белых кровяных клеток, как правило, составляет от 4300 до 10800 клеток на кубический миллиметр крови. Это также может упоминаться как количество лейкоцитов и может быть выражено в международных единицах, как 4,3-10,8×10⁹ клеток на литр.

В конкретном варианте осуществления представленного изобретения, субъект с нарушенной иммунологической реактивностью, которого следует вакцинировать, страдает от нейтропении. В конкретном варианте осуществления представленного изобретения, субъект с нарушенной иммунологической реактивностью, которого следует вакцинировать, имеет количество нейтрофилов ниже 2×10⁹ клеток на литр, или ниже 1×10⁹ клеток на литр, или ниже 0,5×10⁹ клеток на литр, или ниже 0,1×10⁹ клеток на литр, или ниже 0,05×10⁹ клеток на литр.

Низкое количество белых кровяных клеток или "нейтропения" представляет собой состояние, характеризуется аномально низким уровнем нейтрофилов в циркулирующей крови. Нейтрофилы представляют собой специфический вид белых кровяных клеток, которые помогают предупреждать и бороться с инфекциями. Самой распространенной причиной того, что больные раком страдают от нейтропении, является побочный эффект химиотерапии. Нейтропении, индуцированнаях химиотерапией, увеличивает риск инфицирования пациента и срывает лечения рака.

В конкретном варианте осуществления представленного изобретения, субъект с нарушенной иммунологической реактивностью, которого следует вакцинировать, имеет количество CD4+ клеток ниже 500/мм³, или количество CD4+ клеток ниже 300/мм³, или количество CD4+ клеток ниже 200/мм³, количество CD4+ клеток ниже 100/мм³, количество CD4+ клеток ниже 75/мм³, или количество CD4+ клеток ниже 50/мм³.

Исследования CD4 клеток, как правило, сообщаются как количество клеток в мм³. Нормальный уровень CD4 составляет от 500 до 1600, и уровень CD8 составляет от 375 до 1100. Уровень CD4 резко падает у людей с ВИЧ.

В одном варианте осуществления согласно изобретению, какой-либо из субъектов с нарушенными иммунологическими реактивностями, раскрытыми в данном документе, является человеком мужского пола или человеком женского пола.

8 Режим

В некоторых случаях, необходимой является всего навсего одна доза иммунногенной композиции в соответствии с изобретением, но при некоторых обстоятельствах, таких как состояния большего иммунного дефицита, могут давать вторую, третью или четвертую дозу. После первичной вакцинации субъекты могут получать одну или несколько бустерных иммунизации, адекватно разнесенных.

В одном варианте осуществления, график вакцинации иммунногенной композицией в соответствии с изобретением представляет собой одну дозу. В конкретном варианте осуществления, указанный график одной дозы является для здорового индивидуума в возрасте, по меньшей мере, 2 года.

В одном варианте осуществления, график вакцинации иммунногенной композицией в соответствии с изобретением представляет собой график несколько доз. В конкретном варианте осуществления, указанный график несколько доз состоит из серий из 2 доз, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев. В конкретном варианте осуществления, указанный график несколько доз состоит из серий из 2 доз, разделенных интервалом приблизительно 1 месяц, или серий из 2 доз, разделенных интервалом приблизительно 2 месяца.

В другом варианте осуществления, указанный график несколько доз состоит из серий из 3 доз, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев. В другом варианте осуществления, указанный график несколько доз состоит из серий из 3 доз, разделенных интервалом приблизительно 1 месяц, или серии из 3 доз, разделенных интервалом приблизительно 2 месяца.

В другом варианте осуществления, указанный график несколько доз состоит из серий из 3 доз, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев с последующими четырьмя дозами от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первой дозы. В другом варианте осуществления, указанный график несколько доз состоит из серий из 3 доз, разделенных интервалом приблизительно 1 месяц с последующими четырьмя дозами от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первой дозы, или серии из 3 доз, разделенных интервалом приблизительно 2 месяца с последующими четырьмя дозами от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первой дозы.

В одном варианте осуществления, график несколько доз состоит из, по меньшей мере, одной дозы (например, 1, 2 или 3 доз) в первый год жизни, с последующей, по меньшей мере, одной дозой в возрасте малыша.

В одном варианте осуществления, график несколько доз состоит из серий из 2 или 3 доз, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев (например, 28-56 дней между дозами), начиная с 2-месячного возраста, и с последующей дозой малышу в возрасте 12-18 месяцев. В одном варианте осуществления, указанный график несколько доз состоит из серии из 3 доз, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев (например, 28-56 дней между дозами), начиная с 2-месячного возраста, и с последующей дозой малышу в возрасте 12-15 месяцев. В другом варианте осуществления, указанный график несколько доз состоит из серий из 2 доз, разделенных интервалом приблизительно 2 месяца, начиная с 2-месячного возраста, и с последующей дозой малышу в возрасте 12-18 месяцев.

В одном варианте осуществления, график несколько доз состоит из серии из 4-доз вакцины в возрасте 2, 4, 6 и 12-15 месяцев.

В одном варианте осуществления, первую дозу дают в возрасте 0 дней и один или больше бустов дают с интервалами, которые находятся в диапазоне от приблизительно 2 до приблизительно 24 недель, предпочтительно с интервалом дозирования 4-8 недель.

В одном варианте осуществления, первую дозу дают в возрасте 0 дней и буст дают приблизительно через 3 месяца.

Как использовано в данном документе, термин "приблизительно" означает в пределах статистически значимого диапазона значения, такого как указанный диапазон концентраций, временные рамки, молекулярная масса, температура или pH. Такой диапазон может быть в пределах порядка величины, как правило, в пределах 20%, более типично, в пределах 10%, и еще более типично, в пределах 5% или в пределах 1% от заданного значения или диапазона. Иногда, такой диапазон может быть в пределах погрешности эксперимента типичных стандартных методов, используемых для измерения и/или определения заданного значения или диапазона. Допустимое отклонение, охватываемое термином "приблизительно", будет зависеть от конкретной исследуемой системы, и может быть легко оценено обычным специалистом в данной области. Всякий раз, когда диапазон читается в пределах данной заявки, каждое целое число целого числа в пределах диапазона также рассматривается в качестве варианта осуществления изобретения.

Термины "содержащий", "содержат" и "содержит" в данном документе предназначены авторами изобретения, чтобы быть, необязательно, взаимозаменяемыми с терминами "содержащий по сути", "содержат по сути", "содержит по суть", "состоящий из', "состоят из' и "состоит из', соответственно, в каждом примере.

Все ссылки или заявки на патент, процитированные в данном описании патента являются включенными в данный документ в качестве ссылки. Изобретение иллюстрируется в прилагаемых примерах. Приведенные ниже примеры выполняются с использованием стандартных методик, которые хорошо известны и рутинны для квалифицированных специалистов в данной области, за исключением того, где описано иначе подробно. Примеры иллюстрируют, но не ограничивают, изобретение.

ПРИМЕР

Пример 1. Общий способ получения еТЕС связанных гликоконъюгатов

Активирование сахарида и тиолирование цистамина д и гидрохлоридом

Сахарид растворяют в безводном диметилсульфоксиде (ДМСО). Содержание влаги в растворе определяют по методу Карла Фишера (KF) и регулируют, чтобы достичь содержание влаги от 0,1% до 0,4%, как правило 0,2%.

Для того, чтобы инициировать активирование, готовят свежий раствор 1,1'-карбонил-ди-1,2,4-триазол (CDT) или 1,1'-карбонилдиимидазол (CDI) концентрацией 100 мг/мл в ДМСО. Сахарид активируют различными количествами CDT/CDI (1-10 молярными эквивалентами) и реакции дают протекать в течение 1 часа при 23±2°C. Уровень активации может быть определен с помощью ВЭЖХ. Цистамина дигидрохлорид готовят свежим в безводном ДМСО в концентрации 50 мг/мл. Активированный сахарид подвергается взаимодействию с 1 молярным эквивалентом (мол. экв.) цистамина дигидрохлорида.

Альтернативно, активированный сахарид подвергается взаимодействию с 1 мол. экв. цистеамина гидрохлорида. Реакции тиолирования дают протекать в течение 21±2 часа при 23±2°C, получая тиолированный сахарид. Уровень тиолирования определяют дополнительным количеством CDT/CDI.

Остаточный CDT/CDI в реакции активации раствора гасят путем добавления 100 мМ натрия тетрабората, рН раствора 9,0. Расчеты выполняют, чтобы определить дополнительное количество тетрабората и регулировать конечное содержание влаги, которое должно составлять вплоть до 1-2% общей воды.

Восстановление и очистка активированного тиолированного сахарида

Реакционную смесь тиолированного сахарида разбавляют в 10 раз за счет добавления к предварительно охлажденному 5 мМ сукцинату натрия в 0,9% солевом растворе, pH 6,0 и фильтруют через фильтр 5 мкм. Диафильтрацию тиолированного сахарида осуществляют против 40-кратного диаобъема WFI. К ретенату добавляют раствор три(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР), 1-5 мол. экв., после разбавления 10% объема 0,1 М буфера фосфата натрия, pH 6,0. Данной реакции восстановления дают протекать в течение 20±2 часов при 5±3°C. Очистку активированного тиолированного сахарида осуществляют предпочтительно, используя ультрафильтрацию/диафильтрацию против предварительно охлажденного 10 мМ моноосновного фосфата натрия, рН 4,3. Альтернативно, тиолированный сахарид чистят, используя стандартные гель-проникающие хроматографические (SEC) методики или ионообменные хроматографические способы. Аликвоту ретената активированного тиолированного сахарида отбирают, чтобы определить концентрацию сахарида и провести анализы на содержание тиолов (Элман).

Альтернативное восстановление и очистка активированного тиолированного сахарида

В качестве альтернативы процедуре очистки, описанной выше, активированный тиолированный сахарид также чистили, как описано ниже.

К реакционной смеси тиолированного сахарида добавляли раствор три(2-карбоксиэтил)фосфин (ТСЕР), 5-10 мол. экв., и давали протекать реакции в течение 3±1 часов при 23±2°C. Реакционную смесь затем разбавляли в 5 раз посредством добавления к предварительно охлажденному 5 мМ сукцината натрия в 0,9% солевом растворе, pH 6,0 и фильтровали через фильтр 5 мкм. Диафильтрацию тиолированного сахарида проводили с использованием 40-кратного диаобъема предварительно охлажденного 10 мМ раствора моноосновного фосфата натрия, pH 4,3. Аликвоту ретената активированного тиолированного сахарида отбирали, чтобы определить концентрацию сахарида и провести анализы на содержание тиолов (Элман).

Активирование и очистка бромацетилированного белка-носителя

Свободные аминогруппы белка-носителя бромацетилируются в результате реакции с бромацетилирующим агентом, таким как сложный эфир бромуксусной кислоты и N-гидроксисукцинимида (BAANS), бромацетилбромид, или другим приемлемым реагентом.

Белок-носитель (в 0,1 М фосфате натрия, pH 8,0±0,2) сначала выдерживают при 8±3°C, при приблизительно рН 7 перед активированием. К раствору белка добавляют сложный эфир N-гидроксисукцинимида и бромуксусной кислоты (BAANS) как исходный раствор в диметилсульфоксиде (ДМСО) (20 мг/мл) в соотношении 0,25-0,5 BAANS: белок (масс/масс). Реакцию осторожно перемешивают при 5±3°C в течение 30-60 минут. Полученный в результате бромацетилированный (активированный) белок чистят, например, используя ультрафильтрацию/диафильтрацию с использованием 10 кДа MWCO мембраны с 10 мМ фосфатным (pH 7,0) буфером. После очистки, концентрацию белка бромацетилированного белка-носителя оценивают согласно белковому анализу по Лоури.

Степень активации определяют по общему анализу на бромид, используя ионно-обменную жидкостную хроматографию в сочетании кондуктометрическим детектированием с подавлением фоновой электропроводности (ионная хроматография). Связанный бромид на активированном бромацетилированном белке отщепляется от белка в препарате для анализа образца и количественного анализа вместе с каким-либо свободным бромидом, который может присутствовать. Какой-либо оставшийся ковалентно связанный бром на белке высвобождается путем превращения в ионный бромид путем нагревания образца в щелочном 2-меркаптоэтаноле.

Активирование и очистка бромацетилированного CRM₁₉₇

CRM₁₉₇ разбавляли до 5 мг/мл 10 мМ фосфатным буферным 0,9% NaCl pH 7 (PBS) и затем приготовленным 0,1 М NaHCO₃, pH 7,0, с использованием 1 М исходного раствора. BAANS добавляли в CRM₁₉₇: BAANS соотношение 1: 0,35 (w:w) с использованием BAANS исходного раствора 20 мг/мл ДМСО. Реакционную смесь инкубировали при температуре от 3°C до 11°C в течение 30 минут-1 часа, затем чистили, используя ультрафильтрацию/диафильтрацию с использованием 10К MWCO мембраны и 10 мМ фосфата натрия/0,9% NaCl, pH 7,0. Очищенный активированный CRM₁₉₇ анализировали, с помощью анализа Лоури, чтобы определить концентрацию белка и затем разбавляли PBS до 5 мг/мл. Добавляли сахарозу до 5% масс./об. в качестве криопротектора и активированный белок замораживали и хранили при -25°C до необходимой для конъюгации.

Бромацетилирование лизиновых остатков CRM₁₉₇ было очень последовательным, что в результате приводило к активированию от 15 до 25 лизинов из 39 доступных лизинов. Реакция давала высокие выходы активированного белка.

Конъюгация активированного тиолированного сахарида с бромацетилированным белком-носителем

Перед началом реакции конъюгации, реакционные сосуды, предварительно охлаждают до 5°C. Бромацетилированный белок-носитель и активированный тиолированный сахарид последовательно добавляют и перемешивают со скоростью перемешивания 150-200 оборотов в минуту. Вводимое соотношение сахарид/белок составляет 0,9±0,1. pH реакции регулируют до 8,0±0,1 1 М раствором NaOH. Реакции конъюгации дают протекать при 5°C в течение 20±2 часов.

Блокирование остаточных реакционноспособных функциональных групп

Непрореагировавшие бромацетилированные остатки на белке-носителе гасят путем взаимодействие 2 мол. экв. N-ацетил-L-цистеина в качестве блокирующего реагента в течение 3 часов при 5°C. Остаточные свободные сульфгидрильные группы блокируют 4 мол. экв. йодацетамида (IAA) в течение 20 часов при 5°C.

Очистка еТЕС-связанного гликоконъюгата

Смесь реакции конъюгации (пост-IАА-блокированный) фильтруют через 0,45 мкм фильтр. Ультрафильтрацию/диафильтрацию гликоконъюгата осуществляют против 5 мМ сукцинат-0,9% солевого раствора, pH 6,0. Ретенат гликоконъюгата фильтруют через 0,2 мкм фильтр. Аликвоту гликоконъюгата отбирают для анализов. Оставшийся гликоконъюгат хранят три 5°C.

Пример 2. Получение Pn-33F еТЕС конъюгатов

Процесс активирования

Активирование Pn33F полисахарида

Pn-33F полисахарид смешивали с 500 мМ 1,2,4-триазола (в WFI) с получением 10 грамм триазола на грамм полисахарида. Смесь замораживали в оболочке на бане сухой лед-этанол и затем лиофилизировали до сухости. Лиофилизированный 33F полисахарид восстанавливали в безводном диметилсульфоксиде (ДМСО). Содержание влаги лиофилизированного 33F/ДМСО раствора определяли по методу Карла Фишера (KF). Содержание влаги регулировали за счет добавления WFI к раствору 33F/ДМСО, чтобы достичь содержания влаги 0,2%.

Для того, чтобы инициировать активирование, готовили свежий 1,1'-карбонил-ди-1,2,4-триазол (CDT) как 100 мг/мл раствор в ДМСО. Pn33F полисахарид активировали различными количествами CDT перед стадией тиолирования. CDT активирование проводили при 23±2°C в течение 1 часа. Уровень активации определяли по ВЭЖХ (А220/А205). Раствор тетрабората натрия, 100 мМ, pH 9,0 добавляли, чтобы погасить какой-либо остаточный CDT в реакции активации раствора. Расчеты выполняют, чтобы определить дополнительное количество тетрабората и позволить конечному содержанию влаги составлять 1,2% общей воды. Реакции давали протекать в течение 1 часа при 23±2°C.

Тиолирование активированного Pn-33F полисахарида

Цистамина дигидрохлорид готовили свежим в безводном ДМСО, и 1 мол. экв. цистамина дигидрохлорид добавляли к реакционному раствору активированного полисахарида. Реакции давали протекать в течение 21±3 часов при 23±2°C. Раствор тиолированного сахарида разбавляли в 10 раз посредством добавления к предварительно охлажденному 5 мМ сукцинату натрия в 0,9% солевом растворе, pH 6,0. Разбавленный реакционный раствор фильтровали через фильтр 5 мкм. Диафильтрацию тиолированного Pn-33F полисахарида проводили на 100K MWCO ультрафильтрационных мембранных кассетах, с использованием воды для инъекций (WFI).

Восстановление и очистка активированного тиолированного Pn-33F полисахарида

К раствору ретената добавляли три(2-карбоксиэтил)фосфин (ТСЕР), 5 мол. экв., после разбавления 10% по объему 0,1 М буфером фосфата натрия, pH 6,0. Данной реакции восстановления давали протекать в течение 2±1 часов при 23±2°C. Диафильтрацию тиолированного 33F полисахарида проводили на 100K MWCO ультрафильтрационных мембранных кассетах. Диафильтрацию проводили против предварительно охлажденного 10 мМ фосфата натрия, pH 4,3. Ретенат тиолированного 33F полисахарида отбирали как для анализа концентрации сахарида, так и тиола (Элман).

Альтернативное восстановление и очистка активированного тиолированного Pn-33F полисахарида

В качестве альтернативы процедуре очистки, описанной выше, 33F активированный тиолированный сахарид также чистили следующим образом. К реакционной смеси тиолированного сахарида добавляли раствор три(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР), 5 мол. экв., и давали протекать реакции в течение 3±1 часов при 23±2°C. Реакционную смесь затем разбавляли в 5 раз посредством добавления к предварительно охлажденному 5 мМ сукцинату натрия в 0,9% солевом растворе, pH 6,0 и фильтровали через фильтр 5 мкм. Диафильтрацию тиолированного сахарида проводили с использованием 40-кратного диаобъема предварительно охлажденного 10 мМ моноосновного фосфата натрия, pH 4,3 на 100K MWCO ультрафильтрационных мембранных кассетах. Ретенат тиолированного 33F полисахарида отбирали как для анализа концентрации сахарида, так и тиола (Элман). Блок-схема процесса активирования представлена на фигуре 8(A).

Процесс конъюгирования

Конъюгация тиолированного Pn33F полисахарида с бромаиетилированным CRM₁₉₇

CRM₁₉₇ белок-носитель активировали отдельно путем бромацетилирования, как описано в примере 1, и затем подвергали взаимодействию с активированным Pn-33F полисахаридом для реакции конъюгации. Перед началом реакции конъюгации, реакционную емкость предварительно охлаждали до 5°C. Бромацетилированный CRM₁₉₇ и тиолированный 33F полисахарид смешивали вместе в реакционной емкости со скоростью перемешивания 150-200 оборотов в минуту. Входное соотношение сахарид/белок составляло 0,9±0,1. pH реакции регулировали до 8,0-9,0. Реакции конъюгации давали протекать при 5°C в течение 20±2 часов.

Блокирование реакционноспособных групп на бромацетилированном CRM₁₉₇ и тиолированном Pn33F полисахариде

Непрореагировавшие бромацетилированные остатки на CRM₁₉₇ белках блокировали путем взаимодействия с 2 мол. экв. N-ацетил-N-цистеина в течение 3 часов при 5°C, с последующим блокированием каких-либо остаточных свободных сульфгидрильных групп тиолированного 33F-полисахарида с 4 мол. экв. йодацетамида (IAA) в течение 20 часов при 5°C.

Очистка еТЕС-связанного Pn-33F гликоконъюгата Конъюгационный раствор фильтровали через 0,45 мкм или 5 мкм фильтр. Диафильтрацию 33F гликоконъюгата проводили на 300K MWCO ультрафильтрационных мембранных кассетах. Диафильтрацию проводили против 5 мМ сукцината-0,9% солевого раствора, pH 6,0. Ретенат Pn-33F гликоконъюгата 300K затем фильтровали через 0,22 мкм фильтр и хранили при 5°C. Блок-схема процесса конъюгирования представлена на фигуре 8(B).

Результаты

Параметры реакции и характеристические данные для нескольких серий Pn-33F еТЕС гликоконъюгатов показаны в таблице 1. CDT активирование-тиолирование цистамина дигидрохлоридом генерировало гликоконъюгаты, имеющие от 63% до 90% выходы сахарида и от <1% до 13% свободных сахаридов.

ОРА Титры Pn-33F еТЕС гликоконъюгатов с CRM₁₉₇

Pn-33F ОРА титры у мышей определяли в стандартных условиях (подобные к ОРА методикам, описанным ниже для конъюгатов 10А и 22F). ОРА титры (GMT с 95% CI) через четыре и семь недель показаны в таблице 2, демонстрируя, что гликоконъюгат серотипа 33F Pn вызвал ОРА титры в модели иммуногенности на мышах.

Пример 3. Получение дополнительных Pn-33F еТЕС конъюгатов

Дополнительные Pn-33F еТЕС конъюгаты получали с использованием способа, описанного в примере 2. Параметры реакции и характеристические данные для данных дополнительных серий Pn-33F еТЕС гликоконъюгатов показаны в таблице 3.

Как показано выше и в таблице 3, несколько Pn-33F конъюгатов были получены с использованием еТЕС конъюгации, приведенной выше. еТЕС химия позволила получение конъюгатов с высоким выходом, низким % свободного сахарида и высокой степенью конъюгации (конъюгированных лизинов). Дополнительно, было возможным защитить больше, чем 80% ацетильных функциональных групп, используя еТЕС способ конъюгирования.

Пример 4. Оценка стабильности Pn-33F еТЕС гликоконъюгатов: тенденции % свободного сахарида

Аликвоты серии конъюгата 33F-2B (смотри таблицу 1) дозировали в полипропиленовые пробирки и хранили при 4°C, 25°C, и 37°C, соответственно и контролировали тенденции по % свободного сахарида. Данные (% свободного сахарида) показаны в таблице 4. Как показано в данной таблице, значительных изменений в % свободного сахарида не было.

Ускоренная стабильность другой партии конъюгата (Партия 33F-3C) также проводили при 37°C вплоть до 1 месяца. Как показано в таблице 5, значительных изменений в % свободного сахарида не было при 37°C, вплоть до 1 месяца.

Для дополнительного подтверждения стабильности еТЕС конъюгатов, конъюгаты дополнительной серии (33F-3C и 33F-5E (смотри таблицу 1)) хранили при 4°C контролировали в течение приблизительно одного года, для потенциальных тенденций в % свободного сахарида. Как показано в таблице 6, значительных изменений в % уровней свободного сахарида не было для конъюгатов хранили при 4°C в течение длительного периода времени до приблизительно одного года.

Конъюгаты серотипа 33F, полученные с использованием 33F еТЕС химии, как продемонстрировано, являются стабильными без заметного разложения, как контролировали по тенденциям свободного сахарида при различных температурах (в режиме реального времени и ускоренном режиме).

Пример 5. Получение Pn-8 конъюгатов с CRM₁₉₇

Получение Рп-8 RAC/ДМСО гликоконъюгатов

Замороженный полисахарид размораживали и переносили в реакционную емкость. 2 М уксусную кислоту и WFI (воду для инъекций) добавляли к раствору полисахарида, чтобы достичь конечной концентрации полисахарида приблизительно 2,5 г/л и конечной концентрации уксусной кислоты 0,2 М.

Гидролиз полисахарида

Нативный полисахарид химически гидролизовали перед активированием. Разбавленный раствор полисахарида нагревали до 70°C, и затем выдерживали при данной температуре в течение 3,5 часов.

Окисление полисахарида

Окисление полисахарида инициировали путем добавления раствора натрия перйодата, и реакцию оставляли для протекания в течение 20 часов при 23°C.

Очистка активированного полисахарида

Активированный полисахарид концентрировали с использованием ультрафильтрационных кассет. Диафильтрацию проводили против 20-кратного дипобъема WFI.

Лиофилизация

Активированный полисахарид смешивают с сахарозой в соотношении 25 грамм сахарозы на грамм активированного полисахарида. Флаконы, содержащие активированный сахарид и сахарозу замораживают в оболочке на этанольных банях и лиофилизируют.

Конъюгация активированного полисахарида с CRM₁₉₇ и блокирование

Лиофилизированный активированный полисахарид восстанавливали до 2 мг/мл в ДМСО. ДМСО добавляли к лиофилизированному CRM₁₉₇ для восстановления. Восстановленный CRM₁₉₇ добавляли к восстановленному активированному полисахариду. Затем инициировали конъюгацию за счет добавления натрия цианоборгидрида к реакционной смеси и инкубировали при 23°C в течение 24 часов. Прекращение реакции конъюгацию осуществляется путем добавления 2 мэкв боргидрида натрия. Данное блокирование реакции проводили в течение 3 часов при 23°C.

Очистка конъюгата

Раствор конъюгата затем разбавляли охлажденным 5 мМ сукцинат-0,9% солевым раствором (рН 6,0), фильтровали, концентрировали до 2-4 г/л, используя 300K целлюлозные мембраны, и первую стадию диафильтрации проводили против 5 мМ сукцинат - 0,9% солевого раствора (рН 6,0). Стадию конечной очистки осуществляли путем диафильтрации с 5 мМ сукцинат - 0,9% солевого раствора, буфера с pH 6,0. После того, как диафильтрация завершилась, очищенный конъюгат переносили в емкость для сбора через 0,22 мкм фильтр.

Разбавление моновалентного объемного конъюгата

Конъюгат разбавляли дополнительным 5 мМ сукцинат / 0,9% солевым раствором (рН 6), до целевой концентрации сахарида 0,5 мг/мл. Конечную стадию фильтрования через 0,22 мкм завершали, чтобы получитть моновалентный объемный продукт конъюгата (МВС) для препарата.

Несколько конъюгатов получали с использованием выше описанного способа путем изменения различных параметров (например, входного соотношения сахарид-белок, концентрации реакционной смеси и мэкв натрия цианоборгидрида). Характеристика представленных Pn-8 гликоконъюгатов с CRM₁₉₇ приводится в таблице 7.

Титры опсонофагоцитирующей активности (ОРА) для конъюгатов серотип 8-CRM₁₉₇ у мышей определяли у мышей в стандартных условиях (подобные к ОРА методикам, описанным ниже для 10А и 22F конъюгатов). ОРА титры (средний геометрический титр (GMT) с 95% доверительным интервалом (CI)) через четыре недели в различных дозах показаны в таблице 8 и 9 (два отдельных эксперимента), демонстрируя, что конъюгат серотипа 8 (образцы 1-9; также смотри таблицу 7 для характеристических данных этих конъюгатов) вызвал ОРА титры в модели иммуногенности на мышах.

Как показано в таблице 8, конъюгаты серотипа 8, как показано, имеют значительно более высокие титры антитела, по сравнению с контрольным неконъюгированным полисахаридом, которые давали низкие титры антитела.

Общие данные, полученные от конъюгатов, приготовленных по описанному выше способу восстановительного аминирования, продемонстрировали, что это позволило получение конъюгатов с хорошим выходом конъюгации, низким % свободного сахарида и с хорошей стабильностью. Дополнительно, полученные конъюгаты вызвали хорошие ОРА титры в модели иммуногенности на мышах.

Пример 6. Получение конъюгата полисахарида серотипа 10А - CRM₁₉₇

Получение выделенного полисахарида S. pneumoniae серотипа 10А Капсульные полисахариды серотипа 10А могут быть получены непосредственно из бактерий с использованием процедур выделения известных квалифицированному специалисту в данной области (смотри, например, способы, раскрытые в публикациях заявок на патент США №№2006/0228380, 2006/0228381, 2007/0184071, 2007/0184072, 2007/0231340, до 2008/0102498 и WO 2008/118752). Streptococcus pneumoniae серотипа 10А выращивали в флаконе для посева, а затем переносили в ферментер для посева. После того, как целевая оптическая плотность была достигнута, клетки переносили в производственный ферментер. Ферментативный бульон инактивировали добавлением N-лауроилсаркозина и чистили, используя ультрафильтрацию и диафильтрацию.

Окисление выделенного капсульного полисахарида Streptococcus pneumoniae серотипа 10A

Рассчитанный объем 0,1 М буфера фосфата калия (pH 6,0) и воды для инъекций (WFI) добавляли к раствору полисахарида для того, чтобы достичь конечную концентрацию полисахарида 2,5 г/л и конечную концентрацию 25 мМ буфера фосфата калия, если необходимо, регулировали pH до приблизительно 6,0. Разбавленный полисахарид затем охлаждали до 5°C. Окисление инициировали путем добавления раствора 0,25 молярных эквивалентов (М-экв.) натрия перйодата. Время окислительной реакции составляло приблизительно 4 часа при 5°C. Окислительную реакцию гасили 1 М-экв. 2,3-бутандиола продолжая перемешивание при 5°C в течение 1-2 часов.

После достижения целевого времени реакции, активированный полисахарид концентрировали с использованием 30k MWCO Millipore ультрафильтрационной кассеты. Затем проводили диафильтрацию против 20-кратного диаобъема WFI. Очищенный активированный полисахарид хранили при 5°C. Очищенный активированный сахарид характеризуется, среди прочего, (i) молекулярной массой по SEC-MALLS и (ii) степенью окисления.

Конъюгация активированного полисахарида S. pneumoniae серотипа 10А с CRM₁₉₇

Процесс конъюгирования включал следующие стадии:

a. Смешивания с сахарозным эксципиентом, и лиофилизации;

b. Восстановления лиофилизированного полисахарида и CRM₁₉₇;

c. Конъюгации активированного полисахарида с CRM₁₉₇ и блокирования; и

d. Очистки конъюгата

a. Смешивание с сахарозой

Активированный полисахарид смешивают с сахарозой в соотношении 25 г сахарозы на грамм активированного полисахарида. Флакон компаундированной смеси затем лиофилизировали. После лиофилизации, флаконы, содержащие лиофилизированный активированный полисахарид хранили при -20°C.

b. Восстановления лиофилизированного активированного полисахарида и CRM₁₉₇ белка

Лиофилизированный активированный полисахарид восстанавливали в безводном диметилсульфоксиде (ДМСО). После полного растворения полисахарида, такое же количество ДМСО добавляли к рассчитанному CRM₁₉₇ для восстановления.

c. Конъюгация активированного полисахарида с CRM₁₉₇ и блокирование

Восстановленный CRM₁₉₇ (в ДМСО) добавляли к восстановленному активированному полисахариду в реакторе для конъюгирования. Конечная концентрация полисахарида составляет 1 г/л. Конъюгацию проводили за счет добавления 1,2 М-экв. натрия цианоборгидрида к реакционной смеси. Реакцию инкубировали при 23°C в течение 24 часов. Завершение реакции конъюгирования осуществляли за счет добавления 2 М-экв. натрия боргидрида. Реакцию блокирования инкубировали при 23°C в течение 3 часов.

Завершение реакции конъюгирования осуществляли за счет добавления 2 М-экв. натрия боргидрида. Данная реакция блокирования проходила в течение 3 часов при 23°C.

d. Очистка конъюгата

Раствор конъюгата затем разбавляли в 5х (по объему) охлажденным 5 мМ сукцинат-0,9% солевым раствором (рН 6,0) и 20Х диафильтрацию проводили с использованием 5 мМ сукцинат - 0,9% солевого раствора (pH 6,0). После того, как начальная диафильтрация завершалась, ретенат конъюгата переносили через 0,22 мкм фильтр. Конъюгат разбавляли дополнительным 5 мМ сукцинат / 0,9% солевым раствором (pH 6), и после конечной стадии фильтрования через 0,22 мкм его хранили при 2-8°C.

Несколько конъюгатов получали с использованием выше описанного способа за счет варьирования различных параметров (например, входного соотношения сахарид-белок, концентрации реакционной смеси и М-экв. натрия цианоборгидрида). Указанная выше химия позволила получить конъюгаты серотипа 10А, которые, как продемонстрировано, являются стабильными без заметного разложения, которое контролировали по тенденциям свободного сахарида при различных температурах (в режиме реального времени и ускоренном режиме). Характеристика предсталенных гликоконъюгатов Pn-10А с CRM₁₉₇ приведены в таблице 10.

Титры опсонофагоцитирующей активности (ОРА) для конъюгатов серотипа 10А-CRM₁₉₇ у мышей определяли в стандартных условиях. Группы из тридцати самок мышей Swiss Webster возрастом 6-7 недель иммунизировали 0,001 мкг, 0,01 мкг, или 0,1 мкг исследуемых конъюгатов с помощью подкожной инъекции в возрасте 0 недель. Мышей бустировали такой же дозой конъюгата в возрасте 3 недели и затем брали кровь в возрасте 4 недели. Серотип-специфические ОРА проводили на 4 недельных образцах сывороток.

Анализы опсонофагоцитирующей активности (ОРА) используются для измерения функциональных антител в сыворотке крови мышей специфической для S. pneumoniae серотипа 10А. Тест сыворотка устанавливается в реакциях анализа которые измеряют способность капсульного полисахарида специфического иммуноглобулина, чтобы опсонизировать бактерии, отложение триггерного комплемента, тем самым облегчая фагоцитоз и уничтожая бактерии с помощью фагоцитов. ОРА титр определяют как обратное разведение, которое в результате приводит к 50% уменьшению количества бактерий по сравнению с контрольными лунками без исследуемой сыворотки. ОРА титр интерполируется от двух разведений, которые охватывают данное 50% отсечение уничтожения.

Процедуры ОРА были основаны на способах, описанных в Hu et аl. (2005) Clin Diagn Lab Immunol12 (2): 287-295 со следующими модификациями. Исследуемую сыворотку серийно разбавляли в 2,5 раза и добавляли в планшеты для микротитрования для анализа. Живые целевые бактериальные штаммы серотипа 10А добавляли в лунки и планшеты встряхивали при 37°C в течение 30 минут. Дифференцированные HL-60 клетки (фагоциты) и сыворотку детенышей кроликов (возрастом 3-4-недели, PEL-FREES®, 12,5% конечная концентрация) добавляли в лунки, и планшеты встряхивали при 37°C в течение 60 минут. Для прекращения реакции, 80 мкл 0,9% NaCl добавляли во все лунки, перемешивали, и 10 мкл аликвоту переносили в лунки MULTISCREEN® HTS HV планшетов для фильтрования (MILLIPORE®), содержащих 200 мкл воды. Жидкость фильтровали с помощью планшетов в вакууме, и 150 мкл среды HYSOY® добавляли в каждую лунку и фильтровали. Планшеты для фильтрования затем инкубировали при 37°C, 5% СO₂ на протяжении ночи и затем фиксировали обесцвечивающим раствором (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA). Планшеты затем окрашивали кумасси голубым, и обесцвечивали один раз. Колонии были обследованы и перечислены по методу Cellular Technology Limited (CTL) (Shaker Heights, OH) IMMUNOSPOT® Анализатором. Необработанный подсчет колоний использовали для построения кривых по уничтоженным и рассчета ОРА титров. ОРА титры (средний геометрический титр (GMT) с 95% доверительным интервалом (CI)) через четыре недели в различных дозах показаны в таблице 11, демонстрируя, что конъюгат серотипа 10А (Образцы 1-3; также смотри таблицу 10 для характеристических данных этих конъюгатов) вызвал ОРА титры в модели иммуногенности на мышах. Как показано в таблице 11, конъюгаты серотип 10А, как показано, имеют значительно более высокие ОРА титры, по сравнению с контрольным неконъюгированным полисахаридом, который имел низкий ОРА ответ.

Пример 7. Конъюгация Pn cepoтип-12F с использованием TEMPO/NCS

В целях повышения стабильности гликоконъюгатов серотипа 12F-CRM₁₉₇, альтернативные биохимии были исследованы с использованием 2,2,6,6-тетраметил-1-пиперидинилокси свободного радикала (TEMPO) и N-хлорсукцинимида (NCS) в качестве совместного окислителя для окисления первичных спиртов до альдегидных групп. ГХ/МС анализ показал, что участки были окисление различными для перйодат-опосредованного окисления. В случае TEMPO-NCS окисления, α-D-Glcp и 2-Glcp окисллись, тогда как α-D-Galp was был основным местом окисления когда использовали перйодат (смотри фигуру 4). Как описано дальше более подробно в данном документе, TEMPO использовали в каталитических количествах (≥0,1 молярный эквивалент), и желаемая степень окисление (DO) достигалась за счет варьирования количеств используемого NCS. Впоследствии несколько было синтезировано и охарактеризовано несколько конъюгатов. В целом, получение гликоконъюгатов серотипа 12F проводили в несколько стадий, следующим образом:

a) Гидролиз полисахарида серотипа 12F до молекулярных масс от 50 кДа до 500 кДа

b) Активирование полисахарида серотипа 12F TEMPO/NCS;

c) Очистка активированного полисахарида;

d) Конъюгация активированного серотипа 12F с CRM₁₉₇ белком; и

e) Очистка конъюгатов серотип 12F - CRM₁₉₇.

Гидролиз и окисление серотипа 12F

Гидролиз полисахарида как правило проводили в кислотных условиях с нагреванием, получая среднюю молекулярную массу в желаемом диапазоне от 100 кДа до 350 кДа. Типичный эксперимент описан ниже.

Гидролиз

Раствор полисахарида серотипа 12F добавляли в реакционную емкость с рубашкой. В него, добавляли требуемый объем 0,30 М уксусной кислоты и воды для инъекций (WFI), поддерживая концентрацию ~0,1 М уксусной кислоты. рН раствора регулировали до 3,2±0,3 с использованием 1N NaOH или ледяную уксусную кислоту. Температуру реакционной смеси повышали до 70±5°C. Реакционную смесь перемешивали при 70±5°C в течение 90-120 минут. Реакционную смесь охлаждали до 23±2°C и нейтрализовали (pH 7,0) за счет добавления 1 М раствора NaOH. Гидролизованный полисахарид чистили, используя ультрафильтрацию/диафильтрацию против WFI с использованием 30K MWCO мембран. Раствор фильтровали через 0,22 мкм фильтр и хранили при 2-8°C до окисления. Молекулярную массу гидролизованного полисахарида анализировали с помощью SEC-MALLS чтобы гарантировать, что молекулярная масса соответствует целевому диапазону от 100 кДа до 350 кДа.

Частичное окисление

В одной эксперименте, полисахарид серотипа 12F механически сортировали по размерам с использованием гомогенизации под давлнием с использованием микрофлюидизатора для снижения молекулярной масса до приблизительно 100 кДа до 500 кДа. Сортированный по размеру полисахарид добавляли в реакционную емкость концентрацией 4,0 мг/мл и перемешивали с бикарбонатным/ карбонатным буфером (0,5 М NaHCO₃/0,05 М Na₂CO₃ буфер, pH 8,6) в соотношении 1:1 об./об. К перемешиваемой смеси добавляли ≤0,1 моль эквивалента TEMPO. Реакцию начинали путем добавления от 0,6 до 1,0 моль эквивалента NCS. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов, после чего активированный полисахарид чистили диафильтрацией, с WFI с использованием 30K ультрафильтрационной мембраны. Очищенный полисахарид собирали, и степень окисления (DO) определяли с помощью количественных измерений альдегида (с использованием анализа гидразона 3-метил-2-бензотиазолинона (МВТН)) и полисахарида (с использованием антронового анализа).

В другом эксперимент, полисахарид серотипа 12F гидролизовали, чтобы уменьшить молекулярную массу до молекулярной массы от приблизительно 100 кДа до 500 кДа. Полисахарид серотипа 12F добавляли в реакционную емкость и перемешивали с 0,5 М NaHCO₃/0,05 М Na₂CO₃ буфером (рН 8,6) в соотношении 1:1 об./об. К перемешиваемой смеси добавляли от 0,6 до 1,0 молярного эквивалента NCS, растворенного в WFI. Активирование инициировали путем добавления приблизительно 0,1 молярного эквивалента TEMPO, растворенного в WFI. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов, после чего активированный полисахарид чистили, используя диафильтрацию с WFI с использованием 30K ультрафильтрационной мембраны. Очищенный активированный полисахарид фильтровали через 0,2 мкм фильтр и хранили при 4°C до использования.

TEMPO/NCS опосредованные окисления также успешно проводили в буферах фосфата натрия с pH 6,5, 7,0, 7,5 и 8,0. В некоторых экспериментах по активированию первичный спирт, такой как н-пропанол использовали, чтобы погасить реагенты для того, чтобы избежать окисление сахарида. В другом наборе экспериментов, химически гидролизованный полисахарид был подвергнут окислению непосредственно, без стадию очистки ультрафильтрацией/ диафильтрацией.

Конъюгация окисленного полисахарида серотипа 12F

В одном эксперименте, очищенный окисленный полисахарид серотипа 12F добавляли в реакционную емкость с последующим добавлением 0,5 М буфера фосфата натрия (рН 6,5) до конечной концентрации буфера 0,1 М. К данному раствору, ранее лиофилизированному CRM₁₉₇ добавляли и тщательно перемешивали для того, чтобы получить гомогенный раствор. рН регулировали до 6,8 с использованием разбавленной HCl или 1N раствора NaOH. После чего добавляли 1,5 молярных эквивалентов NaCNBH₃. Реакционную смесь перемешивали в течение 24 часов при комнатной температуре (23°C) и в течение 2,5 дней при 37°C. Реакционную смесь затем разбавляли 1Х 0,9% солевым раствором, и непрореагировавшие альдегидные группы "блокировали" 2 молярными эквивалентами натрия боргидрида. Время реакции блокирования составляло 3 часа.

В другом эксперименте, очищенный активированный серотип 12F добавляли в реакционную емкость с последующим добавлением 0,5 М буфера фосфата натрия (pH 6,5) до конечной концентрации буфера 0,1 М. К данному раствору добавляли и интенсивно перемешивали ранее лиофилизированный CRM₁₉₇ , чтобы получить гомогенный раствор. pH регулировали до 6,8 с использованием разбавленной HCl или 1N раствора NaOH. После чего добавляли 3 молярных эквивалента NaCNBH3. Реакционную смесь перемешивали в течение 24 часов при 23°C и в течение 48 часов при 37°C. Реакционную смесь затем разбавляли 1Х 0,9% солевым раствором и с перемешиванием, непрореагировавшие альдегидные группы "блокировали" 1 молярным эквивалентом натрия боргидрида NaBH₄. Время реакции блокирования составляло 3 часа.

В другом эксперименте, очищенный активированный серотип 12F добавляли в реакционную емкость и перемешивали с раствором CRM₁₉₇. Смесь лиофилизировали, и порошок растворяли в 0,1 М буфере фосфата натрия (рН 6,8) до конечной концентрации сахарида 5 мг/мл. Если необходимо, рН регулировали до 6,8 с использованием разбавленной HCl или 1N раствора NaOH. После чего добавляли 3 молярных эквивалента NaCNBH₃. Реакционную смесь перемешивали в течение 24 часов при 23°C и в течение 48 часов при 37°C. Реакционную смесь затем разбавляли 1Х 0,9% солевым раствором, непрореагировавшие альдегидные группы "блокировали" 1 молярным эквивалентом натрия боргидрида NaBH₄. Время реакции блокирования составляло 3 часа.

Очистка конъюгата

Блокированную реакционную смесь фильтровали с использованием 5 мкм фильтра и затем чистили с использованием 100K MWCO ультрафильтрационных мембран. Конъюгат сначала диафильтровали с использованием 10 мМ сукцинат/0,9% солевого раствора, буфера с pH 6,0. Очищенный конъюгат затем фильтровали через 0,45/0,22 мкм фильтры, для того, чтобы получить объемный конъюгат.

Степень окисления

Успешное окисление первичного спирта в полисахариде серотипа 12F достигали с использованием системы TEMPO/NCS. Гидролизованные полисахариды серотипа 12F окисляли до различных уровней степеней окисление (DO) за счет регулирования количества соокислителя NCS. Эффект на DO за счет варьирования количеств NCS с использованием различных полисахаридных партий и молекулярные массы показаны на фигуре 9. Как правило, окислительная реакция завершается за 2 часа, поскольку никаких значительных изменений в DO не наблюдалось после 2 часов.

Несколько конъюгатов серотипов 12F получали и характеризовали с использованием TEMPO/NCS окисленного полисахарида. Результаты просуммированы в таблице 12.

Пример 8. Иммуногенность конъюгатов Pn-серотипа 12F-CRM₁₉₇ c использованием TEMPO/NCS способа окисления

Титры опсонофагоцитирующей активности (ОРА) для конъюгатов серотипа 12F-CRM₁₉₇ у мышей определяли у мышей в стандартных условиях. ОРА титры (средний геометрический титр (GMT) с 95% доверительным интервалом (CI)) через четыре и семь недель показаны в таблице 13, демонстрируя, что конъюгат серотипа 12F-CRM₁₉₇ (Партия 12F-97B; также смотри таблицу 12 для характеристических данных этого конъюгата) вызвал ОРА титры в модели иммуногенности на мышах. Конъюгат, полученный по TEMPO-NCS, был более иммуногенный чем контрольный конъюгат (171 В), полученный путем окисления перйодатом.

Пример 9. Оценка стабильности Pn-12F гликоконъюгатов

Сравнение стабильности (при 25°C) конъюгатов, полученных окислением перйодатом против TEMPO/NCS окисления (смотри фигуру 10), продемонстрировало, что конъюгаты, полученные путем окисления Pn-12F полисахаридов, были относительно более стабильными. Как показано на фигуре 10, наблюдалось возрастание свободного сахарида с течением времени для гликоконъюгата, полученного путем окисления перйодатом Pn-12F полисахарида при 25°C. В отличие от этого, гликоконъюгат, полученный за счет окисления TEMPO/NCS Pn-12F полисахарида, показал незначительные тенденции касательно свободного сахарида в аналогичных условиях.

Пример 10.Получение конъюгата полисахарида серотипа 15В - CRM₁₉₇

Получение выделенного полисахарид Streptococcus pneumoniae серотипа 15В

Капсульные полисахариды серотипа 15В могут быть получены непосредственно из бактерий с использованием процедур выделения, известных квалифицированному специалисту в данной области. S. pneumoniae серотип 15В вырващивали в флаконе для посева, а затем переносили в ферментер для посева. После того, как целевая оптическая плотность была достигнута, клетки переносили в производственный ферментер. Ферментативный бульон инактивировали добавлением N-лауроилсаркозина и чистили, используя ультрафильтрацию и диафильтрацию.

Очищенный полисахарид S. pneumoniae серотипа 15В затем сортировали по размерам при гомогенизации под высоким давлением с использованием PANDA 2К® гомогенизатора (GEA Niro Soavi, Parma, Italy), получая выделенный полисахарид S. pneumoniae серотипа 15В.

Предпочтительно, выделенный капсульный полисахарид S. pneumoniae серотипа 15В полученный согласно способу, указанному выше, содержит, по меньшей мере, 0,6 мМ ацетата на мМ капсульного полисахарид серотипа 15В и имеет молекулярную массу от 50 кДа до 500 кДа, предпочтительно от 150 кДа до 350 кДа.

Окисление выделенного капсульного полисахарида Streptococcus pneumoniae серотипа 15В

Окисление полисахарида проводили в 100 мМ буфере калия фосфата (рН 6,0) последовательным добавлением рассчитанного количества 500 мМ буфера калия фосфата (рН 6,0) и WFI, получая конечную концентрацию полисахарида 2,0 г/л. Если необходимо, pH реакции регулировали до рН приблизительно 6,0. После регулирования pH, температуру реакции регулировали до 23°C. Окисление инициировали путем добавления приблизительно 0,25 молярных эквивалентов натрия перйодата. Окислительную реакцию проводили при 23°C в течение приблизительно 16 часов.

Концентрацию и диафильтрация активированного полисахарида проводили с использованием 10К MWCO ультрафильтрационных касет. Диафильтрацию проводили против 20-кратных диаобъемов WFI. Очищенный активированный полисахарид затем хранили при 5°C. Очищенный активированный сахарид характеризовали среди прочего (i) концентрацией сахарида по калориметрическому анализу; (ii) концентрацией альдегида по калориметрическому анализу; (iii) степенью окисления; (iv) молекулярной массой по SEC-MALLS и (v) присутствием O-ацетила и глицерина.

SEC-MALLS используют для определения молекулярной массы полисахаридов и конъюгатов полисахарид-белок. SEC используют для разделения полисахаридов по гидродинамическому объему. Показатель преломления (RI) и детекторы многоугольного рассеяние лазерного излучения (MALLS) используются для определения молекулярной массы. Когда свет взаимодействует с материей, он рассеивается, и количество рассеянного света связано с концентрацией, квадрат dn/dc (специфические приращения показателя преломления), и молярной массой вещества. Измерение молекулярной массы рассчитывается на основе считанных сигналов рассеянного света детектора MALLS и концентрации сигнала RI детектора.

Степень окисления (DO = моли повторяющейся единицы сахара / моли альдегида) активированного полисахарида определяли следующим образом: Моли повторяющейся единицы сахара определяют, используя различные колориметрические способы, например, путем использования антронового способа. Полисахарид сначала разрушается до моносахаридов действием серной кислоты и тепла. Антроновый реагент взаимодействует с гексозой с образованием комплекса желто-зеленого цвета, чье поглощение считывается спектрофотометрически на 625 нм. В пределах диапазона анализа, поглощение прямо пропорционально присутствующему количеству гексозы.

Моли альдегида также определяют одновременно, используя МВТН колориметрический способ. МВТН анализ включает образование азинового соединения за счет взаимодействия альдегидных групп (предоставленного образца) с гидразоном 3-метил-2-бензотиозолона (МВТН анализ реагента). Избыток гидразона 3-метил-2-бензотиозолона окисляется с образованием реакционноспособного катиона. Реакционноспособный катион и азин реагируют с образованием голубого хромофора. Образованный хромофор считывается спектроскопически на 650 нм.

Предпочтительно, активированный капсульный полисахарид S. pneumoniae серотипа 15В, полученный согласно способу, указанному выше содержит, по меньшей мере, 0,6 мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 15В и имеет молекулярную массу от 50 кДа до 500 кДа, предпочтительно от 150 кДа до 350 кДа.

Конъюгирование активированного капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 15В с CRM₁₉₇

Процесс конъюгирования включает следующие стадии:

a) Смешивания с сахарозным эксципиентом и лиофилизации;

b) Восстановления лиофилизированного активированного полисахарида и CRM₁₉₇;

c) Конъюгирования активированного полисахарида с CRM₁₉₇ и блокирования; и

d) Очистка конъюгата

a) Смешивание с сахарозным эксципиентом, и лиофилизация

Активированный полисахарид смешивали с сахарозой в соотношении 25 грамм сахарозы на грамм активированного полисахарида. Флакон компаундированной смеси затем лиофилизировали. После лиофилизации, флаконы, содержащие лиофилизированный активированный полисахарид, хранили при -20°C. Рассчитанное количество белка CRM₁₉₇ замораживали в оболочке и лиофилизировали отдельно. Лиофилизированный CRM₁₉₇ хранили при -20°C.

b) Восстановление лиофилизированного активированного полисахарида и белка CRM₁₉₇

Лиофилизированный активированный полисахарид восстанавливали в безводном диметилсульфоксиде (ДМСО). После полного растворения полисахарида, добавляли такое же количество безводного ДМСО к лиофилизированному CRM₁₉₇ для восстановления.

c) Конъюгация и блокирование

Восстановленный активированный полисахарид смешивали с восстановленным CRM₁₉₇ в реакционной емкости (входное соотношение: 0,8:1), с последующим тщательным перемешиванием для получения прозрачного раствора перед началом конъюгирования с натрия цианоборгидридом. Конечная концентрация полисахарида в реакционном растворе составляет приблизительно 1 г/л. Конъюгацию инициировали за счет добавления 1,0-1,5 М-экв. натрия цианоборгидрида в реакционную смесь и инкубировали при 23°C в течение 40-48 часов. Реакции конъюгации завершали за счет добавления 2 М-экв. натрия боргидрида (NaBH₄) для того, чтобы блокировать непрореагировавшие альдегиды. Данную реакцию блокирования продолжали при 23°C в течение 3 часов.

d) Очистка конъюгата

Раствор конъюгата разбавляли 1:10 охлажденным 5 мМ сукцинат-0,9% солевым раствором (рН 6,0) в рамках подготовки для очистки фильтрованием тангенциальным потоком с использованием 100-300K MWCO мембран. Разбавленный раствор конъюгата пропускали через 5 мкм фильтр, и диафильтрацию проводили с использованием 5 мМ сукцинат - 0,9% солевого раствора (рН 6,0) в качестве среды. После того, как диафильтрация завершалась, ретенат конъюгата переносили через 0,22 мкм фильтр.

Конъюгат дополнительно разбавляли 5 мМ сукцинатом / 0,9% солевым раствором (рН 6), до целевой концентрации сахарида приблизительно 0,5 мг/мл. Конечная стадия фильтрования через 0,22 мкм завершалась с получением гликоконъюгата. Предпочтительно, конъюгат, полученный согласно способу, указанному выше, содержит, по меньшей мере, 0,6 мМ ацетата на мМ капсульного полисахарид серотипа 15В, имеет молекулярную массу от 3000 кДа до 20000 кДа и имеет степень конъюгации от 2 до 6.

Пример 11. Характеристика гликоконъюгата. содержащего капсульный полисахарид S. pneumoniae серотипа 15В, ковалентно связанный с CRM₁₉₇

Конъюгат 1 получали согласно способу из примера 10. Конъюгаты 2 и 3 получали согласно аналогичному способу с использованием различного количества окислительного агента. Конъюгат 4 получали согласно аналогичному способу за исключением того, что очищенный капсульный полисахарид серотипа 15В не сортировали по размерам и активировали до меньшего DO (более высокие степени окисление) и конъюгацию проводили в водной среде. Конъюгат 5 получали согласно аналогичному способу за исключением того, что очищенный капсульный полисахарид серотипа 15В сортировали по размерам путем химического гидролиза, и конъюгацию проводили в водной среде. Конъюгаты 6 и 7 получали согласно аналогичному способу за исключением того, что очищенный капсульный полисахарид серотипа 15В не сортировали по размерам.

Полученные конъюгаты были охарактеризованы и результаты просуммированы в таблице 14.

Процент свободного полисахарида измеряют, используя методику с применением геля гидроксида алюминия, связывающего белок, и ковалентно связанный сахарид удаляли путем центрифугирования. Образцы перемешивают с фосфатным буфером геля гидроксида алюминия и центрифугировали. Связанный сахарид пеллетируют с гелем, и свободный сахарид остается в супернатанте. Полученный в результате супернатант и контрольные образцы количественно определяют с помощью соответствующих колориметрических анализов, чтобы определить процент свободного сахарида, и подтвердить достаточное удаление белка и восстановления сахарида.

Для аминокислотного анализа образец полисахарид-белок сначала гидролизуют ни его индивидуальные компоненты в виде свободных аминокислот, с использованием гидролиза 6N соляной кислоты (HCl) в вакууме и при нагревании (160°C в течение 15 минут). После гидролиза, образцы анализируют с использованием аминокислотного анализатора. Индивидуальные аминокислоты разделяют с помощью ионно-обменной хроматографии с использованием стадийного градиента буфера цитрата натрия с изменениями температуры и скорости потока. После разделения остаточное количество каждой аминокислоты количественно определяют с использованием системы детектирования сочетания с нингидрином после колонки. В данной системе, нингидрин перемешиваот с элюатом колонки в послеколоночной системе реакторов и смесь направляют в фотометр. Реакцию нингидрина с элюированными аминокислотами дает соединение пурпурного цвета, максимум поглощения которого находится на 570 нм. Данное поглощение представляет собой линейный ответ (функцию) количества присутствующих α-аминогрупп, и данная реакция предусматривает количественный колориметрический анализ для всех органических соединений с а-аминогруппами. В реакции с иминокислотами, такими как пролин и гидроксилпролин, у которых свободная аминогруппа отсутствует, образуется ярко-желтое соединение, и его контролируют на 440 нм. Площади пиков для каждой аминокислоты рассчитывают с использованием длины волны выходов как при 570 нм, так и 440 нм.

Выход рассчитывают следующим образом: (количество полисахарида в конъюгате × 100) / количество активированного полисахарида.

Конъюгаты (4 до 5), полученные с использованием водной среды, демонстрировали значительную потерю O-ацетильных уровней. Конъюгаты, полученные в растворителе ДМСО, с использованием нативного полисахарида без сортировки по размерам М.М. (6 и 7) не демонстрировали потери O-ацетильных уровней. Однако, выходы конъюгатов были очень низкие, также низкими были характеристиками фильтруемости. Конъюгаты, полученные в ДМСО с использованием полисахаридов, которые сортировали по размерам при гомогенизации под высоким давлением (1, 2 и 3), имели высокий выход и лучшие характеристики фильтруемости со значительным сохранением O-ацетильных уровней. Данные конъюгаты также имели очень низкие уровни свободных полисахаридов.

Пример 12. Анализ опсоноФагоиитирующей активности (ОРА) с использованием конъюгатов Pn-серотип 15B-CRM₁₉₇

Иммуногенность конъюгатов S. pneumoniae серотипа 15В согласно изобретению может быть оценена с использованием ОРА анализа, описанного ниже.

Групп из 30 самок мышей Swiss Webster возрастом 6-7 недель иммунизировали 0,001 мкг, 0,01 мкг, или 0,1 мкг исследуемых конъюгатов посредством их введения подкожно в возрасте 0 недель. Мышей бустировали такой же дозой конъюгата в возрасте 3 недели, и затем брали кровь в возрасте 4 недели. Серотип-специфические ОРА проводили на 4 недельных образцах сывороток.

ОРА используются для измерения функциональных антител в мышиных сыворотках, специфичных к S. pneumoniae серотипа 15В. Исследуемую сыворотку вводили в тест-реакции, которые измеряют способность капсульного полисахарида специфического иммуноглобулина к опсонизированию бактерии, отложению триггерного комплемента, тем самым облегчая фагоцитоз и уничтожая бактерии с помощью фагоцитов. ОРА титр определяют как обратное разведение, которое в результате приводит к 50% уменьшению количества бактерий по сравнению с контрольными лунками без исследуемой сыворотки. ОРА титр интерполируется от двух разведений, которые охватывают данное 50% отсечение уничтожения.

Процедуры ОРА были основаны на способах, описанных в Hu et al. (2005) Clin Diagn Lab Immunol12 (2): 287-295 со следующими модификациями. Исследуемую сыворотку серийно разбавляли в 2,5 раза и добавляли в планшеты для микротитрования для анализа. Живые целевые бактериальные штаммы серотипа 10А и 15В бактерий-мишеней добавляли в лунки, и планшеты встряхивали при 37°C в течение 30 минут. Дифференцированные HL-60 клетки (фагоциты) и сыворотку детенышей кроликов (возрастом 3-4-недели, PEL-FREES®, 6,25% конечная концентрация) добавляли в лунки, и планшеты встряхивали при 37°C в течение 45 минут. Для прекращения реакции, 80 мкл 0,9% NaCl добавляли добавляли во все лунки, перемешивали, и аликвоту 10 мкл переносили в лунки MULTISCREEN® HTS HV планшетов для фильтрования (MILLIPORE®), содержащие 200 мкл воды. Жидкость фильтровали с помощью планшетов в вакууме, и 150 мкл среды HYSOY® добавляли в каждую лунку и снова фильтровали. Планшеты для фильтрования затем инкубировали при 37°C, 5% СO₂ на протяжении ночи и затем фиксировали обесцвечивающим раствором (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA). Планшеты затем окрашивали кумасси голубым и обесцвечивали один раз. Колонии были обследованы и перечислены по методу Cellular Technology Limited (CTL) (Shaker Heights, OH) IMMUNOSPOT® анализатором. Необработанный подсчет колоний использовали для построения кривых по уничтожению и рассчета ОРА титров.

Иммуногенность конъюгатов 1 и 2 исследовали в соответствии с указанным выше анализом. Один дополнительный конъюгат и неконъюгированный нативный капсульный полисахарид S. pneumoniae серотипа 15В (неконъюгированный PS) также исследовали в таком же анализе:

Конъюгат 9 получали путем конъюгации нативного (то есть, не сортированного по размерам) капсульного полисахарида серотипа 15В с CRM₁₉₇ посредством восстановительного аминирования в водном растворе.

Результаты показаны в таблице 15.

Как показано в таблице 15, указанной выше, конъюгаты 1 и 2, при введении мышам, генерировали антитела способные к опсонизированию S. pneumoniae серотипа 15В, отложению триггерного комплемента, тем самым облегчая фагоцитоз и уничтожая бактерии с помощью фагоцитов. Кроме того, несмотря на их более низкую молекулярную массу, они также показали аналогичный уровень иммуногенности по сравнению с конъюгатом 9, который не был сортирован по размерам.

Пример 13.Получение конъюгата полисахарид серотипа 22F - CRM₁₉₇

Получение выделенного полисахарида S. pneumoniae серотипа 22F S. pneumoniae серотип 22F вырващивали в флаконе для посева, а затем переносили в ферментер для посева. После того, как целевая оптическая плотность была достигнута, клетки переносили в производственный ферментер. Ферментативный бульон инактивировали добавлением N-лауроилсаркозина и чистили, используя ультрафильтрацию и диафильтрацию.

Очищенный полисахарид S. pneumoniae серотипа 22F сортировали по размерам при гомогенизации под высоким давлением с использованием PANDA 2K® гомогенизатора (GEA Niro Soavi, Parma, Italy), получая выделенный полисахарид S. pneumoniae серотипа 22F.

Окисление выделенного капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 22F.

Окисление полисахарида проводили в 100 мМ буфере фосфата калия (pH 5,8), полученном последовательным добавлением рассчитанного количество 500 мМ буфера фосфата калия (рН 5,8) и WFI, получая конечную концентрацию полисахарида 2,0 г/л. Если необходимо, pH реакции регулировали до приблизительно 5,8. После регулирования pH, температуру реакции понижали до 5°C. Окисление инициировали путем добавления 0,10 молярного эквивалента (М-экв.) перйодата натрия. Целевое время окислительной реакции составляет 16 часов при 5°C.

Окислительную реакцию гасили 2 М-экв. 2,3-бутандиола при продолжении перемешивани при 5°C в течение 1-2 часов.

Концентрацию и диафильтрацию активированного полисахарида проводили с использованием 100K MWCO ультрафильтрационных касет. Диафильтрацию проводили против 35 кратного диаобъема WFI. Очищенный активированный полисахарид хранили при 5°C. Очищенный активированный сахарид характеризовали среди прочего (i) молекулярной массой согласно SEC-MALLS (ii) присутствием O-ацетила и (iii) степенью окисления.

SEC-MALLS используют для определения молекулярной массы полисахаридаы и конъюгатов полисахарид-белок. SEC используют для разделения полисахаридов по гидродинамическому объему. Показатель преломления (RI) и детекторы многоугольного рассеяние лазерного излучения (MALLS) используются для определения молекулярной массы. Когда свет взаимодействует с материей, он рассеивается, и количество рассеянного света связано с концентрацией, квадрат dn/dc (специфические приращения показателя преломления), и молярной массой вещества. Измерение молекулярной массы рассчитывается на основе считанных сигналов рассеянного света детектора MALLS и концентрации сигнала RI детектора.

Степень окисления (DO = моли повторяющейся единицы сахара / моли альдегида) активированного полисахарида определяли следующим образом:

Моли повторяющейся единицы сахара определяют, используя различные колориметрические способы, например, путем использования антронового способа. Полисахарид сначала разрушается до моносахаридов действием серной кислоты и тепла. Антроновый реагент взаимодействует с гексозой с образованием комплекса желто-зеленого цвета, чье поглощение считывается спектрофотометрически на 625 нм. В пределах диапазона анализа, поглощение прямо пропорционально присутствующему количеству гексозы.

Моли альдегида также определяют одновременно, используя МВТН колориметрический способ. МВТН анализ включает образование азинового соединения за счет взаимодействия альдегидных групп (предоставленного образца) с гидразоном 3-метил-2-бензотиозолона (МВТН анализ реагента). Избыток гидразона 3-метил-2-бензотиозолона окисляется с образованием реакционноспособного катиона. Реакционноспособный катион и азин реагируют с образованием голубого хромофора. Образованный хромофор считывается спектроскопически на 650 нм.

Конъюгирование активированного полисахарида S. pneumoniae серотипа 22F с CRM₁₉₇

Процесс конъюгирования включал следующие стадии:

a. Смешивания с сахарозным эксципиентом, и лиофилизации;

b. Восстановления лиофилизированного полисахарида и CRM₁₉₇;

c. Конъюгирования активированного полисахарида с CRM₁₉₇ и блокирования; и

d. Очистки конъюгата

а. Смешивание с сахарозой и лиофилизация

Активированный полисахарид смешивали с сахарозой (50% мас./об. в WFI) в соотношении 25 грамм сахарозы на грамм активированного полисахарида. Флакон компаундированной смеси затем лиофилизировали. После лиофилизации, флаконы, содержащие лиофилизированный активированный полисахарид, хранили при -20°C. Рассчитанное количество белка CRM₁₉₇ (целевое S/P входное соотношение = 1) замораживали в оболочке и лиофилизировали отдельно. Лиофилизированный CRM₁₉₇ хранили при -20°C.

b. Восстановление лиофилизированного активированного полисахарида и белка CRM₁₉₇

Лиофилизированный активированный полисахарид восстанавливали в безводном диметилсульфоксиде (ДМСО). После полного растворения полисахарида, такое же количество безводного ДМСО добавляли к лиофилизированному CRM₁₉₇ для восстановления.

c. Конъюгирование активированного полисахарида с CRM₁₉₇ и блокирование

Восстановленный CRM₁₉₇ (в ДМСО) смешивали в емкости для реакции конъюгации с восстановленным активированным полисахаридом. Конечная концентрация полисахарида в реакционном растворе составляет 1 г/л. Конъюгацию инициировали за счет добавления в реакционную смесь 1,5 М-экв. натрия цианоборгидрида, и реакцию инкубировали при 23°C в течение 20 часов. Завершение реакции конъюгирования осуществляли за счет добавления 2 М-экв. натрия боргидрида. Реакцию блокирования инкубировали при 23°C в течение 3 часов.

d. Очистка конъюгата

Раствор конъюгата разбавляли 1:5 охлажденным 5 мМ сукцинат - 0,9% солевым раствором (pH 6,0), получая для очистки фильтрованием тангенциальным потоком с использованием 100K MWCO мембран, и 20Х диафильтрацию проводили с использованием 5 мМ сукцината - 0,9% солевого раствора (pH6,0) в качестве среды. После того, как диафильтрация завершалась, ретенат конъюгата дополнительно разбавляли, фильтровали через 0,22 мкм фильтр и хранили при 2-8°C.

Несколько конъюгатов были получены с использованием описанного выше способа за счет варьирования различными параметрами (например, входным соотношением сахарид-белок, концентрацией реакционной смеси и М-экв. натрия цианоборгидрида). Характеристика для представленных Pn-22F гликоконъюгатов с CRM₁₉₇ приведены в таблице 16

Уровень %O-Ацетила (сохранившегося) в конечном конъюгате рассчитывали по соотношению содержания O-Ацетила конъюгата (мкмоль О-Ацетила на мкмоль повторяющейся единицы сахарида серотипа 22F) относительно содержания O-Ацетила полисахарида (мкмоль O-Ацетила на мкмоль повторяющейся единицы сахарида серотипа 22F).

Иммуногенность конъюгатов, полученных выше, оценивали с использованием анализа опсонофагоцитирующей активности (ОРА), который описан ниже. Группы из тридцати самок мышей Swiss Webster возрастом 6-7 недель иммунизировали 0,001 мкг, 0,005 мкг, или 0,01 мкг исследуемых конъюгатов с помощью подкожной инъекции в возрасте 0 недель. Мышей бустировали такой же дозой конъюгата в возрасте 3 недели, и затем брали кровь в возрасте 4 недели. Серотип-специфические ОРА проводили на 4 недельных образцах сывороток.

Анализы опсонофагоцитирующей активности (ОРА) используются для измерения функциональных антител в мышиных сыворотках, специфичных к S. pneumoniae серотипа 22F. Исследуемую сыворотку вводили в тест-реакции, которые измеряют способность капсульного полисахарида специфического иммуноглобулина к опсонизированию бактерии, отложению триггерного комплемента, тем самым облегчая фагоцитоз и уничтожая бактерии с помощью фагоцитов. ОРА титр определяют как обратное разведение, которое в результате приводит к 50% уменьшению количества бактерий по сравнению с контрольными лунками без исследуемой сыворотки. ОРА титр интерполируется от двух разведений, которые охватывают данное 50% отсечение уничтожения.

Процедуры ОРА были основаны на способах, описанных в Hu et al. (2005) Clin Diagn Lab Immunol12 (2): 287-295 со следующими модификациями. Исследуемую сыворотку серийно разбавляли в 2,5 раза и добавляли в планшеты для микротитрования для анализа. Живые целевые бактериальные штаммы серотипа 22F добавляли в лунки и планшеты встряхивали при 25°C в течение 30 минут. Дифференцированные HL-60 клетки (фагоцитов) и сыворотку детенышей кроликов (возрастом 3- 4-недели, PEL-FREES®, 12,5% конечная концентрацию) добавляли в лунки, и планшеты встряхивали при 37°C в течение 45 минут. Для прекращения реакции, 80 мкл 0,9% NaCl добавляли во все лунки, перемешивали, и аликвоту 10 мкл переносили в лунки MULTISCREEN® HTS HV планшетов для фильтрования (MILLIPORE®), содержащие 200 мкл воды. Жидкость фильтровали с помощью планшетов в вакууме, и 150 мкл среды HYSOY® добавляли в каждую лунку и снова фильтровали. Планшеты для фильтрования затем инкубировали при 37°C, 5% CO₂ на протяжении ночи и затем фиксировали обесцвечивающим раствором (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA). Планшеты затем окрашивали кумасси голубым и обесцвечивали один раз. Колонии были обследованы и перечислены по методу Cellular Technology Limited (CTL) (Shaker Heights, OH) IMMUNOSPOT® анализатором. Необработанный подсчет колоний использовали для построения кривых по уничтожению и рассчета ОРА титров. Титры опсонофагоцитирующей активности (ОРА) для конъюгатов серотип 22F-CRM₁₉₇ определяли, как указано выше. ОРА титры (средний геометрический титр (GMT) с 95% доверительным интервалом (CI)) через четыре недели в различных дозах показаны в таблицах 17 до 18, (два отдельных эксперимента), демонстрируя, что конъюгат серотипа 22F (партии 1-7; также смотри таблицу 16 для характеристических данных этих конъюгатов) вызвал ОРА титры в модели иммуногенности на мышах.

Пример 14. Получение конъюгатов Pn-11А с CRM₁₉₇

Получение гликоконъюгатов Pn-11A RAC Замороженный, сортированный по размерам полисахарид, который хранили в деионизированной воде или 25 мМ буфере фосфата калия (pH 6,0) размораживали при 5°C.

Окисление полисахарида

Окисление полисахарида проводили в 100 мМ буфере фосфата калия (pH 6,0) посредством добавления 500 мМ буфера фосфата калия (pH 6,0) и WFI, получая конечную концентрацию полисахарида 2,0 г/л. Окислительную реакцию проводили при 23°C. Окисление инициировали путем добавления натрия перйодата. Скорость перемешивания находилась в диапазоне от 100-140 оборотов в минуту.

Очистка активированного полисахарид 11А

Концентрацию и диафильтрацию активированного полисахарида проводили с использованием ультрафильтрационных касет. Диафильтрацию проводили против 20-кратного диаобъема WFI. После фильтрования через 0,22 мкм, очищенный активированный полисахарид хранили при 5°C.

Описание процесса конъюгирования

Процесс конъюгирования включает следующие стадии:

a. Замораживания в оболочке и лиофилизации белка CRM₁₉₇;

b. Восстановления активированного полисахарида и CRM₁₉₇;

c. Конъюгирования активированного полисахарида с CRM₁₉₇; и

d. Очистки и разбавления конъюгата

a. Замораживание в оболочке и лиофилизация белка CRM₁₉₇

Белок CRM₁₉₇ замораживали в оболочке и лиофилизировали.

b. Восстановление активированного полисахарида и белка CRM₁₉₇

Раствор активированного полисахарида (~10 г/л) загружали в реактор с последующим добавлением рассчитанного количества 0,5N буфера фосфата натрия (рН 7,2). При перемешивании добавляли лиофилизированный CRM₁₉₇, и реакционную смесь перемешивали в течение 2-4 часов для того, чтобы достичь полное растворение CRM₁₉₇.

с. Конъюгация и блокирование

Конъюгацию инициировали за счет добавления цианоборгидрида. Реакционную смесь инкубировали при 23°C в течение 72-96 часов. Завершение реакции конъюгации осуществляли за счет добавления 0,5X WFI с последующим 2 М-экв. натрия боргидрида. Данную реакцию блокирования выдерживали при 23°C в течение 3-4 часов.

d. Разбавление и начальная очистка конъюгата

Раствор конъюгата разбавляли 1:5 (реакционный объем) 0,15N буфером фосфата натрия (pH 8,0), получая для очистки фильтрованием тангенциальным потоком (TFF). Разбавленный конъюгат перемешивали в емкости для разбавления и затем пропускали через 5 мкм фильтр. Фильтрованный раствор конъюгата затем концентрировали до 1-2 г/л. Проводили двух-стадийный способ диафильтрации. На первой стадии, TFF проводили с использованием 30Х (диафильтрационный объем) 0,15N буфера фосфата натрия (рН 8,0) с последующим 20Х 5 мМ сукцинат-0,9% NaCl (pH6,0). После того, как начальная диафильтрация завершалась, ретенат конъюгата переносили через 0,4 фильтр 5 мкм в емкость для сбора.

Конечная диафильтрация конъюгата

Конечная стадия очистки представляла собой 20Х диафильтрацию со средой 5 мМ сукцинат - 0,9% NaCl, pH 6,0 с использованием регенерируемых целлюлозных мембран.

Разбавления моновалентного объемного конъюгата (МВС)

Конъюгат дополнительно разбавляли 5 мМ сукцинатом / 0,9% NaCl, рН 6, до целевой концентрации сахарида 0,5 мг/мл. Конечная стадия фильтрования через 0,22 мкм завершалась, давая продукт моновалентного объемного конъюгата (МВС) для препарата.

Несколько конъюгатов было получено с использованием описанных выше способов за счет варьирования различных параметров (например, входного соотношения сахарид-белок, концентрации реакционной смеси и М-экв. натрия цианоборгидрида). Характеристика для представленных гликоконъюгатов Pb-11А с CRM₁₉₇ приведены в таблице 19 (партии 1-5).

Получение гликоконъюгатов Pn-11А с использованием RAC/ДМСО

Окисленный полисахарид получали и чистили, как описано выше (смотри получение гликоконъюгатов Pn-11A RAC).

Конъюгация посредством восстановительного аминирования в ДМСО (RAC/ДМСО)

Конъюгация 11А посредством RAC/ДМСО включала следующие стадии:

a. Смешивания с сахарозой, замораживания в оболочке и лиофилизации;

b. Восстановления лиофилизированного полисахарида и CRM₁₉₇;

c. Конъюгирования активированного полисахарида с CRM₁₉₇; и

d. Очистки и разбавления конъюгата.

a. Смешивание с сахарозой, замораживание в оболочке и лиофилизация

Активированный полисахарид, полученный сортировкой по размерам полисахарида, смешивали с сахарозой (50% мас./об. в WFI) в соотношении 25 грамм сахарозы на грамм активированного полисахарида. Компоненты смешивали в флаконе для замораживания в оболочке, компаундированную смесь затем лиофилизировали. CRM₁₉₇ белок замораживали в оболочке и лиофилизированный отдельно.

b. Восстановление лиофилизированного активированного полисахарида и белка CRM₁₉₇

Лиофилизированный активированный полисахарид восстанавливали в ДМСО до концентрации 2 мг/мл. После завершения растворения полисахарида, ДМСО добавляли к лиофилизированному CRM₁₉₇ для восстановления

c. Конъюгация и блокирование

Восстановленный CRM₁₉₇ (в ДМСО) смешивали в емкости для реакции конъюгации с восстановленным активированным полисахаридом. Конечная концентрация полисахарида в реакционном растворе составляет 1 г/л. Конъюгацию инициировали за счет добавления цианоборгидрида к реакционной смеси и инкубировали при 23°C в течение 22 часов. Завершение реакции конъюгирования осуществляли за счет добавления 2 М-экв. натрия боргидрида. Данную реакцию блокирования выдерживали при 23°C в течение 3-4 часов.

d. Очистка и разбавление конъюгата

Раствор конъюгата чистили и разбавляли применяя аналогичный способ, как описано выше.

Несколько конъюгатов были получены с использованием описанного выше способа за счет варьирования различными параметрами (например, входным соотношением сахарид-белок, концентрацией реакционной смеси и М-экв. натрия цианоборгидрида). Характеристика для представленных гликоконъюгатов Pn-11А с CRM₁₉₇, полученных согласно способу, указанному выше, приведены в таблице 19 (партии 6-8).

Общие данные, полученные из конъюгатов, приготовленных с использованием указанных выше способов восстановительного аминирования, processes продемонстрировали, что это позволило получение конъюгатов с хорошим выходом конъюгирования, низким % свободного сахарида и с хорошей стабильностью.

Иммуногенность конъюгатов, полученных выше, оценивали с использованием анализа опсонофагоцитирующей активности (ОРА), который описан ниже.

Группы из 30 самок мышей Swiss Webster возрастом 6-7 недель иммунизировали 0,001 мкг, 0,005 мкг, 0,01 мкг, или 0,1 мкг исследуемых конъюгатов посредством их введения подкожно в возрасте 0 недель. Мышей бустировали такой же дозой конъюгата в возрасте 3 недели, и затем брали кровь в возрасте 4 недели. Серотип-специфические ОРА проводили на 4 недельных образцах сывороток.

Анализы опсонофагоцитирующей активности (ОРА) используются для измерения функциональных антител в мышиных сыворотках, специфичных к S. pneumoniae серотипа 11А. Исследуемую сыворотку вводили в тест-реакции, которые измеряют способность капсульного полисахарида специфического иммуноглобулина к опсонизированию бактерии, отложению триггерного комплемента, тем самым облегчая фагоцитоз и уничтожая бактерии с помощью фагоцитов. ОРА титр определяют как обратное разведение, которое в результате приводит к 50% уменьшению количества бактерий по сравнению с контрольными лунками без исследуемой сыворотки. ОРА титр интерполируется от двух разведений, которые охватывают данное 50% отсечение уничтожения.

Процедуры ОРА были основаны на способах, описанных в Hu et аl. (2005) Clin Diagn Lab Immunol12 (2): 287-295 со следующими модификациями. Исследуемую сыворотку серийно разбавляли в 2,5 раза и добавляли в планшеты для микротитрования для анализа. Живые целевые бактериальные штаммы серотипа 11А добавляли в лунки, и планшеты встряхивали при 25°C в течение 30 минут. Дифференцированные HL-60 клетки (фагоциты) и сыворотку детенышей кроликов (возрастом 3-4-недели, PEL-FREES , 12,5% конечная концентрация) добавляли в лунки, и планшеты встряхивали при 37°C в течение 60 минут. Для прекращения реакции, 80 мкл 0,9% NaCl добавляли во все лунки, перемешивали, и аликвоту 10 мкл переносили в лунки MULTISCREEN® HTS HV планшетов для фильтрования (MILLIPORE®), содержащие 200 мкл воды. Жидкость фильтровали с помощью планшетов в вакууме, и 150 мкл среды HYSOY® добавляли в каждую лунку и фильтровали через. Планшеты для фильтрования затем инкубировали при 37°C, 5% CO₂ на протяжении ночи и затем фиксировали обесцвечивающим раствором (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA). Планшеты затем окрашивали кумасси голубым и обесцвечивали один раз. Колонии были обследованы и перечислены по методу Cellular Technology Limited (CTL) (Shaker Heights, OH)IMMUNOSPOT® анализатором. Необработанный подсчет колоний использовали для построения кривых по уничтожению и рассчета ОРА титров.

Титры опсонофагоцитирующей активности (ОРА) для конъюгатов серотипа 11А-CRM₁₉₇ у мышей определяли, как указано выше. ОРА титры (средний геометрический титр (GMT) с 95% доверительным интервалом (CI)) через четыре недели в различных дозах показаны в таблице 20, демонстрируя, что конъюгат серотипа 11А (партии 2-4 и 8; также смотри таблицу 19 для характеристических данных этих конъюгатов) вызвал ОРА титры в модели иммуногенности на мышах.

Пример 15. Препарат 16-валентной пневмококковой конъюгированной вакцины

16-валентная конъюгированная композиция, содержащая гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F(16vPnC) все по-отдельности конъюгированные с CRM₁₉₇, была сформулирована.

Гликоконъюгаты из S. pneumoniaeoi серотипов 15В, 22F и 33F были получены, как раскрыто выше, и гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F были получены, как раскрыто в WO 2006/110381. Требуемые объемы составных концентратов рассчитывали на основе объема партии и концентраций составного сахарида. Сформулированную составную вакцину получали за счет добавления требуемого объема буфера NaCl / сукцинат (pH 5,8) для того, чтобы получить конечную целевую концентрацию буфера сукцината 5,0 мМ и 150 мМ NaCl. Добавляли полисорбат 80 до конечной концентрации 0,02% и 16 пневмококковых конъюгатов. Полученую смесь фильтровали через мембрану 0,2 мкм Millipore PES, с последующим добавлением AlPO4. Препарат перемешивали, чтобы позволить связывание, и для того, чтобы достичь гомогенности.

Препаратом затем наполняли стеклянные шприцы, чтобы доставлять дозу объемом 0,5 мл.

Конечная дозированная форма содержала 2,2 мкг каждого из гликоконъюгатов S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 7F, 9V, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F по-отдельности конъюгированных с CRM₁₉₇, 4,4 мкг гликоконъюгата S. pneumoniae серотипа 6В, 5 мМ буфера сукцината pH 5,8, 0,02 PS80, 150 мМ NaCl и 0,25 мг/мл алюминия в виде AlPO₄ для дозы 0,5 мл. Содержание CRM₁₉₇, составляло приблизительно 38 мкг для дозы 0,5 мл.

Пример 16. Препарат 20-валентной пневмококковой конъюгированной вакцины

20 валентная конъюгированная композиция, содержащая гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9V, 10А, 11А, 12F, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F (20vPnC) все по-отдельности конъюгированные с CRM₁₉₇, была сформулирована.

Гликоконъюгаты из S. pneumoniae oт серотипов 8, 10А, 11А, 12F, 15В, 22F и 33F были получены, как раскрыто выше, и гликоконъюгаты S. Pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F были получены, как раскрыто в WO 2006/110381.

Требуемые объемы составных концентратов рассчитывали на основе объема партии и концентраций составного сахарида. Сформулированную составную вакцину получали за счет добавления требуемого объема буфера NaCl /сукцинат (pH 5,8) для того, чтобы получить конечную целевую концентрацию буфера сукцината 5,0 мМ и 150 мМ NaCl. Добавляли полисорбат 80 до конечной концентрации 0,02% и 20 пневмококковых конъюгатов. Полученую смесь фильтровали через мембрану 0,2 мкм Millipore PES, с последующим добавлением AlPO4. Препарат хорошо перемешивали, чтобы получить максимальное связывание конъюгатов с алюминием.

Препаратом затем наполняли стеклянные шприцы, чтобы доставлять дозу объемом 0,5 мл.

Конечная дозированная форма содержала 2,2 мкг каждого из гликоконъюгатов S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 7F, 8, 9V, 10А, 11A, 12F, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F по-отдельности конъюгированных с CRM₁₉₇ , 4,4 мкг гликоконъюгата S. pneumoniae серотипа 6В, 5 мМ буфера сукцината рН 5,8, 0,02 PS80, 150 мМ NaCl и 0,25 мг/мл алюминия в виде AlPO₄ для дозы 0,5 мл. Содержание CRM₁₉₇, составляло приблизительно 46 мкг для дозы 0,5 мл.

Пример 17. Иммуногенность 16-валентной иммунногенной композиции

Иммуногенность 16-валентной иммунногенной композиции (смотри пример 15) оценивали на кроликах с использованием мультиплексных прямых иммуноанализов Luminex (dLIAs) для того, чтобы измерить серотип-специфические IgG концентрации в сыворотку и серотип-специфические ОРА. Группы из десяти самок новозеландских белых кроликов весом от 2,5 кг до 3,5 кг иммунизировали предлагаемой человеческой клинической дозой (2,2 мкг конъюгата за исключением серотипа 6В, которого брали 4,4 мкг; плюс 0,1 мг алюминия в виде AlPO₄) вводили внутримышечно в возрасте 0 недель. Кроликов бустировали такой же дозой конъюгированной вакцины в возрасте 2 недели, и затем брали кровь в возрасте 4 недели. Серотип-специфические dLIA и ОРА проводили на образцах сывороток 0 недели и 4 недели.

Для количественной оценки общего связывания полисахаридных антител (IgG), специфичных для каждого пневмококкового полисахарида (ПНП), кроличьи сыворотки были оценены в двух прямых иммуноанализах Luminex (dLIAs, 13-Plex dLIA, Prevnar 13® серотипы и 7-Plex dLIA, дополнительные серотипы). В 13-Plex анализе измеряют анти-PnPS антитела, специфичные к 13 серотипам, включенным в 13-валентную пневмококковую конъюгированную (PnC) вакцину (1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F, и 23F) и в 7-Plex анализе измеряют анти-PnPS антитела к дополнительным серотипам (15В, 22F, 33F). Каждый анализ содержит комбинацию из 13 или 7 спектрально различных магнитных микросфер, соединенных с PnPS конъюгатами (PnPS-PLL конъюгаты: PnPS конъюгированный с поли-L-лизином).

Коротко говоря, референтный стандарт, контроли и исследуемые сыворотки сначала были предварительно адсорбированы на два Pn адсорбента; CWPS1 (полисахарид клеточной стенки PnA, содержащий С-полисахарид) и CWPS2 (CWP акапсульного S. pneumoniae серотипа 2) для того, чтобы блокировать связывание неспецифических антител с PnPS покрывающим антигеном. После предварительной адсорбции, PnPS-связанные микросферы инкубировали с соответственно разбавленным референтным стандартом сыворотки, контролями или исследуемыми сыворотками кролика. После инкубирования, каждую смесь промывали и добавляли R-фикоэритрин-конъюгированное козье анти-кроличье IgG вторичное антитело. Сигналы флуоресценции (выраженные в виде средних значений интенсивности флуоресценции (MFI)) измеряли с использованием Bio-Plex ридера и коррелировали с количеством связанного PnPS-специфического IgG. Значения для исследуемых сообщались как (единицы/мл, ед./мл). Серотип-специфические ОРА проводили как описано выше. ОРА титр представляет собой обратную величину самому высокому разбавлению сыворотки, что в результате приводит к 50% уменьшению количества бактериальных колониеобразующих единиц (КОЕ), по сравнению с контролем без сыворотки (определено как фоновое КОЕ). Титр интерполируют от двух разведений, которые охватывают данное 50% отсечение уничтожения.

Результаты показали значительное увеличение серотип-специфических IgG и функциональных ответов ОРА антитела после двух иммунизации 16vPnC (Таблица 21). Уровни сывороточного IgG увеличились более чем 2-log выше базового уровня. Аналогичным образом, надежный функциональный ответ ОРА антитела вызывали минимум 22-кратное увеличение ОРА GMT выше базовой линии. Сыворотки для иммунизации (Нед. 0) показали недетектируемые уровни PnPS-специфических IgG и функциональных ОРА антитела для большинства 16v Pn серотипов за исключением серотипов 14 и 33F. Низкие уровни ОРА титров присутствовали на данных серотипов, но эти базовые ответы не оказывает неблагоприятного воздействия на реакцию антител после вакцинации.

Пример 18. Иммуногенность 20-валентной иммунногенной композиции

Иммуногенность 20-валентной иммунногенной композиции (которая получена в примере 16) оценивали на кроликах с использованием мультиплексных прямых иммуноанализов Luminex (dLIAs) для того, чтобы измерить серотип-специфические IgG концентрации в сыворотке и серотип-специфических ОРА.

Группы из десяти самок новозеландских белых кроликов весом от 2,5 кг до 3,5 кг иммунизировали предлагаемой человеческой клинической дозой (2,2 мкг конъюгата за исключением серотипа 6В, которого брали 4,4 мкг; плюс 0,1 мг алюминия в виде AIPO4) вводили внутримышечно в возрасте 0 недель. Кроликов бустировали такой же дозой конъюгированной вакцины в возрасте 2 недели, и затем брали кровь в возрасте 4 недели. Серотип-специфические dLIA и ОРА проводили на образцах сывороток 0 недели и 4 недели.

Для количественной оценки общего связывания полисахаридных антител (IgG), специфичных для каждого пневмококкового полисахарида (ПНП), кроличьи сыворотки были оценены в двух прямых иммуноанализах Luminex (dLIAs, 13-Plex dLIA, Prevnar 13® серотипы и 7-Plex dLIA, дополнительные серотипы). В 13-Plex анализе измеряют анти-PnPS антитела, специфичные к 13 серотипам, включенным в 13-валентную пневмококковую конъюгированную (PnC) вакцину (1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F, и 23F) и в 7-Plex анализе измеряют анти-PnPS антитела к дополнительным серотипам (15В, 22F, 33F). Каждый анализ содержит комбинацию из 13 или 7 спектрально различных магнитных микросфер, соединенных с PnPS конъюгатами (PnPS-PLL конъюгаты: PnPS конъюгированный с поли-L-лизином).

Коротко говоря, референтный стандарт, контроли и исследуемые сыворотки сначала были предварительно адсорбированы на два Рп адсорбента; CWPS1 (полисахарид клеточной стенки PnA, содержащий С-полисахарид) и CWPS2 (CWP акапсульного S. pneumoniae серотипа 2) для того, чтобы блокировать связывание неспецифических антител с PnPS покрывающим антигеном. После предварительной адсорбции, PnPS-связанные микросферы инкубировали с соответственно разбавленным референтным стандартом сыворотки, контролями или исследуемыми сыворотками кролика. После инкубирования, каждую смесь промывали и добавляли R-фикоэритрин-конъюгированное козье анти-кроличье IgG вторичное антитело. Сигналы флуоресценции (выраженные в виде средних значений интенсивности флуоресценции (MFI)) измеряли с использованием Bio-Plex ридера и коррелировали с количеством связанного PnPS-специфического IgG. Значения для исследуемых сообщались как (единицы/мл, ед./мл).

Серотип-специфические ОРА проводили как описано выше. ОРА титр представляет собой обратную величину самому высокому разбавлению сыворотки, что в результате приводит к 50% уменьшению количества бактериальных колониеобразующих единиц (КОЕ), по сравнению с контролем без сыворотки (определено как фоновое КОЕ). Титр интерполируют от двух разведений, которые охватывают данное 50% отсечение уничтожения.

Кролики, иммунизированные 20vPnC также демонстрировали значительное увеличение общего IgG и титров функциональных ОРА антител против серотипов, общих для 16v и 20v препаратов, а также дополнительных четырех серотипов (8, 10А, 11А, и 12F) (Таблица 22). 2-log увеличение сывороточных уровней IgG для совокупности 20 серотипов индуцировалось после двух иммунизации. ОРА GMT, вызваный вакциной, был, по меньшей мере, в 27 раз выше базовой линии. Низкие уровни ОРА титров в сыворотках перед иммунизацией для серотипов 4 и 33F аналогичным образом наблюдались после вакцинации 20vPnC, но снова не меняли устойсивость ответов на антитело после вакцинации. 16vPnC до 20vPnC препараты вызвали устойчивый гуморальный ответ, который был как специфическим к пневмококковым полисахаридам, так и связан с функциональным уничтожением бактерии (смотри таблицы 21 и 22). В завершение, исследования показанные в примерах 17 и 18, продемонстрировали хорошую иммуногенность как 16vPnC, так и 20vPnC препаратов.

Пример 19. Оценка перекрестных реакционноспособных опсонофагоцитирующих иммунных ответов в пределах серогруппы 9 Streptococcus pneumoniae

Пневмококковый анализ опсонофагоцитирующей активности (ОРА), который измеряет уничтожение S. pneumoniae клеток с использованием фагоцитарных эффекторных клеток в присутствии функционального антитела и комплемента, как считается, является важным суррогатом для оценки эффективности пневмококковых вакцин.

Материалы и Способы

Два случайно выбранных подмножества иммунных сывороток от взрослых, вакцинированных 13-валентной пневмококковой конъюгированной вакциной (13vPnC) были исследованы в анализах ОРА для серотипов 9В, 9А, 9L и 9N. Сыворотки собирали из клинических испытаний США 6115А1-004 (N=59, после вакцинирования) и 6115А1-3005 (N=66, соответствует до и после вакцинирования), соответственно.

Исследование 6115А1-3005 (Клинические исследования - правит. идентификатор: NCT00546572) представляло собой фазы 3, рандомизированное, активно-контролируемое, модифицированное двойное слепое исследование для оценки безопасности, переносимости и иммуногенности Prevnar 13 по сравнению с 23-валентной пневмококковой полисахаридной вакциной (23vPS) у амбулаторных людей приклонного возраста 70 лет и старше, которые получали 1 дозу 23vPS, по меньшей мере, за 5 лет до регистрации на исследование (смотри: http://http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00546572; доступный 31 марта, 2014). Исследование 6115А1-004 (Клинические исследования - правит. идентификатор: NCT00427895) представляло собой фазы 3, рандомизированное, активно-контролируемое, модифицированные двойное слепое исследование для оценки безопасности, переносимости и иммуногенности 13-валентной пневмококковой конъюгированной вакцины (13vPnC) по сравнению с 23-валентной пневмококковой полисахаридной вакциной (23vPS) у взрослых в возрасте от 60 до 64 лет, которые являются нативными к 23vPS, и безопасности, переносимости и иммуногенности 13vPnC у взрослых в возрасте от 18 до 59 лет, которые являются нативными к 23vPS (смотри: http://clinicaltrials.gov/show/NCT00427895; доступный 31 марта, 2014).

13-валентные пневмококковые конъюгированные вакцины (13vPnC), тестированные в данных исследованиях, содержали конъюгаты от пневмококковых серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F, и 23F, по-отдельности конъюгированных с дифтерийным перекрестно-взаимодействующего материала 197 (CRM₁₉₇) белка-носителя.

ОРА используются для измерения функциональных антител в человеческих сыворотах против S. pneumoniae серотипов 9V, 9N, 9А и/или 9L. Исследуемую сыворотку вводили в тест-реакции, которые измеряют способность капсульного полисахарида специфического иммуноглобулина к опсонизированию бактерии, отложению триггерного комплемента, тем самым облегчая фагоцитоз и уничтожая бактерии с помощью фагоцитов. ОРА титр определяют как обратное разведение, которое в результате приводит к 50% уменьшению количества бактерий по сравнению с контрольными лунками без исследуемой сыворотки. ОРА титр интерполируется от двух разведений, которые охватывают данное 50% отсечение уничтожения.

Процедуры ОРА были основаны на способах, описанных в Hu et аl. (2005) Clin Diagn Lab Immunol122): 287-295. Исследуемую инактивированную нагреванием сыворотку серийно разбавляли в 2,5 раза и добавляли вместе сбактериями-мишенями в планшеты для анализа и инкубировали в течение 30 минут с встряхиванием. Дифференцированные HL-60 клетки (фагоциты) и сыворотку детенышей кроликов (возрастом 3-4-недели, PEL-FREES®, Arkansas, 12,5% конечная концентрацию) затем добавляли в лунки, при соотношение эффектора апроксимации к мишени 200:1, и инкубировали при 37°C с встряхиванием. Для прекращения реакции, 80 мкл 0,9% NaCl добавляли во все лунки, перемешивали, и аликвоту 10 мкл переносили в лунки MULTISCREEN® HTS HV планшетов для фильтрования (MILLIPORE®), содержащие 200 мкл воды. Жидкость фильтровали с помощью планшетов в вакууме, и 150 мкл среды HYSOY® добавляли в каждую лунку и фильтровали через. Планшеты для фильтрования затем инкубировали при 37°C, 5% CO₂ на протяжении ночи и затем фиксировали обесцвечивающим раствором (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA). Планшеты затем окрашивали кумасси голубым и обесцвечивали один раз. Колонии были обследованы и перечислены по методу Cellular Technology Limited (CTL) (Shaker Heights, OH)IMMUNOSPOT® анализатором.

Статистический анализ: рассчитывались двухсторонние корреляции Пирсона.

Результаты - ОРА ответы в 9V, 9А, 9L и 9N

Перекрестно-функциональный ответ от иммунных сывороток взрослых, иммунизированных против 13vPnC серотипов 9а, 9L, и 9N, оценивали в соответствующем анализе опсонофагоцитирующих активностей микроколоний (mcOPAs), наряду с гомологичным функциональным ответом на серотип 9V. Протестироваными были два случайно выбранных подмножества иммунных сывороток от взрослых, вакцинированных 13vPnC. Сыворотки собирали из клинических испытаний в США 6115А1-004 (N=59, после вакцинирования) и 6115А1-3005 (N=66, соответствует до и после вакцинирования), соответственно.

Субъекты в исследовании 6115А1-004 ранее были нативными к какой-либо пневмококковой вакцинации и получили одну дозу 13vPnC как часть протокола исследования. Иммунные сыворотки из исследования 6115А1-004 показывают аналогичный процент отвечающих субъектов для всех серогрупп со значениями 98,3%, 98,3%, 100% и 93,2% для 9V, 9А, 9L и 9N, соответственно (фигура 11), поддерживая результаты 6115А1-3005 (фигура 12). Наблюдались относительно хорошие корреляции ОРА титров между серотипами 9V и 9А (корреляции Пирсона ρ=0,5456, р<0,0001) или 9L (ρ=0,7353, р<0,0001), но не с 9N (ρ=0,1217, р<0,3627).

Субъекты в исследовании 6115А1-3005 ранее получали 1 дозу 23vPS, по меньшей мере, за 5 лет до включения в исследование и получили одну дозу 13vPnC как часть протокола исследования. Соответствующей панели сывороток до и после вакцинирования (N=66) от взрослых, иммунизированных 13vPnC (исследование 6115А1-3005) оценивали на ОРА касательно гомологичного ответа на серотип 9V и касательно перекрестной реактивности анти-9V антител к серотипам 9А, 9L и 9N. Как показано на фигуре 12, относительно высокий иммунитет (процент респондеров) к 9V (84%), 9А (66%), 9L (82%) и 9N (86%) был обнаружен в ОРА анализе вероятных в связи с их предыдущей иммунизацией 23vPS, которая включает неконъюгированные полисахариды из серотипов 9V и 9N. Тем не менее, процент отвечающих субъектов увеличился до 95% или более для всех четырех серотипов после вакцинации 13vPnC, которая содержит только конъюгат серотипа 9V серогруппы 9. Несколько-кратный рост величин титра приведены в таблице 23 и являются аналогичными серотипам, также предполагающим перекрестную реактивность.

Большой всесторонний анализ распределения титра ОРА показан в обратных кумулятивных кривых распределения (RCDC) в фигурах 13-16. RCDC показывают увеличение серотип-специфического иммунного ответа после вакцинации для серотипов 9V, 9А, 9L и в меньшей степени 9N. Корелляция кратности повышения титра отдельных совпадений / образцов от 9V 9А, 9V/9L и 9V/9N были также проанализированы с использованием корреляции Пирсона. Наблюдались относительно хорошие корреляции кратности повышения титров от серотипов 9V и 9А (корреляция Пирсона ρ=0,8720, р<0,0001) или 9N (ρ=0,5801, р<0,0001), но в меньшей степени с 9L (ρ=0,1804, р<0,1640).

Вывод

На основании этих данных, вакцина 13vPnC, вероятно, должна обеспечивать более широкий охват серотипа, обеспечивая дополнительную защиту от серотипов 9А, 9L и 9N.

Пример 20: Кросс-функциональные ОРА ответы на серотип 15В и серотип 15С

Пневмококковая серогруппа 15 включает четыре структурно связанных серотипа: 15А, 15В, 15С и 15F. Серотипы 15В и 15С являются неразличимыми генетическими методами типирования и имеют аналогичное строение капсульного полисахарида (PS), за исключением того, что 15B-PS является О-ацетилированным вариантом 15C-PS. Для того, чтобы понять, являются ли анти-капсульные антитела PS к серотипу 15В функциональностями кросс-взаимодействия к серотипу 15С, 10 кроликов были иммунизированы 16vPnC (смотри пример 15) и 20vPnC (смотри пример 16) и вакцинами, содержащими иммуногенный конъюгат, содержащий капсульный полисахарид S. pneumoniae, серотипа 15b, ковалентно связанный с CRM₁₉₇, как раскрыто в данном документе, как часть, их препарата. Сыворотки перед и после вакцинации были протестированы в анализах ОРА относительно серотипов 15В и 15С целевых пневмококковых штаммов.

Из 10 кроликов от каждой группы, у 100% был ответ ОРА на серотип 15В после иммунизации конъюгатом серотипа 15В. Из этих же образцов, 100% имели ответ ОРА также к серотипу 15С (таблица 24 и таблица 25). Низкие ОРА титры наблюдались в сыворотке перед вакцинацией 15С ОРА. Тем не менее, более чем в 10 раз GMT ОРА увеличение титра в сыворотке после вакцинации по сравнению с перед вакцинацией показало, что иммуногенные конъюгаты согласно изобретению индуцируют образование антител, способных уничтожать серотип 15В и 15С Streptococcus pneumoniae в ОРА.

Все публикации и заявки на патенты, упомянутые в описании, показывают уровень техники для специалистов в данной области, к которой относится данное изобретение. Все публикации и заявки на патенты включены в данное описание посредством ссылок таким образом, как если бы каждая отдельная публикация или заявка на патент была бы конкретно и отдельно указана для включения в качестве ссылки.

Хотя настоящее изобретение было подробно описано путем иллюстраций и примеров в целях ясности понимания, определенные изменения и модификации могут быть осуществлены в пределах объема прилагаемой формулы изобретения.

Изобретение относится к области биохимии и иммунологии. Предложена иммуногенная композиция для применения в качестве вакцины для предупреждения состояния, связанного с S. pneumoniae, содержащая гликоконъюгат изолированного капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 22F с белком – носителем CRM197, и эксципиент. Изобретение может быть использовано для вакцинации субъектов против пневмококковых инфекций. 18 з.п. ф-лы, 16 ил., 25 табл., 20 пр.

1. Иммуногенная композиция для применения в качестве вакцины для предупреждения заболевания или состояния, связанного с S. pneumoniae, содержащая гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 22F и эксципиент, где гликоконъюгат имеет молекулярную массу от 1000 кДа до 12 500 кДа и представляет собой конъюгат изолированного капсульного полисахарида из S. pneumoniae серотипа 22F и белка носителя, где отношение (мас./мас.) полисахарида к белку носителю от 0,4 до 2, и где указанный белок носитель является CRM₁₉₇, где каждая доза содержит от 0,1 до 100 мкг 22F полисахарида.

2. Иммуногенная композиция по п. 1, дополнительно содержащая, по меньшей мере, один гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 15 В и, по меньшей мере, один гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 33F.

3. Иммуногенная композиция по п. 1, дополнительно содержащая, по меньшей мере, один гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 15 В, по меньшей мере, один гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 33F, по меньшей мере, один гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 12F, по меньшей мере, один гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 10 А, по меньшей мере, один гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 11 А и, по меньшей мере, один гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 8.

4. Иммуногенная композиция по п. 1, дополнительно содержащая гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипов 4, 6В, 9V, 14, 18С, 19F и 23F.

5. Иммуногенная композиция по п. 1, дополнительно содержащая гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19F и 23F.

6. Иммуногенная композиция по п. 1, дополнительно содержащая гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F.

7. Иммуногенная композиция по п. 1, дополнительно содержащая гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F.

8. Иммуногенная композиция по п. 1, дополнительно содержащая гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F.

9. Иммуногенная композиция по п. 1, дополнительно содержащая гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 23F и 33F.

10. Иммуногенная композиция по п. 1, дополнительно содержащая гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9V, 10А, 11А, 12F, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 23F и 33F.

11. Иммуногенная композиция по какому-либо одному из пп. 1-10, которая представляет собой 8-, 9-, 10-, 11-, 12-, 13-, 14-, 15-, 16-, 17-, 18-, 19- или 20-валентную пневмококковую конъюгированную композицию.

12. Иммуногенная композиция по какому-либо одному из пп. 1-11, где указанные гликоконъюгаты по отдельности конъюгированы с CRM₁₉₇.

13. Иммуногенная композиция по какому-либо одному из пп. 2-3 или 9-10, где указанный гликоконъюгат серотипа 15В имеет молекулярную массу от 1000 кДа до 7500 кДа.

14. Иммуногенная композиция по какому-либо одному из пп. 2-3 или 9-10, где указанный гликоконъюгат серотипа 33F имеет молекулярную массу от 2000 кДа до 6000 кДа.

15. Иммуногенная композиция по какому-либо одному из пп. 3, 10, где указанный гликоконъюгат серотипа 12F имеет молекулярную массу от 1000 кДа до 4000 кДа.

16. Иммуногенная композиция по какому-либо одному из пп. 3, 10, где указанный гликоконъюгат серотипа 10А имеет молекулярную массу от 3000 кДа до 7500 кДа.

17. Иммуногенная композиция по какому-либо одному из пп. 3, 10, где указанный гликоконъюгат серотипа 11А имеет молекулярную массу от 500 кДа до 12500 кДа.

18. Иммуногенная композиция по какому-либо одному из пп. 3, 10, где указанный гликоконъюгат серотипа 8 имеет молекулярную массу от 3000 кДа до 15000 кДа.

19. Иммуногенная композиция по какому-либо одному из пп. 1-11, где указанная иммуногенная композиция дополнительно содержит, по меньшей мере, один адъювант.