Способ прогнозирования лимфогенного метастазирования при аденокарциноме толстого кишечника Российский патент 2019 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к области медицины, онкологии, и касается способов прогнозирования лимфогенного метастазирования при аденокарциноме толстого кишечника.

Наличие метастатического поражения регионарных лимфоузлов, локализация метастазов и количество пораженных лимфатических узлов при колоректальном раке являются факторами прогноза заболевания, а также показателями, которые имеют крайне важное значение относительно принятия лечащим врачом решения о вариантах дальнейшей терапии в адъювантном режиме. Кроме того, наличие метастазов в лимфатических узлах при злокачественных новообразованиях данной локализации лежит в основе стадирования заболевания во всех современных системах постановки диагноза [2, 3]. Широко обсуждается вопрос о том, что возможность иметь данные относительно состоянии регионарных лимфоузлов до этапа оперативного лечения позволила бы клиническому врачу хирургу определить оптимальную степень хирургической резекции, ведь этот момент на протяжении долгого времени все же продолжает оставаться предметом обсуждений. С высокой степенью достоверности обеспечить наличие информации относительно метастатического поражения лимфатических узлов при колоректальном раке может молекулярно-морфологическое исследование [1, 4, 5]. Идеальным решением этого вопроса может стать определение возможной степени риска лимфогенного метастазирования на этапе биопсии первичной опухоли. В настоящее время крайне актуальным является изучение молекулярных характеристик ткани новообразования с проецированием полученных результатов на параметры прогрессирования процесса.

Наиболее близким к предлагаемому является способ прогнозирования метастазирования, основанный на градации аденокарциномы кишечника на степени дифференцировки опухоли, среди которых выделяют low-grade и high-grade новообразования (World Health Organization Classification of Tumours; 2000). К low-grade опухолям относятся высоко - и умеренно дифференцированная аденокарциномы кишечника. Высоко дифференцированная аденокарцинома (grade 1) преимущественно представлена отчетливо определяемыми железистоподобными структурами, процент которых в опухолевой ткани составляет более 95%. Умеренно дифференцированная аденокарцинома представлена железистоподобными структурами, процент которых в опухолевой ткани составляет от 50 до 95%. К high-grade опухолям относятся низко дифференцированная и недифференцированная аденокарциномы. Низко дифференцированная аденокарцинома (grade 3) представлена опухолевыми структурами, среди которых процент железистоподобных варьирует от 5 до 50%. Опухоли, которые оцениваются как недифференцированные (grade 4), содержат менее 5% структур, формирующих подобие желез, от всего объема опухолевой ткани. Известно, что low-grade аденокарциномы кишечника имеют более хороший прогноз и, соответственно, характеризуются наименьшим риском возникновения метастазов. В свою очередь, high-grade аденокарциномы считаются более агрессивными в плане частоты и сроков метастазирования и, соответственно, имеют худшие показатели в плане прогноза заболевания [7].

Недостатком этого способа является то, что отсутствуют конкретные числовые показатели, позволяющие оценить риск развития метастазов, в частности лимфогенных метастазов, у конкретного пациента с раком толстой кишки. При этом исключительно морфологическое исследование может иметь субъективный характер при оценке патогистологических изменений в ткани опухоли. Соответственно, существует необходимость поиска новых, более достоверных факторов прогноза и необходимость применения более совершенных и современных методов молекулярной диагностики.

Новая техническая задача - создание нового способа прогнозирования лимфогенного метастазирования при аденокарциноме толстого кишечника.

Новый технический результат - повышение точности, достоверности и информативности способа, за счет использования численных показателей молекулярно-морфологических характеристик опухоли.

Для достижения нового технического результата в способе прогнозирования лимфогенного метастазирования при аденокарциноме толстого кишечника путем макроскопического исследования первичной опухоли, линий резекции и всех удаленных во время операции лимфатических узлов, а также морфологического исследования препаратов ткани первичной опухоли на светооптическом уровне, при этом, при исследовании в ткани опухоли в каждом случае детально оценивают наличие участков некроза, при отсутствии в ткани опухоли участков некроза признак оценивают как 1 балл, при наличии в ткани опухоли участков некроза признак оценивают как 2 балла, после гистологического исследования ткани первичной опухоли проводят иммуногистохимическое исследование по стандартной методике согласно протоколам, для которого используют следующие антитела: Rb pAb to Beclin 1 (ab62472, Abcam), Rb Anti-mTOR PAb (E1 8590, Bioscience), p53 Protein (Clone DO-7, monoclonal mouse, RTU, Dako), Ki67 Antigen (Clone MIB-1, monoclonal mouse, RTU, Dako), Bcl2 Oncoprotein (Clone 124, monoclonal mouse, RTU, Dako), далее, исследуют экспрессию указанных маркеров в опухолевой ткани по следующим параметрам: процент опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка beclin 1, процент опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка m-TOR, наличие экспрессии белка р53 в ткани опухоли, характер экспрессии белка р53 в ткани опухоли, наличие экспрессии ki67 в клетках воспалительного инфильтрата, наличие экспрессии bcl2 в клетках воспалительного инфильтрата, при наличии в опухолевой ткани до 35% клеток с позитивной экспрессией белка beclin 1 признак оценивают как 1 балл, при наличии от 35% до 70% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка beclin 1 признак оценивают как 2 балла, в случаях наличия более 70% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка beclin 1 признак оценивают как 3 балла, при наличии в опухолевой ткани до 35% клеток с позитивной экспрессией белка m-TOR признак оценивают как 1 балл, при наличии от 35% до 70% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка m-TOR признак оценивают как 2 балла, в случаях наличия более 70% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка m-TOR признак оценивают как 3 балла, при отсутствии в ткани опухоли позитивной экспрессии р53 признак оценивают как 1 балл, при наличии в ткани опухоли позитивной экспрессии р53 признак оценивают как 2 балла, далее оценивают характер экспрессии р53 в ткани опухоли -гомогенный или гетерогенный, если в опухоли отмечается тотально негативная экспрессия или равномерная позитивная экспрессия маркера р53 одинаковой интенсивности окрашивания опухолевых клеток, то экспрессию оценивают как гомогенную, а сам признак оценивают как 1 балл, если в опухолевой ткани определяются участки с позитивной и негативной экспрессией маркера р53 одновременно, при этом позитивная экспрессия характеризуется различной интенсивностью иммунного окрашивания от слабо выраженного до резко интенсивного, то экспрессию оценивают как гетерогенную, а признак оценивают как 2 балла, при наличии в клетках воспалительного инфильтрата позитивной экспрессии ki67 признак оценивают как 1 балл, при отсутствии позитивной экспрессии ki67 в клетках воспалительного инфильтрата признак оценивают как 2 балла, при наличии в клетках воспалительного инфильтрата позитивной экспрессии bcl2 признак оценивают как 1 балл, при отсутствии позитивной экспрессии bcl2 в клетках воспалительного инфильтрата признак оценивают как 2 балла, далее рассчитывают значеие значение уравнения регрессии Y по следующей формуле:

Y=6-6⋅Х₁+6⋅Х₂-14,8⋅Х₃+11,9⋅Х₄+9,8⋅Х₅-10,3⋅Х₆+11,9⋅Х₇,

где

6 - значение коэффициента регрессии свободного члена;

X₁ - наличие участков некроза в ткани опухоли, Х₁=1 балл в случае, если участки некроза в ткани опухоли отсутствуют; X₁=2 балла, если участки некроза в ткани опухоли присутствую;

6 - значение коэффициента регрессии признака X₁;

Х₂ - процент опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка beclin 1, Х₂=1 балл, если в ткани опухоли определяется до 35% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка beclin 1; Х₂=2 балла, если в ткани опухоли определяется от 35% до 70% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка beclin 1; Х₂=3 балла, если в ткани опухоли определяется более 70% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка beclin 1;

6 - значение коэффициента регрессии признака Х₂;

Х₃ - процент опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка m-TOR, Х₃=1 балл, если в ткани опухоли определяется до 35% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка m-TOR; Х₃=2 балла, если в ткани опухоли определяется от 35% до 70% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка m-TOR; Х₃=3 балла, если в ткани опухоли определяется более 70% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка m-TOR;

-14,8 - значение коэффициента регрессии признака Х₃;

Х₄ - наличие в опухолевой ткани позитивной экспрессии р53, Х₄=1 балл, если позитивная экспрессия р53 в ткани опухоли отсутствует; X₄=2 балла, если позитивная экспрессия р53 в ткани опухоли присутствует;

11,9 - значение коэффициента регрессии признака Х₄;

Х₅ - характер экспрессии р53 в ткани опухоли, X₅=l балл в случае наличия гомогенная экспрессия р53, X₅=2 балла в случае наличия гетерогенная экспрессия р53;

9,8 - значение коэффициента регрессии признака Х₅;

Х₆ - наличие в клетках воспалительного инфильтрата позитивной экспрессии ki67, Х₆=1 балл если позитивная экспрессия ki67 в клетках воспалительного инфильтрата присутствует; Х₆=2 балла, если позитивная экспрессия ki67 в клетках воспалительного инфильтрата отсутствует;

-10,3 - значение коэффициента регрессии признака Х₆;

Х₇ - наличие в клетках воспалительного инфильтрата позитивной экспрессии bcl2, Х₇=1 балл, если позитивная экспрессия bcl2 в клетках воспалительного инфильтрата присутствует; Х₇=2 балла, если позитивная экспрессия bcl2 в клетках воспалительного инфильтрата отсутствует;

11,9 - значение коэффициента регрессии признака Х₇,

далее вероятность развития лимфогенных метастазов Р определяют по формуле: Р=e^Y/(1+e^Y), где

е - математическая константа, равная 2,72.

и при вероятности Р≥50% определяют высокий, а при вероятности Р<50% определяют низкий риск развития лимфогенных метастазов

Степень достоверности χ2=188,66; р=0,0000). Чувствительность модели составила 83%, специфичность - 97,4%.

Способ осуществляют следующим образом.

Осуществляют макроскопическое исследование ткани первичной опухоли, линий резекции и всех удаленных во время операции лимфатических узлов. Материал фиксируют в 10-12% растворе нейтрального формалина. Проводку материала и изготовление гистологических препаратов осуществляют по стандартной методике. Гистологический тип опухоли устанавливают на основании международной классификации «Опухоли желудочно-кишечного тракта» (ВОЗ, 2013), способ предназначен только для аденокарциномы толстого кишечника. Далее проводят морфологическое исследование препаратов ткани первичной опухоли на светооптическом уровне. При исследовании в ткани опухоли в каждом случае детально оценивают наличие участков некроза. При отсутствии в ткани опухоли участков некроза признак оценивают как 1 балл, при наличии в ткани опухоли участков некроза признак оценивают как 2 балла. После гистологического исследования ткани первичной опухоли проводят иммуногистохимическое исследование, для которого используют следующие антитела: Rb pAb to Beclin 1 (ab62472, Abcam), Rb Anti-mTOR PAb (E18590, Bioscience), p53 Protein (Clone DO-7, monoclonal mouse, RTU, Dako), Ki67 Antigen (Clone MIB-1, monoclonal mouse, RTU, Dako), Bcl2 Oncoprotein (Clone 124, monoclonal mouse, RTU, Dako). Иммуногистохимическое исследование проводят по стандартной методике согласно протоколам. Далее исследуют экспрессию указанных маркеров в опухолевой ткани по следующим параметрам:

- процент опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка beclin 1,

- процент опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка m-TOR,

- наличие экспрессии белка р53 в ткани опухоли,

- характер экспрессии белка р53 в ткани опухоли,

- наличие экспрессии ki67 в клетках воспалительного инфильтрата,

- наличие экспрессии bcl2 в клетках воспалительного инфильтрата.

При наличии в опухолевой ткани до 35% клеток с позитивной экспрессией белка beclin 1 признак оценивают как 1 балл, при наличии от 35% до 70% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка beclin 1 признак оценивают как 2 балла, в случаях наличия более 70% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка beclin 1 признак оценивают как 3 балла. При наличии в опухолевой ткани до 35% клеток с позитивной экспрессией белка m-TOR признак оценивают как 1 балл, при наличии от 35% до 70% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка m-TOR признак оценивают как 2 балла, в случаях наличия более 70% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка m-TOR признак оценивают как 3 балла. При отсутствии в ткани опухоли позитивной экспрессии р53 признак оценивают как 1 балл, при наличии в ткани опухоли позитивной экспрессии р53 признак оценивают как 2 балла. Далее оценивают характер экспрессии р53 в ткани опухоли - гомогенный или гетерогенный. Если в опухоли отмечается тотально негативная экспрессия или равномерная позитивная экспрессия маркера р53 одинаковой интенсивности окрашивания опухолевых клеток, то экспрессию оценивают как гомогенную, а сам признак оценивают как 1 балл. Если в опухолевой ткани определяются участки с позитивной и негативной экспрессией маркера р53 одновременно, при этом позитивная экспрессия характеризуется различной интенсивностью иммунного окрашивания (от слабо выраженного до резко интенсивного), то экспрессию оценивают как гетерогенную, а признак оценивают как 2 балла [6]. При наличии в клетках воспалительного инфильтрата позитивной экспрессии ki67 признак оценивают как 1 балл, при отсутствии позитивной экспрессии ki67 в клетках воспалительного инфильтрата признак оценивают как 2 балла. При наличии в клетках воспалительного инфильтрата позитивной экспрессии bcl2 признак оценивают как 1 балл, при отсутствии позитивной экспрессии bcl2 в клетках воспалительного инфильтрата признак оценивают как 2 балла.

Далее расчет вероятности риска лимфогенного метастазирования при колоректальном раке проводят по следующей формуле:

Y=6-6⋅X₁+6⋅Х₂-14,8⋅Х₃+11,9⋅Х₄+9,8⋅Х₅-10,3⋅Х₆+11,9⋅Х₇,

где Y - значение уравнения регрессии;

(6) - значение коэффициента регрессии свободного члена;

X₁ - наличие участков некроза в ткани опухоли (1 балл - участки некроза в ткани опухоли отсутствуют; 2 балла - участки некроза в ткани опухоли присутствуют),

(6) - значение коэффициента регрессии признака X₁;

Х₂ - процент опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка beclin 1(1 балл - в ткани опухоли определяется до 35% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка beclin 1; 2 балла - в ткани опухоли определяется от 35% до 70% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка beclin 1; 3 балла - в ткани опухоли определяется более 70% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка beclin 1),

(6) - значение коэффициента регрессии признака Х₂;

Х₃ - процент опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка m-TOR (1 балл - в ткани опухоли определяется до 35% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка m-TOR; 2 балла - в ткани опухоли определяется от 35% до 70% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка m-TOR; 3 балла - в ткани опухоли определяется более 70% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка m-TOR),

(-14,8) - значение коэффициента регрессии признака Х₃;

Х₄ - наличие в опухолевой ткани позитивной экспрессии р53 (1 балл - позитивная экспрессия р53 в ткани опухоли отсутствует; 2 балла - позитивная экспрессия р53 в ткани опухоли присутствует),

(11,9) - значение коэффициента регрессии признака X₄;

Х₅ - характер экспрессии р53 в ткани опухоли (1 балл - гомогенная экспрессия р53, 2 балла - гетерогенная экспрессия р53),

(9,8) - значение коэффициента регрессии признака Х₅;

Х₆ - наличие в клетках воспалительного инфильтрата позитивной экспрессии ki67 (1 балл - позитивная экспрессия ki67 в клетках воспалительного инфильтрата присутствует; 2 балла - позитивная экспрессия ki67 в клетках воспалительного инфильтрата отсутствует), (-10,3) - значение коэффициента регрессии признака Х₆;

Х₇ - наличие в клетках воспалительного инфильтрата позитивной экспрессии bcl2 (1 балл - позитивная экспрессия bcl2 в клетках воспалительного инфильтрата присутствует; 2 балла - позитивная экспрессия bcl2 в клетках воспалительного инфильтрата отсутствует), (11,9) - значение коэффициента регрессии признака Х₇.

Вероятность развития лимфогенных метастазов определяют по формуле: Р=e^Y/(1+e^Y), где

е - математическая константа, равная 2,72.

При вероятности Р≥50% определяют высокий риск развития лимфогенного метастазирования, при вероятности Р<50% определяют низкий риск развития лимфогенных метастазов.

Сущность предлагаемого способа иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Пациентка Т., 88 лет, гистотип опухоли прямой кишки соответствует аденокарциноме. При гистологическом исследовании на светооптическом уровне в ткани опухоли участки некроза отсутствовали (1 балл). При иммуногистохимическом исследовании в ткани новообразования процент опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка beclin 1 составил менее 35% (1 балл), процент опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка m-TOR составил более 70% (3 балла), также в ткани опухоли присутствовала позитивная экспрессия р53 (2 балла), при этом характер экспрессии р53 в опухоли был расценен как гетерогенный (2 балла). При оценке экспрессии изучаемых маркеров в клетках воспалительного инфильтрата опухоли было установлено отсутствие позитивной экспрессии ki67 (2 балла) и наличие позитивной экспрессии bcl2 (1 балл).

Расчет степени риска лимфогенного проводили по формуле:

Y=6-6⋅X₁+6⋅Х₂-14,8⋅Х₃+11,9⋅Х₄+9,8⋅Х₅-10,3⋅Х₆+11,9-Х₇=

6-6⋅1+6⋅1-14,8⋅3+11,9⋅2+9,8⋅2-10,3⋅2+11,9⋅1=

6-6+6-44,4+23,8+19,6-20,6+11,9=-3,7

Вероятность развития лимфогенных метастазов определяли по формуле:

Р=е^-3,7/(1+е^-3,7)=2,72^-3,7/(1+2,72^-3,7)=0,024665791442429/1,024665791442429=0,02=2%. Таким образом, у пациентки был определен низкий риск развития лимфогенных метастазов. При исследовании лимфатических узлов метастатического поражения обнаружено не было.

Пример 2. Пациентка С., 63 лет, гистотип опухоли прямой кишки соответствует аденокарциноме. При гистологическом исследовании на светооптическом уровне в ткани опухоли участки некроза отсутствовали (1 балл). При иммуногистохимическом исследовании в ткани новообразования процент опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка beclin 1 составил менее 35% (1 балл), процент опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка m-TOR составил менее 35% (1 балл), также в ткани опухоли присутствовала позитивная экспрессия р53 (2 балла), при этом характер экспрессии р53 в опухоли был расценен как гомогенный (1 балл). При оценке экспрессии изучаемых маркеров в клетках воспалительного инфильтрата опухоли было установлено отсутствие позитивной экспрессии ki67 (2 балла) и отсутствие позитивной экспрессии bcl2 (2 балла).

Расчет степени риска лимфогенного проводили по формуле:

Y=6-6⋅X₁+6⋅Х₂-14,8⋅Х₃+11,9⋅Х₄+9,8⋅Х₅-10,3⋅Х₆+11,9⋅Х₇=

6-6⋅1+6⋅1-14,8⋅1+11,9⋅2+9,8⋅1-10,3⋅2+11,9⋅2=

6-6+6-14,8+23,8+9,8-20,6+23,8=28

Вероятность развития лимфогенных метастазов определяли по формуле:

Р=е²⁸/(1+е²⁸)=2,72²⁸/(1+2,72²⁸)=1472072884036,705/1472072884037,705=0,99=99%. Таким образом, у пациентки был определен высокий риск развития лимфогенных метастазов. При оценке метастатического поражения в 5 лимфоузлах из 12 исследованных было обнаружено наличие метастазов.

Предлагаемый способ основан на анализе данных морфологического и иммуногистохимического исследования операционного материала пациентов.

В исследование были включены 105 больных колоректальным раком T_1-4N_0-2M₀ стадии, проходивших лечение в торакоабдоминальном отделении НИИ онкологии Томского НИМЦ в период с 2012 по 2015 годы. Средний возраст больных составил 59,7±4,3. Среди пациентов было 47% мужчин (n=49) и 53% женщин (n=56). Предоперационного лечения пациенты не получали. Локализация опухоли в толстой кишке была следующей: у 16 (15%) пациентов опухоль располагалась в слепой кишке, у 8 (7%) - в восходящей части ободочной кишки, у 3 (3%) пациентов новообразование было выявлено в области печеночного изгиба. В 2 (2%) случаях опухоль располагалась в поперечной части ободочной кишки, у 23 (22%) пациентов локализация новообразования соответствовала области селезеночного изгиба, в 6 (5%) случаях - нисходящей части ободочной кишки, при этом у 31 (30%) пациента опухоль была обнаружена в сигмовидной кишке и у 16 (16%) пациентов локализация новообразования соответствовала ректо-сигмоидному отделу толстого кишечника. Хирургический этап лечения проводился всем пациентам в объеме гемиколонэктомии или резекции кишки. Сроки наблюдения за больными составили 3 года.

С целью определения прогноза димфогенного метастазирования макроскопическому исследованию подвергали ткань первичной опухоли, линии резекции и все удаленные во время операции лимфатические узлы. Материал фиксировали в 10-12% растворе нейтрального формалина. Проводку материала и изготовление гистологических препаратов осуществляли по стандартной методике. Препараты окрашивали гематоксилином и эозином. Гистологический тип опухоли устанавливали на основании международной классификации «Опухоли желудочно-кишечного тракта» (ВОЗ, 2013), способ предназначается только для аденокарциномы. Проводили морфологическое исследование препаратов ткани первичной опухоли на светооптическом уровне. При исследовании в ткани опухоли в каждом случае детально оценивали наличие участков некроза, при отсутствии в ткани опухоли участков некроза признак оценивали как 1 балл, при наличии в ткани опухоли участков некроза признак оценивали как 2 балла, после гистологического исследования ткани первичной опухоли проводили иммуногистохимическое исследование по стандартной методике согласно протоколам, для которого использовали следующие антитела: Rb pAb to Beclin 1 (ab62472, Abcam), Rb Anti-mTOR PAb (E18590, Bioscience), p53 Protein (Clone DO-7, monoclonal mouse, RTU, Dako), Ki67 Antigen (Clone MIB-1, monoclonal mouse, RTU, Dako), Bcl2 Oncoprotein (Clone 124, monoclonal mouse, RTU, Dako), далее, исследуют экспрессию указанных маркеров в опухолевой ткани по следующим параметрам: процент опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка beclin 1, процент опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка m-TOR, наличие экспрессии белка р53 в ткани опухоли, характер экспрессии белка р53 в ткани опухоли, наличие экспрессии ki67 в клетках воспалительного инфильтрата, наличие экспрессии bcl2 в клетках воспалительного инфильтрата, при наличии в опухолевой ткани до 35% клеток с позитивной экспрессией белка beclin 1 признак оценивали как 1 балл, при наличии от 35% до 70% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка beclin 1 признак оценивали как 2 балла, в случаях наличия более 70% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка beclin 1 признак оценивали как 3 балла, при наличии в опухолевой ткани до 35% клеток с позитивной экспрессией белка m-TOR признак оценивают как 1 балл, при наличии от 35% до 70% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка m-TOR признак оценивали как 2 балла, в случаях наличия более 70% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка m-TOR признак оценивали как 3 балла, при отсутствии в ткани опухоли позитивной экспрессии р53 признак оценивают как 1 балл, при наличии в ткани опухоли позитивной экспрессии р53 признак оценивали как 2 балла, далее оценивали характер экспрессии р53 в ткани опухоли -гомогенный или гетерогенный, если в опухоли отмечается тотально негативная экспрессия или равномерная позитивная экспрессия маркера р53 одинаковой интенсивности окрашивания опухолевых клеток, то экспрессию оценивали как гомогенную, а сам признак оценивают как 1 балл, если в опухолевой ткани определяются участки с позитивной и негативной экспрессией маркера р53 одновременно, при этом позитивная экспрессия характеризуется различной интенсивностью иммунного окрашивания от слабо выраженного до резко интенсивного, то экспрессию оценивали как гетерогенную, а признак оценивали как 2 балла, при наличии в клетках воспалительного инфильтрата позитивной экспрессии ki67 признак оценивали как 1 балл, при отсутствии позитивной экспрессии ki67 в клетках воспалительного инфильтрата признак оценивали как 2 балла, при наличии в клетках воспалительного инфильтрата позитивной экспрессии bcl2 признак оценивали как 1 балл, при отсутствии позитивной экспрессии bcl2 в клетках воспалительного инфильтрата признак оценивали как 2 балла, далее рассчитывали значение уравнения регрессии Y по следующей формуле:

Y=6-6⋅X₁+6⋅Х₂-14,8⋅Х₃+11,9⋅X₄+9,8⋅Х₅-10,3⋅Х₆+11,9⋅Х₇,

где

6 - значение коэффициента регрессии свободного члена;

X₁ - наличие участков некроза в ткани опухоли, X₁=1 балл в случае, если участки некроза в ткани опухоли отсутствуют; Х₁=2 балла, если участки некроза в ткани опухоли присутствую;

6 - значение коэффициента регрессии признака X₁;

Х₂ - процент опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка beclin 1, Х₂=1 балл, если в ткани опухоли определяется до 35% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка beclin 1; Х₂=2 балла, если в ткани опухоли определяется от 35% до 70% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка beclin 1; Х₂=3 балла, если в ткани опухоли определяется более 70% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка beclin 1;

6 - значение коэффициента регрессии признака Х₂;

Х₃ - процент опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка m-TOR, Х₃=1 балл, если в ткани опухоли определяется до 35% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка m-TOR; Х₃=2 балла, если в ткани опухоли определяется от 35% до 70% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка m-TOR; Х₃=3 балла, если в ткани опухоли определяется более 70% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка m-TOR;

-14,8 - значение коэффициента регрессии признака Х₃;

Х₄ - наличие в опухолевой ткани позитивной экспрессии р53, X₄=l балл, если позитивная экспрессия р53 в ткани опухоли отсутствует; X₄=2 балла, если позитивная экспрессия р53 в ткани опухоли присутствует;

11,9 - значение коэффициента регрессии признака Х₄;

Х₅ - характер экспрессии р53 в ткани опухоли, X₅=l балл в случае наличия гомогенная экспрессия р53, X₅=2 балла в случае наличия гетерогенная экспрессия р53;

9,8 - значение коэффициента регрессии признака Х₅;

Х₆ - наличие в клетках воспалительного инфильтрата позитивной экспрессии ki67, Х₆=1 балл если позитивная экспрессия ki67 в клетках воспалительного инфильтрата присутствует; Х₆=2 балла, если позитивная экспрессия ki67 в клетках воспалительного инфильтрата отсутствует;

-10,3 - значение коэффициента регрессии признака Х₆;

Х₇ - наличие в клетках воспалительного инфильтрата позитивной экспрессии bcl2, Х₇=1 балл, если позитивная экспрессия bcl2 в клетках воспалительного инфильтрата присутствует; Х₇=2 балла, если позитивная экспрессия bcl2 в клетках воспалительного инфильтрата отсутствует;

11,9 - значение коэффициента регрессии признака X₇,

далее вероятность развития лимфогенных метастазов Р определяют по формуле: Р=e^Y/(1+e^Y), где е - математическая константа, равная 2,72.

и при вероятности Р≥50% определяли высокий, а при вероятности Р<50% низкий риск развития лимфогенных метастазов

Таким образом, предлагаемый способ позволяет с высокой точностью и информативностью с помощью конкретных числовых показателей прогнозировать вероятность лимфогенного метастазирования у пациентов с колоректальным раком, в частности, при аденокарциноме толстой кишки, что может позволить оптимизировать тактику ведения таких больных как в плане коррекции объема лечения, так и в плане последующего послеоперационного динамического наблюдения.

Источники информации, использованные при составлении описания:

1. Bertelsen С., Kirkegaard-Klitbo A., Nielsen М, et al. Pattern of Colon Cancer Lymph Node Metastases in Patients Undergoing Central Mesocolic Lymph Node Excision: A Systematic Review // Dis Colon Rectum. - 2016. - Vol. 59(12). P. 1209-1221

2. Matsuda K., Hotta Т., Takifuji K., et al. Lymph nodes ratio is associated with the survival of colorectal cancer patients with peritoneal carcinomatosis // Am Surg. - 2011. - Vol. 77(5). P. 602-607

3. Ong M., Schofield J. Assessment of lymph node involvement in colorectal cancer // World J Gastrointest Surg. -2016. - Vol. 8(3). P. 179-192

4. Takaaki Fujii, Yuichi Tabe, Reina Yajuma et al. Process of distant lymph node metastasis in colorectal carcinoma: Implication of extracapsular invasion of lymph node metastasis // BMC Cancer. - 2011. - Vol.1 LP. 216

5. Ulintz P.J., Greenson J.K., Wu R., et al. Lymph Node Metastases in Colon Cancer Are Polyclonal // Clin Cancer Res. - 2018. - Vol. 24(9). P. 2214-2224

6. Крахмаль H.B., Вторушин C.B, Перельмутер В.М., Завьялова М.В., Слонимская Е.М., Денисов Е.В. Гетерогенность экспрессии маркеров, ассоциированных с инвазивным клеточным ростом, при раке молочной железы // Сибирский онкологический журнал. - 2016. - Том 15, №4. - С. 56-61

7. Pathology and Genetics of Tumours of the Digestive System / World Health Organization Classification of Tumours. - Lyon, France. - 2000. (P. l10)

Изобретение относится к медицине и предназначено для прогнозирования лимфогенного метастазирования при аденокарциноме толстого кишечника. Исследуют ткани опухоли, проводят иммуногистохимическое исследование с антителами: Rb pAb to Beclin 1 (ab62472, Abeam), Rb Anti-mTOR PAb (El8590, Bioscience), p53 Protein (Clone DO-7, monoclonal mouse, RTU, Dako), Ki67 Antigen (Clone MIB-1, monoclonal mouse, RTU, Dako), Bcl2 Oncoprotein (Clone 124, monoclonal mouse, RTU, Dako). Исследуют экспрессию указанных маркеров в опухолевой ткани по следующим параметрам: процент опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка beclin 1, процент опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка m-TOR, наличие экспрессии белка р53 в ткани опухоли, характер экспрессии белка р53 в ткани опухоли, наличие экспрессии ki67 в клетках воспалительного инфильтрата, наличие экспрессии bcl2 в клетках воспалительного инфильтрата и рассчитывают риск развития лимфогенных метастазов. Способ позволяет повысить эффективность раннего определения риска лимфогенного метастазирования. 2 пр.

Способ прогнозирования лимфогенного метастазирования при аденокарциноме толстого кишечника путем макроскопического исследования первичной опухоли, линий резекции и всех удаленных во время операции лимфатических узлов, а также морфологического исследования препаратов ткани первичной опухоли на светооптическом уровне по стандартной методике, отличающийся тем, что, при исследовании ткани опухоли детально оценивают наличие участков некроза, при отсутствии в ткани опухоли участков некроза признак оценивают, как 1 балл, при наличии в ткани опухоли участков некроза признак оценивают как 2 балла, после гистологического исследования ткани первичной опухоли проводят иммуногистохимическое исследование по стандартной методике согласно протоколам, для которого используют следующие антитела: Rb pAb to Beclin 1 (ab62472, Abcam), Rb Anti-mTOR PAb (E18590, Bioscience), p53 Protein (Clone DO-7, monoclonal mouse, RTU, Dako), Ki67 Antigen (Clone MIB-1, monoclonal mouse, RTU, Dako), Bcl2 Oncoprotein (Clone 124, monoclonal mouse, RTU, Dako), далее, исследуют экспрессию указанных маркеров в опухолевой ткани по следующим параметрам: процент опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка beclin 1, процент опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка m-TOR, наличие экспрессии белка р53 в ткани опухоли, характер экспрессии белка р53 в ткани опухоли, наличие экспрессии ki67 в клетках воспалительного инфильтрата, наличие экспрессии bcl2 в клетках воспалительного инфильтрата, при наличии в опухолевой ткани до 35% клеток с позитивной экспрессией белка beclin 1 признак оценивают как 1 балл, при наличии от 35% до 70% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка beclin 1 признак оценивают как 2 балла, в случаях наличия более 70% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка beclin 1 признак оценивают как 3 балла, при наличии в опухолевой ткани до 35% клеток с позитивной экспрессией белка m-TOR признак оценивают как 1 балл, при наличии от 35% до 70% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка m-TOR признак оценивают как 2 балла, в случаях наличия более 70% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка m-TOR признак оценивают как 3 балла, при отсутствии в ткани опухоли позитивной экспрессии р53 признак оценивают как 1 балл, при наличии в ткани опухоли позитивной экспрессии р53 признак оценивают как 2 балла, далее оценивают характер экспрессии р53 в ткани опухоли - гомогенный или гетерогенный, если в опухоли отмечается тотально негативная экспрессия или равномерная позитивная экспрессия маркера р53 одинаковой интенсивности окрашивания опухолевых клеток, то экспрессию оценивают как гомогенную, а сам признак оценивают как 1 балл, если в опухолевой ткани определяются участки с позитивной и негативной экспрессией маркера р53 одновременно, при этом позитивная экспрессия характеризуется различной интенсивностью иммунного окрашивания от слабо выраженного до резко интенсивного, то экспрессию оценивают как гетерогенную, а признак оценивают как 2 балла, при наличии в клетках воспалительного инфильтрата позитивной экспрессии ki67 признак оценивают как 1 балл, при отсутствии позитивной экспрессии ki67 в клетках воспалительного инфильтрата признак оценивают как 2 балла, при наличии в клетках воспалительного инфильтрата позитивной экспрессии bcl2 признак оценивают как 1 балл, при отсутствии позитивной экспрессии bcl2 в клетках воспалительного инфильтрата признак оценивают как 2 балла, далее рассчитывают значение уравнения регрессии Y по следующей формуле:

Y=6-6⋅X₁+6⋅Х₂-14,8⋅Х₃+11,9⋅Х₄+9,8⋅Х₅-10,3⋅Х₆+11,9⋅Х₇,

где

6 - значение коэффициента регрессии свободного члена;

X₁ - наличие участков некроза в ткани опухоли, Х₁=1 балл в случае, если участки некроза в ткани опухоли отсутствуют; X₁=2 балла, если участки некроза в ткани опухоли присутствую;

6 - значение коэффициента регрессии признака X₁;

Х₂ - процент опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка beclin 1, Х₂=1 балл, если в ткани опухоли определяется до 35% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка beclin 1; Х₂=2 балла, если в ткани опухоли определяется от 35% до 70% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка beclin 1; Х₂=3 балла, если в ткани опухоли определяется более 70% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка beclin 1;

6 - значение коэффициента регрессии признака Х₂;

Х₃ - процент опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка m-TOR, Х₃=1 балл, если в ткани опухоли определяется до 35% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка m-TOR; Х₃=2 балла, если в ткани опухоли определяется от 35% до 70% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка m-TOR; Х₃=3 балла, если в ткани опухоли определяется более 70% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка m-TOR;

-14,8 - значение коэффициента регрессии признака Х₃;

Х₄ - наличие в опухолевой ткани позитивной экспрессии р53, Х₄=1 балл, если позитивная экспрессия р53 в ткани опухоли отсутствует; Х₄=2 балла, если позитивная экспрессия р53 в ткани опухоли присутствует;

11,9 - значение коэффициента регрессии признака Х₄;

X₅ - характер экспрессии р53 в ткани опухоли, X₅=l балл в случае наличия гомогенная экспрессия р53, X₅=2 балла в случае наличия гетерогенная экспрессия р53;

9,8 - значение коэффициента регрессии признака Х₅;

Х₆ - наличие в клетках воспалительного инфильтрата позитивной экспрессии ki67, Х₆=1 балл если позитивная экспрессия ki67 в клетках воспалительного инфильтрата присутствует; Х₆=2 балла, если позитивная экспрессия ki67 в клетках воспалительного инфильтрата отсутствует;

-10,3 - значение коэффициента регрессии признака Х₆;

Х₇ - наличие в клетках воспалительного инфильтрата позитивной экспрессии bcl2, Х₇=1 балл, если позитивная экспрессия bcl2 в клетках воспалительного инфильтрата присутствует; Х₇=2 балла, если позитивная экспрессия bcl2 в клетках воспалительного инфильтрата отсутствует;

11,9 - значение коэффициента регрессии признака Х₇,

далее вероятность развития лимфогенных метастазов Р определяют по формуле: Р=e^Y/(1+e^Y), где

е - математическая константа, равная 2,72.

и при вероятности Р≥50% определяют высокий, а при вероятности Р<50% определяют низкий риск развития лимфогенных метастазов.