СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ЛИМФОГЕННОГО МЕТАСТАЗИРОВАНИЯ ПРИ ИНВАЗИВНОЙ КАРЦИНОМЕ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОГО ТИПА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ Российский патент 2015 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к области медицины, конкретно к онкологии, и касается способов прогнозирования лимфогенного метастазирования при инвазивной карциноме неспецифического типа молочной железы.

В настоящее время одним из общепризнанных параметров, ассоциированных с частотой лимфогенного метастазирования при раке молочной железы, является размер опухоли. Известно, что по мере увеличения размера новообразования риск метастатического поражения возрастает. Так, при размере новообразования более 5 мм частота регионарного метастазирования увеличивается до 46%, опухоли менее 5 мм метастазируют в 18% [1, 2].

Гистологическим параметром, связанным с риском лимфогенного метастазирования, принято считать степень злокачественности, определяемую по модифицированной схеме P. Scarff, Н. Bloom и W. Richardson на основании степени тканевой и клеточной атипии (образование тубулярных и протокоподобных структур, число митозов и клеточный полиморфизм) [3]. Степень злокачественности отражается на частоте регионального метастазирования, так при первой степени злокачественности лимфогенное метастазирование наблюдается в 21%, при второй - в 44%, при третьей - в 33% [4]. Другим гистологическим параметром, связанным с риском лимфогенного метастазирования, является опухолевая эмболия в сосудах новообразования [5, 6].

Наиболее близким к настоящему способу прогнозирования лимфогенного метастазирования при раке молочной железы является способ, предложенный Ермиловой В.Д. с соавт. Суть этого способа основывается на определении уровня экспрессии Her2/neu иммуногистохимическим методом. При этом уровень экспрессии данного маркера оценивается полуколичественно по характеру, интенсивности мембранной реакции и пропорции иммунопозитивных клеток. Неr2/nеu негативными считаются случаи с отсутствием или слабым прерывистым окрашиванием менее чем в 30% клеток (0) или со слабым прерывистым мембранным окрашиванием более чем в 30% клеток (1+). Случаи с умеренным непрерывным мембранным окрашиванием более чем в 30% клеток или интенсивным непрерывным мембранным окрашиванием менее чем в 10% клеток считаются «сомнительными» (2+). Her2/neu позитивными считаются опухоли с непрерывным мембранным окрашиванием более чем в 30% клеток (3+). Установлено, что Неr2/nеu позитивные новообразования (3+) обладают склонностью к более частому метастатическому поражению регионарных лимфатических узлов [7].

Недостатком этого способа является достаточно частое обнаружение случаев с «сомнительной» (2+) экспрессией, требующей дополнительного выявления наличия амплификации гена HER2/neu методом FISH или CISH /SISH.

Новый технический результат - повышение точности и информативности при упрощении способа.

Для решения поставленной задачи в способе прогнозирования лимфогенного метастазирования при инвазивной карциноме неспецифического типа молочной железы проводят иммуногистохимическое исследование препаратов ткани первичной опухоли. На основании иммуногистохимического исследования определяют процент экспрессии нефосфорилированной формы молекулярного шаперона Hsp27 в ядре опухолевых клеток, также учитывают состояние менструальной функции пациентки, размер первичной опухоли и степень ее злокачественности, рассчитывают значение уравнения регрессии Y по формуле

Y=(24+12X₁-39,9Х₂-33,1Х₃+47,7X₄),

где Y - значение уравнения регрессии;

(24) - значение коэффициента регрессии свободного члена;

X₁ - состояние менструальной функции пациентки (1 - сохранена; 2 - менопауза),

(12) - значение коэффициента регрессии этого признака;

Х₂ - размер первичной опухоли (1 - до 2 см; 2 - 2-5 см; 3 - более 5 см),

(-39,9) - значение коэффициента регрессии этого признака;

Х₃ - степень злокачественности (1 - низкая; 2 - умеренная; 3 - высокая),

(-33,1) - значение коэффициента регрессии этого признака;

X₄ - наличие экспрессии нефосфорилированной формы молекулярного шаперона Hsp27 в ядре опухолевых клеток (1 - нет; 2 - есть),

(47,7) - значение коэффициента регрессии этого признака.

Значение вероятности развития лимфогенных метастазов рассчитывают по формуле Р=e^Y/(1+e^Y),

где Р - значение вероятности развития признака;

е - математическая константа, равная 2,72.

При Р≥50% прогнозируют высокий, а при Р<50% - низкий риск развития лимфогенных метастазов.

Способ осуществляют следующим образом.

Макроскопической оценке подвергают ткань первичной опухоли и все удаленные лимфатические узлы.

Материал фиксируют в 10-12% растворе нейтрального формалина. Проводку материала и изготовление гистологических препаратов осуществляют по стандартной методике. Препараты окрашивают гематоксилином и эозином. Гистологический тип рака устанавливают согласно рекомендациям ВОЗ, Женева, 2012.

Степень злокачественности оценивают по модифицированной схеме P. Scarff, H. Bloom и W. Richardson. Для определения степени злокачественности исследуют 3 гистологических параметра, каждый из которых оценивают в баллах от 1 до 3: количество тубулярных и протоковых структур (>75% - 1 балл, >10<75% - 2 балла, <10% - 3 балла), число митозов (<10 в 10 полях зрения - 1 балл, >10<20 - 2 балла, >20 - 3 балла), клеточный полиморфизм (клетки одного размера и формы, мелкие, с дисперсным распределением хроматина, без ядрышек - 1 балл, небольшой полиморфизм ядер, некоторое укрупнение клеток - 2 балла, ядра крупные различной формы с одним или несколькими ядрышками, с грубым хроматином - 3 балла). На основании суммы баллов 3 параметров определяют степень злокачественности (3-5 баллов - низкая степень, 6-7 баллов - умеренная степень, 8-9 баллов - высокая степень злокачественности).

Иммуногистохимическое исследование осуществляют по стандартной методике с использованием моноклональных антител Anti-Hsp27 antibody (клон G3.1, рабочее разведение 1:500, Abcam, ab5579). Отмечают наличие экспрессии Hsp27. Экспрессию оценивают по процентному содержанию позитивно окрашенных ядер клеток на 1000 клеток в 10 полях зрения при большом увеличении микроскопа (×400). Также учитывают состояние менструальной функции пациентки, размер первичной опухоли и степень ее злокачественности. Рассчитывают значение уравнения регрессии Y по формуле

Y=(24+12X₁-39,9Х₂-33,1Х₃+47,7X₄),

где Y - значение уравнения регрессии;

(24) - значение коэффициента регрессии свободного члена;

X₁ - состояние менструальной функции пациентки (1 - сохранена; 2 - менопауза),

(12) - значение коэффициента регрессии этого признака;

Х₂ - размер первичной опухоли (1 - до 2 см; 2 - 2-5 см; 3 - более 5 см),

(-39,9) - значение коэффициента регрессии этого признака;

Х₃ - степень злокачественности (1 - низкая; 2 - умеренная; 3 - высокая),

(-33,1) - значение коэффициента регрессии этого признака;

Х₄ - наличие экспрессии нефосфорилированной формы молекулярного шаперона Hsp27 в ядре опухолевых клеток (1 - нет; 2 - есть),

(47,7) - значение коэффициента регрессии этого признака.

Значение вероятности развития лимфогенных метастазов определяют по формуле Р=e^Y/(1+e^Y),

где Р - значение вероятности развития признака;

е - математическая константа, равная 2,72.

При Р≥50% прогнозируют высокий, а при Р<50% низкий риск развития лимфогенных метастазов.

Hsp27 (HspB1) является одним из представителей малых белков теплового шока (small heat shock proteins, sHsp), который ранее был изучен как р29, srp27 и р24 [8]. Основными функциями Hsp27 является фолдинг, мисфолдинг и рефолдинг белков. Шаперон Hsp27 влияет на регуляцию множества внутриклеточных процессов. Так, Hsp27 защищает клетки от запуска апоптоза, препятствуя образованию апоптосомы и нарушая активацию каспаз, участвует в балансе «спокойного» состояния и интенсивного роста опухоли, принимает участие в регуляции эпителиально-мезенхимального перехода и др. [9, 10, 11, 12]. В настоящее время шаперон Hsp27 рассматривают в качестве молекулярного маркера рака молочной железы [10, 13, 14].

Сущность предлагаемого способа иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Больная Т., 56 лет, с инвазивной карциномой неспецифического типа молочной железы, в менопаузе (2), с размером опухоли 1,5 см (1), со второй степенью злокачественности (2), с наличием экспрессии нефосфорилированной формы молекулярного шаперона Hsp27 в ядре опухолевых клеток (2).

Рассчитывали значение уравнения регрессии Y:

Y=24+12×2-39,9×1-33,1×2+47,7×2=37,3.

Значение вероятности развития лимфогенных метастазов определяли по формуле Р=e^Y/(1+e^Y)=2,72^37,3/(1+2,72^37,3)=0,99.

Таким образом, вероятность развития лимфогенных метастазов составила 99%. В операционном материале в исследованных аксиллярных лимфатических узлах определялось метастатическое поражение.

Пример 2. Больная К., 65 лет, с инвазивной карциномой неспецифического типа молочной железы, в менопаузе (2), с размером опухоли 1,5 см (1), с первой степенью злокачественности (1), с отсутствием экспрессии нефосфорилированной формы молекулярного шаперона Hsp27 в ядре опухолевых клеток (1).

Рассчитывали значение уравнения регрессии Y

Y=24+12×2-39,9×1 -33,1×1+47,7×1=22,7.

Значение вероятности развития лимфогенных метастазов определяли по формуле Р=e^Y/(1+e^Y)=2,72^22,7/(1+2,72^22,7)=0,01.

Вероятность развития лимфогенных метастазов составила 1%. В операционном материале в исследованных аксиллярных лимфатических узлах метастатического поражения обнаружено не было.

Предлагаемый способ основан на анализе результатов клинических наблюдений, данных морфологического и иммуногистохимического исследования биопсийного и операционного материала.

Изучался биопсийный материал от 36 больных инвазивной карциномой неспецифического типа молочной железы стадии T1-3N0-3M0. Средний возраст больных составил 49,1±8,5 лет. Больные не получали неоадъювантной терапии. Операция выполнялась в объеме радикальной мастэктомии или радикальной резекции молочной железы.

Макроскопической оценке подвергалась ткань первичной опухоли и все удаленные аксиллярные лимфатические узлы.

Материал фиксировали в 10-12% растворе нейтрального формалина. Проводка материала и изготовление гистологических препаратов осуществляли по стандартной методике. Препараты окрашивали гематоксилином и эозином. Гистологический тип рака устанавливали согласно рекомендациям ВОЗ, Женева, 2012.

Степень злокачественности оценивали по модифицированной схеме P. Scarff, H. Bloom и W. Richardson. При этом учитывали количество тубулярных и протоковых структур, число митозов и клеточный полиморфизм.

Иммуногистохимическое исследование осуществляли по стандартной методике с использованием моноклональных антител Anti-Hsp27 antibody (клон G3.1, рабочее разведение 1:500, Abcam, ab5579). Отмечали наличие экспрессии Hsp27. Экспрессию оценивали по процентному содержанию позитивно окрашенных ядер клеток на 1000 клеток в 10 полях зрения при большом увеличении микроскопа (×400).

Статистическую обработку результатов выполняли с помощью пакета программ «Statistica 6.0 for Windows». Обсуждали результаты с достоверностью различий при р<0,05, и с тенденцией при р<0,1.

Для предсказания риска развития лимфогенных метастазов использовали метод логистической регрессии. Была определена формула

Y=(24+12Х₁-39,9Х₂-33,1Х₃+47,7X₄),

где Y - значение уравнения регрессии;

(24) - значение коэффициента регрессии свободного члена;

X₁ - состояние менструальной функции пациентки (1 - сохранена; 2 - менопауза), (12) - значение коэффициента регрессии этого признака;

Х₂- размер первичной опухоли (1 - до 2 см; 2 - 2-5 см; 3 - более 5 см),

(-39,9) - значение коэффициента регрессии этого признака;

Х₃ - степень злокачественности (1 - низкая; 2 - умеренная; 3 - высокая),

(-33,1) - значение коэффициента регрессии этого признака;

Х₄ - наличие экспрессии нефосфорилированной формы молекулярного шаперона Hsp27 в ядре опухолевых клеток (1 - нет; 2 - есть),

(47,7) - значение коэффициента регрессии этого признака.

Значение вероятности развития лимфогенных метастазов определяли по формуле Р=e^Y/(1+e^Y), где Р - значение вероятности развития признака, е - математическая константа, равная 2,72.

При вероятности Р≥50% определяется высокий риск развития лимфогенных метастазов, а при вероятности Р<50% - низкий риск развития лимфогенных метастазов.

Модель имеет высокую степень достоверности (х²=34,3; р=0,00000). Чувствительность 100%, специфичность 90%.

При анализе частоты возникновения лимфогенных метастазов от признаков, вошедших в прогностическую модель, оказалось, что метастатическое поражение регионарных лимфатических узлов чаще возникало у больных с более крупными опухолями, размеры которых варьировали в пределах от 2 до 5 см, а также при наличии ядерной экспрессии нефосфорилированной формы молекулярного шаперона Hsp27 в ткани опухоли, что показано в табл. 1, 2 и на фигуре 1, где изображена ядерная локализация нефосфорилированной формы шаперона Hsp27 в опухолевых клетках инвазивной карциномы неспецифического типа молочной железы (указана стрелкой) на основании применения метода иммуногистохимического окрашивания с использованием моноклональных антител Anti-Hsp27 (клон G3.1, рабочее разведение 1:500).

Кроме того, обнаруживалась зависимость лимфогенного метастазирования от процента клеток с позитивной ядерной экспрессией Hsp27. В случаях с метастатическим поражением регионарных лимфатических узлов процент был выше (табл. 3). Изолированно, вне прогностической модели, связи лимфогенного метастазирования с состоянием менструальной функции и со степенью злокачественности опухоли обнаружено не было (табл. 4, 5).

Таким образом, предлагаемый способ позволяет с большей точностью и информативностью прогнозировать развитие лимфогенных метастазов при инвазивной карциноме неспецифического типа молочной железы и оптимизировать тактику ведения таких больных.

Источники информации, принятые во внимание

1. Завьялова М.В. Зависимость лимфогенного метастазирования от морфологического строения первичного опухолевого узла при уницентическом инфильтрирующем протоковом раке молочной железы у больных с разным состоянием менструальной функции / М.В. Завьялова, В.М. Перельмутер, Е.М. Слонимская, С.В. Вторушин / Сибирский онкологический журнал. - 2008. - №3 (27). - С. 5-9.

2. Page D.L. Prognosis and breast cancer. Recognition of lethal and favourable prognostic types / D. L. Page // The American journal of surgical pathology. -1991. - Vol. 15. - P. 334-346.

3. Ганцев Ш.Х. Онкология: учебник для студентов медицинских вузов. - 2-е изд., испр. и доп. - М.: ООО «Медицинское информационное агентство», 2006. - 488 с.

4. Elston C.W. Pathological prognostic factors in breast cancer. I. The value of histological grade in breast cancer: experience from a large study with long term follow up / C.W. Elston, I.O. Ellis // Histopathology. - 1991. - Vol. 19. - P. 403-410.

5. 3анкин B.B., Лазаревский M.M., Кометова B.B. Клинико-морфологические факторы прогноза (на примере рака молочной железы) // Тезисы научно-практической конференции «Модниковские чтения». Ульяновский государственный университет. 2009. Режим доступа: (дата обращения 14.05.2014).

6. Mascarel I. D2-40 in breast cancer: should we detect more vascular emboli? /I. Mascarel, G. MacGrogan, M. Debled, G. Sierankowski1, V. Brouste, S. Mathoulin-Pélissier, L. Mauriac // Modern Pathology. - 2009. - Vol. 22. - P. 216-222.

7. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека / под ред. С.В. Петрова, Н.Т. Райхлина. - 4-е изд., перераб. и доп. - Казань, 2012. 624 с.

8. Ciocca D.R.; Luque, Е.Н. Immunological evidence for the identity between the Hsp27 estrogen-regulated Heat-Shock Protein and the P29 estrogen receptor-associated protein in breast and endometrial cancer / D.R. Ciocca, E.H. Luque // Breast Cancer Research and Treatment. - 1991. - Vol. 20, №1. - P. 33-42.

9. Кайгородова E.В. Молекулярные механизмы регуляторного влияния белка теплового шока 27 кДа на апоптоз опухолевых клеток // Бюллетень сибирской медицины. - 2011. - Т. 10. №4. - С. 71-76.

10. Straume О. Suppression of heat shock protein 27 induces long-term dormancy in human breast cancer / O. Straume, T. Shimamura, M.J. Lampa, J. Carretero, A.M. Oyan, D. Jia, C.L. Borgman, M. Soucheray, S.R. Downing, S.M. Short, et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. - 2012. - Vol. 109. N. 22. - P. 8699-8704.

11. Wei L. Hsp27 participates in the maintenance of breast cancer stem cells through regulation of epithelial-mesenchymal transition and nuclear factor-kappa В / L. Wei, T.T. Liu, Н.H. Wang, H.M. Hong, A.L. Yu, H.P. Feng, W.W. Chang // Breast Cancer Res. - 2011. - Vol. 13. - R101.

12. Arrigo A.P., Gibert, B. HspB1, HspB5 and HspB4 in Human Cancers: Potent Oncogenic Role of Some of Their Client Proteins // Cancers (Basel). - 2014. - Vol. 6. N. 1. - P. 333-365.

13. Targeting heat shock protein 27 (HspB1) interferes with bone metastasis and tumour formation in vivo / B. Gibert, B. Eckel, V. Gonin, D. Goldschneider, J. Fombonne, B. Deux, P. Mehlen, A-P. Arrigo, P. Clézardin, C. Diaz-Latoud // Br. J. Cancer. - 2012. - Vol. 107, №1. - P. 63-70.

14. Upregulated HSP27 in human breast cancer cells reduces Herceptin susceptibility by increasing Her2 protein stability / Kang SH, Kang KW, Kim KH, Kwon B, Kim SK, Lee HY, Kong SY, Lee ES, Jang SG, Yoo B.C. // BMC Cancer. - 2008. Oct 4;8:286. doi: 10.1186/1471-2407-8-286.

Таблица 1. Частота лимфогенного метастазирования при инвазивной карциноме неспецифического типа в зависимости от размера опухоли.

Таблица 2. Частота лимфогенного метастазирования при инвазивной карциноме неспецифического типа в зависимости от наличия экспрессии нефосфорилированной формы молекулярного шаперона Hsp27 в ядре опухолевых клеток.

Таблица 3. Процент экспрессии нефосфорилированной формы молекулярного шаперона Hsp27 в ядре опухолевых клеток в зависимости от наличия лимфогенного метастазирования при инвазивной карциноме неспецифического типа.

Таблица 4. Частота лимфогенного метастазирования при инвазивной карциноме неспецифического типа в зависимости от состояния менструальной функции.

Таблица 5. Частота лимфогенного метастазирования при инвазивной карциноме неспецифического типа в зависимости от степени злокачественности.

Таблица 1 Размер опухоли Наличие лимфогенных метастазов Нет (N0) Есть (N+) До 2 см 14/24 (58%) 1/12 (8%) 2-5 см 10/24 (42%) 11/12 (92%) χ2=8,2; р=0,004

Таблица 2 Наличие экспрессии нефосфорилированной формы молекулярного шаперона Hsp27 в ядре опухолевых клеток Наличие лимфогенных метастазов p Нет (N0) Есть (N+) Нет 18/24 (75%) 6/12 (50%) 0,07 Есть 6/24 (25%) 6/12 (50%) 0,07

Таблица 3 Наличие лимфогенных метастазов Процент экспрессии молекулярного шаперона Hsp27(M±SD) Нет (N0) 0,5±1,1 (n=24) Есть (N+) 5,5±11,6 (n=12)   F=4,4; р=0,04

Таблица 4 Состояние менструальной функций Наличие лимфогенных метастазов Нет (N0) Есть (N+) сохранена 5/24 (21%) 3/12 (25%) менопауза 19/24 (79%) 9/12 (75%) χ2=0,08; р=0,77

Таблица 5 Степень злокачественности Наличие лимфогенных метастазов Нет (N0) Есть (N+) первая 2/24 (8%) 1/12 (8%) вторая 19/24 (79%) 10/12 (84%) третья 3/24 (13%) 1/12 (8%) χ2=0,06; р=0,96

Изобретение относится к области медицины, а именно к онкологии, и описывает способ прогнозирования лимфогенного метастазирования при инвазивной карциноме неспецифического типа молочной железы. Способ характеризуется тем, что проводят иммуногистохимическое исследование препаратов ткани первичной опухоли, при котором определяют процент экспрессии нефосфорилированной формы молекулярного шаперона Hsp27 в ядре опухолевых клеток, также учитывают состояние менструальной функции пациентки, размер первичной опухоли и степень ее злокачественности, рассчитывают значение уравнения регрессии и далее рассчитывают значение вероятности развития лимфогенных метастазов Р. При Р≥50% прогнозируют высокий, а при Р<50% низкий риск развития лимфогенных метастазов. Предложенный способ позволяет с высокой точностью и информативностью прогнозировать развитие лимфогенных метастазов при инвазивной карциноме неспецифического типа молочной железы и оптимизировать тактику ведения больных. 2 пр., 5 табл., 1 ил.

Способ прогнозирования лимфогенного метастазирования при инвазивной карциноме неспецифического типа молочной железы путем проведения иммуногистохимического исследования препаратов ткани первичной опухоли, отличающийся тем, что определяют процент экспрессии нефосфорилированной формы молекулярного шаперона Hsp27 в ядре опухолевых клеток, также учитывают состояние менструальной функции пациентки, размер первичной опухоли и степень ее злокачественности, рассчитывают значение уравнения регрессии Y по формуле
Y=24+12X₁-39,9Х₂-33,1Х₃+47,7X₄,
где Y - значение уравнения регрессии;
24 - значение коэффициента регрессии свободного члена;
X₁ - состояние менструальной функции пациентки (1 - сохранена; 2 - менопауза);
12 - значение коэффициента регрессии для X₁;
Х₂ - размер первичной опухоли (1 - до 2 см; 2 - 2-5 см; 3 - более 5 см);
-39,9 - значение коэффициента регрессии для X₂;
Х₃- степень злокачественности (1 - низкая; 2 - умеренная; 3 - высокая);
-33,1 - значение коэффициента регрессии для X₃;
Х₄ - наличие экспрессии нефосфорилированной формы молекулярного шаперона Hsp27 в ядре опухолевых клеток (1 - нет; 2 - есть);
47,7 - значение коэффициента регрессии для X₄.
Значение вероятности развития лимфогенных метастазов определяют по формуле Р=e^Y/(l+e^Y),
где Р - значение вероятности развития признака;
е - математическая константа, равная 2,72.
При вероятности Р≥50% определяют высокий риск развития лимфогенных метастазов, при вероятности Р<50% - низкий риск развития лимфогенных метастазов.