СРЕДСТВО ДЛЯ РАННЕГО КОНТРАСТНОГО МРТ ВЫЯВЛЕНИЯ ЦЕНТРОВ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОЙ ПРОЛИФЕРАЦИИ С ПИТАЮЩИМИ СОСУДАМИ, ГРАНИЦАМИ ДИФФУЗНОЙ ИНФИЛЬТРАЦИИ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТАДИЙ ИХ РАЗВИТИЯ В ДИНАМИКЕ Российский патент 2019 года по МПК A61B5/55 A61K49/06 B82B3/00 C23C18/22 C23C22/05 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к экспериментальной медицине и касается средства и способа раннего (через 48-72 ч после перевивки) контрастного магнитно-резонансного томографического (КМРТ) выявления центров злокачественной пролиферации (ЦЗП) с питающими сосудами, границами диффузной инфильтрации злокачественных клеток в нормальные ткани и определение стадий их развития в динамике in vivo.

Уровень техники

Разработка способов ранней диагностики и терапии злокачественных опухолей является актуальной биомедицинской задачей. Злокачественные опухоли (ЗО) образуются в результате развития ЦЗП и могут содержать от одного до нескольких первичных, вторичных, третичных и т.д. ЦЗП, фигуры 1 (g, h, r, v, w); 4 (b, с); 5 (a, b, с, d, e, f); 9 (a, b); 10 (c, d, e, f, g, h); 11 (e). До настоящего времени не были известны способы раннего выявления ЦЗП злокачественных глиом и других солидных опухолей. Разработка способов ранней диагностики и терапии ЦЗП является актуальной. Практически ранняя диагностика ЦЗП начинается с имплантации ЗК определенного штамма в нормальные ткани животного и осуществляется одновременно с КМРТ определением прививаемости данного штамма злокачественных клеток (ЗК). Традиционно через 5-7 дней после подкожного введения ЗК место прививки пальпируют, размеры опухоли определяют с помощью микрометра и выбраковывают животных, у которых опухоли не выросли. Большинство штаммов ЗК мышиных и крысиных опухолей имеют прививаемость от 85 до 100% [Л.Ф. Ларионов. Химиотерапия злокачественных опухолей, Мед. Лит. М. 1962, с. 16-18]. Ранняя КМРТ визуализация глиальных ЦЗП начинается с инъекции злокачественных глиальных клеток (ЗГК) в нормальные ткани мозга через имплантационное отверстие в черепе животного и совпадает по времени с ранним КМРТ определением прививаемости данного штамма. Через 2-3 дня проводят КМРТ сканирование места интрацеребрального введения ЗГК, размеры ЦЗП глиомы С6 и глиобластомы 101/8 определяют по формуле (4) и выбраковывают животных, у которых ЦЗП не визуализировались или не соответствовали стандартным размерам. Прививаемость злокачественных глиальных клеток (ЗГК) от 44 до 100%.

В настоящее время не известны способы полного излечения запущенных злокачественных глиом и других солидных опухолей. Однако хорошо известен способ излечения опухолей, выявленных до инфильтрации злокачественных клеток (ЗК) в нормальные ткани. Поэтому особенно актуально раннее выявление центров злокачественной пролиферации с питающими сосудами, границ диффузной инфильтрации злокачественных клеток (ЗК) в нормальные ткани с определением стадий их развития в динамике. Кроме того, эффективный мониторинг развития злокачественных опухолей важен при проведении исследований, направленных на разработку и тестирование противоопухолевых препаратов. Например, при карциноме Эрлиха латентный период после перевивки длится 4-6 дней [Л.Ф. Ларионов. Химиотерапия злокачественных опухолей, Мед. Лит. М. 1962, с. 15]. Традиционно терапию злокачественных глиальных опухолей начинают через 6-14 дней после интрацеребральной перевивки, без предварительного КМРТ исследования с целью контроля прививаемости, без учета возможной инфильтрации и метастазирования. Это приводит к разбросу результатов и делает их статистически недостоверными.

Из уровня техники известны: способ ферримагнито-термохимиотерапии злокачественных опухолей комбинациями магнитоуправляемых нанопрепаратов с визуализацией онкогенеза, определением терапии предпочтительной в режиме реального времени и мониторингом результатов лечения в эксперименте [Брусенцов Н.А., Барышников А.Ю. Полянский В.А., Пирогов Ю.А., Точилкин А.И., Брусенцова Т.Н., Кузнецов В.Д., Анисимов Н.В., Гуляев М.В., Голубева И.С., Ксеневич Т.И., Никитин С.И., Никитина И.Л., Патент РФ №2563369 от 28.02.2014, публ. 20.09.15 Бюл. №26] и способ индукционной гипертермии плотных опухолей в эксперименте [Брусенцов Н.А. Брусенцова Т.Н., Шумаков Л.И., Барышников А.Ю. Патент РФ №2291677 от 30.06.2004, публ. 20.01.07, Бюл. №2].

Введенные в нормальные ткани правой половины мозга крысы линии Wistar злокачественные клетки (ЗК) глиомы С6 (ЗКГ С6) или клетки глиобластомы 101/8 (КГБ 101/8) инфильтрируют и малигнизируют их, прикрепляются к сосудам и проникают в сосуды мозга, малигнизируют их, образуют центры злокачественной пролиферации (ЦЗП). По сосудам ЗК быстро распространяются на левую половину мозга, делая заболевание чрезвычайно трудным для терапии хирургическим путем, или радио- и химиотерапией. Без лечения крысы, привитые интрацеребрально, стереотаксически 10⁶ клеток ЗГ С6, живут от 18 до 23 дней. При КМРТ мониторинге развития ЗГ С6 на крысах из клеток ЗГ С6 одного штамма, выявлено, что при ВВ введении заявленной комбинации негативного и позитивного контрастных МРТ препаратов, соблюдении стандартных условий, и режима КМРТ мониторинга места перевивки, КМРТ изображения ЦЗП, пограничных и нормальных тканей мозга, полученные через 2-3 дня после перевивки воспроизводятся. Таким образом, известен способ раннего выявления центров злокачественной пролиферации с границами диффузной инфильтрации ЗК в нормальный мозг путем их ранней КМРТ визуализации и определения стадий их развития в динамике с помощью КМРТ изображений высокого разрешения. При химиотерапии (XT), регионарной химиотерапии (РХТ), регионарной магнито-термотерапии (РМТТ), регионарной магнито-термохимиотерапии (РМТХТ) и магнито-гидродинамической термохимиотерапии центров злокачественной пролиферации возможно определить: максимально-достижимый результат лечения при терапевтической дозе комбинации противоопухолевых препаратов, начиная терапию мышей через 34-48 ч после перевивки опухоли, но не позднее 24 ч до перфорации, инвазии или диффузной инфильтрации мембраны первичного центра злокачественной пролиферации (ПЦЗП) (время необходимое для полного хирургического удаления ПЦЗП при полном подавлении злокачественной пролиферации химио-, термо-, магнито-термо-химио-, и лучевой терапией). Предпочтительно лечение начинают через 24-30 ч. Полную регрессию опухолей у 55% мышей с солидными злокачественными опухолями наблюдают в конце 1- и начале 2 стадии их развития в результате удаления жизнеспособных злокачественных клеток из организма. Исключение составляют злокачественные глиальные опухоли (ГО), полное удаление жизнеспособных клеток ГО из головного мозга известными способами оказалось проблематичным.

Из уровня техники также известны контрастные магнитно-резонансные томографические средства (КМРТС): декстранферрит (ДФ), цитратферрит и способы их получения, которые включают синтез высокодисперсного магнетита.

где: (Fe²⁺O⋅Fe³⁺₂О₃)m - нанокристаллы стехиометрического магнетита

Берут 19,9 г FeCl₂⋅4H₂O и 57,7 г 2FeCl₃⋅7H₂O

Получают 14,95 г (Fe²⁺O⋅Fe³⁺₂O₃)m. Выход 80,3%.

Приготовление растворов солей Fe²⁺, Fe³⁺ и синтез магнетита ведут в дистиллированной, свежепрокипяченной воде, в атмосфере азота. Готовят раствор смеси 19,9 г FeCl₂ 4H₂O и 57,7 г FeCl₃ 7H₂O в 500 мл воды, пропускают через стеклянный фильтр №4, получают фильтрат №1.

В водный 25% раствор гидроксида аммония с 20% избытком (33,6 г NH4OH, 134,4 мл) быстро прибавляют фильтрат №1 при перемешивании. Продолжают перемешивать при рН 10-11 до полного превращения солей железа в гидроксиды железа:

[Fe(OH)₂, + 2Fe(OH)₃]m, (рН суспензии 10-11)

Водную суспензию смеси полученных гидроксидов нагревают 40 мин при +85 - +90°С при перемешивании. Чистят от примесей в неоднородном постоянном магнитном поле (НПМП) индукцией от 0,2 до 3,0 Тл. Получают магнетит в виде кубических нанокристаллов шпинели диаметром от 5 до 12 нм. Размеры нанокристаллов свежеполученной суспензии определяют просвечивающей электронной микроскопией. Ферритовые ядра имеют диаметр от 5 до 11 нм. Синтез и выделение промежуточных продуктов и магнетита ведут в неоднородном постоянном магнитном поле индукцией от 0,2 до 3,0 Тл. Получают 14,95 г, выход 80,3% стехиометрического магнетита состава: (Fe²⁺Fe³⁺₂O₄)m.

Однако, стехиометрический магнетит состава (Fe²⁺Fe³⁺₂O₄)_m неконкурентоспособен при получении ФНЦФ 28 т.к. окисляется при синтезе активированного магнетита до соединений, из которых получаются МРТ контрастеры с низкой намагниченностью насыщения (Ms) и низкой релаксивностью.

Сущность синтеза ДФ и ФНЦФ 28 заключается в окислении катионов, Fe²⁺ до Fe³⁺ по уравнению реакции получения активированного магнетита:

где:

- (0,9Fe²⁺O⋅Fe³⁺₂O₃⋅0,1Fe³⁺OCl^-)m - активированный анионами Cl^- магнетит;

- (0,1Fe³⁺OCl^-)m - пленка, покрывающая наночастицы активированного магнетита.

От 0,01 до 0,2 мл 2% золь ФНЦФ 28 используют в качестве негативного МРТ контрастного средства. Для получения контрастных МРТИ золь ФНЦФ 28 вводят мышам внутриартериально (ВА), ВВ и ИП.

Приготовление 5% водного золя ДФ осуществляют в аналогичных условиях. Приготовление 5% золя ФНЦФ 28 с полиглюкином осуществляют в аналогичных условиях и применяют как ДФ70 при аденокарциноме молочной железы Са 755. Через 7-14 дней после подкожной перевивки аденокарциномы молочной железы Са 755 в организм животного внутривенно (ВВ) вводят ДФ70 в полиглюкине и MB, и проводят КМРТ сканирование места перевивки. Визуализируют КМРТ изображения злокачественных опухолей у мышей C57Bl/6j.

Через 2-3 дня после перевивки злокачественных опухолей, при ВВ или интраперитонеальном (ИП) введении 0,2 мл / кг магневиста® (MB), без предварительного введения ДФ70, ранняя (через 48-72 ч) визуализация первичных центров злокачественной пролиферации с питающими сосудами не происходит из-за отсутствия достаточного числа черных вокселей, создающих контраст на КМРТ изображениях (КМРТИ) совместно с белыми вокселями, [Н.А. Брусенцов, Т.Н. Брусенцова, Д.А. Куприянов, Ю.А. Пирогов, А.И. Дубина, М.Н. Шумских, Способ диагностики онкологических заболеваний в эксперименте, Патент РФ №2343828 от 12.02.2007, Бюл. №2].

Однако основным недостатком аналогов является неустойчивость золей ДФ70 в полиглюкине. Ферримагнитные наночастицы ДФ70 в полиглюкине, при хранении в течение 1-3 дней слипаются и выпадают в осадок. При ВВ введении ДФ70 в полиглюкине они эндоцитируются клетками сердечно-сосудистой - и ретикуло-эндотелиальной системы.

В публикации «Визуализация экспериментальной глиомы С6 методом МРТ с помощью магнитных наночастиц, конъюгированных с моноклональными антителами к фактору роста эндотелия сосудов» [Абакумов М.А., Шеин С.А., Вишвасрао X., Нуколова Н.В., Сокольски-Папков, Сандалова Т.О., Губский И.Л., Гриненко Н.Ф., Кабанов А.В., Чехонин В.П. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2012, 154, №8, 242-246], описан контрастный агент на основе наночастиц оксида железа и антител к VEGF, который визуализирует КМРТИ интракраниальной опухоли глиомы С6 через 14 дней после перевивки. Основным недостатком является поздняя визуализация опухоли, без выявления границ инфильтрации клеток С6, в результате которых опухоль глиомы С6 через 14 дней после перевивки занимает практически весь мозг и является неизлечимой.

Наиболее близкими к заявляемой группе решений является средство, 5% золь цитратферрита в полиглюкине, полученный аналогично золю ДФ70 и способ его применения для обнаружения сосудов, питающих опухоль, в эксперименте (прототип): «Способ обнаружения сосудов, питающих опухоль, в эксперименте» [Брусенцов Н.А., Пирогов Ю.А., Брусенцова Т.Н., Учеваткин А.А., Никитин П.И., Иванов А.В. Патент РФ №2382596, 29.09.2008, 27.02.2010, Бюл. Изобр. №6]. При попадании в организм ФНЦФ 28 увеличивает магнитную гетерогенность биологических тканей и повышают контраст КМРТ изображений патогенных тканей за счет подавления сигнала протонов от здоровых тканей. Магневист увеличивает яркость КМРТ изображения, усиливая сигнал от протонов молекул гидратной воды тканей с пониженным содержанием феррита. При визуальном анализе МРТ изображений внутренних органов и опухолей, выявляют малигнизированные сосуды, питающие опухоли. На 6-14 день после перевивки аденокарциномы молочной железы Са 755 в хвостовую вену самок мышей C57Bl/6j вводят 0,5 мл/кг 5% золь цитратферрита в полиглюкине полученный аналогично ДФ70. Через 10 мин - 30 ч после ВВ введения цитратферрита в полиглюкине, за 3-9 мин до проведения контрастного МРТ сканирования, ВВ вводят 0,2 мл/кг магневиста® (MB). Последующим контрастным МРТ сканированием места перевивки визуализируют КМРТ изображения сосудов, питающих опухоль Са 755. К недостаткам способа обнаружения сосудов, питающих опухоль аденокарциномы молочной железы Са 755, относят эндоцитоз ДФ70 клетками сердечно-сосудистой- и ретикуло-эндотелиальной системы.

Таким образом, среди недостатков известных из уровня техники решений, стоит выделить следующие:

- не приводится выход ДФ, цитратферрита и промежуточных продуктов синтеза, в доступных источниках информации;

- быстрое окисление цитратферрита с уменьшением намагниченности насыщения и релаксивности, указывающее на его получение из магнетита с дефицитом катионов (Fe²⁺), отсутствие устойчивости водных золей проявляется в слипании частиц с образованием конгламератов при хранении в течение 3 месяцев;

- неустойчивость золей цитратферрита в полиглюкине, связанную с изменением физико-химических свойств поверхности наночастиц цитратферрита в полиглюкине, которая приводит к образованию наночастиц диаметром от 90 до 19000 нм, образующих тромбы в сосудах легких.

Раскрытие изобретения

Задачей настоящего изобретения является:

- создание способа получения средства раннего (через 48-72 ч после перевивки) контрастного магнитно-резонансного томографического (КМРТ) выявления центров злокачественной пролиферации (ЦЗП) с визуализацией питающих сосудов и границ диффузной инфильтрации злокачественных клеток (ЗК) в нормальные ткани с определением стадий их развития в динамике;

- разработка способа применения полученного средства при КМРТ исследовании в эксперименте на иммунокомпетентных животных с перевиваемыми злокачественными опухолями.

Техническим результатом, достигаемым заявленной группой изобретений, является:

- способ синтеза заявляемого средства, представляющего собой ферримагнитные наночастицы цитратферрита (ФНЦФ) диаметром от 9 до 130 нм в комбинации с магневистом;

- подбор комбинации негативного и позитивного контрастного средства и оптимальных параметров КМРТ сканирования тела животного для выявления ЦЗП с питающими сосудами и границами диффузной инфильтрации, и определение стадий их развития в динамике.

Заявляемый способ на основе контрастной магнитно-резонансной томографической (КМРТ) визуализации обеспечивает:

- успешное применение заявляемого средства для раннего (через 48-72 ч после перевивки) КМРТ выявления центров злокачественной пролиферации (ЦЗП) с питающими сосудами, границами диффузной инфильтрации злокачественных клеток в нормальные ткани в динамике;

- определение стадий развития ЦЗП в динамике в эксперименте на иммунокомпетентных животных с перевиваемыми злокачественными опухолями.

Раннюю визуализацию КМРТ изображений ЦЗП с питающими сосудами и границами инфильтрации реализуют через 2-3 дня после перевивки опухоли ВВ введением заявляемых соединений общей формулы (Fe₃O₄⁺)m (C₆H₇O₇^-)n за 12 мин - 45 ч до КМРТ мониторинга, и ВВ введением магневиста® за 3-9 мин до КМРТ мониторинга, этим создают контраст, сокращают время МРТ релаксации T1, Т2, Т*2 и время ранней КМРТ визуализации T1, Т2, Т*2 взвешенных 3D КМРТ изображений, кроме того, сокращают время необходимое для выявления центров злокачественной пролиферации с границами инфильтрации с определением стадий их развития в динамике от 72 до 264 ч (от 3 до 11 дней).

Поставленная задача решается посредством разработки нового средства для раннего контрастного магнитно-резонансного томографического исследования, представляющего собой водный золь на основе ферримагнитных наночастиц цитратферрита общей формулы (Fe₃O₄⁺)m⋅(C₆H₇O₇^-)n, где: m от 14 масс % до 29 масс % и n от 71 масс % до 86 масс %, предпочтительно m от 16 масс % до 27 масс % и n от 73 масс % до 84 масс %;

- (Fe₃O₄)m содержит от (Fe²_1,01⁺O⋅Fe³⁺_1,99О₃)m до (Fe²_1,30⁺O⋅Fe³⁺_1,70O₃)m, предпочтительно от ;

- (С₆Н₇О₇^-)n цитратанионы, содержащиеся в поверхностном слое ферримагнитных наночастиц, химически связанные с окисью железа;

- наночастицы в водном золе содержатся в количестве от 0,1 до 50 масс %, предпочтительно от 2,0 до 40 масс %;

- гидродинамический диаметр наночастиц составляет от 9 до 130 нм, намагниченность насыщения (Ms) от 8,3 кА/м до 8,9 кА/м; рН золя от 6,6 до 6,9, ζ потенциал -31±5 мВ, релаксивность 4550 мл⋅мг-1 с-.

Острая токсичность при внутривенном введении ЛД₅₀ мышей C57Bl/6j 1,0 г/кг, ЛД₅₀ крыс Вистар 1,7 г/кг.

Для получения заявляемого средства проводят синтез ферримагнитных нанокристаллов, при котором Fe²⁺O и Fe³⁺₂О₃ находятся в соотношении от 1,01/1,99 до 1,3/1,7, предпочтительно 1,15/1,85, структуры шпинели, кубической формы, общей формулы: Fe₃O₄, где Fe₃O₄ содержит от (1,15Fe²⁺O⋅1,85Fe³⁺О₃)m до (1,30Fe²⁺O⋅1,70Fe³⁺O₃)m, предпочтительно от (1,05Fe²⁺O⋅1,95Fe³⁺O₃)m до (1,15Fe²⁺O⋅1,85Fe³⁺O₃)m (1).

Затем кубические ферримагнитные нанокристаллы общей формулы (1) обрабатывают от 2 до 10 ч 36% хлористоводородной кислотой, предпочтительно от 4 до 6 ч. Получают активированные ферримагнитные наночастицы округлой формы, общей формулы от (1,05Fe²⁺O⋅1,85Fe³⁺O₃⋅0,1Fe³⁺OCl)m до (1,15Fe²⁺O⋅1,75Fe³⁺O₃⋅0,1Fe³⁺OCl)m (2), при этом количественное содержание в водном золе нанокристаллов соединения формулы (1,05Fe²⁺O⋅1,85Fe³⁺O₃⋅0,1Fe³⁺OCl) составляет от 10 масс % до 40 масс %. Диаметр, которых составляет от 5 до 11 нм, отличающиеся структурой шпинели, округлой формой, и поверхностью, состоящей из анионов Cl^-, защищающих их от слипания.

Покрытие наночастиц общей формулы (2), цитратанионами, путем замещения анионов Cl^- на цитратанионы ведут при +80-+90°С и перемешивании от 300 до 1500 об/мин, предпочтительно от 500 до 1000 об/мин, рН от 3,5 до 6,9, до образования водного золя соединений общей формулы (3);

Поставленная задача решается также посредством способа контрастного магнитно-резонансного томографического выявления центров злокачественной пролиферации с питающими сосудами и расширяющейся границей диффузной инфильтрации злокачественных клеток в нормальные ткани в эксперименте, включающий:

- внутривенное введение лабораторным животным от 0,1 до 10 мл/кг, предпочтительно от 0,2 до 5,0 мл/кг, от 2% до 5% водного золя соединений общей формулы (Fe₃O₄⁺)m⋅(С₆Н₇О₇^-)n за 10 мин - 75 ч до КМРТ сканирования исследуемой области и первичное внутривенное введение от 0,1 до 2,0 мл/кг магневиста® за 3-9 мин до КМРТ сканирования, которые вызывают раннюю КМРТ визуализацию развития центров злокачественной пролиферации с питающими сосудами, расширяющейся границей диффузной инфильтрации злокачественных клеток в нормальные ткани в течение 75 ч с

перерывами;

- проведение КМРТ сканирования тканей в режимах получения T₁ В {600/15 [время повторения, мс/время эхо, мс], Т₂ В (1950/85) спин эхо, Т₂ В градиент эхо (600/13) и Т*₂ В градиент эхо (550/15)};

- повторное внутривенное введение от 0,1 до 0,2 мл/кг магневиста® за 3-5 мин до КМРТ сканирование исследуемой области, с визуализацией границ диффузной инфильтрации ЗК в нормальные ткани и вторичное внутривенное введение от 0,1 до 1,0 мл/кг, от 2% до 5% водного золя соединений общей формулы (Fe₃O₄⁺)m⋅(C₆H₇O₇^-)n за 5-10 мин до КМРТ сканирования исследуемой области с последующей визуализацией контрастного изображения границы диффузной инфильтрации ЗК в нормальные ткани;

- проведение КМРТ сканирования тканей в режимах получения T₁ В {600/15 [время повторения, мс/время эхо, мс], Т₂ В (1950/85) спин эхо, Т₂ В градиент эхо (600/13) и Т*₂ В градиент эхо (550/15)};

- выявление центров злокачественной пролиферации с питающими сосудами и границ диффузной инфильтрации злокачественных клеток в нормальные ткани по изменениям интенсивностей вокселей в исследуемой области.

При этом, внутривенное введение лабораторным животным водного золя соединений общей формулы (Fe₃O₄⁺)m⋅(C₆H₇O₇^-)n проводят из расчета 0,2-5,0 мл/кг за 50 мин 12 ч до КМРТ сканирования исследуемой области, а внутривенное введение лабораторным животным магневиста® проводят из расчета 0,2-1,5 мл/кг.

Таким образом, заявляется средство на основе водного золя ферримагнитных наночастиц цитратферрита (ФНЦФ) общей формулы (Fe₃O₄⁺)m⋅(C₆H₇O₇^-)n, где: m от 14% масс до 29% масс и n от 71% масс до 86% масс, предпочтительно m от 16% масс до 27% масс и n от 73% масс до 84% масс. При этом с увеличением массы m увеличивается гидрофобность ФНЦФ, уменьшается растворимость в воде и увеличивается острая токсичность, а с увеличением массы n увеличивается их гидрофильность, увеличивается растворимость в воде и уменьшается острая токсичность.

Краткое описание чертежей

Изобретение поясняется чертежами и таблицами.

Фигура 1 (а, b, с, d, е, f, g, h, i, j, k, l, m, n, p, q, r, s, t, u, v, w). Ранние контрастные MPT изображения (РКМРТИ) патологических изменений в динамике на месте перевивки солидных злокачественных опухолей глиомы (Г) С6 и глиобластомы (ГБ) 101/8, визуализируют в виде срезов первичных центров злокачественной пролиферации (ПЦЗП)

после ВВ введения комбинации ферримагнитных наночастиц цитратферрита (ФНЦФ) и магневиста®.

Фигура 1 (а, b, с, d, е, f, g, h) Ранние РКМРТИ патологических изменений в динамике на месте перевивки Г С6 визуализируют в виде срезов ПЦЗП после ВВ введения комбинации ФНЦФ 28 и магневиста®:

1 (а) через 24-30 ч после перевивки бесформенные РКМРТИ или точки и пятна;

1 (b) через 48-72 ч после перевивки РКМРТИ первичного центра злокачественной пролиферации (ПЦЗП) (большие черные стрелки), который частично покрыт участками формирующейся мембраны, (толстые белые стрелки), малигнизированные сосуды (маленькие белые стрелки), 1 стадия развития ПЦЗП;

1 (с) через 72-96 ч после перевивки РКМРТИ ПЦЗП (между черными стрелками) и малигнизированные сосуды, питающие ПЦЗП, (между белыми стрелками), 2 стадия развития ПЦЗП;

1 (d) через 96-120 ч, после перевивки РКМРТИ ПЦЗП (между черными стрелками), изолированного формирующейся многослойной мембраной ПЦЗП (белые стрелки), 3 стадия развития ПЦЗП;

1 (е) через 120-144 ч после перевивки РКМРТИ ПЦЗП, (между тонкими черными стрелками), однослойную мембрану ПЦЗП (между черной и белой стрелками), 4 стадия развития ПЦЗП;

1 (f) через 144-168 ч перфорацию мембраны с проникновением ФНЦФ 28 в ПЦЗП, (между черными стрелками), формирование вторичных ЦЗП (ВЦЗП), генерирующих гиперинтенсивные сигналы протонов, (белые стрелки), 5 стадия развития ПЦЗП;

1 (g) через 168-192 ч визуализируют дефрагментацию мембраны ПЦЗП (между двумя длинными, толстыми белыми стрелками), формирование вторичных ЦЗП (ВЦЗП) (между двумя короткими белыми стрелками), инвазию злокачественных клеток в кровеносный сосуд (белая стрелка), сформировавшиеся ВЦЗП (между тонкими белыми стрелками), малигнизированные сосуды (тонкие белые пунктирные стрелки), ткани, насыщенные ФНЦФ, (белые, толстые пунктирные стрелки), 6 стадия - дефрагментация мембраны ЦЗП;

1 (h) через 192-216 ч - инвазию клеток Г С6 из кровеносного сосуда правой половины мозга в здоровые ткани левой половины мозга с их малигнизацией и неоангиогенезом (длинная белая стрелка); извитые малигнизированные сосуды (короткие стрелки); вторичный ЦЗП (между двумя стрелками).

1 (i, j, k, l). Ранние контрастные MPT изображения (РКМРТИ) патологических

изменений в динамике в головном мозге крысы, на месте перевивки солидной злокачественной опухоли ГС6, после ВВ введения комбинации ферримагнитных наночастиц цитратферрита и магневиста® визуализируют срезы головного мозга крысы Вистар:

1 (i) через 120-144 ч, на 4 стадии развития ПЦЗП, до введения ФНЦФ 28 из-за недостатка черных вокселей мембрана капсулы ПЦЗП и границы диффузной инфильтрации не видны (стрелка);

1 (j) через 120-144 ч, на 4 стадии развития ПЦЗП, после введения в хвостовую вену 0,2 мл 5% ФНЦФ 28 визуализируют мембрану капсулы, расположенную по периферии ПЦЗП, (маленькая стрелка) см. также фигуру 13;

1 (k) через 144-168 ч, на 5 стадии развития ПЦЗП, визуализируют контрастную границу диффузной инфильтрации (длинная стрелка), узкая светлая полоса, расположенная по границе мембраны ПЦЗП и нормальных тканей мозга (ограниченная диффузная инфильтрация пролиферирующих клеток НГС6 в нормальные ткани мозга через «щели» в мембране ПЦЗП) подтверждением полученных результатов служит фигура 13;

1 (l) через 168-192 ч, на 6 стадии развития ПЦЗП - инвазию и диффузную инфильтрацию мембраны ПЦЗП (короткая стрелка) широкую светлую полосу, образовавшуюся в результате инвазии и диффузной инфильтрации пролиферирующих клеток С6 в нормальные ткани мозга (длинная стрелка); мембрана (маленькая стрелка).

1 (m, n, р, q, r). Граница диффузной инфильтрации в динамике (пунктирные стрелки):

1 (m) через 96-120 ч, после перевивки - КМРТИ первичного ЦЗП (тонкая белая стрелка), разрушение мембраны ПЦЗП (черная стрелка), с проникновением ФНЦФ 28 в ПЦЗП, 5 стадия развития ПЦЗП;

1 (n) через 120-144 ч после перевивки раннее КМРТИ ПЦЗП, (тонкая черная стрелка), разрушение мембраны ПЦЗП (черная стрелка), 6 стадия развития ПЦЗП;

1 (р) через 144-168 ч после перевивки раннее КМРТИ ПЦЗП, (тонкая черная стрелка), разрушение мембраны ПЦЗП (черная стрелка), 6 стадия развития ПЦЗП;

1 (q) через 168-192 ч - фрагментацию мембраны ПЦЗП (маленькая, черная стрелка), 6 стадия развития ПЦЗП;

1 (r) через 336-400 ч на месте первичного ЦЗП НГБ 101/8 (пунктирная стрелка) образовалась полицентрическая опухоль, включающая 6 вторичных- и 2 третичных ЦЗП с несколькими инвазиями в «нормальные» ткани мозга, (маленькая стрелка), 7 стадия развития ПЦЗП.

Фигура 2. 1 стадия развития ПЦЗП карциномы легких Льюис (LLC). На 2-4 день после

перевивки LLC в мышцу бедра самки мыши C57Bl/6j визуализируют: КМРТ изображение ПЦЗП размером до 4 мм с сосудом, питающим ПЦЗП (стрелка); слой клеток мембраны богатый ФНЦФ 28 (между стрелками), образующими темные пятна и полосы с гипоинтенсивными МРТ сигналами протонов.

Фигура 3 (а, b). 5 стадия. Визуализируют: контрастное МРТ изображение ПЦЗП LLC. Через 5-7 дней объем ПЦЗП увеличился от 9 до 12 раз: (а) малигнизированные сосуды, снабжающие ПЦЗП, (между белой и черной стрелками); (b) ПЦЗП (между белыми стрелками), ткани, содержащие ФНЦФ, проникшие в ПЦЗП в результате перфорации мембраны, (между черными стрелками), светлые полосы и точки - инфильтрация пролиферирующих злокачественных клеток в кровеносную систему и в нормальные ткани (между белой и черной стрелками).

Фигура 4 (а, b, с). Режим «Ангио». Через 4-7 дней после перевивки LLC в мышцу бедра мыши визуализируют: контрастные МРТ изображения сосудов, питающих ПЦЗП, (а) 2 стадия, сеть злокачественных сосудов и капилляров, питающих опухоль и несколько небольших ПЦЗП (между стрелками); (b) 5 стадия, расширенные малигнизированные сосуды, питающие центры злокачественной пролиферации, (между пунктирными стрелками); (с) 6 стадия, светлые полосы, выходящие из опухоли, инвазия злокачественных тяжей и клеток в нормальные ткани (между черными и белыми пунктирными стрелками).

Фигура 5 (а, b, с, d, е, f). Контрастные МРТ изображения развития ПЦЗП через 5-14 дней после перевивки LLC в мышцу правого бедра, визуализируют: (а) 4 стадия, инфильтрирующего ПЦЗП, малигнизация и отек тканей, граничащих с ПЦЗП (стрелки);

(b) инфильтрирующий ПЦЗП на 5 стадии развития, отек и малигнизация пограничных тканей и сосудов, неоангиогенез сосудов, питающих ПЦЗП (стрелки); (с) 5 стадия, инфильтрирующего ПЦЗП (пунктирная стрелка), инвазия из центров злокачественной пролиферации (маленькие тонкие стрелки), множественные инвазии (маленькие толстые стрелки); (d) 6 стадия, ПЦЗП инфильтрирует в брюшную полость и образует вторичный центр злокачественной пролиферации, который смещает переполненный мочевой пузырь;

(е) 6 стадия, гидроцефалия, инвазия первого злокачественного жгута в ткани начинается из ПЦЗП (между черной и белой стрелками) и заканчивается образованием метастазов в переполненном мочевом пузыре (тонкие черные стрелки), инвазия второго злокачественного жгута в нормальные ткани начинается из вторичного ЦЗП позвоночника (между двумя черными стрелками), в нормальных тканях, жгут распускается, клетки инфильтрируют в нормальные ткани с образованием третичных центров злокачественной

пролиферации (ТЦЗП) в печени и легких (между двумя белыми стрелками); (f) негатив.

Фигура 6 (а, b, с, d). Центр злокачественной пролиферации аденокарциномы Са 755: (а) сосуд, питающий ЦЗП (белые стрелки); (b) мембрана ЦЗП (черная стрелка), инвазия ЗК с проникновением ФНЦФ 28 в ЦЗП (белые стрелки); (с) инвазия ЗК с проникновением ФНЦФ 28 в ЦЗП (белые стрелки); (d) инвазия ЗК из ЦЗП с проникновением ФНЦФ 28 в ЦЗП (белые стрелки).

Фигура 7 (а, b, с, d, е, f, g, h, i, j, k, l). Развитие ПЦЗП трубчатой и лобулярной форм аденокарциномы молочной железы Са 755, визуализируют: (а) 1 стадия, развитие первичного центра злокачественной пролиферации на месте перевивки трубчатой формы; (b) 2 стадия, развитие злокачественных трубочек; (с) 3 стадия, развитие мембраны ПЦЗП (стрелка); (d) 4 стадия, развитие опухолевых тканей, растягивающих мембрану ПЦЗП, (белая стрелка), перфорация мембраны ПЦЗП, инвазия с образованием вторичных центров злокачественной пролиферации (ВЦЗП) (черная стрелка); (е) 5 стадия, увеличение объема опухолевых тканей, перфорация мембраны и проникновение ФНЦФ 28 ПЦЗП с образованием вторичных ЦЗП (черная стрелка); (f) 6 стадия, увеличение объема вторичных ЦЗП (черные стрелки); (g) 1 стадия, развитие первичного центра злокачественной пролиферации на месте перевивки лобулярной формы опухоли Са 755 (стрелка); (h) 2 стадия, развитие злокачественных лобулярных тканей (стрелка); (i) 3 стадия, развитие мембраны ПЦЗП и увеличение массы опухолевых тканей (между стрелками); (j) 4 стадия, развитие опухолевых тканей, растягивающих мембрану ПЦЗП, (между стрелками), перфорация мембраны ПЦЗП, инвазия с образованием вторичных центров злокачественной пролиферации (между стрелками); (k) 5 стадия, увеличение объема опухолевых тканей, перфорация мембраны ПЦЗП с образованием вторичных ЦЗП (ВЦЗП) (между стрелками); (l) 6 стадия, увеличение объема вторичной опухоли с перфорацией мембраны (между стрелками).

Фигура 8 (а, b, с, d). Контрастное МРТ изображение развития ПЦЗП лобулярной формы аденокарциномы молочной железы Са 755, визуализируют: (а) 6 стадия, образование множественных вторичных центров злокачественной пролиферации (толстые стрелки) с инвазией клеток Са 755 в лимфатическую систему и другие нормальные ткани (тонкие стрелки); (b) негатив; (с) 6 стадия, инвазия спонтанной злокачественной опухоли молочной железы в печень и другие внутренние органы у крысы Линии Wistar (белая стрелка); (d) инвазия опухоли в печень, легкое и другие органы (белые стрелки).

Фигура 9 (а, b). 6 стадия. Контрастные МРТ изображения ВЦЗП лимфатической системы, пораженной клетками лимфолейкоза Р388 у самки мыши DBA 2, через 48 ч после

внутрибрюшинного введения 10⁶ клеток лимфолейкоза Р388 визуализируют: (а) метастазирование клеток лимфолейкоза Р388 в области подмышечных лимфатических узлов с образованием вторичных ЦЗП (стрелки); (b) лимфатические узлы, пораженные лимфолейкозом Р388 (стрелки).

Фигура 10 (а, b, с, d, е, f, g, h). КМРТ изображения меланомы B16F-11:

(а) патологические изменения поверхности кожи ПЦЗП в подмышечной области, на месте подкожной инокуляции 10⁶ злокачественных клеток (между черными стрелками), отек сосудов, питающих ПЦЗП, (между пунктирными стрелками); псевдостручек диссеминирующий поверхность кожи, струйки клеток B16F-11, мигрирующих от псевдостручка по поверхности клеток кожи, (тонкие стрелки); (b) первичный ЦЗП меланомы B16F-11 (черная стрелка); инвазионные стромальные трубки (между белыми стрелками); псевдостручек с клетками меланомы B16F-11, диссеминирует внутренние органы опухолевыми клетками (белая стрелка); (с) режим «Ангио», меланома B16F-11, расположенная под кожей правой подмышечной области самки мыши C57Bl/6j, патологические изменения сосудистой системы мыши под действием клеток и белков меланомы B16F-11 (между стрелками); (d) первичный центр злокачественной пролиферации меланомы B16F-11 (длинная стрелка); инвазия в аорту, грудину и печень (короткие стрелки); (е) режим «Ангио», часть мембраны ПЦЗП (белая стрелка), первичный центр злокачественной пролиферации (черная стрелка), патологические изменения кровеносной системы и внутренних органов (между белыми стрелками); (f) первичный ЦЗП меланомы B16F-11 покрыт перфорированной мембраной ПЦЗП, содержит ФНЦФ 28 и имеет черный цвет (между тонкими белыми стрелками), вторичные ЦЗП, покрытые нативными мембранами, не содержат ФНЦФ 28 и имеют белый цвет (большие белые стрелки), сосудистая система опухоли (маленькие белые и черные стрелки); (g) инвазия опухоли и неоангиогенез в печени, расширенные и деформированные злокачественной пролиферацией кровеносные малигнизированные сосуды (маленькие белые стрелки), ПЦЗП (большая белая стрелка); (h) зрелый ПЦЗП, содержащий некротизированные участки серого цвета (короткая белая стрелка), ПЦЗП конец черной стрелки, место выхода инвазионной стромальной трубки из мемраны ПЦЗП (длинная белая стрелка), инвазионная стромальная трубка (конец белой стрелки), вторичный ЦЗП, образовавшийся в головке инвазионной стромальной трубки (маленькая черная стрелка).

Фигура 11 (а, b, с, d, е). 6 стадия. Контрастные магнитно-резонансные томографические изображения развития меланомы B16F-11, привитой под кожу правой

подмышечной области самки мыши C57Bl/6j:

11 (а) стромальная инвазивная эндотелиальная трубка меланомы B16F-11, в которой развиваются, и с помощью которой распространяются в организме млекопитающих ЦЗП B16F-11 (белая стрелка), некротизированные ткани ПЦЗП меланомы B16F-11 (черная стрелка), малигнизированные сосуды, питающие стромальную трубку меланомы B16F-11, (большая белая стрелка), первичный ЦЗП, конец трубки, в котором происходит развитие вторичного ЦЗП;

11 (b) аналогичное развитие стромальной инвазивной эндотелиальной трубки меланомы B16F-11 (5 стадия).

11 (с) 6 стадия, малигнизированные сосуды головного мозга мыши, питающие метастазы меланомы B16F-11, (длинные белые стрелки), метастазы меланомы B16F-11 в головном мозге мыши (короткие белые стрелки), стромальная эндотелиальная трубка меланомы B16F-11 с ПЦЗП (черная стрелка), (d) негатив, (е) 6 стадия, вторичные ЦЗП (черные стрелки), инвазия опухоли B16F-11 из вторичных ЦЗП (белые стрелки), струйки клеток B16F-11, вытекающие из псевдостручка и диссеминирующие здоровые ткани мыши (концы тонких белых стрелок).

Фигура 12 (а, b). (а) 6 стадия. Цифровая фотография крысы Линии Wistar с аденокарциномой молочной железы под вторым правым, соском. Железа увеличилась в размерах на 2 прядка и вызвала патологические изменения состава крови, инвазию в печень и легкие, см. фигура 8 (с, d); (b) цифровая фотография, препарат самки мыши C57Bl/6j с патоморфологически измененными внутренними органами при меланоме B16F-11, первичная опухоль в правой подмышечной области (между тремя маленькими стрелками); метастазирование с образованием вторичной опухоли меланомы B16F-11 на месте левой почки (длинная стрелка); крупный метастаз меланомы B16F-11 в правой почке (короткая стрелка).

Фигура 13 (а, b, с). Гистологический анализ тканей головного мозга, занятых мембраной ПЦЗП включает:

- (а) участок первичного центра злокачественной пролиферации, в котором преимущественно содержатся злокачественные клетки Г С6, находящиеся в состоянии митоза;

- (b) мембрану, состоящую из макрофагов, лимфоцитов, лейкоцитов и других иммунокомпетентных клеток (ИКК), инфильтрированную злокачественными клетками Г С6, и «изолирующую» участок, занятый ПЦЗП от нормального мозга;

- (с) пограничные мембране ПЦЗП ткани мозга, содержащие много макрофагов, лимфоцитов, лейкоцитов и небольшое число клеток ЗГ Сб.

На изображениях гистологических срезов четко не очерчены границы между первичным центром злокачественной пролиферации, мембраной и пограничными тканями мозга, инфильтрированными злокачественными клетками, наблюдаются: цельные клетки ЗГ С6 и их срезы с ядром в центре, покрытые ферримагнитными наночастицами цитратферрита и макрофаги. Злокачественные клетки, покрытые наночастицами, окрашены по Перлсу, имеют темно-синюю окраску, округлую форму, ядро и мигрируют из первичного центра злокачественной пролиферации (ПЦЗП) в нормальные ткани мозга (черные пунктирные стрелки). Макрофаги, крупные светло-синие клетки, непредсказуемой формы, составляющие от 70 до 90% клеток в структуре мембраны ПЦЗП, мигрируют в сторону ПЦЗП (белые стрелки). Макрофаги эндоцитируют, дефрагментируют и убивают попадающиеся им злокачественные клетки, (черные пунктирные стрелки). Макрофаги, переполненные фрагментами злокачественных клеток, уменьшаются в размерах, истончаются и постепенно исчезают в среде клеток ГБ. В ПЦЗП макрофаги практически отсутствуют. Окраска по Перлсу, Х300.

Фигура 14. Гистологический анализ тканей участка мембраны первичного центра злокачественной пролиферации (ПЦЗП) глиобластомы 101/8 (ГБ), находящегося в мозге крысы линии Wistar. Ткани мембраны богаты жизнеспособными злокачественными клетками, макрофагами, лейкоцитами, лимфоцитами: макрофаги, эндоцитируют и дефрагментируют опухолевые клетки, (пунктирные стрелки); дефрагментированные опухолевые клетки (короткие белые стрелки). Окраска по Перлсу, X1000.

Осуществление изобретения

Последовательный синтез соединений формул: 1, 2, 3.

где:

от (Fe²⁺_1,30O⋅Fe³⁺_1,70O₃)m до (Fe²⁺_1,15O⋅Fe³⁺_1,85О₃)m

- нестехиометрический магнетит;

от (Fe²⁺_1,1O⋅Fe³⁺_1,7O₂⋅0,2Fe³⁺OCl^-)m до (Fe²⁺_1,05O⋅Fe³⁺_1,85O₂⋅0,1Fe³⁺OCl^-)m

- активированный анионами Cl^- магнетит;

- от (0,2Fe³⁺OCl^-)m до (0,1Fe³⁺OCl^-)m

- пленка, покрывающая наночастицы активированного нестехиометрического магнетита;

- (C₆H₇O₇)^-_n - цитратанионы;

- от (1,05Fe²⁺O⋅1,95Fe³⁺О₃)m(C₆H₇O₇)n до (1,1Fe²⁺O⋅1,9Fe³⁺О₃)m(C₆H₇O₇)n

- заявляемое соединение, ферримагнитные наночастицы цитратферрита.

Намагниченность насыщения, M_s которых увеличивается от 8,3 кА/м до 8,9 кА/м пропорционально понижению содержания Fe²⁺O в заявляемом средстве общей формулы (3).

Внутривенное введение лабораторным животным от 0,1 до 10 мл/кг, предпочтительно от 0,2 до 5,0 мл/кг, от 2% до 5% водного золя соединений общей формулы (3) за 10 мин до 45 ч до КМРТ сканирования, обеспечивают тем самым избирательное увеличение числа черных вокселей в КМРТ изображениях нормальных тканей с сокращением времени Т2 и Т*2 спин спиновой МРТ релаксации протонов молекул гидратной воды нормальных тканей с увеличением контраста МРТИ от 30 мин до 45 ч;

- внутривенное введение от 0,1 до 2,0 мл/кг магневиста®, предпочтительно от 0,2 до 1,5 мл/кг, за 3-9 мин до раннего КМРТ сканирования опухоли, обеспечивая тем самым избирательное увеличение числа белых вокселей КМРТ изображений злокачественных клеток млекопитающего с усилением яркости T1, Т2 и Т*2 взвешенных 3D КМРТ изображений продолжительностью от 30 мин до 40 мин и сокращением времени Т1 градиентного эха (GRE) МРТ релаксации тканей от 10 мин до 30 мин;

- проведение КМРТ сканирования тканей в режимах получения T₁ В {600/15 [время повторения, мс/время эхо, мс], Т₂ В (1950/85) спин эхо, Т₂ В градиент эхо (600/13) и Т*₂ В градиент эхо (550/15)};

- повторное внутривенное введение от 0,1 до 0,2 мл/кг магневиста® за 3-5 мин до КМРТ сканирование исследуемой области, с визуализацией границ диффузной инфильтрации ЗК в нормальные ткани и вторичное внутривенное введение от 0,1 до 1,0 мл/кг, от 2% до 5% водного золя соединений общей формулы (Fe₃O₄⁺)m⋅(C₆H₇O₇^-)n за 5-10 мин до КМРТ сканирования исследуемой области с последующей визуализацией контрастного изображения границы диффузной инфильтрации ЗК в нормальные ткани;

- проведение КМРТ сканирования тканей в режимах получения T₁ В {600/15 [время

повторения, мс/время эхо, мс], Т₂ В (1950/85) спин эхо, Т₂ В градиент эхо (600/13) и Т*₂ В градиент эхо (550/15)};

- выявление центров злокачественной пролиферации с питающими сосудами и границ диффузной инфильтрации злокачественных клеток в нормальные ткани по изменениям интенсивностей вокселей в исследуемой области.

Способ проведения МРТ исследования включает следующую последовательность действий:

а) раннюю, через 48 ч-72 ч после имплантации 10⁶ злокачественных клеток (перевивка опухоли) визуализацию высококонтрастных T1, Т2 и Т*2 взвешенных (В) 3D изображений высокого разрешения центров злокачественной пролиферации с питающими их сосудами и границами диффузной инфильтрации злокачественных клеток, для чего перед КМРТ сканированием злокачественной опухоли в режиме «Angio» для увеличения контраста избирательно понижают яркость нормальных тканей млекопитающего внутривенным введением заявляемого средства общей формулы (3), а яркость КМРТ изображений злокачественных клеток избирательно повышают внутривенным введением магневиста®, за счет этого от 3 до 11 дней сокращают время визуализации КМРТ изображений развития центров злокачественной пролиферации, границ диффузной инфильтрации злокачественных клеток и их развития по стадиям;

б) выявление центров злокачественной пролиферации с питающими сосудами, границами диффузной инфильтрации, и определением стадий их развития в динамике с помощью контрастного магнитно-резонансного мониторинга, отличающееся тем, что при КМРТ мониторинге последовательно визуализируют увеличение объема ЦЗП, расширение границ инфильтрации, перфорацию мембраны ЦЗП, инвазию и диссеминацию ОК в нормальные ткани;

в) внутривенное введение от 0,1 до 0,2 мл/кг магневиста® для увеличения контраста, яркости и пространственного разрешения КМРТ изображений, полученных после ВВ введения комбинации ФНЦФ 28/MB, за 7-10 мин до хирургического удаления ЦЗП вместе с мозгом по границам диффузной инфильтрации.

Ниже приведены примеры конкретного выполнения. Специалист в данной области техники понимает, что данные примеры не являются ограничивающими группу изобретений.

Пример 1. Синтез ферримагнитных наночастиц цитратферрита (ФНЦФ) с профицитом Fe²⁺

Готовят раствор смеси 25,87 г FeCl₂4H₂O и 49,0 г FeCl₃7H₂O в 500 мл воды, пропускают через стеклянный фильтр №4, получают прозрачный фильтрат №1.

В водный 25% раствор гидроксида аммония с 20% избытком (33,6 г NH₄OH, 134,4 мл) быстро (в течение 2 сек) прибавляют фильтрат №1 при перемешивании при 1500 об/мин. Продолжают перемешивать 30 мин при рН от 10 до 11 до полного превращения солей железа в гидроксиды железа:

[1,3Fe(OH)₂,+1,7Fe(OH)₃]m, рН суспензии от 10 до 11.

Водную суспензию смеси полученных гидроксидов нагревают 40 мин при +85-+90°С при перемешивании. Чистят от примесей в неоднородном постоянном магнитном поле (НПМП) индукцией от 0,2 до 3,0 Тл, градиент от 0,0012 до 0,013 Тл/см.

Получают магнетит в виде кубических нанокристаллов шпинели диаметром от 5 до 12 нм. Размеры нанокристаллов свежеполученной суспензии определяют просвечивающей электронной микроскопией на ЭМ Филипс. Синтез и выделение промежуточных продуктов и магнетита ведут в НПМП индукцией от 0,2 до 3,0 Тл, градиент от 0,0012 до 0,03 Тл/см.

Получают 20 г магнетита, выход 86% нестехиометрического магнетита с профицитом Fe²⁺ состава:

(Fe²⁺_1,3Fe³⁺_1,7O₄)m

Применяют высокодисперсный нестехиометрический магнетит с профицитом по Fe²⁺ при получении магнитоуправляемых препаратов биомедицинского назначения. При хранении нанокристаллы магнетита окисляются, спонтанно слипаются и образуют агрегаты. Для сохранения нанокристаллической структуры нанокристаллы (Fe²⁺Fe³⁺₂O₄)m обрабатывают (травят) 36% хлористоводородной кислотой, которую прикапывают к водной суспепзии магнетита до образования соединений, представляющих собой наночастицы округлой формы, покрытые анионами Cl^-.

Учитывая неустойчивость к окислению молекул стехиометрического магнетита, которая приводит к понижению Ms, синтез активированного магнетита ведут из нестехиометрического магнетита с профицитом по катионам Fe².

Подготовку растворов солей Fe²⁺, Fe³⁺ и синтез нестехиометрического магнетита с профицитом по Fe²⁺, ведут в дистиллированной, свежепрокипяченной воде, в атмосфере азота. Готовят раствор смеси 25,87 г FeCl₂4H₂O и 49,0 г FeCl₃7H₂O в 500 мл воды, пропускают через стеклянный фильтр №4, получают прозрачный фильтрат №1. В водный 25% раствор гидроксида аммония с 20% избытком (33,6 г NH4OH, 134,4 мл) в течение 2 сек прибавляют фильтрат №1 при перемешивании. Продолжают перемешивать 30 мин при рН от

10 до 10,5 до полного превращения солей железа в гидроксиды железа:

[1,3Fe(OH)₂,+1,7Fe(OH)₃]m, рН суспензии от 10 до 10,5.

Водную суспензию смеси полученных гидроксидов нагревают 40 мин при +85-+90°С при перемешивании. Чистят от примесей в неоднородном постоянном магнитном поле индукцией от 0,2 до 3,0 Тл, градиент от 0,0012 до 0,013 Тл/см.

Получают 20,2 г магнетита в виде кубических нанокристаллов шпинели диаметром от 5 до 12 нм. Выход 87%.

Синтез ферримагнитных наночастиц цитратферрита ведут по уравнениям реакций:

где:

от (Fe²⁺_1,30O⋅Fe³⁺_1,70O₃)m до (Fe²⁺_1,15O⋅Fe³⁺_1,85O₃)m - нестехиометрический магнетит формулы (1) в виде кубических нанокристаллов шпинели диаметром от 5 до 11 нм.

Водную суспензию смеси полученных гидроксидов нагревают 40 мин при +85-+90°С при перемешивании. Чистят от исходных веществ и примесей диализом. Подвижная фаза, проточная вода.

Получают 13,0 г. Выход 57%.

Нестехиометрический магнетит формулы (1) окисляется при хранении и при синтезе активированного магнетита с увеличением намагниченности насыщения (Ms) от 5,3 кА/м до 7,8 кА/м.

Размеры нанокристаллов свежеполученной суспензии магнетита определяют просвечивающей электронной микроскопией. Просвечивающую электронную микроскопию проводят на ЕМ400, разрешение (Филипс). Ферритовые ядра имеют диаметр от 5 до 11 нм.

Очищенный золь ФНЦФ 28 концентрируют в неонородном постоянном магнитном поле (НПМП) от 0,2 до 0,4 Тл и центрифугируют при 2000 об/мин в течение 5 мин, супернатант сливают, упаривают на роторном испарителе до получения 40% водного золя ФНЦФ.

Синтез и выделение промежуточных продуктов и магнетита ведут в НПМП индукцией от 0,2 до 3,0 Тл, градиент от 0,0012 до 0,013 Тл/см.

Теоретически должно получаться 23 г магнетита.

Получают от 18 до 20 г, выход до 87% нестехиометрического магнетита с профицитом

Fe²⁺состава:

где:

от Fe²⁺_1,30O⋅Fe³⁺_1,70O₃)m до (Fe²⁺_1,15O⋅Fe³⁺_1,85O₃)m - нестехиометрический магнетит;

от (Fe²⁺_1,1O⋅Fe³⁺_1,7O₂⋅0,2Fe³⁺OCl^-)m до (Fe²⁺_1,05O⋅Fe³⁺_1,85O₂⋅0,1Fe³⁺OCl^-)m - активированный анионами Cl^- магнетит;

- от (0,2Fe³⁺OCl^-)m до (0,1Fe³⁺OCl^-)m - пленка, покрывающая наночастицы активированного нестехиометрического магнетита;

- (С₆Н₇О₇)^-n - цитратанионы;

- от (1,05Fe²⁺O⋅1,95Fe³⁺О₃)m(C₆H₇O₇)n до (1,1Fe²⁺O⋅1,9Fe³⁺О₃)m(C₆H₇O₇)n - заявляемое соединение, ферримагнитные наночастицы цитратферрита.

В среднем на 1 молекулу магнетита приходится 0,15 аниона хлора или цитрат аниона, покрывающих ферримагнитные нанокристаллы магнетита.

Мм активированного магнетита 242,65.

Средняя молекулярная масса соединений, из которых состоят ФНЦФ 28 260,65.

Из 1М активированного магнетита образуется 1 М ФНЦФ.

Теоретический выход активированного магнетита 24,3 г.

Теоретический выход ФНЦФ 28 26,1 г.

Получают 21,5 г ФНЦФ. Выход 82%

При синтезе ФНЦФ 28 активированные наночастицы магнетита диаметром от 5 до 11 нм, общей формулы (2), перемешивают в растворе 5% лимонной кислоты (ЛК), (C₆H₈O₇⋅H₂O)n фирмы Sigma. Синтез ведут в отсутствии кислорода, при нагревании от +70 до +80°С в течение 40 мин. При взаимодействии наночастиц активированного магнетита с молекулами ЛК при температуре от +70 до +90°С в атмосфере азота происходит выделение HCl с образованием химических связей между молекулами окиси железа и цитратанионами, и образуется водный золь ферримагнитных наночастиц цитратферрита (ФНЦФ).

Реакционную смесь очищают от исходных веществ в неоднородном постоянном

магнитном поле индукцией от 0,2 до 3,0 Тл, градиент от 0,0012 до 0,013 Тл/см, центрифугируют 2 мин при 2000 оборотов/мин.

Супернатант собирают и фильтруют через мембранные фильтры, диаметр пор 0,2-0,45 мкм, получают золь ФНЦФ 28 в воде. Цитратанионы, образующие верхний слой нанокристаллов магнетита, защищают их от окисления и слипания в водных золях.

Золь, содержащий от 2,0 до 5,0% ФНЦФ, концентрируют в неоднородном постоянном магнитном поле (НПМП) индукцией 0,2 Тл, градиент 0,0012 Тл/см, разбавляют водой до образования 10% водного золя и центрифугируют 5 мин при 2000 оборотов/мин.

Полученный супернатант фильтруют через бумажный фильтр и систему фильтров Миллипор (диаметр пор от 40 до 150 нм). 0,1 мл полученного фильтрата разбавляют до содержания ФНЦФ 28 от 0,01 до 0,0001% и определяют гидродинамический диаметр наночастиц, который составляет от 9 до 130 нм.

Полученный фильтрат ФНЦФ 28 концентрируют на роторном испарителе до 10% содержания сухого остатка. Получают 10% водный золь, рН от 6,7 до 7,0 который стерилизуют в УЗ бане 6 ч в атмосфере азота, разливают по 10 мл в стеклянные флаконы объемом 20 мл, замораживают при -75-80°С и лиофильно высушивают до содержания воды от 0,01 до 0,10%. Флаконы заполняют азотом, закрывают резиновыми пробками с металлическими колпачками. Хранят при +4°С во флаконах, закрытых резиновыми пробками, снабженными металлическими колпачками. Срок хранения 3 года.

В стерильных условиях к ФНЦФ 28 прибавляют 5 мл стерильной дистиллированной свежепрокипяченной, насыщенной N₂, доводят объем полученного золя до 10 мл. Закрывают флакон резиновой пробкой, снабженной металлическим колпачком, помещают в ультразвуковую баню на 30 мин. Получают стерильный 2% водный золь, который имеет цвет, от темно-коричневого до черного, рН от 6,9 до 7,1.

Пример 2. Получение 40% водного золя ФНЦФ

Очищенный золь ФНЦФ 28 концентрируют в неонородном постоянном магнитном поле от 0,2 до 0,4 Тл и центрифугируют при 2000 об/мин в течение 5 мин, супернатант сливают, упаривают на роторном испарителе до получения 40% водного золя ФНЦФ, который используют для получения 10%, 5% и 2% золей, для ВВ введения животным.

Определяют физико-химические свойства водного золя ФНЦФ:

просвечивающую электронную микроскопию проводят на ЕМ400, разрешение 1,4 Е (Филипс). Ферритовые ядра имеют диаметр от 5 до 11 нм. Гидродинамический диаметр ФНЦФ определяют по динамическому рассеянию света с помощью Zetasizer NanoZS

(Malvern, UK). Распределение по величине гидродинамических диаметров ФНЦФ 28 в 0,1% водном золе от 9 до 130 нм. Удельная намагниченность (Ms от 7,8 до 8,9 кА/м, релаксивность от 4550 до 4556 мл⋅мг^-1с^-1,

Биологические свойства ФНЦФ: острая токсичность ЛД₅₀ мышей C57Bl/6j 1,0 г/кг; ЛД₅₀ крыс Вистар 1,7 г/кг. Применяют в исследованиях in vitro и in vivo.

Пример 3. Подбор соотношений ферримагнитных наночастиц цитратферрита и магневиста (ФНЦФ/МВ)

В опытах по подбору соотношений ФНЦФ 28/MB, при которых сокращается время ранней визуализации КМРТИ, для увеличения числа черных вокселей в визуализируемых МРТ изображениях тканей млекопитающего через 2-4 дня после перевивки опухоли животным вводят ВВ 0,2 мл водного от 2 до 5% золя заявляемого средства. При КМРТ сканировании места перевивки, визуализируют темные КМРТ изображения ПЦЗП с питающими сосудами и пограничными тканями. Для увеличения контраста и яркости изображений, за 3-9 мин до КМРТ сканирования вводят MB от 0,1 до 0,2 мл/кг, постепенно прибавляя препарат, проводят КМРТ сканирование в динамике. Визуализируют ранние контрастные МРТ изображения, которые отображают картину развития первичных центров злокачественной пролиферации.

Разработка заявляемой комбинации, заявляемого контрастного средства.

Разработку заявляемой комбинации, заявляемого контрастного средства, ФНЦФ 28 с магневистом®, которые при последовательном внутривенном (ВВ) введении млекопитающим создают контраст и пространственное разрешение, избирательно увеличивая число черных вокселей в КМРТ изображениях нормальных тканей, и белых вокселей в КМРТ изображениях центров злокачественной пролиферации с питающими сосудами;

- контрастный МРТ мониторинг места перевивки опухоли для ранней визуализации КМРТ изображений, представляющих определенные стадии процесса развития центров злокачественной пролиферации.

Для решения указанной задачи к 0,2 г ФНЦФ 28 в стерильных условиях прибавляют 5 мл дистиллированной свежепрокипяченной, насыщенной N₂, стерильной воды, доводят объем полученного золя до 10 мл. Закрывают флакон резиновой пробкой, снабженной металлическим колпачком, помещают в ультразвуковую баню на 30 мин. Получают стерильный 2% водный золь, который имеет цвет, от темно-коричневого до черного, рН 7,2, острая токсичность ЛД₅₀ 1 г/кг. От 0,01 до 0,2 мл 2% золь ФНЦФ 28 вводят мышам внутриартериально, ВВ и ИП в качестве негативного МРТ контрастного средства.

Приготовление 5% водного золя ФНЦФ 28 осуществляют в аналогичных условиях.

Пример 4. Ранняя МРТ визуализация глиальных опухолей

Центры ЗП глиомы С6 и глиобластомы 101/8 визуализируют на Т2 взвешенных КМРТ изображениях (Т2 ВИ), благодаря разнице во временах поперечной релаксации Т2 по сравнению с нормальным мозгом. Различия в протонной плотности (PD) и времени продольной релаксации Т1 для ЦЗП глиальных опухолей и нормальных тканей менее выражены. Эти различия наблюдают на параметрических картах, построенных по изображениям, полученным методом спинового эха при варьировании параметров TR и ТЕ от 0,95 до 5.0 с и от 13 до 170 мс, соответственно. После ВВ введения в организм животного ФНЦФ, ЦЗП глиомы С6 визуализируют на Т1 взвешенных МРТ изображениях в виде светлого пятна с темным кольцом по его периферии, фигура 1 (i, j, k, l).

При гистологических исследованиях состава темного кольца определяют макрофаги и опухолевые клетки, содержащие конгломераты ФНЦФ, фигуры 13, 14. Проникновению ФНЦФ 28 в ЦЗП способствуют: небольшие размеры наночастиц, понижение гематоэнцефалического барьера из-за разрушения выстилающего эндотелия сосудов опухолевыми клетками и высокая концентрация VGFE, увеличивающего проницаемость стенок сосудов. Темная полоса по периферии первичной опухоли увеличивает контраст МРТ изображений и способствует раннему выявлению ЦЗП глиомы С6, фигура 1 (i, j, k, l).

Аналогичные результаты получают на крысах Вистар с глиобластомой 101/8, фигура 1 (m, n, р, q, r). Через 24-30 час после введения ФНЦФ, за 5 мин до КМРТС, вводят магневист (MB) фирмы «Шеринг» - парамагнетик ионной природы, который быстро диффундирует в окружающие ткани через стенки сосудов с увеличенной проницаемостью, яркость здоровых и опухолевых тканей при этом повышается. Попадая в ткани, не содержащие ДФ, магневист увеличивает их яркость, время релаксации таких тканей - Т1 сокращается. Магневист быстро выводился из организма и, через 30-40 минут яркая полоса, окружающая ЦЗП, меркнет.

Пример 5. Проведение КМРТ исследования

Через 24 ч после перевивки опухоли (например, глиома С6) в предварительном исследовании 3 самкам крыс Вистар вводят интраперитонеально (ИП) 0,1 г/кг «Zoletil 100», (Virbac). Спящим животным, вводят ВВ 0,1 мл 2% водный золь ФНЦФ. Через 10 мин животных по одному помещают в магнитное поле MP томографа, в режиме «Ангио» сканируют место перевивки опухоли. Визуализация четких КМРТ изображений не происходит. Тем же животным ВВ вводят 0,2 мл/кг магневист. Визуализация четких КМРТ изображений не происходит, фигура: 1 (а).

Животных выдерживают 24-48 ч в условиях вивария. Вводят ИП 0,1 г/кг «Zoletil 100». Спящих животных по одному помещают в магнитное поле MP томографа, и в режиме «Ангио», сканируют место перевивки опухоли. Визуализируют темные КМРТ изображения, развивающейся мембраны ПЦЗП. Тем же животным за 3 мин до КМРТ сканирования вводят ВВ 0,2 мл/кг магневист. При КМРТ сканировании визуализируют светлые КМРТ изображения развивающейся многослойной мембраны ПЦЗП, фигура: 1 (b-d). Контрастное МРТ сканирование продолжают 30 мин. Через карждые 30-60 мин (до появления на КМРТИ артефактов) дополнительно вводят животным Zoletil 100 и магневист, и сканируют тело животных вновь. Через 5-14 дней непрерывных исследований с заменой животных особями, привитыми за определенное время до начала КМРТ мониторинга, получают КМРТИ, фигура, 1 (е, g, h, k, l, m, n, p, q, r, s, t, u, v, w).

50 крыс линии Wistar, весом 150-180 г, разведения экспериментально-биологической лаборатории "ФГБУ НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина" Минздрава России получают одной партией. Предварительные опыты проводят на 8 самках крыс. Злокачественная глиома С6 (ЗГ С6 и глиобластома (ГБ) - инвазивные формы опухолей мозга.

У здоровой крысы после анестезии проводят трепанацию черепа, и помещают мозг в чашку Петри. При введении шприцем "Гамильтон" 15 мкл водного 40% золя ФНЦФ 28 в правый каротид (carotids) мозга, золь не задерживается в тканях мозга, а протекает на дно чашки Петри. При введении золя ФНЦФ 28 в дно правого желудочка, золь ФНЦФ 28 остается на месте введения, поэтому ЗГ С6 и ГБ 101/8 перевивают в дно правого желудочка, фигура 1 (w). Общий вид контрастного МРТ изображения продольного среза головы крысы Вистар: череп (длинная белая стрелка); нормальный мозг (толстая белая стрелка); граница диффузной инфильтрации клеток глиомы С6 в нормальный мозг (короткая белая стрелка); место правого желудочка занимает покрытый мембраной капсулы центр злокачественной пролиферации глиомы С6 (длинная черная стрелка); мембрана капсулы ПЦЗП (конец черной стрелки); левый желудочек (короткая черная стрелка).

После стереотаксической перевивки ЗГ С6 или ГБ 101/8 у крыс Линии Wistar на месте перевивки начинается злокачественная пролиферация и, в течение 2-4 дней, образуются ПЦЗП фигура: 1 (b, с, d, е, m, n, р, q, r, s, t, u, v, w). Макрофаги, лимфоциты, лейкоциты и другие иммунокомпетентные клетки окружают ПЦЗП и образуют объемную многослойную сетчатую мембрану, диаметром от 1 до 7 мм, покрывающую ПЦЗП, фигуры: 1 (b, d, е, j, k, l, w); 13 и 14. При образовании многослойной мембраны из ИКК в ее структуре остаются «щели» (участки, не содержащие клеток, способных убивать и дефрагментировать

злокачественные клетки). По этим «щелям» часть злокачественных клеток инфильтрирует из ПЦЗП через мембрану в пограничные нормальные ткани мозга, фигуры: 1 (k, l) и 13. Многослойная «сетчатая» мембрана постепенно превращается в однослойную мембрану ПЦЗП с более плотной структурой, но и она не способна долго надежно защищать нормальные ткани мозга от злокачественных клеток, фигуры: 1 (е, g, h, k, l, m, n, p, q, r, s, t, u, v, w); 13 (a, b, с) и 14.

Заявляемое средство, ФНЦФ, применяют в комбинации с магневистом®, для ранней визуализации контрастных МРТ изображений ПЦЗП, которые являются первыми признаками развития солидных злокачественных опухолей. ПЦЗП визуализируют в виде КМРТ изображений через 48-72 ч после перевивки опухолей. Заявляемое средство, в виде 2-5% водного золя вводят от 1,0 до 2,0 мл/кг последовательно с магневистом^® 0,2 мл/кг в хвостовую вену крыс с перевитой ЗГ С6 или ГБ 101/8. Через 2-3 дня после перевивки, за 6-10 минут до проведения магнитно-резонансного томографического сканирования (МРТС), для анестезии, перед ВВ введением контрастных препаратов крысам вводят интраперитонеально 0,1 г/кг «Zoletil 100», (Virbac). В хвостовую вену крыс 1 группы вводят 0,2 мл 0,9% NaCl, через 6 минут животных размещают в поле 7 Тл биоспектротомографа BioSpec ВС 70/30 USR (Bruker) и проводят раннее контрастное МРТ сканирование тканей в режимах получения T₁ В {600/15 [время повторения, мс/время эхо, мс], Т₂ В (1950/85) спин эхо, Т₂ В градиент эхо (600/13) и Т*₂ В градиент эхо (550/15)} изображений. Визуализируют бесформенные МРТИ низкого контраста и разрешения, фигура 1 (а), (табл. 1).

Крысам 2 группы после проведения анестезии, в хвостовую вену вводят 20 мл/кг 2% ФНЦФ. Место введения препарата промывают теплой водой, протирают досуха, животных содержат при температуре +25-+28°С в стандартных условиях от 10 мин до 45 ч. Животных размещают в поле 7 Тл биоспектротомографа BioSpec ВС 70/30 USR (Bruker) и проводят раннее контрастное МРТ сканирование тканей в режимах получения T₁ В {600/15 [время повторения, мс/время эхо, мс], Т₂ В (1950/85) спин эхо, Т₂ В градиент эхо (600/13) и Т*₂ В градиент эхо (550/15)} изображений. Визуализируют в течение до 45 ч темные не контрастные МРТ изображения, (табл. 1).

В 3 группе крысам вводят последовательно комбинацию 10 мл/кг ДФ70 и 0,2 мл/кг MB. При КМРТ сканировании в аналогичных условиях визуализируют МРТИ низкого разрешения. Для сравнения крысам 4 группы вводят магневист® 0,2 мл/кг.

Контрастным МРТ сканированием головного мозга визуализируют МРТИ низкого разрешения, сохраняющие яркость в течение 30 мин.

В 5 группе крысам вводят комбинацию 5% ФНЦФ 28 10 мл/кг и MB 0,2 мл/кг визуализируют КМРТИ яркие, четкие, высокого контраста и разрешения, кроме того, в течение 30 мин визуализируют КМРТИ сосудов, питающих ЦЗП, фигура: 1 (b, с, s, t, u, v, w).

Опухолевые клетки, инфильтрировавшие нормальные ткани, образуют вторичные ЦЗП (ВЦЗП), которые визуализируются на КМРТ изображениях в виде темных или светлых пятен, полос и точек, фигура: 1 (g, h, i, j, k, l). При продолжении КМРТ сканирования более 30 мин, из-за уменьшения числа белых вокселей в результате клиренса MB, визуализируют темные КМРТ изображения.

При КМРТ мониторинге до 45 ч визуализируют патологические изменения в контрастных T₁, Т₂ В 3D КМРТ изображениях ПЦЗП и ВЦЗП с питающими сосудами без дополнительного введения ФНЦФ.

В 6 группе препараты вводят крысам в обратном порядке: MB 0,2 мл/кг, ФНЦФ 28 10 мл/кг. Визуализируют КМРТИ низкого контраста и разрешения (табл. 1).

МРТ изображения ранних форм ЗГ С6 не визуализируются, фигура 1 (а). Однако, через 7-14 дней в местах перевивки ЗГ С6 и ГБ 101/8 визуализируют КМРТИ ПЦЗП и вторичных ЦЗП, опухоли ЗГ С6 и ГБ 101/8, фигура 1 (g) и третичных ЦЗП, фигура 1 (h). В опытных группах 2; 3; 4; 5 и 6 после анестезии за такой же период времени перед ранним, контрастным МРТ сканированием внутривенно вводят препараты, как указано в таблицах 1; 2.

Ранние контрастные магнитно-резонансные томографические изображения ПЦЗП ЗГ

С6 визуализируют через 2-4 дня после перевивки опухоли внутрисосудистым введением заявляемой комбинации заявляемого средства ФНЦФ 28 с гадолиний содержащим контрастером, например магневистом®, фигура 1 (b, с, d, е, f, g, h, i, j, k, l).

Через 60-168 ч после перевивки злокачественной ЗГ С6 или ГБ 101/8 ВВ вводят заявляемое средство. Через 10 мин - 45 ч вводят MB и визуализируют КМРТ изображения мозга крыс с привитой глиомой С6 или глиобластомой 101/8, которые точнее отражают изменения тканей мозга, вызванные малигнизацией и пролиферацией, чем комбинации ДФ70-МВ, фигура 1 (b, с, d, е, f, g, h, i, j, k, l, m, n, p, q, r).

Раннюю КМРТ диагностику развития злокачественных опухолей начинают с визуализации первичных центров злокачественной пролиферации с питающими сосудами и границами инфильтрации через 2-3 дня после перевивки опухоли. При раннем КМРТ сканировании места перевивки визуализируют: центры злокачественной пролиферации с сосудами, питающими опухолевые ткани. Параллельно с ПЦЗП визуализируют диффузную инфильтрацию клеток ЗГ С6 и ГБ 101/8 в пограничные ткани, отек и малигнизацию пограничных тканей и лимфатических узлов, фигуры: 1 (b, с, k, l, m, n, р, q, r, s, t, u, v, w); 3 (a, b); 9 (a, b).

В процессе развития ПЦЗП в пограничных нормальных тканях наблюдают: диффузную инфильтрацию, отек, неоангиогенез, малигнизацию и злокачественную пролиферацию. Изолированные "непроницаемой" мембраной злокачественные клетки продолжают делиться, объем ткани быстро увеличивается с выделением белков, вызывающих малигнизацию пограничных тканей. Это приводит к увеличению интерстициального давления внутри мембраны, запредельному растяжению мембраны, диффузной инфильтрации малигнизации, износу и разрушению мембраны ПЦЗП быстрее, чем иммунная система обновляет ее. В результате этого происходит перфорация мембраны ПЦЗП, инвазия, инфильтрация и метастазирование злокачественных клеток с отеком пограничных тканей, поражением лимфатических узлов, кровеносной системы и других жизненно-важных органов.

Отличительными признаками высококонтрастных МРТ изображений высокого разрешения, по которым определяют стадии процесса развития центров злокачественной пролиферации, наблюдаемых только в присутствии заявляемой комбинации, заявляемого КМРТ средства, ФНЦФ 28 с магневистом® (MB), являются:

- образование мембраны на поверхности ПЦЗП в течение 3-4 дней после перевивки, которую визуализируют по периметру ПЦЗП при КМРТ мониторинге развития центров

злокачественной пролиферации;

- перфорация мембраны неоплазмой с диссеминацией клеток ЗГ С6 и ГБ 101/8 в нормальные ткани через 4-5 дней и проникновением ФНЦФ 28 в ПЦЗП, (содержимое мембраны темное) фигура 1 (f, l, m);

- инвазия, инфильтрация, и метастазирование, которые не сопровождаются проникновением ФНЦФ 28 в ПЦЗП, (содержимое ПЦЗП светлое), 1 (d, е, g, h, j, р, q, r).

При контрастном МРТ мониторинге визуализируют следующие стадии в процессе развития центров злокачественной пролиферации, фигура 1 (b, с, d, е, f, g, h, i, j, k, l).

1) через 2-3 дня после перевивки визуализируют КМРТ изображения первичных центров злокачественной пролиферации с участками мембраны и питающими сосудами (1 стадия развития ЗГ С6), фигура: 1 (b, с);

2) через 3-4 дня после перевивки визуализируют КМРТ изображения многослойной мембраны ПЦЗП, изолирующей ПЦЗП от нормальных тканей (2 стадия развития ЗГ С6) фигура 1 (d);

3) через 4-5 дней после перевивки визуализируют КМРТ изображения однослойной мембраны ПЦЗП, изолирующей ПЦЗП от нормальных тканей, стадия превращения многослойной мембраны в однослойную мембрану ПЦЗП (3 стадия развития ЗГ С6), фигура 1 (e);

4) через 5-6 дней после перевивки визуализируют КМРТ изображения тканей ПЦЗП, увеличившихся в объеме с растяжением и перфорацией мембраны ПЦЗП (4 стадия развития ЗГ С6) фигура 1 (f);

5) через 6-7 дней после перевивки визуализируют КМРТ изображения перфорированной мембраны созревшими тканями, с ФНЦФ, проникшими в ПЦЗП, с инвазией в малигнизированные сосуды (5 стадия развития ЗГ С6), фигура 1 (g);

6) через 7-8 дней после перевивки визуализируют КМРТ изображения развития вторичной опухоли с множеством вторичных центров злокачественной пролиферации (ВЦЗП), с питающими их сосудами, (6 стадия развития ЗГ С6), фигура 1 (h, i, j, k, l).

Определение объема центров злокачественной пролиферации (ЦЗП)

Через 2-4 дня после перевивки ЗГ С6 отбирают 10 крыс, диаметр ПЦЗП которых достигает 2-4 мм. Объем ПЦЗП определяют по результатам анализа КМРТИ, полученным при сканировании тканей на биоспектротомографе (Bruker). Объем вычисляют как произведение полной площади срезов (последовательностей) на сумму толщины срезов и пропущенного расстояния между ними, (за пропущенное расстояние всегда берут 1/2

толщины среза). Вычисления проводят по формуле:

где, V - объем опухоли cm³; ZP сумма площадей срезов; ZT толщина среза и М - пропуск.

В течение 3-7 дней после перевивки, в результате развития в центрах злокачественной пролиферации, неоангиогенеза, отека, малигнизации и инфильтрации пограничных тканей злокачественными клетками, контраст и пространственное разрешение МРТИ изменяются, фигура 1 (b, с, d, е, f, g, h, i, j, k, l). При КМРТ мониторинге развития опухоли через 5-6 дней после перевивки визуализируют перфорацию мембраны ПЦЗП тканями первичного центра злокачественной пролиферации, диссеминацию ОК в нормальные ткани. На фоне белых вторичных ЦЗП визуализируют:

- темные участки мембраны, пронизанной извитыми сосудами, образовавшимися в процессе неоангиогенеза, множественные инвазии злокачественных клеток из ЦЗП в малигнизированные сосуды, из сосудов в нормальные ткани мозга, фигура 1 (g, h);

- множественные слившиеся центры злокачественной пролиферации, которые образуют вторичные бугристые опухоли (светлые пятна), фигура 1 (g, h).

Инвазия в малигнизированные сосуды приводит к возникновению вторичных (ВЦЗП) в левой половине мозга, фигура 1 (h). В результате инфильтрации злокачественных клеток и их белков в пограничные ткани за 5-6 дней происходит их малигнизация и пролиферация с быстрым увеличением объема. Одновременно визуализируют множество ВЦЗП, фигура 1 (g, h, r).

Первичный ЦЗП ЗГ С6, диаметром 5 мм, фигура 1 (b, с, d, е, f), за 4-6 дней трансформируется во вторичную бугристую опухоль, диаметром 32 мм, фигура 1 (g, h, r). Интраваскулярная инвазия злокачественных клеток приводит к развитию вторичных центров злокачественной пролиферации, в левой половине мозга, фигура 1 (g, h). Созревание опухоли сопровождается увеличением ее объема с запредельным растяжением и перфорацией мембраны ПЦЗП. Перфорация мембраны сопровождается инвазией в нормальные ткани с одновременным проникновением ФНЦФ 28 в ПЦЗП, ВЦЗП и ТЦЗП (черные пятна внутри ЦЗП), фигура 1 (f, k, m).

В процессе 14 дневного КМРТ мониторинга развития опухолей визуализируют образование и развитие множества ПЦЗП и ВЦЗП опухоли, которые получают питание от извитых, расширенных под действием VGEF сосудов и капилляров, фигура 1 (b, с, g, h).

Биомеханика ранней КМРТ визуализации сигнала протонов парамагнитных молекул

гидратной воды, поступающего из ПЦЗП, на 2-3 день после перевивки злокачественных опухолей включает:

- быстрое проникновение ФНЦФ 28 в ПЦЗП до капсулирования с обогащением этих тканей ФНЦФ, и с их темным окрашиванием;

- быстрое проникновение ФНЦФ 28 в нормальные ткани и органы РЭС, с увеличением числа черных вокселей в их КМРТ изображениях;

- увеличение контраста между "старыми" и молодыми ПЦЗП и композициями злокачественных клеток с визуализацией контрастных МРТ изображений структуры опухоли высокого разрешения, при раннем КМРТ сканировании места перевивки, фигура 1 (b, с, d);

- очень медленное проникновение ФНЦФ 28 в ткани ПЦЗП, изолированного от организма мембраной ПЦЗП, при КМРТ сканировании места перевивки опухоли

визуализируют контрастные МРТ изображения ПЦЗП в виде белых пятен фигура 1 (d, е);

- быстрое проникновение ФНЦФ 28 в ткани злокачественной опухоли, после перфорации мембраны ПЦЗП, при КМРТ сканировании места перевивки опухоли визуализируют КМРТ изображения темных полос, линий и точек на светлом фоне вторичных и третичных ЦЗП (ТЦЗП), фигура 1 (f, g, h, k, l);

- быстрое увеличение числа ФНЦФ 28 в нормальных тканях приводит к ослаблению КМРТ сигнала протонов парамагнитных молекул гидратной воды этих тканей до гипоинтенсивного, к увеличению числа черных вокселей в КМРТ изображениях нормальных тканей и к темной окраске визуализируемых КМРТ изображений;

- нормальные ткани, содержащие достаточное число ФНЦФ, на КМРТ изображениях имеют черный цвет.

Нативная мембрана ПЦЗП непроницаема для злокачественных клеток и наночастиц, она не пропускает злокачественные клетки в нормальные ткани и ФНЦФ 28 в ПЦЗП. Поэтому КМРТ изображения ПЦЗП опухоли на 4 стадии развития представлены пятнами белого цвета, фигура 1 (е). На 5 стадии развития ПЦЗП происходит перфорация мембраны ПЦЗП. Перфорация происходит изнутри мембраны под действием созревших злокачественных тканей ПЦЗП и сопровождается практически одновременным проникновением злокачественных клеток из ПЦЗП в нормальные ткани, а ФНЦФ 28 с элементами мембраны и пограничных тканей переносятся в ПЦЗП, фигуры: 1 (f) и 3 (а, b).

В начале развития центров злокачественной пролиферации при ВВ введении ФНЦФ 28 увеличивается число черных вокселей в ПЦЗП, окруженных многослойной мембраной

ПЦЗП. Это создает контраст между отдельными частями ПЦЗП, так визуализируют КМРТИ, отражающие структуру ПЦЗП, фигура 1 (b, с, d, е). КМРТ изображения мембраны ПЦЗП содержат множества черных вокселей, визуализирующих множество ВЦЗП, развитие которых ведет к увеличению объема вторичной опухоли на 1-2 порядка, фигура 1 (g, h, k, l).

Для ранней КМРТ визуализации развития ПЦЗП перед КМРТ сканированием места перевивки злокачественной опухоли ВВ вводят ФНЦФ, этим самым, создают контраст между нормальными, темными тканями, и патологическими, светлыми тканями. При ВВ введении ФНЦФ 28 крысам через 4-5 дней после перевивки, когда мембрана уже образовалась, визуализируют КМРТ изображения ПЦЗП в виде белых пятен, окруженных темными кольцами мембраны фиг. 1 (j, k, l). Магневист® при ВВ введении, через 2-14 дней после перевивки опухолей, проникает как в нормальные, так и в патологические ткани. Он усиливает КМРТ сигналы протонов парамагнитных молекул гидратной воды тканей, увеличивает число белых вокселей, которые на КМРТИ первичных центров злокачественной пролиферации дают яркие белые пятна на фоне серой окраски нормальных тканей, фиг. 1 (b, с).

При последовательном ВВ введении ФНЦФ 28 и MB в КМРТ изображениях тканей к черным вокселям, прибавляют белые воксели. Контраст КМРТИ изображений всех тканей организма усиливается. Особенно яркими становятся патологические ткани, изолированные нативной мембраной ПЦЗП, исключающей проникновение ФНЦФ 28 в ПЦЗП. Черные воксели нормальных тканей создают темный фон. Патологические ткани визуализируются в виде белых пятен на темном фоне нормальных тканей. Создавая контраст между темными, нормальными тканями и светлыми - патологическими тканями, визуализируют ранние КМРТИ высокого пространственного разрешения и ПЦЗП с инфильтрацией и инвазией клеток ЗГ С6 в нормальные пограничные ткани мозга, фиг. 1 (k, l). Через 30 мин после однократного введения MB до 80% его выводится из организма крысы, число белых вокселей КМРТ изображения уменьшается и изображение темнеет.

Учитывая быстрый клиренс MB, в процессе КМРТ мониторинга развития ПЦЗП, MB вводят постепенно. Этим создают соответствующие соотношения черных и белых вокселей в КМРТ изображениях тканей млекопитающего, и визуализируют яркие КМРТ изображения высокого пространственного разрешения и контраста в течение всего КМРТ мониторинга развития ЦЗП.

Так визуализируют ранние КМРТ изображения:

- первичных центров злокачественной пролиферации с питающими сосудами;

- многослойной и однослойной мембраны ПЦЗП;

- перфорацию мембраны ПЦЗП клетками ЗГ С6 с их диссеминацией в нормальные ткани и проникновением ФНЦФ 28 в ПЦЗП;

- перфорацию мембраны ПЦЗП с образованием ВЦЗП, фигур 1 (g, h);

- инфильтрацию и инвазию клеток ЗГ С6 через мембрану ПЦЗП в пограничные ткани с контрастной визуализацией границы инфильтрации, фигура 1 (k);

- инфильтрацию и инвазию клеток ЗГ С6 через мембрану ПЦЗП в пограничные ткани, фигура 1 (l).

За 3-6 мин до проведения контрастного магнитно-резонансного томографического сканирования ВВ вводят от 0,1 до 0,2 мл/кг MB, этим усиливают сигналы протонов парамагнитных молекул гидратной воды ПЦЗП до гиперинтенсивного. На месте перевивки ЗГ С6 визуализируют: яркие магнитно-резонансные T₁, Т₂ и Т*₂ В 3D КМРТ изображения центров злокачественной пролиферации с питающими сосудами, на темном фоне нормальных тканей, фигура 1 (b, с, d, е, f, g, h, j, k, l). При ВВ введении ФНЦФ 28 до завершения формирования мембраны ПЦЗП ФНЦФ 28 относительно равномерно распределяются в опухолевых и нормальных тканях и визуализируют ранние КМРТ изображения ПЦЗП с питающими сосудами на темном фоне нормальных тканей, фигура 1 (b, с, d).

При ВВ введении ФНЦФ 28 после завершения формирования однослойной мембраны ПЦЗП, КМРТ сигналы протонов ПЦЗП остаются гиперинтенсивными, а первичные ЦЗП сохраняют белый цвет до перфорации мембраны, фигура 1 (е).

Перфорация мембраны сопровождается проникновением ФНЦФ 28 в ПЦЗП. ФНЦФ 28 ослабляют МРТ сигнал протонов парамагнитных молекул гидратной воды до гипоинтенсивного. Гипоинтенсивные сигналы визуализируются на КМРТ изображениях черными вокселями, которые вместе с белыми вокселями создают контрастные МРТ изображения высокого разрешения, отражающие структуру опухолевых тканей в реальном времени, фигура 1 (b, с, d, е, f, g, h, j, k, l, m, n, p, q, r, s, t, u, v, w).

Сущность контрастирования при визуализации 3D КМРТ изображений заключается в том, что MB, при ВВ введении, распределяется как в нормальных тканях, так и в центрах злокачественной пролиферации, 30-40 мин усиливает МРТ сигналы протонов парамагнитных молекул гидратной воды, которые дают белые воксели. ФНЦФ 28 распределяются лишь в нормальных тканях, ослабляют MP сигналы протонов парамагнитных молекул гидратной воды, которые дают черные воксели. Белые воксели визуализируются как светлые точки,

черные воксели визуализируются как темные точки. Комбинации большого числа светлых и темных точек визуализируются как 3D КМРТ изображения, отражающие развитие ПЦЗП по стадиям.

До контрастирования на МРТ изображениях тканей с быстрым обменом парамагнитных молекул гидратной воды много белых и мало черных вокселей. В результате избирательного распределения черных и белых вокселей, образование которых зависит от локальной величины МРТ сигналов протонов парамагнитных молекул гидратной воды, происходит ранняя визуализация КМРТ изображений ПЦЗП с питающими сосудами, усиливается контраст, разрешение и яркость КМРТИ биологических тканей млекопитающего. В процессе развития ПЦЗП визуализируют: КМРТ изображения патоморфологических изменений, связанных с образованием сосудов, питающих ПЦЗП, многослойной и однослойной мембраны ПЦЗП, расширением границ и увеличением объема ПЦЗП, растяжением и перфорацией мембраны ПЦЗП, инфильтрацией, инвазией, метастазированием ОК с образованием вторичных и третичных ЦЗП в динамике, фигура 1 (g, h, j, k, l).

В предварительных опытах при мониторинге КМРТ изображений наблюдают:

- злокачественную пролиферацию, малигнизацию, включающую отек питающих сосудов и тканей;

- неоангиогенез, заканчивающийся образованием малигнизированных сосудов, увеличение объема ПЦЗП, и перфорацию мембраны капсулы ПЦЗП, переполненной злокачественными клетками, инфильтрацию злокачественных клеток в нормальные ткани, инвазию в сосуды и пограничные нормальные ткани, фигура 1 (g, h, k, l).

При раннем КМРТ выявлении развития центров злокачественной пролиферации у крыс Линии Wistar через 2-3 дня визуализируют КМРТИ первичных центров злокачественной пролиферации с питающими сосудами, которые относят к первой стадии развития ПЦЗП, фигура 1 (b, с).

Через 3-4 дня после перевивки ЗГ С6 в хвостовую вену крыс вводят от 0,5 до 1,0 мл/кг ФНЦФ 28 в виде 2% водного золя за 12-45 ч, a MB от 0,1 до 0,2 мл/кг - за 3-9 мин до проведения контрастной МРТ визуализации с получением магнитно-резонансных T₁, Т₂ и Т*₂ В 3D изображений. Визуализируют КМРТИ развития мембраны ПЦЗП, которые относят ко второй стадии развития ПЦЗП, фигура 1 (d, е) и перфорации мембраны ПЦЗП к 6 стадии, фигура 1 (f, g, h, j, k, l).

На всех КМРТИ, фигура 1 (m, n, p, q, r) представлена граница диффузной

инфильтрации клеток ГБ 101/8 в динамике.

Фигура 1 (m, n, р, q, r). Контрастные магнитно-резонансные томографические изображения (КМРТИ) головного мозга (ГМ) самки крысы Вистар на 7-10 день после интракраниальной, стериотаксической инокуляции клеток недифференцированной глиобластомы 101/8 (КНГБ 101/8) визуализируют:

Фигура 1 (m) на 7 день протонно-плотностное (PD) изображение НГБ 101/8, по периферии которого видна темная полоса мембраны (толстая черная стрелка), первичный ЦЗП КНГБ 101/8 (тонкая белая стрелка), граница диффузной инфильтрации КНГБ 101/8 в "нормальные" ткани мозга (пунктирная стрелка);

Фигура 1 (n) на 8 день - T₁ взвешенное изображение (ВИ) НГБ 101/8, мембрана ПЦЗП (толстая черная стрелка), граница диффузной инфильтрации КНГБ 101/8 в "нормальный" мозг (пунктирная стрелка), пролиферирующие КНГБ 101/8 (тонкая черная стрелка);

Фигура 1 (р) на 9 день - Т₂ ВИ НГБ 101/8, мембрана - темная полоса по периферии первичного ЦЗП (толстая стрелка), перфорированная мембрана ПЦЗП (маленькая стрелка), граница диффузной инфильтрации КНГБ 101/8 в "нормальный" мозг (пунктирная стрелка);

Фигура 1 (q) на 10 день визуализируют темную полосу, проходящую по периферии опухоли НГБ 101/8 (толстая стрелка) и зона инфильтрации КНГБ 101/8 в "нормальный" мозг (пунктирная стрелка), перфорированная мембрана ПЦЗП (маленькая стрелка) и инфильтрация клеток НГБ 101/8 в «нормальную» часть мозга (пунктирная стрелка);

Фигура 1 (r) контрастное магнитно-резонансное томографическое T₁ ВИ (КМРТ) НГБ 101/8 самки крысы Вистар на 14 день после интракраниальной, стереотаксической инокуляции КНГБ 101/8 правой контралатеральной половины ГМ: после введения в хвостовую вену ФНЦФ 28 и магневиста® на светлом фоне первичного ЦЗП НГБ 101/8 (пунктирная стрелка) выявляют полицентрическую опухоль, включающую, 1 первичный, 5 вторичных и 2 третичных ЦЗП с несколькими инвазиями в «нормальные» ткани ГМ (маленькая стрелка).

Фигура 1 (s, t, u, v, w), 3D визуализация сосудов, питающих ПЦЗП и смешанной перивазально-периневральной инвазии ЗКГ С6 в нормальные ткани мозга.

Фигура 1 (s). Контрастные магнитно-резонансные томографические 3D изображения (КМРТИ), контралатеральных половин головного мозга (ГМ) в режиме «Angio» крысы линии Вистар на 12 день после интракраниальной, стереотаксической инокуляции клеток недифференцированной ЗГ С6 (ЗКНГ С6) в правую половину ГМ: правая половина ГМ в районе ПЦЗП (толстая черная пунктирная стрелка); левая половина ГМ (толстая белая

пунктирная стрелка); «нормальные» сосуды, питающие ГМ и опухоль, (толстые, белые длинные стрелки); смешанная перивазально-периневральная инвазия ЗКНГ С6 из ПЦЗП в нормальные ткани мозга (между тонкими, белыми стрелками); перивазальная инвазия ЗКНГ С6 (короткие белые и черные стрелки); пробка, закрывающая имплантационный канал (тонкая черная пунктирная стрелка).

Фигура 1 (t). Режим «Angio». Общий вид КМРТИ кровеносных сосудов, питающих ЦЗП, в правой половине головного мозга (ГМ) крысы линии Вистар на 12 день после интракраниальной, стереотаксической инокуляции клеток недифференцированной глиомы С6 (ЗКНГ С6) в правую половину ГМ: правая половина ГМ (белая пунктирная стрелка); левая половина ГМ (черная пунктирная стрелка); малигнизированные сосуды, питающие ЦЗП, (толстые, длинные белые стрелки); смешанная периневрально-перивазальная инвазия ЗКНГ С6 в нормальные ткани мозга (между тонкими, белыми стрелками); перивазальная инвазия ЗКНГ С6 (короткие белые и черные стрелки). Под действием злокачественных клеток и их белков сосуды и нервные волокна малигнизировались и образовали множественные вторичные центры злокачественной пролиферации (короткие стрелки).

Фигура 1 (u). Режим «Angio». Контрастные МРТ изображения кровеносных сосудов, питающих ЦЗП и нервных стволов правой половины головного мозга (ГМ) крысы линии Вистар на 12 день после интракраниальной, стереотаксической инокуляции клеток недифференцированной глиомы С6 (ЗКНГ С6) в правую половину ГМ; малигнизированные сосуды, питающие ЦЗП, (короткие стрелки); смешанная периневрально-перивазальная инвазия ЗКНГ С6 в нормальные ткани мозга (между длинными белыми стрелками); перивазальная инвазия ЗКНГ С6 в нормальные ткани мозга (короткие стрелки).

Фигура 1 (v). Режим «Angio». Общий вид КМРТИ, питающих кровеносных сосудов, находящихся внутри ВЦЗП, в правой половине головного мозга (ГМ) крысы линии Вистар на 12 день после интракраниальной, стереотаксической инокуляции клеток недифференцированной глиомы С6 (ЗКНГ С6): правая половина ГМ (белая пунктирная стрелка); смешанная периневрально-перивазальная инвазия ЗКНГ С6 с размытыми границами диффузной инфильтрации (между толстыми черные стрелки); перивазальная инвазия ЗКНГ С6 размытыми границами диффузной инфильтрации (короткие стрелки); (между двумя толстыми черными стрелками); ВЦЗП с сильно размытыми границами диффузной инфильтрации (белая пунктирная стрелка).

Фигура 1 (w). Общий вид контрастного МРТ изображения продольного среза головы крысы Вистар через 130-150 ч после перевивки РКМРТИ ПЦЗП: череп (длинная белая

стрелка); нормальный мозг (толстая белая стрелка); граница диффузной инфильтрации клеток глиомы С6 в нормальный мозг (короткая белая стрелка); место правого желудочка занимает покрытый капсулой центр злокачественной пролиферации глиомы С6 (длинная черная стрелка); мембрана капсулы (конец черной стрелки); левый желудочек (короткая черная стрелка), малигнизированные сосуды, питающие ПЦЗП, конец белой стрелки. 4 стадия развития ПЦЗП.

Пример 6. Ранняя КМРТ визуализация первичных центров злокачественной пролиферации (ПЦЗП)

За 12-45 ч до контрастного магнитно-резонансного томографического сканирования места перевивки опухоли, вводят в хвостовую вену животных от 1,0 до 1000 мг/кг ФНЦФ, на мышь весом 20 г, предпочтительно от 0,2 до 1,4 мг.

Раннюю визуализацию КМРТ изображений ЦЗП с границами диффузной инфильтрации реализуют через 2-3 дня после перевивки опухоли ВВ введением заявляемых соединений общей формулы (Fe₃O₄⁺)m⋅(C₆H₇O₇^-)n за 12 мин - 45 ч до КМРТ мониторинга, и ВВ введением магневиста® за 3-9 мин до КМРТ мониторинга, этим создают контраст, сокращают время МРТ релаксации T1, Т2, Т*2 и время ранней КМРТ визуализации T1, Т2, Т*2 взвешенных 3D КМРТ изображений, кроме того, сокращают время необходимое для выявления центров злокачественной пролиферации с границами диффузной инфильтрации с определением стадий их развития в динамике от 72 до 264 ч.

Результаты ранней КМРТ визуализации с определением стадий развития центров злокачественной пролиферации обрабатывают статистически по стандартизованным критериям. За достоверные - принимают результаты с различиями ρ<0,05 [8. О.Ю. Реброва, Статистический анализ медицинских данных, Медиа Сфера, Москва (2002)].

Пример 7

Ранняя МРТ визуализация ПЦЗП с границами инфильтрации ЗК в нормальные ткани

Подготовку к эксперименту и премедикацию животных проводят как в примере 5. Через 48-72 ч после перевивки глиомы С6, 3 самкам крыс Вистар вводят интраперитонеально (ИП) 0,1 г/кг «Zoletil 100», (Virbac). Спящим животным, вводят ВВ 0,2 мл 2% водный золь ФНЦФ. Заявляемое средство, ФНЦФ, применяют в комбинации с магневистом®, для ранней визуализации контрастных МРТ изображений ПЦЗП. Заявляемое средство, в виде 2-5% водного золя вводят от 1,0 до 2,0 мл/кг последовательно с магневистом^® 0,2 мл/кг в хвостовую вену крыс с перевитой ЗГ С6 или ГБ 101/8.

Место введения препарата промывают теплой водой, протирают досуха, животных

содержат при температуре +25-+28°С в стандартных условиях от 10 мин до 45 ч. Животных размещают в поле 7 Тл биоспектротомографа BioSpec ВС 70/30 USR (Bruker) и проводят раннее контрастное МРТ сканирование тканей в режимах получения T₁ В {600/15 [время повторения, мс/время эхо, мс], Т₂ В (1950/85) спин эхо, Т₂ В градиент эхо (600/13) и Т*₂ В градиент эхо (550/15)} изображений.

При КМРТ сканировании визуализируют светлые КМРТ изображения ПЦЗП, покрытого темной многослойной мембраной капсулы, фигура: 1 (b-d). Контрастное МРТ сканирование продолжают 30 мин. Делают перерыв в КМРТ сканировании животного на 3 ч. Животное отдыхает при температуре +25-+28°С в стандартных условиях.

Проводят премедикацию и спящему животному вторично внутривенно вводят от 0,1 до 0,2 мл/кг магневиста®. Животное размещают в поле 7 Тл биоспектротомографа BioSpec ВС 70/30 USR (Bruker) и проводят контрастное МРТ сканирование тканей в режимах получения T₁ В {600/15 [время повторения, мс/время эхо, мс], Т₂ В (1950/85) спин эхо, Т₂ В градиент эхо (600/13) и Т*₂ В градиент эхо (550/15)} изображений, последующим КМРТ сканированием исследуемой области, визуализируют границы диффузной инфильтрации ЗК С6 или ГБ 101/8 в нормальный мозг, фиг. 1 (l, m, n, р, q, r).

Пример 8

Ранняя контрастная МРТ визуализация ПЦЗП с контрастными границами инфильтрации ЗК в нормальные ткани

Подготовку к эксперименту и премедикацию животных проводят как в примере 7. Через 48-72 ч после перевивки глиомы С6, 3 самкам крыс Вистар вводят в хвостовую вену заявляемое средство, в виде 2-5% водного золя от 0,2 до 2,0 мл/кг последовательно с магневистом^® 0,2 мл/кг.

Место введения препарата промывают теплой водой, протирают досуха, животных содержат при температуре +25-+28°С в стандартных условиях от 10 мин до 45 ч. Животных размещают в поле 7 Тл биоспектротомографа BioSpec ВС 70/30 USR (Bruker) и проводят раннее контрастное МРТ сканирование тканей в режимах получения T₁ В {600/15 [время повторения, мс/время эхо, мс], Т₂ В (1950/85) спин эхо, Т₂ В градиент эхо (600/13) и Т*₂ В градиент эхо (550/15)} изображений.

При КМРТ сканировании визуализируют светлые КМРТ изображения ПЦЗП, покрытого темной многослойной мембраной капсулы, фигура: 1 (b-d). Контрастное МРТ сканирование продолжают 30 мин. Делают перерыв в КМРТ сканировании животного на 3-6 ч. Животное отдыхает при температуре +25-+28°С в стандатртных условиях. Спящему

животному за 10-30 мин до КМРТ сканирования исследуемой области вторично внутривенно вводят от 0,1 до 1,0 мл/кг, от 2 до 5% водного золя соединений общей формулы (Fe₃O₄⁺)m⋅(С₆Н₇О₇^-)n. При КМРТ сканировании визуализируют контрастное МРТ изображение границы диффузной инфильтрации ЗК в нормальный мозг, фиг. 1 (k).

Повторное ВВ введение MB вызывает образование светлой полосы по периметру темной мембраны капсулы ПЦЗП, фиг. 1 (l).

Повторное ВВ введение ФНЦФ 28 после MB вызывает образование второй темной полосы по периметру светлой полосы, фиг. 1 (k).

Ширина светлой и темной полосы на КМРТИ инфильтрации ЗК через мембрану капсулы ПЦЗП в нормальный мозг зависит:

- от скорости диффузной инфильтрации ЗК мм/ч и времени, прошедшего после визуализации мембраны капсулы ПЦЗП, за которое ЗК, прошли через мембрану капсулы ПЦЗП и переместились на расстояние, равное сумме ширины светлой и 2й темной полосы инфильтрации, фиг. 1 (k).

Злокачественные клетки, прошедшие через мембрану капсулы ПЦЗП, индуцируют приток макрофагов и образование следующего темного слоя ИКК в многослойной мембране капсулы ПЦЗП.

Способ ранней КМРТ визуализации контрастных границ диффузной инфильтрации после вторичного введения MB и ФНЦФ 28 заключается в том, что вначале ВВ вводят магневист и через 5-10 мин вводят ФНЦФ 28 (отличается обратной последовательностью введения контрастных средств).

Сущность МРТ визуализации контрастных границ диффузной инфильтрации после вторичного введения магневиста и ФНЦФ 28 заключается в образовании следующего темного слоя мембраны капсулы ЦЗП, состоящего из иммунокомпетентных клеток (ИКК), эндоцитировавших ФНЦФ. Этот слой проходит по границам диффузной инфильтрации ЗК и отделяет здоровый мозг от мозга инфильтрированного ЗК.

200 мышей C57Bl/6j, весом 19-21 г, разведения экспериментально-биологической лаборатории "ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина" Минздрава России получают четырьмя партиями по 50 мышей. Каждую партию делят на 6 групп: 1 группа контрольная 12 мышей, 2, 3, 4, 5, и 6 группы по 6 мышей. Предварительные опыты проводят на 32 самках мышей C57Bl/6j.

В хвостовую вену мышей весом ~18 г с эпидермоидной карциномой легких Люис,

аденокарциномой молочной железы Са 755, лимфолейкозом Р388 или меланомой B16F-11 вводят заявляемое средство в виде 2-5% водного золя от 0,1 до 0,2 мл/кг последовательно с магневистом® 0,2 мл/кг. Ферримагнитные наночастицы ЦФ не проникают через нативную мембрану внутрь ПЦЗП, поэтому число черных вокселей на КМРТ изображениях внутри ПЦЗП не увеличивается. Серые воксели не образуются, поэтому яркость первичных центров злокачественной пролиферации не уменьшается. ФНЦФ 28 проникают в нормальные ткани по капиллярам, эндоцитируются клетками РЭС, макрофагами, эндотелиальными и опухолевыми клетками, уменьшают сигнал протонов парамагнитных молекул гидратной воды, создают контраст между нормальными и опухолевыми тканями, визуализируют ранние КМРТ изображения первичных центров злокачественной пролиферации с питающими сосудами.

Неоангиогенез, перфорацию мембраны ПЦЗП, инвазию злокачественных клеток в нормальные ткани и проникновение ФНЦФ 28 в ПЦЗП визуализируют в динамике в процессе КМРТ мониторинга развития и деградации ПЦЗП, фигуры: 2; 3 (а, b); 4 (а, b, с); 5 (а, b, с, d, е, f); 6 (а, b, с, d); 7 (а, b, с, d, е, f, g, h, i, j, k, l); 8 (a, b, c, d); 9 (a, b); 10 (a, b, c, d, e, f, g, h); 11 (a, b, e). Метастазирование: фигура: 11 (с, d); числовые фотографические изображения, фигура: 12 (а, b). Гистограммы мембраны, покрывающей центр злокачественной пролиферации, фигуры: 13 (а, b, с) и 14.

При КМРТ визуализации развития центров злокачественной пролиферации заявляемым способом, применяют комбинацию негативного и позитивного контрастного МРТ средства: ФНЦФ28-МВ. ФНЦФ 28 применяют в качестве - источника черных вокселей, a MB в качестве - источника белых вокселей. Поскольку ФНЦФ 28 могут попадать в ПЦЗП из кровеносных сосудов, только до образования непроницаемой мембраны ПЦЗП, или после перфорации мембраны, a MB диффундируют через все ткани, в том числе, и через нативную мембрану ПЦЗП, скорость их проникновения в ткани центров злокачественной пролиферации на много меньше скорости распределения MB. Из-за этого концентрация ФНЦФ 28 в центрах пролиферции и неоангиогенеза повышается медленнее, чем концентрация MB. С учетом этого избирательно увеличивают гетерогенность злокачественных и нормальных тканей по величине намагниченности, величине сигналов протонов парамагнитных молекул гидратной воды и яркости изображений. Повышая магнитную гетерогенность биологических тканей, увеличивают разность между величинами МРТ сигналов протонов парамагнитных молекул гидратной воды злокачественных и нормальных тканей, усиливают контраст, пространственное разрешение КМРТ изображений

этим способствуют ранней контрастной визуализации развития ПЦЗП. Раннюю контрастную МРТ визуализацию первичных центров злокачественной пролиферации, инфильтрации и метастазирования подтверждают результатами патоморфологических и гистопатологических исследований, фигуры: 12 (а, b); 13 (а, b, с) и 14.

Мышам 1 партии вводят в мышцу правого бедра суспензию 10⁶ жизнеспособных клеток LLC в 0,15 мл питательной среды 199 (рН 7,4). Через 3-4 дня отбирают 42 мыши. Поочередно проводят анестезию животных и раннюю КМРТ визуализацию ПЦЗП и сосудов, питающих ПЦЗП LLC (Lyues lung carcinoma). Порядок введения контрастных МРТ средств мышам, их количества, условия проведения раннего контрастного МРТ сканирования в группах 1, 2, 3, 4, 5, 6 третьей партии аналогичны принятым в 1 партии, таблица 1, фигуры: 2; 3 (а, b); 4 (а, b, с); 5 (а, b, с, d, е, f).

Мышам 2 партии вводят под кожу правой подмышечной области суспензию 10⁶ жизнеспособных клеток аденокарциномы молочной железы Са 755 в 0,15 мл питательной среды 199 (рН 7,4). Через 2 дня отбирают 42 мыши, которых делят на 6 групп, по 7 особей в каждой. Последовательно проводят анестезию и раннюю КМРТ визуализацию ПЦЗП и сосудов, питающих ПЦЗП аденокарциномы молочной железы Са 755.

Порядок введения контрастных МРТ средств мышам, их количества, условия проведения раннего контрастного МРТ сканирования в группах 1, 2, 3, 4, 5, 6 из второй партии аналогичны таковым 1 партии, фигуры: 6 (а, b, с, d); 7 (а, b, с, d, е, f, g, h, i, j, k, l); 8 (a, b, c, d); 12 (a).

Мышам 3 партии вводят под кожу правой подмышечной области суспензию 10⁶ жизнеспособных клеток солидной формы лимфолейкоза Р388 в 0,15 мл среды 199 (рН 7,4). Через 3-4 дня отбирают 42 мыши. Поочередно проводят анестезию и визуализируют ПЦЗП и сосуды, питающие ПЦЗП лимфолейкоза Р388. Порядок введения контрастных МРТ средств мышам, их количества, условия проведения раннего контрастного МРТ сканирования в группах 1, 2, 3, 4, 5, 6 четвертой партии аналогичны принятым в 1 партии, фигура: 9 (а, b).

Мышам 4 партии вводят под кожу правой подмышечной области суспензию 10⁶ жизнеспособных клеток меланомы B16F-11 в 0,15 мл питательной среды 199 (рН 7,4). Через 3-4 дня отбирают 42 мыши. Поочередно проводят анестезию и раннюю визуализацию ПЦЗП и сосудов, питающих ПЦЗП меланомы B16F-11. Порядок введения контрастных МРТ средств мышам C57Bl/6), их количества, условия проведения раннего контрастного МРТ сканирования в группах 1, 2, 3, 4, 5, 6 четвертой партии аналогичны принятым в 1 партии, фигуры: 10 (а, b, с, d, е, f, g, h); 11 (a, b, с, d, е); 12 (b).

Раннюю КМРТ визуализацию изображений развития инфильтрации в динамике на 7-9 день после перевивки меланомы B16F-11 самке мыши C57Bl/6) определяют на КМРТ изображениях, фигура 11 (а, b, с, d, е).

Наблюдают инвазия злокачественных клеток из вторичного ЦЗП меланомы B16F-11. Клетки B16F-11 инфильтрировали весь организм мыши и образовали множество вторичных ЦЗП, которые перестроили всю кровеносную систему организма. Малигнизировали все артерии и вены, которые стали обеспечивать кровью только опухолевые ткани, фигуры: 10 (а, b, с, d, е, f, g, h); 11 (a, b, с, d, е).

Мышей каждой партии, с привитыми злокачественными опухолями, делят на 6 групп: 1, 2, 3, 4, 5 и 6. Первая - контрольная группа 12 мышей, 2, 3, 4, 5 и 6 опытные группы по 6 мышей в каждой.

Предварительные опыты проводят на 2 мышах каждой группы: измеряют интенсивность МРТ сигнала и проводят визуальный анализ изображений. Определяют зависимость визуализации изображений, повторяющихся на определенных стадиях развития центров злокачественной пролиферации в зависимости от локализации и структуры ПЦЗП, при эпидермоидной карциноме легкого Льюис, фигуры: 2; 3 (а, b); 4 (а, b, с); 5 (а, b, с, d, е, f).

Мышам контрольной группы перед магнитно-резонансной томографией в период: от 6 минут до 30 ч, внутривенно вводят от 0,1 до 0,3 мл 0,9% раствора NaCl. Мышам опытных групп за такой же период, перед магнитно-резонансной томографией внутривенно вводят от 0,1 до 0,3 мл 1-2% водного золя ФНЦФ 28 и проводят сканирование на биоспектротомографе (Bruker) в режимах получения Т*₂ В {500/15 [время повторения, мс/время эхо, мс] и Т₂ В (1900/80) спин эхо и Т₂ В градиент эхо (500/15)} изображений. Мониторинг жизнеобеспечения осуществляют с помощью Model 1025 smol Animal Monitoring and Gating System. (Operation Mammal) SA Instruments, Inc, (контроль частоты сердечных сокращений и ритм дыхания).

Зависимость визуализации ранних контрастных магнитно-резонансных томографических изображений от времени, прошедшего после перевивки глиобластомы 101/8, LLC, аденокарциномы молочной железы Са 755, лимфолейкоза Р388, меланомы B16F-11 определяют при последовательном ВВ введении комбинации КМРТ средств: ФНЦФ 28 и MB самкам мышей C57Bl/6j. Четкие ранние КМРТ изображения высокого контраста и разрешения глиобластомы 101/8 визуализируют через 2 дня после перевивки путем введения в хвостовую вену мышей комбинации: ФНЦФ 28 2,0 мл/кг, MB 0,2 мл/кг, фигура 1 (n, р, q, r). Яркие, четкие ранние контрастные МРТ изображения высокого контраста и разрешения LLC,

аденокарциномы молочной железы Са 755, лимфолейкоза Р388 и меланомы B16F-1 визуализируют через 3-4 дня после перевивки путем последовательного введения в хвостовую вену мышей комбинации: ФНЦФ 28 и MB. Введение ФНЦФ 28 и MB порознь, или вместе, без учета времени введения, повторное введение избытка ФНЦФ 28 через 30-50 мин после первичного введения ФНЦФ 28 приводит к проникновению части ФНЦФ 28 в капсулу и увеличению толщины КМРТ изображения мембраны капсулы ПЦЗП, фигура 1 (m), (табл. 1).

При раннем выявлении ПЦЗП определяют участки пролиферации, мембраны и питающие их малигнизированные сосуды, фигуры: 1 (b, с); 2; 3 (а, b); 7 (е, f, k, l).

Вторичные ЦЗП (ВЦЗП) определяют через 6-14 дней после перевивки злокачественных опухолей, фигуры: 1 (g, h); 3 (a, b); 4 (b, с); 5 (a, b, с, d, f); 7 (е, f, i, j, k, l); 8 (a, b, c, d); 9 (a, b); 10 (a, b, c, d, e, f, g, h); 11 (a, b, c, d, e); 12 (a, b).

Ha 3-8 день после перевивки опухолей мышам в хвостовую вену вводят 20 мл/кг 2% водного золя ФНЦФ 28 за 12-45 ч, a MB от 0,1 до 0,2 мл/кг - за 3-9 минут до проведения контрастной МРТ визуализации с получением магнитно-резонансных T₁, Т₂ и Т*₂ В 3D изображений.

Для получения ранних контрастных МРТИ высокого разрешения и уменьшения риска инфильтрации злокачественных клеток в нормальные ткани КМРТ мониторинг проводят через 48-72 ч после перевивки ЗГ С6 или глиобластомы 101/8 крысам, a LLC, аденокарциномы Са 755, лимфолейкоза Р388 и меланомы B16F-11 мышам. Заявляемый способ осуществляют на второй стадии образования первичных центров злокачественной пролиферации диаметром 2-4 мм. Отсутствие инвазий, инфильтрации злокачественных клеток и вторичных злокачественных опухолей подтверждают контрастными МРТ изображениями, фигуры: 1 (b, с, d, е); 2; 7 (а, b, с, g, h).

За период от начала раннего контрастного МРТ сканирования (от 10 мин до 30 ч) в хвостовую вену крыс и мышей вводят от 0,1 мл до 0,2 мл от 2 до 5% водного золя ФНЦФ.

Визуализируют КМРТИ ПЦЗП с питающими сосудами и границами инфильтрации фигуры: 1 (b, с, d, е, f, g, h, i, j, k, l, m, n, p, q, r, s, t, u, v, w); 2; 3 (a, b); 4 (a, b, c); 5 (a, b, c, d, e, f); 6 (a, b, c, d); 7 (d, e, f, g, k, l); 8 (a, b, c, d); 9 (a, b); 10 (a, b, c, d, e, f, g, h); 11 (a, b, c, d, e). Внутривенное введение от 0,1 до 0,2 мл/кг MB за 3-9 мин перед КМРТ сканированием усиливает яркость ранних контрастных МРТ изображений, (табл. 1). Раннее КМРТ сканирование проводят с получением T₁ В изображений 600/15 (время повторения/время эха, GRE), Т₂ В 950/80 спиновое эхо, Т₂ В градиентное эхо (GRE) 500/15 и Т*₂ В 500/15

КМРТ изображений, (таблица 1).

Мышей 1 партии, с привитыми злокачественными опухолями, делят на 6 групп: 1, 2, 3, 4, 5 и 6. Первая - контрольная группа 12 мышей, 2, 3, 4, 5 и 6 опытные группы по 6 мышей в каждой. Предварительные опыты проводят на 2 мышах каждой группы: измеряют интенсивность МРТ сигнала и проводят визуальный анализ изображений, определяют локализацию и структуру ПЦЗП с питающими сосудами.

Мышам контрольной группы перед магнитно-резонансной томографией в период времени: от 1 до 30 ч внутривенно вводят от 0,1 до 0,2 мл 0,9% раствора NaCl. Мышам опытных групп за такой же период времени перед магнитно-резонансной томографией внутривенно вводят от 0,1 до 0,2 мл 2% водного золя ФНЦФ 28 и проводят сканирование на биоспектротомографе (Bruker) в режимах получения Т*₂ В {500/15 [время повторения, мс/время эхо, мс], Т₂ В (1900/80) спиновое эхо и T₂ В градиентное эхо (500/15)} изображений. Мониторинг жизнеобеспечения осуществляют с контролем частоты сердечных сокращений и ритма дыхания.

Зависимость визуализации ранних контрастных МРТ изображений от времени, прошедшего после перевивки LLC, аденокарциномы молочной железы Са 755, лимфолейкоза Р388 или меланомы B16F-11 мышей определяют при последовательном ВВ введении комбинации КМРТ средств, ФНЦФ 28 и MB. Ранние контрастные МРТ изображения высокого разрешения ПЦЗП визуализируют через 3-4 дня после перевивки путем введения в хвостовую вену мышей комбинации: ФНЦФ 28 2 мл/кг и MB 0,2 мл/кг. Изменение последовательности ВВ введения комбинатов КМРТП животным дает нечеткие КМРТИ низкого разрешения (табл. 1).

Для получения ранних контрастных МРТИ высокого разрешения и уменьшения риска инфильтрации злокачественных клеток в нормальные ткани, заявляемый способ осуществляют через 2 дня после перевивки карциномы легкого Льюис, аденокарциномы Са 755 или (на стадии развития небольших центров злокачественной пролиферации, диаметром от 3 до 5 мм). Отсутствие вторичных ЦЗП подтверждают ранним контрастным МРТ сканированием места перевивки, фигуры: 2; 7 (a, b, g, h). За период от начала раннего контрастного МРТ сканирования (от 12 до 45 ч) внутривенно вводят мышам от 0,1 до 0,2 мл 2% водного золя ФНЦФ. Визуализируют КМРТИ структуры ЦЗП с сосудами, питающими их. Внутривенное введение от 0,1 до 0,2 мл/кг магневиста® за 3-9 мин до раннего контрастного МРТ сканирования усиливает яркость ранних контрастных МРТ изображений. Раннее контрастное МРТ сканирование проводят с получением T₁ В 500/15 (время повторения/

время эха, GRE), Т₂ В 1,900/80 спиновое эхо, Т₂ В градиентное эхо (GRE) 500/15 и Т*2 В 500/15 КМРТ изображений, (табл. 1).

Контрастные МРТ изображения ПЦЗП диаметром от 3 до 5 мм, с капиллярами, питающими центр злокачественной пролиферации. Черные пятна и темные полосы, покрывающие ПЦЗП, образованы клетками, содержащими ФНЦФ, которые понижают сигнал протонов до гипоинтенсивного уровня, одновременно увеличивают в КМРТИ число черных вокселей до уровня визуализации через 2-3 дня после перевивки, фигуры: 2; 3 (а, b).

Через 6-7 дней, в тех же условиях, визуализируют КМРТИ образования вторичных ЦЗП, фигуры: 1 (g, h, r); 4 (b, с); 5 (а, b, с, d, е, f); 7 (е, f, i, j, k, l); 8 (a, b, c, d); 9 (a, b); 10 (b, c, d, e, f, g, h); 11 (a, b, c, d, e); и третичного ЦЗП, фигура 1 (h).

Через 3-4 дня контрастным МРТ сканированием места перевивки LLC выявляют КМРТИ первичного центра злокачественной пролиферации диаметром до 4,0 мм, с питающим сосудом. Светлые пятна и полосы на КМРТИ образованы пролиферирующими клетками, содержащими MB. Эти клетки дают гиперинтенсивные КМРТ сигналы протонов и белые воксели на КМРТИ, фигуры: 2; 3 (а, b); 4 (а, b, с); 5 (а, b, с, d, е, f). Малигнизированные сосуды, снабжающие центры злокачественной пролиферации и метастазы, расширены под действием факторов, стимулирующих ангиогенез, фигуры: 3 (а, b); 4 (а, b, с); 5 (а, b, с, d, е, f); 10 (а, b, с, d, е, f, g).

Мышам 1 партии вводят в мышцу правого бедра суспензию 10⁶ жизнеспособных клеток эпидермоидной карциномы легких Льюис (LLC) в 0,15 мл питательной среды 199 (рН 7,4). Через 3-4 дня отбирают 42 мыши, которым после проведения анестезии, в хвостовую вену вводят 0,2 мл 2% водного золя ФНЦФ. Место введения препарата промывают теплой водой, протирают досуха, животных содержат при температуре +25-+28°С в стандартных условиях от 10 мин до 30 ч, внутривенно вводят 0,2 мл магневиста®, через 6 минут животных размещают в поле 7 Тл биоспектротомографа BioSpec ВС 70/30 USR (Bruker) и проводят КМРТ сканирование места введения клеток LLC в режимах получения T₁ В {550/15 [время повторения, мс/время эхо, мс], Т₂ В (1970/85) спин-эхо, Т₂ В градиент-эхо (600/25) и Т*2 В градиент-эхо (560/17)} изображений. Измеряют интенсивность МРТ сигнала протонов и проводят визуальный анализ структуры опухоли и сосудов. На КМРТИ выявляют раннее злокачественное новообразование LLC в виде узелка диаметром от 2 до 4 мм. На 6-14 день развития новообразования в результате отека и малигнизации пограничных тканей происходит интенсивная пролиферация, неоангиогенез и инфильтрация клеток LLC в нормальные ткани. Инфильтрировавшие в нормальные ткани злокачественные клетки

пролиферируют, вызывают интраперивазальную инвазию, разрушают и метаболизируют нормальные клетки. В результате этого регионарный процесс деструкции нормальных тканей испытанными злокачественными клетками становится распространенным и необратимым процессом, фигуры: 1 (g, h); 3 (a, b); 4 (a, b, с); 5 (а, b, с, d, е, f).

Мышам 2 партии вводят под кожу второго правого соска суспензию 106 жизнеспособных клеток аденокарциномы молочной железы Са 755 в 0,15 мл питательной среды 199 (рН 7,4). Через 3-4 дня отбирают 42 мыши. Подготовку и проведение КМРТ сканирования тела мыши проводят аналогично примеру 2. Для увеличения контраста и пространственного разрешения МРТ изображений после анестезии мышам вводят в хвостовую вену 0,2 мл 2% золя ФНЦФ. Через 1 ч после введения ФНЦФ, за 3-9 мин до начала РКМРТ сканирования ВВ вводят 0,2 мл/кг MB и проводят раннее КМРТ сканирование места введения злокачественных клеток. Визуализируют изображения: первичных центров злокачественной пролиферации с мембраной и питающими сосудами. На 3-4 день после перевивки Са 755, для увеличения контраста и пространственного разрешения МРТИ вводят в хвостовую вену мышей 0,2 мл 2% золя ФНЦФ. Через 1 ч после введения золя ФНЦФ, за 3-9 мин до начала РКМРТ сканирования вводят 0,2 мл/кг магневист®, проводят КМРТ мониторинг развития аденокарциномы молочной железы Са 755, при ранней визуализации получают Т₂ и Т*₂ В 3D изображения, фигуры: 6 (а, b, с, d); 7 (а, b, с, d, е, f, g, h, i, j, k, l); 8 (a, b, c, d). Патоморфологическим подтверждением полученных результатов является фигура 12 (а).

Мышам 3 партии вводят под кожу правой подмышечной области суспензию 10⁶ жизнеспособных клеток солидной формы лимфолейкоза Р388 в 0,15 мл питательной среды 199 (рН 7,4). Через 2 дня отбирают 42 мыши. Последовательно мышам проводят анестезию, введение КМРТ препаратов и раннее КМРТ сканирование. С помощью КМРТ мониторинга развития ПЦЗП выявляют инфильтрацию лимфолейкоза Р388 в лимфатическую систему с малигнизацией лимфатических узлов и внутренних органов, фиг. 9 (а, b).

За 3 ч до КМРТ сканирования в хвостовую вену мышей 5 группы вводят 0,2 мл 2% водного золя ФНЦФ, и за 3-9 мин до сканирования внутривенно вводят 0,2 мл/кг магневиста®, визуализируют Т₂ и Т*₂ В 3D изображения. Структуру центров злокачественной пролиферации и стадии их развития определяют путем последовательного ВВ введения заявляемого средства в заявляемой комбинации с магневистом®, избирательно увеличивающих число черных и белых вокселей в КМРТ изображениях нормальных и патологических тканей, усиливают контраст, разрешение и яркость 3D КМРТ изображений, и

визуализируют ПЦЗП с питающими сосудами. За 3-9 мин до магнитно-резонансного МРТ сканирования в хвостовую вену мышей 6 группы внутривенно вводят 0,2 мл/кг магневиста® и за 3-9 мин до сканирования вводят 0,2 мл 5% водного золя ФНЦФ 28 (диаметр наночастиц 9-130 нм) с последующим проведением Т₂ и Т*₂ В 3D сканирований. При КМРТ отмечают не четкие изображения, низкого контраста и разрешения стабилизацию яркости изображений, таблица 1.

Инфильтрация клеток лимфолейкоза Р388 происходит в условиях пролиферации с увеличением концентрации VEGFs и сопровождается ускоренным развитием первичных центров злокачественной пролиферации: отеком сосудов, питающих пограничные ткани, малигнизацией тканей, неоангиогенезом и инфильтрацией. Это вызывает приток воды к тканям и сопровождается гиперинтенсивным сигналом протонов. Введение ФНЦФ 28 и магневиста® вызывает увеличение яркости, разрешения и контраста МРТИ, фигура 9 (а, b).

Мышам 4 партии вводят под кожу правой подмышечной области суспензию 10⁶ жизнеспособных клеток меланомы B16F-11 в 0,15 мл питательной среды 199 (рН 7,4). Через 3-4 дня отбирают 42 мыши. Поочередно мышам проводят анестезию и раннее КМРТ сканирование. С помощью КМРТ мониторинга развития ПЦЗП выявляют инфильтрацию меланомы B16F-11 в нормальные ткани.

За 6 мин до КМРТ сканирования в хвостовую вену мышей 4 группы внутривенно вводят 0,2 мл/кг магневиста®, визуализируют нечеткие, неконтрастные, но яркие Т₂ и Т*₂ В 3D изображения.

За 10 мин до магнитно-резонансного МРТ сканирования в хвостовую вену мышей 5 группы вводят 0,2 мл 5% водного золя ФНЦФ 28 (диаметр наночастиц 9-130 нм) и за 3-9 мин до сканирования внутривенно вводят 0,2 мл/кг магневиста® с последующим проведением Т₂ и Т*₂ В 3D сканирований. На КМРТИ отмечают стабилизацию яркости изображений, а при визуальном анализе структуры опухолей и внутренних органов, выявляют ПЦЗП меланомы B16F-11 с питающими сосудами.

Инфильтрация клеток меланомы B16F-11 происходит в условиях пролиферации с увеличением концентрации VEGFs и сопровождается ускорением развития первичных центров злокачественной пролиферации, отеком сосудов, питающих пограничные ткани, малигнизацией тканей. Малигнизация сопровождается притоком воды к тканям, которая вызывает гиперинтенсивный сигнал протонов. Введение ФНЦФ 28 и магневиста® вызывает увеличение яркости, разрешения и контраста МРТИ, фигуры: 10 (а, b, с, d, е, f, g, h); 11 (a, b, с, d, е).

Усиление МРТ изображений внутрисосудистым введением заявляемой комбинации заявляемого соединения общей формулы (3) и магневиста® при магнитно-резонансном сканировании, включает:

- повышение контраста, разрешения и яркости при условии соблюдения подобранных количественных соотношений вводимых контрастных средств, очередности и интервалов времени их введения, поскольку возможно понижение МРТ сигнала протонов и гашение яркости, размывание контраста и уменьшение разрешения, которые приводят к нечетким малоинформативным МРТ изображениям.

Для получения высокоинформативных КМРТ изображений подбирают последовательность введения и количественные соотношения соединения общей формулы (3) и магневиста®.

После образования мембраны ПЦЗП при внутрисосудистом введении водных золей соединений общей формулы (3) проникновение наночастиц в центр злокачественной пролиферации затруднено. Из-за отсутствия действующих сосудов, соединяющих содержимое ПЦЗП, высокой плотности ЗК, повышенного интерстициального давления в ПЦЗП ФНЦФ 28 концентрируются в слое мембраны капсулы ПЦЗП, состоящем из макрофагов, лимфоцитов и лейкоцитов. Концентрация соединений общей формулы (3) в ПЦЗП и в метастазах повышается медленнее, чем в мебране капсулы и в нормальных тканях. Из-за этого увеличивается: магнитная гетерогенность и разность между величинами сигналов протонов ПЦЗП, мембраны и нормальных тканей, усиливающая контраст и разрешение КМРТ изображений.

Усиление контраста и пространственного разрешения МРТ изображений биологических тканей ВВ введением соединений общей формулы (3) позволяет наблюдать анатомические изменения органов и тканей, малигнизацию сосудов, питающих ПЦЗП, фигуры: 2; 3 (а, b); 4 (а, b, с); 5 (а, b, с, d, е, f); 6 (а, b, с, d); 7 (а, b, с, d, е, f, g, h, i, j, k, l); 8 (a, b, c, d); 9 (a, b); 10 (a, b, c, d, e, f, g, h); 11 (a, b, c, d, e). Полученные контрастные MPT изображения подтверждают результатами патоморфологических и гистопатологических исследований, фигуры: 12 (а, b); 13 (а, b, с) и 14.

Для подтверждения малигнизации тканей и сосудов, питающих ПЦЗП, сравнивают данные патоморфологических и гистопатологических исследований, с их контрастными магнитно-резонансными томографическими изображениями, фигуры: 12 (а, b), 13 (а, b, с) и 14. Кроме того, кусочки сосудов, взятые из ПЦЗП и имплантированные в подмышечные ткани сингенных мышей, вызывают развитие первичных центров злокачественной

пролиферации с питающими сосудами, отек, малигнизацию тканей, образование ВЦЗП.

При ВВ введении ФНЦФ 28 происходит уменьшение времени релаксации Т₂, и Т*₂, избирательное увеличение числа черных вокселей в КМРТ изображениях нормальных тканей и ранняя КМРТ визуализация изображений, связанная с избирательным усилением контраста тканей. Последующее ВВ введение магневиста® приводит к уменьшению времени релаксации T₁ и избирательному увеличению числа белых вокселей в КМРТ изображениях патогенных тканей. Это вызывает визуализацию КМРТ изображений, усиление контраста, разрешения и яркости тканей.

При ВВ введении комбинации позитивных и негативных КМРТ средств избирательно увеличивается число белых вокселей в КМРТ изображениях центров злокачественной пролиферации с питающими сосудами и черных вокселей в КМРТ изображениях нормальных тканей. Благодаря этому происходит КМРТ визуализация с избирательным усилением контраста, разрешения и яркости изображений центров злокачественной пролиферации с питающими сосудами, и нормальных тканей.

Намагниченные наночастицы соединений общей формулы (3) удерживают в своем окружении парамагнитные молекулы воды, этим ослабляют МРТ сигнал протонов и сокращают время релаксации Т₂, увеличивают число черных вокселей в КМРТ изображениях нормальных тканей, контраст, и разрешение. Анионы магневиста® повышают сигнал протонов и сокращают время релаксации T₁, результатом этого является увеличение числа белых вокселей в КМРТ изображениях ПЦЗП и увеличение их яркости. Комбинация большого числа вокселей приводят к визуализации КМРТ изображений морфологических изменений в местах перевивки на стадии развития первичных центров злокачественной пролиферации клеток, образования границ инвазии, диффузной инфильтрации злокачественных клеток, сосудов, питающих ПЦЗП, формирования мембраны. Перфорации и фрагментации мембраны, фигура: 1 (b, с, d, е, f, g, h, j, k, l, m, n, p, q, r, s, t, u, v, w).

Одновременно с ЦЗП визуализируют малигнизированные сосуды, питающие их, фигуры: 1 (b, с, g, h, s, t, u, v, w); 2; 3 (a, b); 4 (a, b, c); 5 (a, b, c, d, e, f); 6 (a, b, c, d); 7 (e, f, k, l); 8 (a, b, c, d); 9 (a, b); 10 (a, b, c, d, e, f, g, h); 11 (a, b, c, d, e);

- границы диффузной инфильтрации злокачественных клеток в нормальный мозг, фигура (k, l, m, n, р, q, r, v, w).

Подтвержденные патоморфологическими и гистопатологическими методами КМРТ изображения мест перевивки используют для ранней диагностики солидных опухолей, определения границ диффузной инфильтрации злокачественных клеток, стадий развития и

коррекции планов терапии центров злокачественной пролиферации, фигуры: 12 (а, b); 13 (а, b, с) и 14.

Для одновременного достижения требуемых: контраста, разрешения и яркости изображений за 12-45 ч до магнитно-резонансного сканирования вводят заявляемые соединения общей формулы (3), и за 3-9 мин до магнитно-резонансного сканирования центров злокачественной пролиферации вводят магневист®.

Для проведения эффективной регионарной внутриартериальной таргетной химиотерапии и термо-химиотерапии с полным излечением необходима ранняя КМРТ визуализация ПЦЗП с питающими сосудами, границами диффузной инфильтрации и определение стадии развития ПЦЗП. Благоприятный исход терапии достигается хирургическим путем до инфильтрации, инвазии, и метастазирования на 2-3 стадии развития ПЦЗП. При хирургическом удалении первичного центра злокачественной пролиферации ориентируются по контрастным границам диффузной инфильтрации, фигура 1 (k).

Группа изобретений относится к экспериментальной медицине, лучевой диагностике и фармакологии и может быть использована в качестве средства и способа раннего контрастного магнитно-резонансного томографического (КМРТ) выявления центров злокачественной пролиферации (ЦЗП) и определение стадий их развития in vivo в динамике, а также способа КМРТ выявления ЦЗП с питающими сосудами и расширяющейся границей диффузной инфильтрации злокачественных клеток (ЗК) в нормальные ткани в эксперименте. Средство включает водный золь ферримагнитных наночастиц цитратферрита общей формулы (Fe₃O₄⁺)_m⋅(C₆H₇O₇^-)_n. Первый способ включает синтез ферримагнитных нанокристаллов нестехиометрического магнетита, травление полученных ферримагнитных нанокристаллов 36% хлористоводородной кислотой с получением водного золя нанокристаллов общей формулы от (1,05Fe²⁺O⋅1,85Fe³⁺₂O₃⋅0,1Fe³⁺OCl)_m до (1,15Fe²⁺O⋅1,75Fe³⁺₂O₃⋅0,1Fe³⁺OCl)_m и покрытие полученных нанокристаллов в водном золе цитратанионами. Второй способ включает внутривенное введение лабораторным животным водного золя соединений общей формулы (Fe₃O₄⁺)m⋅(С₆Н₇О₇^-)n за 10 мин - 75 ч до КМРТ сканирования исследуемой области и первичное внутривенное введение магневиста® за 3-9 мин до КМРТ сканирования; проведение КМРТ сканирования тканей в режимах получения T₁ В, Т₂ В спин эхо, Т₂ В градиент эхо и Т*₂ В градиент эхо; повторное внутривенное введение магневиста® за 3-5 мин до КМРТ сканирование исследуемой области с визуализацией границ диффузной инфильтрации ЗК в нормальные ткани и вторичное внутривенное введение водного золя соединений общей формулы (Fe₃O₄⁺)m⋅(C₆H₇O₇^-)n за 5-10 мин до КМРТ сканирования исследуемой области с последующей визуализацией контрастного изображения границы диффузной инфильтрации ЗК в нормальные ткани; проведение КМРТ сканирования тканей в режимах получения T₁ В, Т₂ В спин эхо, Т₂ В градиент эхо и Т*₂ В градиент эхо; выявление ЦЗП с питающими сосудами и границ диффузной инфильтрации ЗК в нормальные ткани по изменениям интенсивностей вокселей в исследуемой области. Группа изобретений обеспечивает подбор комбинации негативного и позитивного контрастного средства и оптимальных параметров КМРТ сканирования тела животного для выявления ЦЗП, раннее КМРТ выявление ЦЗП и определение стадий развития ЦЗП в динамике в эксперименте на иммунокомпетентных животных с перевиваемыми злокачественными опухолями за счет синтеза заявленного средства, вводимого в разные сроки до КМРТ сканирования. 3 н. и 6 з.п. ф-лы, 14 ил., 2 табл., 8 пр.

1. Средство для раннего контрастного магнитно-резонансного томографического выявления центров злокачественной пролиферации и определение стадий их развития in vivo в динамике, включающее водный золь ферримагнитных наночастиц цитратферрита общей формулы (Fe₃O₄⁺)_m⋅(C₆H₇O₇^-)_n, где:

- нанокристаллы Fe₃O₄ содержат от (1,01Fe²⁺O⋅1,99Fe³⁺₂O₃) до (1,30Fe²⁺O⋅1,70Fe³⁺₂O₃), при этом m - количественное содержание нанокристаллов формулы Fe₃O₄ в составе ферримагнитных наночастиц цитратферрита составляет от 14 масс. % до 29 масс. %, а n - количественное содержание цитратанионов формулы (С₆Н₇О₇^-) от 86 масс. % до 71 масс. %;

- цитратанионы (С₆Н₇О₇^-)_n связаны с поверхностью нанокристаллов (Fe₃O₄⁺)_m химически и содержатся в поверхностном слое ферримагнитных наночастиц, (Fe₃O₄⁺)m⋅(C₆H₇O₇^-)n;

- количество наночастиц (Fe₃O₄⁺)m⋅(C₆H₇O₇^-)n в водном золе составляет от 0,01 до 50 масс. %;

- гидродинамический диаметр наночастиц (Fe₃O₄⁺)m⋅(C₆H₇O₇^-)n составляет от 9 до 130 нм;

- намагниченность насыщения наночастиц (M_s) составляет от 8,3 кА/м до 8,9 кА/м;

- рН водного золя от 6,6 до 6,9;

- ζ потенциал водного золя -31±5 мВ;

- релаксивность водного золя 4550±25 мл⋅мг^-1с^-.

2. Средство по п. 1, характеризующееся тем, что m - количественное содержание (Fe₃O₄)⁺ в составе ферримагнитных наночастиц цитратферрита составляет от 16 масс. % до 27 масс. %, n (С₆Н₇О₇)^- - от 84 масс. % до 73 масс. %.

3. Способ получения средства по п. 1, включающий:

- синтез ферримагнитных нанокристаллов нестехиометрического магнетита, содержащего Fe²⁺O и Fe³⁺₂O₃ в соотношении от 1,01/1,99 до 1,30/1,70, характеризующегося структурой шпинели, кубической формой, общей формулы Fe₃O₄;

- травление полученных ферримагнитных нанокристаллов 36% хлористоводородной кислотой от 2 до 10 ч с получением водного золя нанокристаллов общей формулы от (1,05Fe²⁺O⋅1,85Fe³⁺₂O₃⋅0,1Fe³⁺OCl)_m до (1,15Fe²⁺O⋅1,75Fe³⁺₂O₃⋅0,1Fe³⁺OCl)_m,

при этом количественное содержание в водном золе нанокристаллов соединения формулы (1,05Fe²⁺O⋅1,85Fe³⁺₂O₃⋅0,1Fe³⁺OCl) составляет от 10 масс. % до 40 масс. %, характеризующихся структурой шпинели, округлой формой, диаметром от 5 до 11 нм, и наличием на поверхности анионов Cl^-;

- покрытие полученных нанокристаллов в водном золе цитратанионами посредством замещения анионов Cl^- на цитратанионы, при этом реакцию замещения ведут при +80-+90°С и перемешивании от 300 до 1500 об/мин, при рН от 3,5 до 6,9 до образования водного золя соединений общей формулы (Fe₃O₄⁺)m⋅(C₆H₇O₇^-)n.

4. Способ по п. 3, характеризующийся тем, что ферримагнитные нанокристаллы цитратферрита содержат на поверхности цитрат анионы (С₆Н₇О₇)^-_n.

5. Способ по п. 3, характеризующийся тем, что реакцию замещения анионов Cl^- на цитратанионы ведут при перемешивании от 500 до 1000 об/мин.

6. Способ контрастного магнитно-резонансного томографического выявления центров злокачественной пролиферации с питающими сосудами и расширяющейся границей диффузной инфильтрации злокачественных клеток в нормальные ткани в эксперименте, включающий:

- внутривенное введение лабораторным животным от 0,1 до 10 мл/кг, предпочтительно от 0,2 до 5,0 мл/кг, от 2% до 5% водного золя соединений общей формулы (Fe₃O₄⁺)m⋅(С₆Н₇О₇^-)n за 10 мин - 75 ч до КМРТ сканирования исследуемой области и первичное внутривенное введение от 0,1 до 2,0 мл/кг магневиста® за 3-9 мин до КМРТ сканирования, которые вызывают раннюю КМРТ визуализацию развития центров злокачественной пролиферации с питающими сосудами, расширяющейся границей диффузной инфильтрации злокачественных клеток в нормальные ткани в течение 75 ч с перерывами;

- проведение КМРТ сканирования тканей в режимах получения T₁ В {600/15 [время повторения, мс/время эхо, мс], Т₂ В (1950/85) спин эхо, Т₂ В градиент эхо (600/13) и Т*₂ В градиент эхо (550/15)};

- повторное внутривенное введение от 0,1 до 0,2 мл/кг магневиста® за 3-5 мин до КМРТ сканирование исследуемой области, с визуализацией границ диффузной инфильтрации ЗК в нормальные ткани и вторичное внутривенное введение от 0,1 до 1,0 мл/кг, от 2% до 5% водного золя соединений общей формулы (Fe₃O₄⁺)m⋅(C₆H₇O₇^-)n за 5-10 мин до КМРТ сканирования исследуемой области с последующей визуализацией контрастного изображения границы диффузной инфильтрации ЗК в нормальные ткани;

- проведение КМРТ сканирования тканей в режимах получения T₁ В {600/15 [время повторения, мс/время эхо, мс], Т₂ В (1950/85) спин эхо, Т₂ В градиент эхо (600/13) и Т*₂ В градиент эхо (550/15)};

- выявление центров злокачественной пролиферации с питающими сосудами и границ диффузной инфильтрации злокачественных клеток в нормальные ткани по изменениям интенсивностей вокселей в исследуемой области.

7. Способ по п. 6, характеризующийся тем, что первичное внутривенное введение лабораторным животным водного золя соединений общей формулы (Fe₃O₄⁺)m⋅(С₆Н₇О₇^-)n проводят из расчета 0,2-5,0 мл/кг.

8. Способ по п. 6, характеризующийся тем, что первичное внутривенное введение лабораторным животным водного золя соединений общей формулы (Fe₃O₄⁺)m⋅(С₆Н₇О₇^-)n проводят за 50 мин 12 ч до КМРТ сканирования исследуемой области.

9. Способ по п. 6, характеризующийся тем, что первичное внутривенное введение лабораторным животным магневиста® проводят из расчета 0,2-1,5 мл/кг.