Способ определения активности патологического процесса у больных рассеянным склерозом Российский патент 2019 года по МПК G01N33/49 

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике рассеянного склероза, и может быть использовано в отделениях неврологии и иммунологии.

Рассеянный склероз (PC) представляет собой хронической демиелинизирующее заболевание центральной нервной системы с ремиттирующим течением (фаза обострений сменяется фазой ремиссии) и неясным патогенезом, в основе которого лежит аутоиммунный механизм разрушения миелиновой оболочки нервных волокон.

В настоящее время, по разным оценкам, в мире насчитывается около 3 млн. больных PC. В последние годы показатели распространенности и заболеваемости PC во всем мире имеют тенденцию к росту. Российская Федерация относится к зоне среднего риска распространенности PC (частота встречаемости от 10 до 50 случаев на 100000 населения).

Современный рост заболеваемости PC связан не только с реальным увеличением количества случаев PC, но и с улучшением качества диагностики патологического процесса, привлечением инновационных технологий для своевременного выявления дебюта заболевания, использованием унифицированных диагностических шкал, позволяющих систематизировать клинико-лабораторные данные и, наконец, с расширением возможностей патогенетической и симптоматической терапии, способствующей улучшению качества жизни пациентов с PC и пролонгации течения заболевания.

Медико-социальная значимость данного неврологического заболевания определяется поражением преимущественно лиц молодого, трудоспособного возраста, тяжестью прогрессирующих органических поражений центральной и периферической нервной системы, приводящих к ранней временной, а затем и постоянной утрате трудоспособности, высоким экономическим бременем, связанным с расходами на профилактические, диагностические, лечебные и реабилитационные процедуры. В связи с этим остро стоит проблема оперативной и незатратной диагностики активности патологического процесса, выявление ранних признаков обострения заболевания, контроля эффективности проводимого лечения с возможностью своевременной замены препарата или изменения его дозировки.

Для установления достоверного диагноза рассеянного склероза обычно проводят анализ совокупности клинических и анамнестических данных, результатов магнитно-резонансной томографии головного и спинного мозга и нейрофизиологических паттернов, исследование вызванных потенциалов и иммунологические тесты.

Наиболее признанным методом в диагностике PC является МРТ головного и спинного мозга, проводимая в режиме Т2, Т1 и с контрастным усилением. Однако данный метод многим пациентам противопоказан из-за аллергической реакции на контрастное вещество, клаустрофобии, наличия металлических протезов в организме, снижения скорости клубочковой фильтрации, беременности и др. В этих случаях при подозрении на обострение заболевания врач вынужден опираться на жалобы пациента и оценку неврологического статуса, которые не всегда объективны.

Иммунологическая диагностика рассеянного склероза включает показатели, среди которых выделяются: повышение уровня гамма-глобулинов в спинно-мозговой жидкости; выявление олигоклональных иммуноглобулинов G в спинно-мозговой жидкости; повышенное содержание в спинно-мозговой жидкости основного белка миелина, что может служить признаком обострения процесса. Также для оценки характера течения рассеянного склероза используют цитофлюориметрический или иммунофлюоресцентный методы определения субпопуляций Т- и В-лимфоцитов с помощью наборов моноклональных антител; метод оценки пролиферации лимфоцитов; метод определения активности супрессорных лимфоцитов; метод определения чувствительности иммунокомпетентных клеток к нейроспецифическим антигенам; метод определения кислородзависимой бактерицидности фагоцитирующих клеток периферической крови; метод радиальной иммунодиффузии в геле для определения количества иммуноглобулинов классов A, G, М. Однако перечисленные методы достаточно дорогостоящие, технически сложные, требуют длительного времени для их постановки. Кроме того, велико количество как ложноположительных, так и ложноотрицательных результатов.

Известен способ определения стадии патологического процесса в тестах оценки функциональной активности лимфоцитов (Патент РФ №2175769, МПК G01N 33/68, G01N 33/566, публ. 2001 г. ), основанный на проведении реакции спонтанного розеткообразования лимфоцитов с эритроцитами барана в присутствии препаратов иммуномодулируюшего действия, содержащих естественные регуляторные пептиды тимического и костнмозгового происхождения. Вычисляется индекс чувствительности лимфоцитов к препаратам, который определяет индекс активности патологических процессов.

Недостатками данного способа являются длительность и сложность постановки реакции розеткообразования, необходимость проведения на регулярной основе процессов заготовки и хранения в условиях ограниченного времени препаратов живых эритроцитов периферической крови животного (барана), субъективность в оценке результатов реакции при подсчете под микроскопом количества розеткообразующих лимфоцитов, а также неспецифичность полученных результатов, которые могут изменяться в широком диапазоне при различных патологических состояниях и зависеть от множества разнообразных факторов, вызывающих нарушение иммунитета.

Известен способ дифференциальной диагностики ремитирующего и вторично-прогрессирующего типа течения рассеянного склероза (Патент РФ №2428693, МПК G01N 33/48, G01N 33/50, публ. 2006 г. ), основанный на определении глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в эритроцитах периферической крови у пациентов с рассеянным склерозом. Сущность данного способа дифференциальной диагностики заключается в том, что проводят определение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в эритроцитах периферической крови у пациентов страдающих рассеянным склерозом. При превышении активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в эритроцитах периферической крови на 80% и более относительно показателей для здоровых лиц диагностируют ремиттирующий тип течения рассеянного склероза. При снижении активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в эритроцитах периферической крови у пациентов с рассеянным склерозом на 25% и более относительно показателей для здоровых лиц диагностируют вторично-прогрессирующий тип течения рассеянного склероза.

К недостаткам этого способа относятся низкая точность диагностики, основанная на неспецифических показателях биохимической активности эритроцитов, которые могут изменяться в широком диапазоне в зависимости от активности любых воспалительных реакций.

Наиболее близким является способ определения активности патологического процесса у больных рассеянным склерозом (Патент №2613908, МПК G01N 33/49, публ. 2017 г. ) путем исследования лимфоцитов методом компьютерного микроэлектрофореза в условиях переменного электромагнитного поля при значении частоты переменного тока 0,25 Гц, напряжения 28 В. Если количестве неподвижных лимфоцитов менее 10% и средней амплитуде колебаний подвижных лимфоцитов в пределах 8,0-11,0 мкм диагностируют обострение патологического процесса, а при количестве неподвижных лимфоцитов более 10% и средней амплитуде колебаний подвижных лимфоцитов в пределах 5,0-7,0 мкм -ремиссию патологического процесса.

Недостатками данного способа являются то, что его точность не во всех случаях достаточно высокая в связи с широкой индивидуальной вариабельностью абсолютных показателей электрофоретической подвижности лимфоцитов периферической крови пациентов, связанной с наличием возможных изменений морфофункционального состояния лимфоцитов при развитии различных сопутствующих патологических состояний. Также существует необходимость проведения учета и комплексного анализа изменений нескольких различных показателей (подсчета общего количества лимфоцитов, подсчета количества неподвижных лимфоцитов, определения амплитуды колебаний подвижных лимфоцитов), что усложняет постановку диагноза.

Задачей настоящего изобретения является устранение указанных недостатков, повышение точности диагностики за счет использования относительных величин независимых друг от друга показателей электрофоретической подвижности клеток крови, разработка способа определения активности рассеянного склероза, позволяющего сократить время исследования, уменьшить количество регистрируемых и анализируемых показателей.

Для этого при оценке активности патологического процесса у больных рассеянным склерозом, включающей исследование лимфоцитов периферической крови методом компьютерного микроэлектрофореза в условиях переменного электромагнитного поля при значении частоты переменного тока 0,25 Гц, напряжения 28 В, определение средней амплитуды колебаний лимфоцитов, предложено дополнительно определять среднюю амплитуду колебаний эритроцитов. По полученным данным предложено определять отношение значений средних амплитуд колебаний эритроцитов к средним амплитудам колебаний лимфоцитов, и при величине отношения в пределах от 0,950 до 1,250 диагностируют обострение патологического процесса, а при величине отношения от 1,600 до 1,900 -ремиссию патологического процесса.

В основе определения активности патологического процесса у больных PC лежит оценка электрокинетических свойств лимфоцитов и эритроцитов периферической крови, которую проводят с использованием компьютерного микроэлектрофореза (МЭФ) на базе приборного комплекса «Биони-КЭА» (ТУ 9443-009-17390471-2016, ООО «Весттрейд», Москва).

Регистрация перемещения клеток крови в электрическом поле позволяет оценить морфофункциональное состояние мембран клеток и общие закономерности изменения гомеостаза организма.

При обострении PC количество иммунных комплексов и степень их связывания с рецепторами мембраны лимфоцитов увеличивается, вызывая изменение заряда их поверхности и, соответственно, их электрофоретических свойств: подвижности лимфоцитов и амплитуды их движения в условиях переменного электромагнитного поля.

Эритроциты при PC отличаются измененной деформируемостью, повышенной агрегацией из-за высоких уровней воспаления на периферии и, следовательно, измененной гемореологией. Кроме того, они потенциально способствуют окислительному стрессу за счет нарушения антиоксидантной способности. Все эти факторы находят количественное отражение в изменении поверхностного электрического заряда эритроцитов, их подвижности и, соответственно, амплитуды колебаний в условиях переменного электромагнитного поля. Таким образом, на основании анализа электрокинетических свойств методом микроэлектрофореза лимфоциты и эритроциты при PC могут быть использованы в качестве биомаркеров заболевания и помогать стратификации пациентов.

Способ осуществляется следующим образом.

Цельную венозную кровь забирают из кубитальной вены в объеме 3 мл в пластиковую пробирку с добавлением 25 ед. гепарина на 1 мл для предотвращения свертывания крови. Для получения эритроцитов с помощью пипетки-дозатора из пробирки с цельной венозной кровью берут 5 мкл, разводят в 1 мл 0,3 М раствора сахарозы и отстаивают 10 минут. Лимфоциты выделяют по стандартной методике (Новиков Д.К., Новикова B. И. Клеточные методы иммунодиагностики. - Минск: Беларусь, -1979. -

C. 20-27).

В пробирку с 300 мкл 0,3М сахарозы добавляют 30 мкл взвеси лимфоцитов или эритроцитов и тщательно перемешивают. 40 мкл полученной суспензии клеток в растворе сахарозы с помощью дозатора помещают в центр рабочей зоны электрофоретической ячейки между электродами. Включают исполнительный блок «Биони-КЭА», устанавливают необходимые значения частоты 0,25 Гц и напряжения 28 В на электродах электрофоретической камеры. Заправленную электрофоретическую камеру располагают на столике микроскопа так, чтобы объектив находился над центром рабочей зоны. Фокусируют объектив микроскопа на препарате до появления четкого изображения клеток крови на дисплее компьютера. Подают напряжение на электроды камеры, делают запись 2-3 полных колебаний клеток. Клетки снимают в течение 15 секунд по 4 поля зрения. Проводят автоматическую обработку записанных видеофайлов и оценивают следующие параметры анализируемой клеточной популяции:

- среднее значение амплитуды колебаний подвижных лимфоцитов (Ал, мкм);

- среднее значение амплитуды колебаний подвижных эритроцитов (Аэ, мкм).

По полученным данным определяется отношение значений средних амплитуд колебаний эритроцитов к средним амплитудам колебаний лимфоцитов (Аэ/Ал).

По предлагаемому способу изучены электрофоретические свойства лимфоцитов периферической крови 15 больных с верифицированным диагнозом рассеянного склероза до и после обострения PC. Проведено детальное изучение клинической картины заболевания, данные анамнеза, неврологического и соматического статуса, результаты магнитно-резонансной томографии головного и шейного отделов спинного мозга. Тяжесть клинического состояния оценивали с использованием шкал: EDSS, FS, SCRIPSS. По шкале неврологического дефицита FS средний балл составил 7,3±0,49, по шкале инвалидизации EDSS - 3,12±0,35 балла (средняя степень тяжести заболевания), по шкале неврологического дефицита SCRIPSS - 76,8±3,21 балла, индекс прогрессирования заболевания составил 0,9±0,07 балла.

Критериями включения в исследование были:

- ремитирующее течение заболевания;

- наличие не менее двух обострений за последние 2 года;

- EDSS до 5,5 баллов;

- способность больного самому себе самостоятельно делать инъекции;

- письменное согласие больного на лечение.

Обострение PC идентифицировали на основании жалоб, клинической картины и данных МРТ.

Для лечения обострения заболевания больные получали пульс-терапию метилпреднизолоном в суммарной дозе 5000 мг в течение 7 дней.

Группу контроля составили 20 здоровых добровольцев. Оценку электрофоретических свойств лимфоцитов и эритроцитов проводили с использованием компьютерного микроэлектрофореза (МЭФ) на базе приборного комплекса «Биони-КЭА».

При исследовании электрофоретических свойств лимфоцитов и эритроцитов периферической крови в контрольной группе (здоровые добровольцы) по предлагаемому способу, установлено, что в норме средняя амплитуда колебаний подвижных лимфоцитов находится в диапазоне 2,0 -5,0 мкм, средняя амплитуда колебаний подвижных эритроцитов - в диапазоне 1,0 - 4,0 мкм, величина отношения данных показателей составляет от 0,500 до 0,800.

У больных PC в стадии обострения отмечается более высокая активность лимфоцитов: средняя амплитуда колебаний подвижных лимфоцитов увеличивается в 2 раза находится в диапазоне 8,0 - 11,0 мкм. Средняя амплитуда колебаний эритроцитов находится в диапазоне 7,0 -12,0 мкм. Величина отношения данных показателей составляет от 0,950 до 1,250.

У больных PC в стадии ремиссии активность лимфоцитов превышает нормальные значения контрольной группы, но является достоверно ниже показателей больных с обострением PC: средняя амплитуда колебаний подвижных лимфоцитов смещается в диапазон значений - 5,0 - 7,0 мкм. Средняя амплитуда колебаний эритроцитов находится в диапазоне 8,0 -13,0 мкм. Величина отношения данных показателей составляет от 1,600 до 1,900.

В таблицах 1 и 2 представлены результаты исследования электрофоретической активности лимфоцитов и эритроцитов больных рассеянным склерозом в стадии обострения и ремиссии.

Пример 1.

Пациент П., 34 года. Клинический диагноз: Рассеянный склероз. Ремиттирующее течение. Обострение. EDSS 3.0

Жалобы при поступлении: покалывания в области левой половины лица, боль в области правой пятки, дрожь в пальцах, нервозность.

Анамнез vitae: Перенесенные заболевания: ОРВИ. Вредные привычки отрицает. Семейное положение, условия труда и быта удовлетворительные. Наследственность не отягощена. Не работает.

Анамнез morbi: со слов пациентки 1-ое обострение, сопровождавшееся двоением в глазах, головокружением, повышенной утомляемостью, произошло в мае 2016 г. и продолжалось в течение 3 недель. Настоящее состояние регистрируется с 14.07.2018.

МРТ головного мозга от 22.07.2018 - MP-картина многоочагового поражения белого вещества головного мозга с наличием супратенториальных очагов соответствует демиелинизирующему заболеванию. На основании клинической картины и данных МРТ идентифицировано обострение PC.

Проведено исследование лимфоцитов и эритроцитов периферической крови по предлагаемому способу. Результат МЭФ от 21.07.2018 г: средняя амплитуда колебаний подвижных лимфоцитов - 10,11 мкм, средняя амплитуда колебаний подвижных эритроцитов - 10,62 мкм, величина отношения Аэ/Ал - 1,050. Заключение: рассеянный склероз в стадии обострения.

Проведена гормональная терапия Метилпреднизолоном (Солу-Медрол) 1000 мг в/в капельно,метил-преднизолоном (Солу-Медролом), Омез, КCl, Кортексин, витамины В1, В 6, В12, диета№15.

При выписке состояние удовлетворительное. В клинической картине отмечается положительная динамика в виде уменьшения глазодвигательных нарушений, уменьшение чувства онемения. EDSS 2.0

Рекомендации: наблюдение невролога по месту жительства; режим общий, диета №15, глатирамера ацетат 1.0 и/к ежедневно, мексидол 1 табл. 3 раза в день 1 месяц, нейромультивит 1 таб 2 р/д 1 мес.Повторная консультация через 3 мес.

При плановом обследовании 15.10.2018 жалобы не предъявляет. Состояние удовлетворительное. Получает глатирамера ацетат в течение трех месяцев, переносит хорошо. Обострений не было. Для определения активности патологического процесса проведено исследование лимфоцитов и эритроцитов по предлагаемому способу. Результат МЭФ от 15.10.2018 г: средняя амплитуда колебаний подвижных лимфоцитов - 6,34 мкм, средняя амплитуда колебаний подвижных эритроцитов - 10,15 мкм, величина отношения Аэ/Ал - 1,600. Заключение: рассеянный склероз в стадии ремиссии.

На повторном МРТ от 25.10.18 положительная динамика в виде уменьшения очага в размерах и отсутствия признаков активности. Диагноз: рассеянный склероз. Ремиттирующее течение. Ремиссия.

Пример 2.

Пациентка К., 37 лет.Клинический диагноз: Рассеянный склероз. Ремиттирующее течение. Обострение. Атаксия. EDSS - 3,0 балла.

Жалобы при поступлении: "не чувствую все тело", шаткость при ходьбе.

Анамнез заболевания: со слов пациентки 25.08.18 отметила онемение и покалывание в правой ноге, 31.08.2018 возникло онемение ног, затем живота, груди, рук, онемение промежности. Ранее отмечала эпизоды онемения в области ног и рук в 2015 году и 20137 году. К врачу не обращалась и лечения не получала.

Анамнез vitae: перенесенные заболевания ОРВИ, аллергоанамнез не отягощен. Вредные привычки отрицает.

МРТ головного мозга от 11.09.2018 - MP-картина многоочагового поражения вещества головного мозга (супра- и инфратенториально, с вовлечением в процесс мозолистого тела) и вещества спинного мозга на уровне шейного отдела позвоночника, с нарушением целостности ГЭБ (накопление контрастного препарата: 10 супратенториальных очагов и 1 крупный очаг в спинном мозге).

Проведено исследование лимфоцитов и эритроцитов периферической крови по предлагаемому способу. Результат МЭФ от 11.09.2018 г: средняя амплитуда колебаний подвижных лимфоцитов - 8,54 мкм, средняя амплитуда колебаний подвижных эритроцитов - 10,50 мкм, величина отношения Аэ/Ал - 1,230. Заключение: рассеянный склероз в стадии обострения.

Пациента получила лечение: режим стационарный, Вит В12 500 мкг в/м, Октолипен (Берлитион) 600 в/в капельно, Метилпреднизолон (Солу Медрол) 1000 мг в/в капельно, Калия хлорид 1 г. 3р/д, Омепразол 20 мг утром, Плазмаферез 3 сеанса по 500 мл, диета№15.

Выписывается в удовлетворительном состоянии с положительным эффектом. В клинической картине сохраняются парестезии в конечностях.

Рекомендации: наблюдение невролога по месту жительства; режим общий, диета №15, ребиф 44 мкг 3р/нед п/к, постоянно, нейромультивит 1 таб 3 р/д 1 мес, Актовегин 1 табл 3р/д 1 мес.Повторная консультация через 3 мес.

При плановом обследовании 17.12.2018 жалобы не предъявляет.Состояние удовлетворительное. Получает ребиф в течение трех месяцев, переносит хорошо. Обострений не было. Для определения активности патологического процесса проведено исследование лимфоцитов и эритроцитов по предлагаемому способу. Результат МЭФ от 17.12.2018 г: средняя амплитуда колебаний подвижных лимфоцитов - 6,40 мкм, средняя амплитуда колебаний подвижных эритроцитов - 11,62 мкм, величина отношения Аэ/Ал - 1,815. Заключение: рассеянный склероз в стадии ремиссии.

Новых жалоб нет. Получает Ребиф 44 в течение трех месяцев, переносит хорошо. Обострений не было. На повторном МРТ от 18.12.18 положительная динамика в виде уменьшения очагов в размерах и отсутствия признаков активности. Диагноз: рассеянный склероз. Ремиттирующее течение. Ремиссия.

Таким образом, изменение величины отношения средних амплитуд колебаний эритроцитов к средним амплитудам колебаний лимфоцитов коррелирует с исчезновением клинико-функциональных симптомов рассеянного склероза и данными МРТ головного мозга.

Преимущества предлагаемого нами способа заключаются в том то, что он является доступным для учреждений практического здравоохранения; простым в выполнении; практически безреагентным, т.е. не требует дополнительного использования дорогостоящих лабораторных расходных материалов; оперативным, т.к. позволяет получать результат в течение 3-5 минут и ориентироваться на минимальное количество измеряемых параметров; и объективным, т.к. измерения электрокинетических параметров живых клеток и их получение анализируемых данных производится в автоматическом режиме.

Полученные нами результаты указывают, что экспресс-анализ морфофункционального состояния лимфоцитов и эритроцитов периферической крови больных с рассеянным склерозом на основе их электрокинетических показателей является эффективным и экономически оправданным. Применение предлагаемого способа будет способствовать ранней диагностике обострений рассеянного склероза и оперативной оценке эффективности проводимых лечебных мероприятий, что даст возможность непосредственно в процессе наблюдения за пациентом отслеживать динамику течения заболевания и своевременно вносить изменения в протокол лечебных и реабилитационных процедур.

Кроме того, исследование особенностей морфофункционального состояния лимфоцитов и эритроцитов периферической крови при PC может способствовать расширению понимания патологических механизмов этого сложного и гетерогенного заболевания, что, в свою очередь, послужит основой для разработки новых методов лечения, способных значительно улучшить качество жизни пациентов.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для определения активности патологического процесса у больных рассеянным склерозом. Для этого проводят определение средней амплитуды колебаний лимфоцитов методом компьютерного микроэлектрофореза в условиях переменного электромагнитного поля при значении частоты переменного тока 0,25 Гц, напряжения 28 В. Дополнительно определяют среднюю амплитуду колебаний эритроцитов и отношение значений средних амплитуд колебаний эритроцитов к средним амплитудам колебаний лимфоцитов. При величине отношения 0,950-1,250 диагностируют обострение патологического процесса. А при величине отношения 1,600-1,900 диагностируют ремиссию патологического процесса. Изобретение обеспечивает раннюю диагностику обострений рассеянного склероза и позволяет проводить оценку эффективности проводимого лечения у больных рассеянным склерозом. 2 табл., 2 пр.

Способ определения активности патологического процесса у больных рассеянным склерозом, включающий определение средней амплитуды колебаний лимфоцитов методом компьютерного микроэлектрофореза в условиях переменного электромагнитного поля при значении частоты переменного тока 0,25 Гц, напряжения 28 В, отличающийся тем, что дополнительно определяют среднюю амплитуду колебаний эритроцитов, определяют отношение значений средних амплитуд колебаний эритроцитов к средним амплитудам колебаний лимфоцитов, и при величине отношения 0,950-1,250 диагностируют обострение патологического процесса, а при величине отношения 1,600-1,900 - ремиссию патологического процесса.