Способ прогнозирования стадии рассеянного склероза с учетом показателей иммунологического статуса Российский патент 2024 года по МПК G01N33/533 A61B5/00 

Изобретение относится к медицине, а именно к неврологии, и может быть использовано для прогнозирования стадии рассеянного склероза - обострения или ремиссии.

Рассеянный склероз - иммунно-опосредованное заболевание, при котором периоды обострений и ремиссии чередуются, причем основной целью терапии этого заболевания является предупреждение возникновения обострений, приводящих к тяжелой инвалидизации, поэтому прогнозирование развития обострений является важнейшей задачей для принятия решений о путях дальнейшего лечения больных. Прогнозирование имеет особую значимость при необходимости смены текущей терапии рассеянного склероза на альтернативную, например, при прекращении терапии натализумабом в связи с нарастанием риска развития прогрессирующей мультифокальной энцефалопатии или с неэффективностью данного вида терапии.

Известен способ прогнозирования обострений ремиттирующего рассеянного склероза (Патент РФ 2468370, МПК G01N 33/53, публ. 2012) с использованием теста нитросинего тетразолия (НСТ-тест). Для выполнения этого способа у больных берут кровь в период с 6.00 до 9.00 часов утра и определяют показатели НСТ-теста моноцитов до и после стимуляции пирогеналом, и при значениях НСТ-теста выше 53% и при значениях коэффициента активации НСТ-теста моноцитов ниже 1,5 прогнозируют обострение ремиттирующего рассеянного склероза.

Недостатком этого способа является его низкая чувствительность, поскольку для прогнозирования обострения использован НСТ-тест, который отражает бактерицидную активность фагоцитирующих лейкоцитов в отношении возбудителей бактериальных инфекций, что не связано с патогенетическими механизмами рассеянного склероза. При этом в данном способе использованы моноциты, которые имеют кратковременный срок пребывания в кровотоке в течение 1-2 дней, и имеют лишь косвенное значение в патогенезе рассеянного склероза и его обострениях. Так же, как видно из текста описания изобретения, показатели НСТ-теста в моноцитах существенно варьируют в течение суток у одного и того же пациента, что вызывает существенное ограничение значимости получаемых с использованием НСТ-теста результатов. Следует отметить техническую сложность выполнения теста и субъективизм в оценке его результатов, поскольку в течение 1 секунды следует подсчитать число формазан-положительных из 100 моноцитов.

Известен способ определения активности патологического процесса у больных рассеянным склерозом (Патент РФ 2613908, МПК G01N 33/49, публ. 2017). Для выполнения способа при определении активности патологического процесса у больных рассеянным склерозом, включающем количественное определение лимфоцитов периферической крови, предложено исследование лимфоцитов проводить методом компьютерного микроэлектрофореза в условиях переменного электромагнитного поля при значении частоты переменного тока 0,25 Гц, напряжения 28 В. При этом определяют общее количество лимфоцитов, количество неподвижных лимфоцитов и среднюю амплитуду колебаний подвижных лимфоцитов, и при количестве неподвижных лимфоцитов менее 10% и средней амплитуде колебаний подвижных лимфоцитов в пределах 8,0-11,0 мкм диагностируют обострение патологического процесса. При количестве неподвижных лимфоцитов 10% и более, амплитуде колебаний подвижных лимфоцитов в пределах 5,0-7,0 мкм, определяют ремиссию патологического процесса.

Недостатком этого способа является то, что его точность не во всех случаях достаточно высокая в связи с широкой индивидуальной вариабельностью абсолютных показателей электрофоретической подвижности лимфоцитов периферической крови пациентов, связанной с наличием возможных изменений морфофункционального состояния лимфоцитов при развитии различных сопутствующих патологических состояний. Также существует необходимость проведения учета и комплексного анализа изменений нескольких различных показателей (подсчета общего количества лимфоцитов, подсчета количества неподвижных лимфоцитов, определения амплитуды колебаний подвижных лимфоцитов), что усложняет постановку прогноза. Отрицательными чертами являются технологическая сложность выполнения способа с использованием дорогостоящей аппаратуры и отсутствие верификации результатов.

Наиболее близким является способ прогнозирования стадии рассеянного склероза с учетом показателей иммунологического статуса (Патент РФ 2528882, МПК G01N 33/49, публ. 2014), включающий оценку показателей В-лимфоцитов (CD19+), определение коэффициента стадии течения рассеянного склероза с использованием регрессионного уравнения. При этом течение рассеянного склероза определяют с использованием регрессионного уравнения: стадия течения РС=0,161681-0,209483*пол+0,0158676*возраст+0,0477443*лимфоциты+0,578018*CD3-0,259435*CD19-2,29788*CD4+1,37512*CD8+0,680127*CD16-1,50333*CD11b+0,244827*ФЧ-0,124693*НСТсп+1,19125*НСТак-0,0408168*IgG-0,0501667*IgA+0,379248*IgM, где пол - женский обозначают цифрой один, мужской - цифрой два; возраст - количество полных лет на момент обследования, по результатам которого судят о стадии.

Недостатком этого способа является длительность и техническая сложность его выполнения, поскольку способ предусматривает проведение нескольких исследований - НСТ-тест спонтанный и индуцированный, фенотипирование лимфоцитов венозной крови, исследование фагоцитарного числа, исследование уровня иммуноглобулинов периферической крови.

Задачей предлагаемого изобретения является устранение указанных недостатков, повышение точности прогнозирования стадии рассеянного склероза, упрощение способа и сокращение срока его проведения за счет повышения его чувствительности.

Для решения поставленной задачи при прогнозировании стадии рассеянного склероза с учетом показателей иммунологического мониторинга, включающем оценку показателей Т-лимфоцитов (CD3), В-лимфоцитов (CD19) при исследовании венозной крови, определение коэффициента стадии течения рассеянного склероза с использованием регрессионного уравнения, предложено определять процентное содержание Т-лимфоцитов, экспрессирующих на своей поверхности NK-ассоциированные антигены (CD16+CD56+). А при оценке гейта В-лимфоцитов определяют процентное содержание В-лимфоцитов, экспрессирующих на своей поверхности антигены CD5, CD25, CD38, CD40, CD95. Коэффициент стадии течения рассеянного склероза рассчитывают с использованием в регрессионном уравнении числовых значений полученных процентных содержаний этих показателей по формуле:

К_РС=NKT*1,59-CD5*0,04-CD25*0,26-CD38*0,2-CD40*0,12+CD95*0,1+9,43,

где NKT - числовое значение процента Т-лимфоцитов, экспрессирующих на своей поверхности NK-ассоциированные антигены (CD16+CD56+),

CD5 - числовое значение процента В-лимфоцитов, экспрессирующих на своей поверхности антиген CD5,

CD25 - числовое значение процента В-лимфоцитов, экспрессирующих на своей поверхности антиген CD25,

CD38 - числовое значение процента В-лимфоцитов, экспрессирующих на своей поверхности антиген CD38,

CD40 - числовое значение процента В-лимфоцитов, экспрессирующих на своей поверхности антиген CD40,

CD95 - числовое значение процента В-лимфоцитов, экспрессирующих на своей поверхности антиген CD95,

9,43 - постоянный коэффициент,

и если К_РС равен или меньше 0, то прогнозируют стадию ремиссии рассеянного склероза, при значении К_РС более 0 прогнозируют стадию обострения рассеянного склероза.

Техническим результатом применения предлагаемого способа является точное прогнозирование дальнейшего течения рассеянного склероза в виде сохранения ремиссии или наступления обострения за счет того, что прогноз учитывает наличие в периферической крови больного активированных по различным антигенам В-лимфоцитов, более достоверно характеризующих течение заболевания, что позволяет адекватно оценить состояние иммунной системы и особенности дальнейшего развития рассеянного склероза у конкретного больного.

Способ осуществляется следующим образом.

У пациента выполняется забор венозной крови из периферической (кубитальной) вены в объеме 5,0-10,0 мл и помещается в пробирку с антикоагулянтом, содержащим соли ЭДТА. Далее образцы периферической крови определенного объема инкубируются при комнатной температуре в течение 20 мин в темноте с моноклональными антителами (МАТ) определенной специфичности, конъюгированными с флюоресцентными красителями в различных сочетаниях. Далее выполняется лизис эритроцитов путем добавления в пробы лизирующего раствора FacsLysing Solution (Becton Dickinson, USA), содержащий в своем составе фиксирующий компонент формальдегид, стабилизирующий мембрану клеток. После инкубации образцов с лизирующим раствором в темноте в течение 12 мин к пробам добавляется раствор Фосфатно-солевого буфера и проводится анализ проб на лазерном проточном цитометре с использованием безотмывочной технологии. Оценку параметров клеточного иммунитета у больных рассеянным склерозом проводят, например, методом проточной цитометрии (2-лазерный проточный цитофлуориметр FACSCalibur (Becton Dickinson, США) с использованием программного обеспечения «CellQwest». При этом исследуют популяционный и субпопуляционный состав лимфоцитов: CD3+, CD19+, CD3+CD16+CD56+, а субпопуляционный состав В-лимфоцитов (В1-клетки), экспрессию костимулирующих и активационных антигенов (CD5, CD40, CD25, CD38, CD95) - в пределах гейта В-лимфоцитов (CD19+). В результате получают процентное содержание этих клеток в периферической крови.

Далее используют уравнение, полученное методом бинарной логистической регрессии в результате обработки данных процентного содержания указанных субпопуляций лимфоцитов у больных рассеянным склерозом, у которых при длительном наблюдении после выполненного исследования произошло развитие обострения рассеянного склероза или наблюдалась ремиссия заболевания и рассчитывают коэффициент стадии течения рассеянного склероза К_РС. Если К_РС равен или меньше 0, то прогнозируют стадию ремиссии рассеянного склероза, при значении К_РС более 0 прогнозируют стадию обострения рассеянного склероза.

Пример 1

Больная А., 40 лет. Диагноз: рассеянный склероз, ремиттирующее течение.

Пациентка в течение 2 лет получала терапию препаратом натализумаб с положительным результатом, обострений не возникало. Поскольку у пациентки спустя 2 года выявлено нарастание серопозитивности к JC-вирусу более 1,5 у.е., что свидетельствовало о риске возникновения у пациентки прогрессирующей мультифокальной лейкоэнцефалопатии, было решено прекратить терапию натализумабом и выполнить переход на терапию другим препаратом, что требовало проведения «отмывки», периода, в течение которого произойдет полная элиминация препарата в организме. Период «отмывки» имеет продолжительность от 3 до 6 месяцев, причем, чем больше перерыв, тем выше риск развития обострения рассеянного склероза.

Пациентке проведено исследование популяционного и субпопуляционного состава лимфоцитов, при этом получены следующие данные: процентное содержание субпопуляций лимфоцитов составило: NKT - 9,3%, CD19+CD5+ - 14,1%, CD19+CD25+ - 15,3%, CD19+CD38+ - 41,9%, CD19+CD40+ - 87,6%, CD19+CD95+ - 12,7%.

По формуле К_РС=NKT*1,59-CD5*0,04-CD25*0,26-CD38*0,2-CD40*0,12+CD95*0,1+9,43=6,04.

Полученный результат был более 0, поэтому был установлен прогноз: обострение рассеянного склероза.

При наблюдении за состоянием пациентки в течение месяца было зарегистрировано обострение рассеянного склероза, для купирования обострения проведен курс пульс-терапии метилпреднизолоном в дозе 5000 мг внутривенно капельно.

Контрольное наблюдение через 6, 12 месяцев подтвердило прогнозируемое обострение заболевания и позволило своевременно скорректировать терапию и перейти на лечение окрелизумабом.

Пример 2

Больной С., 29 лет. Диагноз: рассеянный склероз, ремиттирующее течение.

Пациент более 2 лет получал терапию препаратом натализумаб с положительным результатом, обострений не возникало. В связи с нарастанием серопозитивности к JC-вирусу более 1,5 у.е., что указывало на риск развития у пациента прогрессирующей мультифокальной лейкоэнцефалопатии, терапия натализумабом была прекращена и больного перевели на терапию другим препаратом, что требовало проведения «отмывки».

Пациенту проведено исследование популяционного и субпопуляционного состава лимфоцитов, при этом получены следующие данные:

процентное содержание субпопуляций лимфоцитов составило: NKT - 6,6%, CD19+CD5+ - 54,8%, CD19+CD25+ - 35,6%, CD19+CD38+ - 49,1, CD19+CD40+ - 89,2%, CD19+CD95+ - 80%.

По формуле К_РС=NKT*1,59-CD5*0,04-CD25*0,26-CD38*0,2-CD40*0,12+CD95*0,1+9,43=-4,05.

Полученный результат был менее 0, поэтому сделан прогноз: ремиссия рассеянного склероза.

При наблюдении за состоянием пациента в течение полугода было зарегистрировано стабильное течение рассеянного склероза без обострений. Пациент перешел на терапию другим препаратом (окрелизумаб).

Нами по предлагаемому способу было проведено обследование 42 пациентов с высокоактивным рассеянным склерозом, имевших риск обострения заболевания в связи со сменой терапии. В результате у 23 пациентов получен прогноз отсутствия обострения, у 19 - прогноз обострения. При наблюдении в течение года у всех пациентов с прогнозом отсутствия обострения зафиксировано безрецидивное течение. Из 19 пациентов, у которых был получен прогноз обострения, рецидив зарегистрирован у 18, у 1 пациентки обострение не возникло. Таким образом, правильность прогноза подтверждена в 97,6% случаев, коэффициент хи-квадрат=18,386, показатель статистической значимости р=0,0053.

Использование данного способа позволяет прогнозировать течение рассеянного склероза с учетом показателей иммунологического мониторинга пациента, что позволяет своевременно выявлять лиц, у которых риск развития обострения рассеянного склероза повышен и корректировать лечебную тактику до момента развития обострения, что предупреждает развитие тяжелой инвалидизации пациентов. Также применение данного способа позволяет прогнозировать благоприятное течение заболевания и оптимизировать терапию у таких больных.

Изобретение относится к медицине, а именно к неврологиии, и может быть использовано для прогнозирования стадии рассеянного склероза. Для этого определяют процентное содержание Т-лимфоцитов CD3, экспрессирующих на своей поверхности NK-ассоциированные антигены CD16+CD56+ и процентное содержание В-лимфоцитов CD19, экспрессирующих на своей поверхности антигены CD5, CD25, CD38, CD40, CD95. Рассчитывают коэффициент стадии течения рассеянного склероза с использованием в регрессионном уравнении числовых значений полученных процентных содержаний этих показателей по формуле: К_РС=NKT*1,59-CD5*0,04-CD25*0,26-CD38*0,2-CD40*0,12+CD95*0,1+9,43, где NKT - числовое значение процента Т-лимфоцитов, экспрессирующих на своей поверхности NK-ассоциированные антигены CD16+CD56+, CD5 - числовое значение процента В-лимфоцитов, экспрессирующих на своей поверхности антиген CD5, CD25 - числовое значение процента В-лимфоцитов, экспрессирующих на своей поверхности антиген CD25, CD38 - числовое значение процента В-лимфоцитов, экспрессирующих на своей поверхности антиген CD38, CD40 - числовое значение процента В-лимфоцитов, экспрессирующих на своей поверхности антиген CD40, CD95 - числовое значение процента В-лимфоцитов, экспрессирующих на своей поверхности антиген CD95, 9,43 - постоянный коэффициент. Если К_РС равен или меньше 0, то прогнозируют стадию ремиссии рассеянного склероза, при значении К_РС более 0 прогнозируют стадию обострения рассеянного склероза. Изобретение обеспечивает точное прогнозирование дальнейшего течения рассеянного склероза. 2 пр.

Способ прогнозирования стадии рассеянного склероза с учетом показателей иммунологического мониторинга, включающего оценку показателей Т-лимфоцитов CD3, В-лимфоцитов CD19 при исследовании венозной крови, определение коэффициента стадии течения рассеянного склероза с использованием регрессионного уравнения, отличающийся тем, что определяют процентное содержание Т-лимфоцитов, экспрессирующих на своей поверхности NK-ассоциированные антигены CD16+CD56+, при оценке гейта В-лимфоцитов определяют процентное содержание В-лимфоцитов, экспрессирующих на своей поверхности антигены CD5, CD25, CD38, CD40, CD95, а коэффициент стадии течения рассеянного склероза рассчитывают с использованием в регрессионном уравнении числовых значений полученных процентных содержаний этих показателей по формуле:

К_РС=NKT*1,59-CD5*0,04-CD25*0,26-CD38*0,2-CD40*0,12+CD95*0,1+9,43,

где NKT - числовое значение процента Т-лимфоцитов, экспрессирующих на своей поверхности NK-ассоциированные антигены CD16+CD56+,

CD5 - числовое значение процента В-лимфоцитов, экспрессирующих на своей поверхности антиген CD5,

CD25 - числовое значение процента В-лимфоцитов, экспрессирующих на своей поверхности антиген CD25,

CD38 - числовое значение процента В-лимфоцитов, экспрессирующих на своей поверхности антиген CD38,

CD40 - числовое значение процента В-лимфоцитов, экспрессирующих на своей поверхности антиген CD40,

CD95 - числовое значение процента В-лимфоцитов, экспрессирующих на своей поверхности антиген CD95,

9,43 - постоянный коэффициент,

и если К_РС равен или меньше 0, то прогнозируют стадию ремиссии рассеянного склероза, при значении К_РС более 0 прогнозируют стадию обострения рассеянного склероза.