СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ОБОСТРЕНИЙ РЕМИТТИРУЮЩЕГО РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА Российский патент 2012 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к области медицины, разделу неврология, а именно к способу прогнозирования обострений ремиттирующего рассеянного склероза (РРС).

Несмотря на совершенствование диагностических и лечебных мероприятий, актуальность проблемы рассеянного склероза (PC) в современной медицине обусловлена частотой возникновения и прогрессированием этого заболевания, особенно у лиц молодого возраста, накоплением неврологического дефицита и нарастанием инвалидизации у больных с PC [Chapel H., Haeney M., Misbah S., Snowden N. Essentials of clinical immunology - fifth edition // Blackwell Publishing, 2008. - P.360-367].

До настоящего времени нет четких клинико-диагностических критериев, позволяющих разработать тесты для прогнозирования обострений при РРС. Одним из перспективных направлений в реализации данной проблемы является разработка информативных иммунодиагностических тестов, позволяющих прогнозировать обострения РРС.

Известен способ прогнозирования PC, основанный на определении активности Na-K-АТФ-азы в эритроцитах крови при температуре 35°C и константы Михаэлиса [Патент RU №2034299 C1, 30.04.1995]. Сущность способа заключается в отмывании от плазмы эритроцитов, суспензировании их в фосфатном буфере, определении коэффициента преломления в интерферометре и вычислении константы Михаэлиса. При значениях константы Михаэлиса 1,07·10^-5±4,53·10^-7 М АТФ диагностируют стадию обострения, при константе Михаэлиса 0,83·10^-5±3,57·10^-7 М АТФ - регистрируют стадию ремиссии.

Недостатками данного способа являются трудоемкость проведения анализа, необходимость использования дорогостоящих реактивов, приборов, а также сложных математических расчетов.

Аналогом изобретения также является тест нитросинего тетразолия (НСТ-тест) [Нагоев Б.С. Модификация цитохимического метода восстановления нитросинего тетразолия. // Лаб. дело. - 1983. - №8 - С.7-11]. Данный тест характеризует окислительно-восстановительный потенциал лейкоцитов, нейтрофилов, моноцитов и является одним из важных показателей их фагоцитарной активности. НСТ-тест основан на способности клеток к пиноцитозу раствора нитросинего тетразолия и накоплении его в фагоцитарных вакуолях с последующим восстановлением и превращением растворимого бесцветного нитросинего тетразолия в нерастворимый темно-синий формазан.

Известны работы, основанные на определении показателей НСТ-теста нейтрофилов [Столяров И.Д., Осетров Б.А. Рассеянный склероз. // СПб.: Элби, 2002. - 174 с.]. Недостатком способа является то, что реактивность нейтрофилов не отражает механизмов аутоиммунного процесса при РРС.

В качестве прототипа выбран иммунологический способ прогнозирования неблагоприятного течения PC. Изобретение включает двукратное определение содержания в крови HLA-DR+, лимфоцитов и иммуноглобулинов класса М (Ig М) и вычисление индекса миграции лейкоцитов (ИМЛ). На основании определения этих показателей прогнозируют ремиттирующее течение PC либо прогнозируют рецидивирующее течение PC [Патент RU №2272292 C1, 20.03.2006].

Существенными недостатками предложенного способа являются необходимость определения нескольких параметров, использования сложных лабораторных тестов, дорогостоящих и не всегда доступных методик определения содержания HLA-DR и Ig М. Следует отметить, что двукратное проведение лабораторных исследований удлиняет время получения окончательных результатов, а относительная интактность популяции B-лимфоцитов и синтезируемых ими иммуноглобулинов при доброкачественном течении PC делает эти показатели недостаточно чувствительными. Кроме того, отсутствие достоверных данных о влиянии генетических факторов на этиологию и тяжесть течения заболевания PC не может служить объективным лабораторным тестом диагностики данного заболевания.

Задачей настоящего изобретения является разработка экспресс-способа прогнозирования обострений РРС.

Технический результат простой, не требующий больших материальных затрат, основанный на определении зависимости между активностью иммунных процессов и уровнем кортикостероидов, позволяющих прогнозировать обострения РРС. Выявлена зависимость между суточной динамикой моноцитов и уровнем кортикостероидов.

Сущность способа достигается тем, что согласно изобретению у больных берут кровь в период с 6.00 до 9.00 часов утра и определяют показатели НСТ-теста моноцитов до и после стимуляции пирогеналом, при значениях НСТ-теста выше 53% и при значениях коэффициента активации НСТ-теста моноцитов ниже 1,5 прогнозируют обострение РРС.

Предложенный способ по сравнению с прототипом имеет следующие преимущества: простота методики проведения лабораторного исследования позволяет применять предлагаемый способ в условиях любого лечебного учреждения. Отсутствие потребности в дорогостоящих реактивах, небольшие затраты на проведение лабораторных исследований (средняя стоимость лабораторного анализа составляет 120 руб.) делают данный способ доступным для внедрения в клиническую практику. Объективность результатов исследования крови больного с помощью предложенного способа основана на результатах учета суточной динамики уровня кортикостероидов и их влияния на функциональную активность моноцитов.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом. Кровь берут из локтевой вены в период с 6.00 до 9.00 часов утра. Для оценки базовой активности НСТ-теста моноцитов берут 2 капли крови, 1 каплю 0,1% гепарина (10 ЕД в 1 мл), 2 капли 0,2% раствора паранитротетразолия фиолетового, 1 каплю 1% раствора метиленовой сини. Все компоненты смешивают и инкубируют на предметном стекле 30 минут при температуре 37°C. Для определения резервной мощности моноцитов ставят стимулированный НСТ-тест: 2 капли крови, 1 каплю 0,1% гепарина (10 ЕД в 1 мл), 2 капли 0,2% раствора паранитротетразолия фиолетового, 1 каплю 1% раствора метиленовой сини, 0,02 мл пирогенала. Эти вещества смешивают и инкубируют на предметном стекле 30 минут при 37°C. Мазки фиксируют 60% раствором ацетона на насыщенном растворе Трилона B в течение 30 секунд. В окрашенных 0,1% водным раствором сафранина мазках в течение 1 секунды подсчитывают процент формазан-позитивных клеток. Для этого мазок микроскопируют под иммерсией при увеличении 90×10. Просматривают 100 моноцитов в мазке и вычисляют процентное содержание клеток с отложениями формазана в виде гранул. Затем вычисляют коэффициент активации (КА), который определяют как отношение показателей стимулированного НСТ-теста к базовому значению НСТ-теста. При значениях базовой активности НСТ-теста моноцитов выше 53% и при значениях коэффициента активации НСТ-теста моноцитов ниже 1,5 прогнозируют обострение РРС.

Примеры практического использования способа

Пример 1

Больной А., 25 лет, в течение 6 лет страдает РРС. Жалобы на общую слабость, онемение правой верхней конечности. При осмотре в неврологическом статусе не выявлено очаговых изменений. Шкала EDSS 0-1 балл. МРТ головного мозга - очаги демиелинизации в головном мозге в количестве 8. Отрицательной динамики по сравнению с предыдущим МРТ исследованием год назад не выявлено. При обследовании в 8.30 получены следующие результаты: базовая активность НСТ-теста - 42,12% (что ниже 53%). Отношение показателей стимулированного пирогеналом НСТ-теста к базовому значению НСТ-теста составило - 1,72 (что выше 1,5). Признаков возможного обострения РРС не установлено. Пациенту назначена следующая терапия: трентал 400 мг 3 раза в день, глицин 100 мг 3 раза в день, ноотропил 400 мг 2 раза в день. Через 10 дней пациент почувствовал себя лучше, онемение верхней конечности регрессировало.

Обострений РРС у больного в течение месяца наблюдений не зарегистрировано.

Пример 2

Больной К., в возрасте 32 лет в течение 4 последних лет страдает РРС. Жалобы на головную боль, головокружение, онемение нижних конечностей. В неврологическом статусе выявлены мозаичные нарушения чувствительности нижних конечностей. Шкала EDSS 1 балл. МРТ головного мозга - очаги демиелинизации в головном мозге в количестве 9. Отрицательной динамики по сравнению с предыдущим МРТ исследованием год назад не выявлено. При обследовании в 8.00 получены следующие результаты: базовая активность НСТ-теста - 55,20% (что выше 53%). Отношение показателей стимулированного пирогеналом НСТ-теста к базовому значению НСТ-теста составило - 1,38 (что ниже 1,5). Прогнозировано обострение PC. Назначена терапия: глицин 100 мг по 3 табл. 3 раза в день, трентал 5,0 в/в, эмоксипин 4,0 в/в, пирацетам 5,0 в/в.

Через неделю после обьследования появилось двоение в глазах, легкий парез правой нижней конечности (Шкала EDSS 1,5-2,0 балла) - диагностировано обострение заболевании РРС. Назначено лечение кортикостероидами. Симптомы регрессировали полностью. Шкала EDSS при выписке 0-1 балл.

Пример 3

Больной М. в возрасте 34 лет в течение 12 последних лет страдает РРС. Поступил с жалобами на онемение и слабость нижних конечностей, затруднение при ходьбе, задержку мочеиспускания. В неврологическом статусе выявлено: легкий нижний спастический парапарез, нарушения чувствительности по проводниковому типу с уровня D10, легкие нарушения функции тазовых органов. Шкала EDSS 2,5-3,0 балла. МРТ головного мозга - очаги демиелинизации в головном мозге в количестве 12. Отрицательной динамики по сравнению с предыдущим МРТ исследованием год назад не выявлено. При обследовании в 7.30 получены следующие результаты: базовая активность НСТ-теста - 56,2% (что выше 53%). Отношение показателей стимулированного пирогеналом НСТ-теста к базовому значению НСТ-теста составило - 1,27 (что ниже 1,5). Диагностировано обострение PC. Назначен курс лечения кортикостероидами. При выписке больного симптомы регрессировали полностью. Шкала EDSS - 0-1 балл.

Приведенные примеры иллюстрируют возможность применения данного способа. Способ апробирован на базе Тюменского областного центра Рассеянного склероза ЗАО МСЧ «Нефтяник». Обследовано 58 мужчин в возрасте 20-40 лет, больных ремиттирующей формой PC в стадии ремиссии. У 31 пациента не было обострений в течение предшествующего года (1 группа); у 27 - диагностированы 1-2 обострения в течение года (2 группа). Все пациенты на момент обследования получали превентивную иммуномодулирующую терапию Копаксоном (глатирамера ацетат). Степень инвалидизации по шкале EDSS (расширенная шкала инвалидизации) составляла 1,0-4,0 балла. В среднем в 1 группе - 1,5 балла, во 2 группе - 2,3 балла. В группу контроля вошли 72 здоровых мужчин. Критериями отбора в контрольную группу являлись: отсутствие неврологических, аутоиммунных, аллергических и других хронических заболеваний,

Проведенный анализ суточной динамики показателей НСТ-теста моноцитов в контрольной и в опытных группах пациентов показал, что максимальная активность приходится на вечернее время, а минимальная - на утренние часы (табл.1). Установлено, что временной интервал с 6.00 до 9.00 часов утра является информативным, так как в это время создаются оптимальные условия для определения НСТ-теста. Это время совпадает с графиком работы большинства лабораторий лечебных учреждений и исключает вмешательство в биологические ритмы обследуемых пациентов (обследование в ночные часы обусловливало бы необходимость пробуждения больных для обследования и срыв биологических часов). Результаты исследований показали, что повышение базовой активности НСТ-теста выше 53% и снижение отношение показателей стимулированного пирогеналом НСТ-теста к базовому значению НСТ-теста ниже 1,5 является прогностическим признаком обострения заболевания РРС. Выявленная зависимость между показателями фагоцитарной активности моноцитов и степенью активности PC позволяет использовать эти показатели как диагностические критерии в прогнозировании обострений РРС.

Оценка экономического и положительного эффекта предлагаемого способа проведена по сравнению с прототипом и представлена в таблице 2.

Предложенный нами экспресс-способ прогнозирования обострений РРС позволяет своевременно провести патогенетический курс лечения РРС, сокращает время проведения лабораторного анализа и не требует больших материальных затрат. Общий экономический эффект на проведение 100 анализов составил 503 тыс. рублей.

Таблица 1 Суточная динамика показателей активации моноцитов по результатам определения НСТ-теста Лабораторные тесты Группы пациентов Время суток (в часах) 6.00-9.00 12.00-15.00 18.00-21.00 24.00-3.00 НСТ-тест (в %) Контрольная группа 37,19±0,81* 39,56±0,75 55,74±0,45* 42,87±0,31 Больные РРС без обострений 41,01±1,15* 48,68±0,74 61,86±1,45* 48,86±1,75 Больные РРС с обострениями 54,68±1,48 56,98±1,45 55,12±2,12 57,01±1,36 Коэффициент активации НСТ-тест моноцитов Контрольная группа 5,16±0,03* 2,64±0,06 2,5б±0,02* 3,72±0,08 Больные РРС без обострений 1,7±0,07 1,5±0,12 1,6±0,11 1,36±0,13 Больные РРС с обострениями 1,38±0,11 1,39±0,08 1,18±0,02 1,16±0,05 Примечание: *- значения, достоверно отличающиеся от среднесуточного уровня (р<0,05);

Таблица 2 Отличительные признаки предложенного способа по сравнению с прототипом Признаки Прототип Предлагаемый способ Кратность обследования больного Двукратно Однократно Хронобиологический анализ Не проводится Проводится Использование дорогостоящих реактивов Используются Не используются Характеристика лабораторных исследований Определение содержания в крови HLA-DR+, лимфоцитов, иммуноглобулинов класса М и вычисление индекса миграции лейкоцитов Определение НСТ-теста моноцитов Затраты на обследование одного больного 5150 руб. 120 руб.

Изобретение относится к области медицины, а именно неврологии, и описывает способ прогнозирования обострений ремиттирующего рассеянного склероза (РРС), где у больных берут кровь в период с 6.00 до 9.00 часов утра и определяют показатели НСТ-теста моноцитов до и после стимуляции пирогеналом, при значениях НСТ-теста выше 53% и при значениях коэффициента активации НСТ-теста моноцитов ниже 1,5 прогнозируют обострение РРС. Предложенный способ легко воспроизводим, объективен, экономичен и сокращает сроки проведения лабораторных анализов. 3 пр., 2 табл.

Способ прогнозирования обострений ремиттирующего рассеянного склероза, отличающийся тем, что у больных берут кровь в период с 6.00 до 9.00 ч утра и определяют показатели НСТ-теста моноцитов до и после стимуляции пирогеналом, при значениях НСТ-теста выше 53% и при значениях коэффициента активации НСТ-теста моноцитов ниже 1,5 прогнозируют обострение РРС.