Способ определения активности патологического процесса у больных рассеянным склерозом Российский патент 2017 года по МПК G01N33/49 

Изобретение относится к медицине, а именно к неврологии и иммунологии, в частности к лабораторной диагностике рассеянного склероза.

Рассеянный склероз (PC) - дизимунно-нейродегенеративное заболевание ЦНС, которое поражает в основном лиц трудоспособного возраста и со временем приводит к инвалидизации. Рассеянный склероз является самым распространенным после черепно-мозговой травмы, органическим заболеванием ЦНС среди лиц молодого возраста, а показатели его распространенности в мире имеют тенденцию к увеличению. У большинства (около 85%) пациентов первоначально диагностируется ремиттирующий PC, течение которого характеризуется чередованием периодов обострений и ремиссий (период полного или частичного восстановления). Своевременная диагностика обострений патологического процесса и назначение эффективной терапии значительно улучшает прогноз заболевания и качество жизни пациентов.

В настоящее время для оценки активности патологического процесса у больных с рассеянным склерозом используют критерии Макдональда, предложенные международной экспертной группой. Эти критерии учитывают клинические проявления, данные магнитно-резонансной томографии (МРТ) головного и спинного мозга и наличие олигоклональных антител (ОАТ) в цереброспинальном ликворе (Polman С.Н., Reingold S.C., Banwell В. et al. Diagnostic criteria for multiple sclerosis. Annals of neurology. - 2011. - Vol. 69, №2. - P. 292-302).

Однако регистрация клинических проявлений заболевания не представляется возможной при радио логически изолированных формах PC. МРТ головного мозга с контрастирующим агентом, безусловно, является наиболее достоверным методом оценки активности патологического процесса у больных с рассеянным склерозом, однако имеет целый ряд противопоказаний: беременность и период кормления грудью, аллергическая реакция на контрастирующий препарат, преклонный возраст пациентов и др. Кроме того, МРТ регистрирует только всплески наибольшей активности, в то время как обострения могут протекать латентно, без клинических признаков и инструментально фиксируемых проявлений. ОАТ обычно определяются у больных в 90-95% случаев, однако, их может не быть в дебюте заболевания, и их наличие не коррелируют с активностью PC.

Известен способ дифференциальной диагностики ремитирующего и вторично-прогрессирующего типа течения рассеянного склероза (Патент №2428693, МПК G01N 33/48, G01N 33/50, публ. 2006 г.), основанный на определении глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в эритроцитах периферической крови у пациентов с рассеянным склерозом. Сущность данного способа дифференциальной диагностики заключается в том, что проводят определение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в эритроцитах периферической крови у пациентов, страдающих рассеянным склерозом. При превышении активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в эритроцитах периферической крови на 80% и более относительно показателей для здоровых лиц диагностируют ремиттирующий тип течения рассеянного склероза. При снижении активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в эритроцитах периферической крови у пациентов с рассеянным склерозом на 25% и более относительно показателей для здоровых лиц диагностируют вторично-прогрессирующий тип течения рассеянного склероза.

К недостаткам этого способа относятся низкая точность диагностики, основанная на неспецифических показателях биохимической активности эритроцитов, которые не являются одним из патогенетических звеньев заболевания и могут изменяться в широком диапазоне в зависимости от активности любых воспалительных реакций.

Известен способ диагностики характера течения рассеянного склероза (Патент №2034299, МПК G01N 33/50, публ. 1995 г.), основанный на определении активности Na⁺K⁺АТФазы в эритроцитах крови в зависимости от концентрации АТФ (в интервале от 5⋅10^-5 до 8⋅10^-4 М АТФ) при температуре 35°С и прогнозируют обострение PC при значениях константы Михаэлиса (K_M) 1,07⋅10^-5 - 4,55⋅10^-7 М АТФ, а при значениях K_M, равных 0,83⋅10^-5 - 3,57⋅10^-7 М АТФ - ремиссию.

Недостатками данной методики является длительность и сложность ее постановки, неспецифичность полученных результатов, основанная на биохимических показателях эритроцитов, которые не являются одним из патогенетических звеньев заболевания и могут изменяться в широком диапазоне при различных патологических состояниях.

Наиболее близким является способ определения активности патологического процесса у больных рассеянным склерозом (Патент №2116652, МПК G01N 33/53, публ. 1998 г.) путем количественного определения CD8+ лимфоцитов после инкубации лимфоцитов больного с мозгоспецифическими белками - опыт и после инкубации без мозгоспецифических белков - контроль. Если содержание CD8+ лимфоцитов в опыте возрастает выше уровня, характерного для больных в состоянии ремиссии, делают вывод об активном патологическом процессе у больного рассеянным склерозом.

Недостатками данного способа являются длительность проведения методики, необходимость использования сложного и разнообразного оборудования, флюоресцентных красителей, субъективность анализа (клетки наблюдают и подсчитываются ручным способом под люминесцентным микроскопом).

Задачей настоящего изобретения является устранение указанных недостатков путем разработки способа определения активности патологического процесса, позволяющего сократить время исследования, снизить стоимость диагностики, обеспечить оперативную и объективную оценку морфофункционального состояния лимфоцитов крови, участвующих в патогенезе заболевания, повысить точность диагностики активности течения рассеянного склероза.

Для этого при определении активности патологического процесса у больных рассеянным склерозом, включающем количественное определение лимфоцитов периферической крови, предложено исследование лимфоцитов проводить методом компьютерного микроэлектрофореза в условиях переменного электромагнитного поля при значении частоты переменного тока 0,25 Гц, напряжения 28 В. При этом определяют общее количество лимфоцитов, количество неподвижных лимфоцитов и среднюю амплитуду колебаний подвижных лимфоцитов, и при количестве неподвижных лимфоцитов менее 10% и средней амплитуде колебаний подвижных лимфоцитов в пределах 8,0-11,0 мкм диагностируют обострение патологического процесса. При количестве неподвижных лимфоцитов более 10% и более, амплитуде колебаний подвижных лимфоцитов в пределах 5,0-7,0 мкм определяют ремиссию патологического процесса.

В основе определения активности патологического процесса у больных PC лежит оценка электрофоретических свойств лимфоцитов периферической крови, представляющих одно из основных звеньев патогенеза рассеянного склероза, которую проводят с использованием компьютерного микроэлектрофореза (МЭФ) на базе модуля аппаратно-программного комплекса (АПК) «Биони-МЭФ» (ТУ 9443-002-17390471-2012, ООО «Весттрейд», Москва).

Биофизические основы метода заключаются в оценке электрического поверхностного заряда мембраны лимфоцитов (Z-потенциала), который входит в число важнейших показателей клеточного гомеостаза и обусловлен наличием на мембране заряженных группировок, включая карбоксильные группы сиаловых кислот, заряженные группы белков и липидов. Считается, что Z-потенциал является постоянной величиной и определен генотипом клетки. При обострении патологического процесса количество иммунных комплексов и степень их связывания с рецепторами мембраны лимфоцитов увеличивается, вызывая изменение заряда их поверхности и, соответственно, их электрофоретических свойств: подвижности лимфоцитов и амплитуды их движения в условиях переменного электромагнитного поля.

На фиг. 1 представлены неподвижные лимфоциты и треки колебаний подвижных лимфоцитов.

Способ осуществляется следующим образом.

Цельную венозную кровь забирают из кубитальной вены в объеме 3 мл в пластиковую пробирку с добавлением 25 ед. гепарина на 1 мл для предотвращения свертывания крови. Лимфоциты выделяют по стандартной методике (Новиков Д.К., Новикова В.И. Клеточные методы иммунодиагностики. - Минск: Беларусь, - 1979. - С. 20-27).

В пробирку с 300 мкл 0,3М сахарозы добавляют 30 мкл взвеси лимфоцитов и тщательно перемешивают. 40 мкл полученной суспензии клеток в растворе сахарозы с помощью дозатора помещают в центр рабочей зоны электрофоретической ячейки между электродами. Включают исполнительный блок «Цито-Эксперт», устанавливают необходимые значения частоты 0,25 Гц и напряжения 28 В на электродах электрофоретической камеры. Заправленную электрофоретическую камеру располагают на столике микроскопа так, чтобы объектив находился над центром рабочей зоны. Фокусируют объектив микроскопа на препарате до появления четкого изображения клеток крови на дисплее компьютера. Подают напряжение на электроды камеры, делают запись 2-3 полных колебаний клеток. Лимфоциты снимают в течение 15 секунд по 4 поля зрения. Далее проводят автоматическую обработку записанных видеофайлов. По завершении обработки автоматически оцениваются следующие параметры анализируемой популяции лимфоцитов:

- общее количество лимфоцитов в пробе;

- процент неподвижных лимфоцитов (%);

- среднее значение амплитуды колебаний подвижных лимфоцитов (мкм).

По предлагаемому способу изучены электрофоретические свойства лимфоцитов периферической крови 25 больных с верифицированным диагнозом рассеянного склероза. Стадию обострения и стадию ремиссии PC идентифицировали на основании клинической картины и данных МРТ. Группу контроля составили 30 здоровых добровольцев (средний возраст 32,7±5,1 лет). Оценку электрофоретических свойств лимфоцитов проводили с использованием компьютерного микроэлектрофореза (МЭФ) на базе модуля аппаратно-программного комплекса (АПК) «Биони-МЭФ».

При исследовании электрофоретических свойств лимфоцитов периферической крови в контрольной группе и группе больных рассеянным склерозом, у которых определяли активность патологического процесса по предлагаемому способу, установлено, что в норме у практически здоровых добровольцев число неподвижных лимфоцитов составляет от 20 до 30%, средняя амплитуда колебаний подвижных лимфоцитов находится в диапазоне 2,0-5,0 мкм.

У больных PC в стадии обострения отмечается высокая активность лимфоцитов: процент неподвижных лимфоцитов снижается преимущественно в 3 раза и составляет менее 10%, средняя амплитуда колебаний подвижных лимфоцитов увеличивается в 2 раза, находится в диапазоне 8,0-11,0 мкм.

У больных PC в стадии ремиссии активность лимфоцитов превышает нормальные значения контрольной группы, но является достоверно ниже показателей больных с обострением PC: процент неподвижных лимфоцитов составляет более 10%, преимущественно находится в пределах 11-15%, а средняя амплитуда колебаний подвижных лимфоцитов смещается в диапазон значений - 5,0-7,0 мкм.

В таблице 1 суммированы результаты исследования электрофоретической активности лимфоцитов здоровых добровольцев и больных рассеянным склерозом в стадии обострения и ремиссии.

Пример 1.

Пациент В., 33 года. Клинический диагноз: Рассеянный склероз. Ремиттирующее течение. Получает лечение копаксоном. 1-й эпизод заболевания произошел в мае 2011 г. и сопровождался онемением и парестезиями в правой руке примерно в течение 1 месяца. В мае 2012 года произошло обострение заболевания, сопровождавшееся симптомами: двоение в глазах, головокружение, повышенная утомляемость. EDSS 1,5 балла. Обострение PC идентифицировали на основании клинической картины и данных МРТ. Для лечения обострения заболевания больной получали пульс-терапию метилпреднизолоном в суммарной дозе 5000 мг в течение 7 дней. Стойкая ремиссия наблюдается с 14.09.2012 г.

При плановом обследовании для определения активности патологического процесса проведено исследование лимфоцитов по предлагаемому способу. Результат МЭФ от 09.03.2015 г: количество лимфоцитов в пробе - 76; процент неподвижных лимфоцитов - 13,7%; средняя амплитуда колебаний подвижных - 6,7 мкм. Заключение: рассеянный склероз в стадии ремиссии.

Для подтверждения состояния пациента проведена магнитно-резонансная томография головного мозга (протокол исследования от 10 марта 2015 г.): МРТ картина множественных очагов демиелинизации в белом веществе больших полушарий. Легкая гипертрофия слизистых оболочек левого верхнечелюстного синуса и решетчатых ячеек воспалительного генеза. Данных за активные очаги не получено.

Пример 2.

Пациентка А., 39 лет. Клинический диагноз: Рассеянный склероз. Ремиттирующее течение. Обострение. Легкий центральный парез левой нижней конечности. Легкий атактический синдром.

В октябре 2015 года впервые обратилась к врачу с жалобами на онемение, парестезии в левом бедре, в левой голени, в области промежности, нарушение дефекации. Ранее отмечала эпизоды онемения в области бедер в 2011 году и в июле 2013 года. К врачу не обращалась и лечения не получала. С начала ноября появилось онемение в руках, на туловище, ослабла левая нога. Балл EDSS 2,5 (в период обострения). Терапии ПИТРС не получает.

Результаты МЭФ от 03.11.2011 г.: количество лимфоцитов в пробе - 75; процент неподвижных лимфоцитов - 9,43%; средняя амплитуда колебаний подвижных лимфоцитов - 8,97 мкм. Заключение: обострение рассеянного склероза.

Для подтверждения состояния пациента проведена магнитно-резонансная томография головного мозга (протокол исследования от 3 ноября 2015 г.): МРТ картина демиелинизирующего процесса головного мозга. Обострение рассеянного склероза. Незначительная наружная открытая гидроцефалия.

Пациентке проведена гормональная терапия метил-преднизолоном (Солу-Медролом), Омез, Октолипен, диета №15, витамины B1, В6, В12.

Выписана в удовлетворительном состоянии. В клинической картине сохраняются парестезии нижней части туловища. EDSS 2,0 баллов.

Проведено повторное исследование электрофоретической подвижности лимфоцитов. Результаты МЭФ после лечения (09.11.2015): количество лимфоцитов в пробе - 67; процент неподвижных лимфоцитов - 13,43%; амплитуда колебаний подвижных - 5,24 мкм. Заключение: рассеянный склероз в стадии ремиссии.

Таким образом, изменение электрофоретических показателей лимфоцитов периферической крови (уменьшение амплитуды колебаний, увеличение процента неподвижных лимфоцитов) коррелирует с исчезновением клинико-функциональных симптомов болезни и нормализацией лабораторных показателей.

Преимуществами метода, предлагаемого нами, является то, что он является существенно более простым в выполнении, не требует использования дорогостоящих лабораторных расходных материалов, позволяет получать результат практически в режиме реального времени в течение 3-5 минут, что дает возможность непосредственно в процессе наблюдения за пациентом отслеживать динамику течения заболевания и своевременно вносить изменения в протокол лечебных и реабилитационных процедур.

Полученные нами результаты указывают, что экспресс-анализ морфофункционального состояния лимфоцитов периферической крови больных с рассеянным склерозом на основе их электрофоретических показателей является эффективным и экономически оправданным. Электрофоретические показатели являются достаточно информативными и объективными. Применение предлагаемого способа исследования будет способствовать ранней диагностике обострений рассеянного склероза и оперативной оценке эффективности проводимых лечебных мероприятий.

Изобретение относится к медицине, а именно к неврологии и иммунологии, в частности к лабораторной диагностике рассеянного склероза. Предложено исследование лимфоцитов проводить методом компьютерного микроэлектрофореза в условиях переменного электромагнитного поля при значении частоты переменного тока 0,25 Гц, напряжения 28 В. При этом определяют общее количество лимфоцитов, количество неподвижных лимфоцитов и среднюю амплитуду колебаний подвижных лимфоцитов, и при количестве неподвижных лимфоцитов менее 10% и средней амплитуде колебаний подвижных лимфоцитов в пределах 8,0-11,0 мкм диагностируют обострение патологического процесса. При количестве неподвижных лимфоцитов 10% и более, амплитуде колебаний подвижных лимфоцитов в пределах 5,0-7,0 мкм определяют ремиссию патологического процесса. Применение предлагаемого способа исследования способствует ранней диагностике обострений рассеянного склероза и оперативной оценке эффективности проводимых лечебных мероприятий. 1 ил., 1 табл., 2 пр.

Способ определения активности патологического процесса у больных рассеянным склерозом, включающий количественное определение лимфоцитов периферической крови, отличающийся тем, что исследование лимфоцитов проводят методом компьютерного микроэлектрофореза в условиях переменного электромагнитного поля при значении частоты переменного тока 0,25 Гц, напряжения 28 В, при этом определяют общее количество лимфоцитов, количество неподвижных лимфоцитов и среднюю амплитуду колебаний подвижных лимфоцитов, и при количестве неподвижных лимфоцитов менее 10% и средней амплитуде колебаний подвижных лимфоцитов в пределах 8,0-11,0 мкм диагностируют обострение патологического процесса, а при количестве неподвижных лимфоцитов более 10% и средней амплитуде колебаний подвижных лимфоцитов в пределах 5,0-7,0 мкм - ремиссию патологического процесса.