Фармацевтическая композиция для улучшения реологических свойств мокроты на основе фермента нуклеазы Serratia marcescens Российский патент 2019 года по МПК A61K38/46 A61P11/12 

Предлагаемое изобретение относится к областям биохимии и медицины, конкретно - к области высокомолекулярных соединений, а также к области ферментов и предназначено для улучшения реологических свойств мокроты, под которым заявитель понимает снижение вязкости мокроты за счет ферментативного гидролиза высокополимерной ДНК мокроты, при лечении болезней дыхательной системы. Примеры болезней, при которых требуется улучшения реологических свойств мокроты из-за затруднения процесса ее эвакуации, включают, но ими не ограничиваются, муковисцидоз, хронический бронхит, трахеобронхит, ларингит, синдром Картагенера, эмфизему легочных тканей, хроническую обструктивную болезнь легких, бронхоэктазную болезнь, бронхиальную астму, синусит, гайморит.

На дату подачи заявки в мире существует проблема нарушения функций органов дыхания из-за накопления мокроты (вязкого гнойного секрета) в дыхательных путях больных, например, муковисцидозом, или хроническим бронхитом, или хронической обструктивной болезнью легких, или бронхоэктазной болезнью и пр. Нарушение вентиляции бронхо-легочной системы, например, при хроническом бронхите микробной или вирусной этиологии, может привести к респираторной обструкции. Закупорка вязкой мокротой мелких дыхательных путей, которая наблюдается, например, при бронхоспазме, или воспалении, или отеке, или дискинезии, может привести к обострению астмы. Смертельным заболеванием является муковисцидоз - системное наследственное заболевание, обусловленное мутацией гена трансмембранного регулятора муковисцидоза и характеризующееся поражением желез внутренней секреции, включая, например, тяжелые нарушения функций органов дыхания. «Муковисцидоз - самое частое наследственное заболевание, приводящее к смерти… муковисцидозом в Российской Федерации страдает приблизительно 8000 человек, большинство из которых в возрасте до 30 лет» [патент РФ №2522846, описание, стр. 2, абзац 2] [1]. Продолжительность и качество жизни больных муковисцидозом находятся в прямой зависимости от непрерывного эффективного выведения из дыхательной системы мокроты, отличающейся высокой вязкостью. «Если вовремя выявить заболевание и правильно лечить больного с самого рождения, он может дожить до 40-50 лет». [http://www.medlinks.ru/article.php?sid=27801, 2-й абзац] [2].

Заявленное техническое решение направлено на решение проблемы улучшения реологических свойств вязкой мокроты, что может быть использовано для улучшения выведения мокроты из дыхательной системы, уменьшения ее накопления в дыхательных путях, улучшения функции органов дыхания больных.

Мокрота представляет собой гель, вязкость которого обусловлена содержанием двух макромолекул - мукоидных гликопротеидов и ДНК, являющихся полимерами (см. цитату далее):

«Мокрота представляет собой гель, образованный молекулами гликопротеинов, соединенных между собой поперечными дисульфидными, кальциевыми, водородными и электростатическими связями. Вязкость бронхиального секрета обусловлена содержанием двух макромолекул: мукоидных гликопротеидов и ДНК. Главным источником ДНК являются распадающиеся полиморфно-ядерные нейтрофилы, которые скапливаются в дыхательных путях в ответ на хроническую бактериальную инфекцию, а также биопленки микробных агентов, в особенности Р.aeruginosa. Вязкая мокрота обнаруживается при муковисцидозе, бронхиальной астме. При хронических неспецифических заболеваниях легких выявлена зависимость между величиной вязкости мокроты и содержанием в ней мукополисахаридов, ДНК, нейтрофилов и других продуктов воспалительной реакции. Так, вязкость слизисто-гнойной и гнойной мокроты существенно выше, чем слизистой» [патент РФ №2559522, описание, стр. 2, абзац 2] [3].

Из исследованного заявителем уровня техники известно, что для выведения мокроты из дыхательной системы используют как инструментальные бронхологические способы, так и медикаментозные средства.

Бронхологические способы включают в себя, например, массаж грудной клетки, позиционный дренаж, термовибротерапию, эндобронхиальный лаваж или бронхоскопическую санацию. «Недостатком бронхологических способов является то, что они травматичны, трудоемки для выполнения, и опасны осложнениями» [патент РФ №2541835, описание, 2 абзац] [4].

Медикаментозные средства представлены, например, стабилизаторами проницаемости капилляров, в том числе нестероидными противовоспалительными препаратами, или кортикостероидными гормонами, или антибактериальными препаратами и др., например, корректорами нарушения водного баланса и регидратации слизи, в том числе минеральной водой и изотоническими растворами в сочетании с обильным питьем и ингаляцией, например:

- физраствором [http://cc-t1.ru/stati/fizrastvor_dlja_ingaljacij.html] [5];

- мукорегуляторами или муколитиками непрямого действия, в том числе бромгексином или карбоцистеином;

- муколитиками прямого действия, в том числе тиолом ацетилцистеином или ферментами протеолитического действия: трипсином, 6-химотрипсином, стрептокиназой, или ферментами нуклеолитического действия - дезоксирибонуклеазами (ДНКазами).

Ферменты нуклеолитического действия - ДНКазы - наиболее близки по назначению к заявленному изобретению. Ниже заявителем приведены аналоги заявленного технического решения по назначению.

«В … группу препаратов, разрушающих высокополимерную ДНК мокроты (ДНКаз или, по иному, дорназ), относят стрептодорназу (ДНКазу, выделенную из стрептококков), человеческую рекомбинантную ДНКазу (ДНКазу I и ДНКазу II) и бычью дезоксирибонуклеазу, выделенную из поджелудочной железы крупного рогатого скота. Как ДНКазу быка, так и рекомбинантную ДНКазу I человека применяют в виде ингаляции для снижения вязкости мокроты и, таким образом, облегчения ее эвакуации при лечении муковисцидоза, хронического бронхита» [3].

Однако, кроме заявленной, но ничем не подтвержденной авторами [3] информации о свойстве стрептодорназы разрушать высокополимерную ДНК мокроты, заявителем на дату подачи заявки не выявлено иных технических решений, направленных на разрушение ДНК в составе мокроты ферментом стрептодорназа. Исходя из указанного, стрептодорназа не рассматривалась заявителем в качестве аналога по назначению.

В описание к патенту РФ №2502803 [Орлова Н.А., Воробьев И.И. «Плазмида для экспрессии в клетках бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, неактивного предшественника ДНКазы I человека или ее мутеинов, бактерия, принадлежащая к роду Escherichia, - продуцент неактивного предшественника рекомбинантной ДНКазы I человека или ее мутеина, предшественник рекомбинантной ДНКазы I человека или ее мутеина, способ получения рекомбинантной ДНКазы I человека или ее мутеина, способ получения конъюгатов полиэтиленгликоля и рекомбинантного мутеина ДНКазы I человека, ферментативно активный конъюгат мутеина рекомбинантной ДНКазы I человека», стр. 3, абзац 6] [6] отмечено, что «бычья панкреатическая ДНКаза I (дорназа) была разрешена к клиническому применению в США в 1958 г. как муколитическое средство ингаляционного и парентерального применения, однако из-за многочисленных побочных эффектов вышла из медицинского употребления».

«Очевидной заменой лекарственных препаратов ДНКазы I быка является рекомбинантная высокоочищенная ДНКаза I человека» [6], имеющая название «Дорназа альфа». Таким образом, «Дорназа альфа» - это рекомбинантная человеческая ДНКаза (рчДНКаза), представляющая собой генно-инженерный вариант природного фермента человека, «при промышленном производстве которого применяется система экспрессии рчДНКазы, основанная на использовании культивируемых клеток яичника китайского хомячка (СНО-DP7), содержащих множественные копии трансгена рчДНКазы под контролем раннего промотора цитомегаловируса» [6].

Дорназа альфа является основным действующим компонентом отхаркивающего муколитического средства под торговым названием «Пульмозим^®» (далее по тексту «Пульмозим»), которое используется для снижения вязкости гнойных секретов легких при лечении больных некоторыми хроническими заболеваниями: бронхоэктатической болезнью, хронической обструктивной болезнью легких, врожденным пороком развития легких у детей, хроническими пневмониями, иммунодефицитными состояниями, протекающими с поражением легких и др. [https://medi.ru/instrukciya/pulmozim_5916/] [7]. Лечебная эффективность препарата основывается на его способности гидролизовать высокомолекулярную ДНК мукоальвеолярного секрета больных, что снижает вязкость секрета.

Основными недостатками «Пульмозима», являются:

- во-первых, высокая стоимость препарата. Например, известно, что курсовая доза препарата «Пульмозим» на месяц стоит более 1000 евро [https://www.9months.ru/zdorovie_malysh/1310/mukoviscidoz] [8].

Причины высокой стоимости «Пульмозима» лежат в использовании «дорогостоящей культуральной среды» [6] для культивирования клеток яичника китайского хомячка и «сложной системы очистки продукта, включающей стадии вирус-инактивации» [6], без которой велик риск контаминации получаемого препарата прионами и вирусами животных из-за использования культуры клеток млекопитающих [3].

- во-вторых, быстрое снижение дезоксирибонуклеазной активности при хранении в растворах и в мокроте в случае его применения. Например, известно, что «у больных муковисцидозом средняя концентрация дорназы альфа в мокроте через 15 мин после ингаляции 2,5 мг фермента (2500 ЕД) равняется примерно 3 мкг/мл» [https://medi.ru/instrukciya/pulmozim_5916/] [7], то есть снижается примерно в 300 раз.

Причинами быстрого снижения дезоксирибонуклеазной активности считают дезамидирование и образование агрегатов в растворах, системную абсорбцию в трахеобронхиальном дереве, протеолиз протеиназами лейкоцитов и бактерий, подавление ферментативной активности актином, содержащимся в мукоальвеолярном секрете в больших количествах, особенно у больных муковисцидозом [3]. Известно, что актин подавляет дезоксирибонуклеазную активность «Дорназы альфа» при связывании с трипептидом Tyr65-Val66-Val 67 этого фермента [Fujihara J., et. al., Actin-inhibition and folding of vertebrate deoxyribonuclease I are affected by mutations at residues 67 and 114. Comparative Biochemistry and Physiology, Part В 143 (2006) 70-75] [9].

Заявителем выявлены технические решения, направленные на исправление указанных недостатков.

Например, заявителем выявлено изобретение по патенту США №2001041360 (A1) «Human DNase I variants» [10]. Сущностью известного технического решения является создание устойчивого к актину варианта человеческой ДНКазы I, устойчивого к актину варианта человеческой ДНКазы I с аминокислотной последовательностью, отличающейся от аминокислотной последовательности, изображенной на Рис. 1, заменой одной аминокислоты на другую в любой одной позиции в пределах аминокислотной последовательности, представленной на Рис. 1, устойчивого к актину варианта человеческой ДНКазы I с аминокислотной последовательностью, отличающейся от аминокислотной последовательности, изображенной на Рис. 1, заменой одной аминокислоты на другую в двух или более позициях в пределах аминокислотной последовательности, представленной на Рис. 1, выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая устойчивый к актину вариант человеческой ДНКазы I, способ лечения пациента с легочным заболеванием или расстройством, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества актинорезистентного варианта ДНКазы человека, фармацевтическая композиция, содержащая актинорезистентный вариант ДНКазы человека 1 и необязательно фармацевтически приемлемый наполнитель.

Кратко говоря, известное техническое решение направлено на создание устойчивого к актину варианта человеческой ДНКазы I.

Недостатком известного технического решения служит то, что «применение таких мутантных форм ДНКаз закономерно приводит к появлению иммунного (в том числе антительного) ответа на такой чужеродный антиген и возникновению аллергических реакций или нейтрализации (антительному связыванию) фермента» [Описание к Патенту [3], абзац 9].

Выявлено изобретение по патенту РФ №2559522 [3], направленное на «создание ингаляционной лекарственной формы лекарственного препарата на основе других вариантов ДНКаз, с одной стороны, не инактивируемых актином, а с другой стороны, не вызывающих иммунологического ответа организма и не теряющих энзиматическую активность при лиофилизации и дальнейшем растворении перед ингаляцией с оптимальным соотношением солей кальция и магния и содержащих в качестве криопротектора лактозу, обеспечивающего приемлемые реологические свойства раствора, как предназначенного для ингаляции».

Сущностью известного технического решения является создание синтетического гликопротеина рчДНКазы, полученной экспрессией гена рчДНКазы в бактериях E.coli, который не инактивируется актином, отличается повышенной устойчивостью при хранении и отсутствием отмеченных недостатков по изобретению [10].

1. Лиофилизированная лекарственная форма гликопротеина дезоксирибонуклеазы I человека для приготовления ингаляционного раствора для снижения вязкости мокроты, отличающаяся тем, что указанный гликопротеин, представляющий собой рекомбинантную дезоксирибонуклеазу I человека, получаемую в микроорганизме Е. coli и ковалентно связанную своим N-концом с полисахаридом, содержащим от 65 до 80 звеньев альфа-2,8 сиаловой кислоты в полисахаридной цепи, следующей формулы:

используется в качестве активного вещества, а в качестве вспомогательных веществ используются магния хлорид, кальция хлорид и лактоза при следующем соотношении компонентов, мас. %:

гликопротеин формулы I 45,0±5,0 магния хлорид 3,5±0,5 кальция хлорид 4,0±0,5 лактоза 45,0±5,0

2. Способ получения лекарственной формы по п. 1, отличающийся тем, что к водному раствору синтетического гликопротеина формулы I добавляют водный раствор, содержащий магния хлорид, кальция хлорид, лактозу при следующем соотношении компонентов, мас. %: гликопротеин формулы I (45,0±5,0), магния хлорид (3,5±0,5), кальция хлорид (4,0±0,5), лактоза (45,0±5,0); перемешивают, затем стерильно разливают во флаконы боросиликатного стекла, лиофилизируют, заполняют флаконы стерильным азотом, стерильно укупоривают флаконы пробками и обжимают колпачками.

Выявлено изобретение по патенту РФ №2522846 [1], направленное на создание лекарственного препарата и способа улучшения реологических свойств мокроты и ингаляционное применение такого препарата. Сущностью известного технического решения является лекарственный препарат для улучшения реологических свойств мокроты и подавления образования бактериальных биопленок в бронхах, у больного муковисцидозом, содержащий в качестве активного вещества эффективное количество рекомбинантной дезоксирибонуклеазы -1 человека, ковалентно связанной с гомополимерным полисахаридом, содержащим 80 звеньев альфа-2,8 сиаловой кислоты. Способ улучшения реологических свойств мокроты и подавления образования бактериальных биопленок в бронхах при муковисцидозе, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества лекарственного препарата, содержащего в качестве активного вещества рекомбинантную дезоксирибонуклеазу-1 человека, ковалентно связанную с гомополимерным полисахаридом, содержащим 80 звеньев альфа-2,8 сиаловой кислоты. Применение лекарственного препарата, содержащего в качестве активного вещества рекомбинантную дезоксирибонуклеазу -1 человека, ковалентно связанную с гомополимерным полисахаридом, содержащим 80 звеньев альфа-2,8 сиаловой кислоты, в качестве ингаляционного средства для улучшения реологических свойств мокроты и подавления образования бактериальных биопленок в бронхах при лечении муковисцидоза.

Недостатком описанных выше технических решений [1], [3] по сравнению с заявленным техническим решением является то, что экспрессию гена ДНКазы проводят в бактериальных клетках E.coli. При этом «возможности повышенной экспрессии гена … ограничены в связи с токсичностью продукта для клеток-продуцентов. В отличие от эукариот, у которых процессы транскрипции и трансляции проходят в разных клеточных компартментах, в клетке Е. coli эти процессы сопряжены. Наличие активной ДНКазы в цитоплазме приводит к деградации геномной ДНК и последующему лизису бактериальной клетки, поэтому повышенная экспрессия ДНКазы неизбежно приводит к генетической нестабильности клона, т.е. отбор суперпродуцентов одновременно является отбором наиболее генетически нестабильных бактерий» [Из описания к Патенту [6] абзац 11]. Таким образом, разработанная система экспрессии в клетках Е. coli является малопродуктивной и, следовательно, промышленно мало пригодной.

Выявлено изобретение по патенту РФ №2502803 [6], направленное на создание технологии получения ферментативно активной рекомбинантной ДНКазы I человека с высоким выходом.

Сущностью известного технического решения являются плазмида для экспрессии в клетках бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, неактивного предшественника ДНКазы I человека или ее мутеинов, содержащего отщепляемый N-концевой лидер, включающий гексагистидиновый кластер и последовательность узнавания энтерокиназы, по существу, содержащая:

- промотор, функционирующий в бактериальной клетке;

- фрагмент ДНК, кодирующий гексагистидиновый кластер;

- фрагмент, кодирующий последовательность узнавания энтерокиназы, слитую в рамке с ДНКазой I человека или ее функционально активным мутеином, содержащим замены аспарагина на цистеин;

- участок терминации транскрипции;

- фрагмент вектора рЕТ28а(+), содержащий участок инициации репликации бактериофага fl, последовательность, кодирующую аминогликозид-3'-фосфотрансферазу, область начала репликации плазмиды pBR322, ген РНК-организующего белка Rop, последовательность, кодирующую репрессор лактозного оперона.

Бактерия, принадлежащая к роду Escherichia, трансформированная плазмидой по п. 1, - продуцент неактивного предшественника рекомбинантной ДНКазы I человека или ее мутеина, содержащего замены аспарагина на цистеин. Предшественник рекомбинантной ДНКазы I человека или ее мутеина, содержащий отщепляемый N-концевой лидер, включающий гексагистидиновый кластер и последовательность узнавания энтерокиназы, полученный путем культивирования бактерии по п. 6 в питательной среде и предназначенный для получения активной формы ДНКазы 1 человека или ее мутеина. Способ получения рекомбинантной ДНКазы I человека или ее мутеина, включающий культивирование бактерии по п. 6 в питательной среде, выделение телец включения, солюбилизацию белка-предшественника, металлохелатную хроматографию в денатурирующих условиях, рефолдинг белка-предшественника, получение зрелого белка обработкой энтерокиназой и выделение указанного зрелого белка рекомбинантной ДНКазы 1 человека или ее мутеина. Способ получения конъюгатов полиэтиленгликоля и рекомбинантного мутеина ДНКазы I человека, полученного способом по п. 12, включающий предварительное ограниченное восстановление белка, инкубацию с малеимид-полиэтиленгликолем и выделение полученного конъюгата. Ферментативно активный конъюгат мутеина рекомбинантной ДНКазы I человека, содержащего замены аспарагина на цистеин, и полиэтиленгликоля, полученный способом по п. 15.

Недостатком известного технического решения служит сложность получения продукта и его потенциальная антигенность в результате аминокислотных замен.

Наиболее близким по назначению к заявленному техническому решению заявителем выбран препарат «Пульмозим» в качестве прототипа, так как на момент подачи заявки препарат «Пульмозим» является единственным высокоэффективным и широко применяемым в мире средством в терапии муковисцидоза [https://www.medpoisk.ru/bolezni/mukoviscidoz.html#fndtn-panel0] [29], а также высокоэффективным средством для снижения вязкости гнойных секретов легких при лечении больных некоторыми хроническими заболеваниями, например - бронхоэктатической болезнью, хронической обструктивной болезнью легких, врожденным пороком развития легких у детей, хроническими пневмониями, иммунодефицитными состояниями, протекающими с поражением легких и др. [7].

Как было указано выше, основными недостатками «Пульмозима», являются, во-первых, высокая стоимость препарата, во-вторых - быстрое снижение дезоксирибонуклеазной активности при хранении в растворах и в мокроте в случае его применения.

Из исследованного заявителем уровня техники известно, что фермент нуклеаза Serratia marcescens, являющаяся активным ингрединтом в заявленной фармацевтической композиции, лишена целого ряда отмеченных выше у прототипа и аналогов недостатков, например:

- использования дорогостоящей культуральной среды и сложной системы очистки продукта, включающей стадии вирус-инактивации;

- подавления ДНКазной активности актином;

- риска присутствия в получаемом препарате прионов и вирусов животных;

- риска деградации геномной ДНК и последующего лизиса бактериальной клетки в результате повышенной экспрессии гена данного фермента при биосинтезе.

Далее заявителем приведена основная выявленная информация о нуклеазе Serratia marcescens, являющейся активным ингрединтом в заявленной фармацевтической композиции.

Так, заявителем выявлено, что нуклеаза Serratia marcescens имеет:

- уникальный идентификационный номер (Unique ID) C021835 [https://meshb.nlm.nih.gov/record/ui?name=Serratia%20marcescens%20nuclease] [11];

- шифр международного Классификатора Ферментов EC 3.1.30.2 (по базам данных BRENDA, EC2PDB, ExplorEnz, PRIAM enzyme-specific profiles, KEGG Ligand Database for Enzyme Nomenclature, IUBMB Enzyme Nomenclature, IntEnz, MetaCyc или P13717, NUCA_SERMA по сведениям UniProtKB/Swiss-Prot [https://enzyme.expasy.org/EC/3.1.30.2] [12]), которым был заменен первоначальный шифр EC 3.1.4.9, принятый в 1965 г. [http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?ec:3.1.30.2] [13].

Нуклеаза бактерий Serratia marcescens - это продукт структурного гена nuc А, исходно найденного в геноме бактерий Serratia marcescens и позднее клонированного и экспрессированного в клетках бактерий Serratia marcescens и E.coli. [Ball T.K., Saurugger P.N., Benedik M.J. The extracellular nuclease gene of Serratia marcescens and its secretion from Escherichia coli (Ген внеклеточной нуклеазы Serratia marcescens и ее секреция из Escherichia coli) // Gene. - 1987. - V. 57. - P. 183-192] [20] или его синонима - гена nuc [http://www.uniprot.org/uniprot/P13717] [27], или его производного или аналогично синтетического гена, кодирующего нуклеазу бактерий Serratia marcescens, и экспрессионного организма: экспрессия гена осуществляется, но не ограничивается, в клетках про- или эукариот, например в Serratia marcescnes, или например E.coli.

Ген nuc A означает, но не ограничивает, нуклеотидную последовательность, обеспечивающую биосинтез при его экспрессии каталитически активной формы нуклеазы Serratia marcescens, и может иметь нуклеотидные замены, образованные, например, спонтанным или сайт направленным мутагенезом, или делецией или вставкой, что не ограничивает пути достижения генных мутаций и не исключает все прочие возможные варианты, кодирующие нуклеазу бактерий Serratia marcescens и обеспечивающие биосинтез нуклеазы Serratia marcescens при его экспрессии в экспрессионном организме; экспрессия гена осуществляется, что не является ограничением, в клетках про- или эукариот (то есть безядерных организмов и организмов, клетки которых имеют ядро).

Из исследованного заявителем уровня техники известно, что нуклеаза Serratia marcescens - это хорошо изученный фермент, который гидролизует одно- и двуцепочечные ДНК и РНК, а также большинство полинуклеотидов разной степени полимерности с образованием 5'-моно-, ди-, три-, тетра-, пента- и олигонуклеотидов. Каталитическая активность эндонуклеазы при оптимальных условиях в тридцать четыре раза выше аналогичной активности ДНКазы I [17].

У нуклеазы Serratia marcescens определены все уровни структурной организации молекул, механизм действия и механизмы регуляции ферментативной активности [17], [Romanova, J., and Filimonova, M. (2012) The Effects of Addition of Mononucleotides on Sma nuc Endonuclease Activity. The Sci. World J. DOI: 10.1100/2012/454176.] [19].

Из уровня техники заявителем выявлено, например, что в аминокислотной последовательности нуклеазы Serratia marcescens отсутствует трипептид Tyr65-Val66-Val67, который имеется в рчДНКазы и который участвует в связывании рчДНКазы с актином. Следовательно, в отличие от прототипа «Пульмозим», нуклеаза Serratia marcescens не будет связываться с актином, и подавление ДНКазной активности нуклеазы Serratia marcescens актином невозможно.

Из уровня техники заявителем выявлено, что экспрессия нуклеазы в клетках Serratia marcescens, например, не приводит к деградации геномной ДНК и последующему лизису бактериальной клетки, так как данный фермент, во-первых, не накапливается в цитоплазме, а сразу же после экспрессии гена секретируется в окружающую среду, во-вторых, он неактивен в цитоплазме [Benedik, M., and Strych, U. (1998). Serratia marcescens and its extracellular nuclease. FEMS Microbiology Letters 165, 1-13] [17]. Поэтому повышенная экспрессия нуклеазы в клетках Serratia marcescens не приводит к генетической нестабильности бактерий, повышенная экспрессия данного фермента протекает без угрозы снижения жизнеспособности бактерий Serratia marcescen. Следовательно, экспрессия нуклеазы в клетках Serratia marcescens может быть высокопродуктивной и пригодной к использованию в промышленных масштабах.

Для высокопродуктивной экспрессии нуклеазы, например, не требуется дорогостоящая культуральная среда, как для экспрессии гена рчДНКазы в культуре клеток яичника китайского хомячка (аналог «Пульмозим»), так как нуклеаза является продуктом бактерий Serratia marcescens, для культивирования которых с целью биосинтеза нуклеазы используется стандартная питательная среда и стандартные условия аэрации и температурного режима [Заявка на изобретение №2017124309 Способ биосинтеза нуклеазы бактерий Serratia marcescens] [18].

Для выделения высокоочищенной нуклеазы Serratia marcescens, например, не требуются дорогостоящие стадии вирус-инактивации и фильтрации продукта, как в случае получения рчДНКазы в культуре клеток яичника китайского хомячка, так как экспрессия гена нуклеазы протекает в клетках бактерий. Следовательно, риск присутствия в препарате нуклеазы прионов и вирусов животных отсутствует.

Из исследованного уровня техники заявителем выявлено, что нуклеазу бактерий Serratia marcescens применяют, например, в молекулярной биологии и сельском хозяйстве.

Так, из исследованного уровня техники заявителем выявлено, что нуклеаза бактерий Serratia marcescens является действующим веществом в составе комбинированного антирабического препарата, т.е. препарата против бешенства [патент на изобретение РФ №2420309 «Препарат против бешенства»] [21], антивирусного препарата контактного действия [патент на изобретение РФ №2423136 «Антивирусный препарат контактного действия на основе "Бетадина" и эндонуклеазы»] [22], антимикробного препарата [патент на изобретение РФ №2337139 «Антимикробный препарат»] [23].

Нуклеазу бактерий Serratia marcescens применяют в молекулярной биологии в качестве реактива под названием Бензоназа или супернуклеаза и в сельском хозяйстве в качестве основного компонента в составе средства «Эндоглюкин» для профилактики и лечения вирусных заболеваний пчел и стимуляции развития пчелиных семей [Handbook of ELISPOT. Methods and Protocols (Справочник по ELISPOT. Методы и протоколы) / Ed. A. Kalyuzhny. N.Y.: Humana Press, 2005. 336 p.] [24], [патент на изобретение РФ №2038776 «Средство «Эндоглюкин» для профилактики и лечения вирусных заболеваний пчел и стимуляции развития пчелиных семей»] [25].

Кроме этого, из исследованного уровня техники заявителем выявлено, что название нуклеаза Serratia marcescens идентично, но не ограничивается, следующими названиями из выявленных источников:

[https://enzyme.expasy.org/EC/3.1.30.2] [14]:

эндонуклеаза Serratia marcescens,

бактериальная нуклеаза,

бактериальная эндонуклеаза,

Sma nuc;

[http://www.sbcs.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/1/30/2.html] [15]:

Serratia marcescens nuclease,

barley nuclease,

plant nuclease I,

nucleate endonuclease;

[https://meshb.nlm.nih.gov/record/ui?name=Serratia%20marcescens%20nuclease] [16]:

BEN endonuclease,

Benzonase,

Sma protein Serratia marcescens,

benzon nuclease,

endonuclease Serratia marcescens,

endonuclease (Serratia marcescens),

extracellular nuclease Serratia marcescens,

nuclease O,

nuclease SM,

nuclease SM1,

nuclease SM2.

Вышеуказанная основная выявленная информация о нуклеазе Serratia marcescens свидетельствует о том, что нуклеаза бактерий Serratia marcescens является хорошо изученным ферментом, подготовленным для использования не только в области биологии, но и в других областях, например - медицины.

Задачей заявленного технического решения является разработка фармацевтической композиции для улучшения реологических свойств мокроты на основе фермента нуклеазы Serratia marcescens с перспективой дальнейшего использования в качестве эффективного медикаментозного средства, например - муколитика прямого действия.

Техническим результатом заявленного технического решения является фармацевтическая композиция для улучшения реологических свойств мокроты на основе фермента нуклеазы Serratia marcescens, которое при равных с прототипом («Пульмозимом») условиях действия разрушает внутримолекулярные связи молекул ДНК в мокроте с повышенной эффективностью в существенно более низких дозах.

Сущностью заявленного технического решения является фармацевтическая композиция для улучшения реологических свойств мокроты, состоящая из физиологического раствора и фермента нуклеазы в качестве активного ингредиента, представляющего собой продукт гена nuc А или, как синоним, nuc, найденного в геноме бактерий Serratia marcescens или полученного синтетически, обеспечивающего биосинтез каталитически активной в отношении высокополимерной ДНК мокроты формы указанного фермента при его экспрессии в клетках про- или эукариот, в количестве 0,03-0,1 мг/мл. Фармацевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что дополнительно содержит 0,0008 М кальция хлорида дигидрата. Фармацевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что дополнительно содержит до 0,34 М магния сульфата гептагидрата. Фармацевтическая композиция по п. 3, отличающаяся тем, что количество нуклеазы Serratia marcescens составляет 0,1 мг/мл.

Заявленное техническое решение проиллюстрировано Фиг. 1 - Фиг. 6.

На Фиг. 1 представлено фото агарозного гель-электрофореза препарата мокроты, включающего физиологический раствор (0,9% NaCl), после ультразвуковой дезинтеграции (дорожка 2). 1А - окрашивание геля бромистым этидием, 1Б - окрашивание геля Камасси ярко-синим. Маркеры нуклеотидных фрагментов, представленные на дорожке 1 (1А), соответствуют (сверху-вниз) 10000; 8000; 6000; 5000; 4000; 3500; 3000; 2500; 2000; 1500; 1200; 1000; 900; 800; 700; 600; 500 нуклеотидных пар.

На Фиг. 2 представлена Таблица 1 определения ДНКазной активности нуклеазы Serratia marcescens и препарата «Пульмозим» при инкубации с мокротой в условиях действия прототипа.

На Фиг. 3 представлена Таблица 2 ДНКазной активности нуклеазы Serratia marcescens при гидролизе ДНК в составе мокроты при различном катионном составе среды.

На Фиг. 4 представлена Таблица 3 ДНКазной активности нуклеазы Serratia marcescens при различных концентрациях добавленного в инкубационную среду магния сульфата гептагидрата при гидролизе ДНК в составе мокроты в присутствии физиологического раствора.

На Фиг. 5 представлено Таблица 4 влияния различного содержания нуклеазы Serratia marcescens на ее ДНКазную активность при гидролизе ДНК в составе мокроты в присутствии магния сульфата гептагидрата.

На Фиг. 6 представлено фото агарозного гель-электрофореза препаратов мокроты после продолжительного гидролиза в присутствии препарата «Пульмозим» или нуклеазы Serratia marcescens, где:

- Дорожки 2, 5, 8 - препарат мокроты, смешаный в объемном соотношении 5:4 с физиологическим раствором, после 60 мин инкубации при 37°C.

- Дорожки 3, 6, 9 - препарат мокроты, смешанный в объемном соотношении 5:4 с физиологическим раствором, включающим 0,002М MgSO₄×7H₂O, после 60 мин инкубации при 37°C.

- Дорожки 4, 7, 10 - препарат мокроты, смешанный в объемном соотношении 5:4 с физиологическим раствором, включающим 0,002М CaCl₂×2H₂O, после 60 мин инкубации при 37°C.

- Дорожки 2, 3, 4 - препараты мокроты, смешанные, соответственно:

с физиологическим раствором,

с физиологическим раствором, включающим 0,002М MgSO₄×7H₂O,

с физиологическим раствором, включающим 0,002М CaCl₂×2H₂O

и далее смешанные в объемном соотношении 9:1 с водой, после 60 мин инкубации при 37°C.

- Дорожки 5, 6, 7 - препараты мокроты, смешанные, соответственно:

с физиологическим раствором,

с физиологическим раствором, включающим 0,002М MgSO₄×7H₂O,

с физиологическим раствором, включающим 0,002М CaCl₂×2H₂O

и далее смешанные в объемном соотношении 9:1 с препаратом «Пульмозим», после 60 мин инкубации при 37°C.

- Дорожки 8, 9, 10 - препараты мокроты, смешанные, соответственно:

с физиологическим раствором,

с физиологическим раствором, включающим 0,002М MgSO₄×7H₂O,

с физиологическим раствором, включающим 0,002М CaCl₂×2H₂O

и далее смешанные в объемном соотношении 9:1 с нуклеазой Serratia marcescens, после 60 мин инкубации при 37°C.

1А - окрашивание геля бромистым этидием, 1Б - окрашивание геля Камасси ярко-синим. Маркеры нуклеотидных фрагментов, представленные на дорожке 1 (1А), соответствуют (сверху-вниз) 10000; 8000; 6000; 5000; 4000; 3500; 3000; 2500; 2000; 1500; 1200; 1000; 900; 800; 700; 600; 500 нуклеотидных пар.

Поставленная задача решается и технический результат достигается тем, что в состав фармацевтической композиции по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента, улучшающего реологические свойства мокроты, входит фермент - каталитически активная нуклеаза бактерий Serratia marcescens, выделенная в очищенном виде любым из известных в настоящее время и разработанных в дальнейшем способов, например [Vafina, G., Bulatov, E., Zainutdinova, E., and Filimonova, M. (2016) A one-step protocol for chromatographic purification of non-recombinant exogenous bacterial enzyme: nuclease of Serratia marcescens. BioNanoSci, DOI 10.1007/s12668-016-0226-9] [26].

Нуклеаза бактерий Serratia marcescens представляет собой продукт гена нуклеазы Serratia marcescens и обладает желательными гидролизующими свойствами, которые делают ее идеально подходящей для медикаментозной и профилактической терапии болезненных состояний, ассоциированных с затрудненным выведением мокроты путем разрушения ДНК мокроты при физиологических условиях, а именно - в присутствии физиологического раствора, или в присутствии катионов магния и физиологического раствора, или в присутствии катионов кальция и физиологического раствора.

Выбор активного ингредиента для предлагаемой композиции основан на результатах исследований, проведенных авторами настоящего технического решения и обнаруживших способность внеклеточной нуклеазы бактерий Serratia marcescens разжижать мокроту путем разрушения внутримолекулярных связей ДНК в мокроте [статья "Endonuclease from gram-negative bacteria Serratia marcescens is as effective as Pulmozyme in the hydrolysis of DNA in sputum", опубликованная 13 февраля 2018 г. в журнале Frontiers in Pharmacology [http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fphar.2018.00114/full?&utm_source=Email_to_authors_&utm_medium=Email&utm_content=T1_11.5e1_author&utm_campaign=Email_publication&field=&journalName=Frontiers_in_Pharmacology&id=328567]] [28].

Ниже приведены основные этапы осуществления заявленного технического решения:

1. Приготовление препарата мокроты.

2. Анализ возможности разрушения внутримолекулярных связей (гидролиза) ДНК в мокроте (in vitro) нуклеазой Serratia marcescens и «Пульмозимом» путем определения ДНКазной активности нуклеазы Serratia marcescens и препарата «Пульмозим» в условиях, приближенных к действию прототипа.

3. Анализ влияния катионного состава среды на ДНКазную активность нуклеазы Serratia marcescens при гидролизе ДНК мокроты.

4. Анализ влияния содержания магния сульфата гептагидрата, добавленного в инкубационную среду, на ДНКазную активность нуклеазы Serratia marcescens при гидролизе ДНК в составе мокроты;

5. Анализ влияния содержания нуклеазы Serratia marcescens в инкубационной среде на ДНКазную активность нуклеазы Serratia marcescens при гидролизе ДНК в составе мокроты в присутствии магния сульфата гептагидрата.

6. Анализ полноты гидролиза ДНК в составе мокроты при продолжительном контакте нуклеазы Serratia marcescens или препарата «Пульмозим» с мокротой при различном катионном составе среды.

Далее заявителем приведены Примеры конкретного осуществления заявленного технического решения с Таблицами, показывающими результаты отдельных сравнительных испытаний. Приведенные Примеры поясняют, но не ограничивают сущность заявленного технического решения.

Пример 1. Приготовление препарата мокроты.

Мокроту, собранную у пациентов при гнойно-пленочном бронхите, хранят при минус 25°C в 50% глицерине. (Все пациенты дали информированное письменное согласие в соответствии с Хельсинской Декларацией. Протокол был одобрен Этическим экспертным комитетом Казанским федеральным университетом Республики Татарстан Российской Федерации). Перед применением глицерин удаляют, для чего мокроту в глицерине смешивают с 2-кратным объемом 0,9% NaCl (далее - физиологический раствор) и, перемешав, собирают 25 мин центрифугированием при 9000 об/мин с охлаждением. Жидкость декантируют, к осадку добавляют 3-кратный объем физиологического раствора, перемешивают и вновь собирают центрифугированием. Этот этап повторяют дважды. Затем осадок смешивают с равным объемом физиологического раствора и диспергируют с охлаждением в ледяной бане в два этапа с периодами по 5 секунд с помощью ультразвукового дезинтегратора «Sonopuls (Bandelin) 2200» с заостренным наконечником из сплава TiAl6V4 (3.7165) ТТ 13 с диаметром 3 мм и при 100 Вт до визуальной однородности.

Определение белка и ДНК в мокроте проводят спектрометрически. Для этого полученную однородную смесь мокроты и физиологического раствора разводят в 100 раз дистиллированной водой и определяют поглощение при 260 нм, 280 нм и 235 нм, в соответствии с известной методикой [Практическая химия белка. Ред. А. Дарбре, М. «Мир», 1989, Стр. 300-301] [30].

Для расчета используют общеизвестные формулы. Например, количество ДНК определяют на основании соотношения А₂₈₀/А₂₆₀ [30], количество белка в мг/мл расчитывают с помощью формул (A₂₃₅-A₂₈₀)/2.51 [30] и 1.45 A₂₈₀-0.74 A₂₆₀ [Methods for General and Molecular Bacteriology. P. 544] [31]. Расчеты показывают, что содержание белка в мокроте колеблется в пределах 11-27 мг/мл, а ДНК в пределах 0,44-1,35 мг/мл.

Оценку полимерности ДНК в препарате мокроты после ультразвуковой дезинтеграции проводят с помощью агарозного гельэлектрофореза, выполненного общеизвестным методом [Wegrzyn, G., Neubauer, P., Krueger, S., Hecker, M., and Taylor, K. (1991) Stringent control of replication of plasmids derived from coliphage λ. Mol.Gen.Genet. 225, 94-98.] [32]. Визуализацию ДНК проводят с помощью окрашивания бромистым этидием. Дополнительно, для визуализации белка после окрашивания гелей бромистым этидием, их окрашивают Куммаси ярко-синим в соответствии со стандартным методом.

Результат визуализации ДНК и белка, входящих в состав препарата мокроты, представлен на Фиг. 1. Как видно из Фиг. 1 (1А, дорожка 2), препарат мокроты после ультразвуковой дезинтеграции содержит фрагменты ДНК величиной от 3 килобас и выше и нуклеопротеидную фракцию, которая располагается на старте анализируемого геля и окрашивается одновременно и бромистым этидием и Кумасси ярко-синим (Фиг. 1А и 1Б, дорожка 2).

Таким образом, Фиг. 1А подтверждает наличие ДНК в препарате мокроты, полученном после ультразвуковой дезинтеграции и далее используемом в качестве субстрата для оценки ДНКазных активностей нуклеазы Serratia marcescesn и препарата «Пульмозим», а также свидетельствует о полимерности ДНК в полученном препарате.

Пример 2. Анализ возможности разрушения внутримолекулярных связей (гидролиза) ДНК в мокроте (in vitro) ферментом нуклеаза Serratia marcescens и «Пульмозимом» путем определения ДНКазной активности нуклеазы Serratia marcescens и препарата «Пульмозим» в условиях, приближенных к действию прототипа. (Таблица 1 на Фиг. 2).

Препарат мокроты готовят, как описано в Примере 1. Выделение и очистку нуклеазы Serratia marcescens проводят, например, как описано ранее [28]. Процесс основан на общепринятом получении культуральной жидкости, фракционировании белков сульфатом аммония, удалении избытка соли диализом, катионообменной хроматографии с использованием, например, колонок UNO S12 column (Bio-Rad, USA) и хроматографической системы NGC Discover.

В собранных фракциях определяют ДНКазную активность общеизвестным методом кислоторастворимых фракций, описанным ранее [Лещинская И.Б., Балабан Н.П., Егорова Г.С, Таняшин В.И., Третьяк Т.М. Получение и характеристика высокоочищенного препарата Serratia marcescens // Биохимия, 1974, Т. 39, №1, С. 116-122] [33]. Этот же метод с модификациями, описанными далее в тексте, применяют для оценки ДНКазной активности препаратов нуклеазы Serratia marcescens и «Пульмозим» при гидролизе ДНК в составе мокроты.

Для сравнительного анализа с «Пульмозимом» выбирают фракцию фермента нуклеазы Serratia marcescens, которая при оптимальных условиях гидролиза, а именно - при 37°C в присутствии 0,1% высокомолекулярной ДНК, 0,08 М Трис-HCl буфера, pH 8,5, и 7 мМ MgSO₄×7H₂O, проявляет ДНКазную активность, равную 164 800 Ед./мл. Так как заявителю известно, что 1 мг гомогенного фермента нуклеазы Serratia marcescens соответствует 1600000 Ед. ДНКазной активности [28], заявитель заключает, что выбранный препарат нуклеазы содержит в 1 мл 0,103 мг нуклеазного белка.

Препарат «Пульмозим», как известно из Инструкции по применению «Пульмозима» [7], содержит в 1 мл 1 мг Дорназы Альфа, что соответствует 1000 Ед. ДНКазной активности, определенной методом Кунитца, а также содержит 8,77 мг NaCl, что соответствует 0,88% раствору NaCl и приближается к известной концентрации физиологического раствора - 0,9%, и 0,152 мг CaCl₂×2H₂O, что соответствует 0,001 М раствору CaCl₂×2H₂O.

Поскольку заявителем не выявлено из уровня техники, как разбавляется в дыхательных путях препарат «Пульмозим» при ингаляциях (in vivo), его активность (in vitro) определяют, смешивая 0,5 мл препарата мокроты в физиологическом растворе с 0,4 мл физиологического раствора, одновременно включающего 0,002 М CaCl₂×2H₂O, и 0,1 мл препарата «Пульмозим», разведенного дистиллированной водой так, чтобы при выбранных условиях гидролиза в кислоторастворимую фракцию превращалось не более 30-50% ДНК мокроты. Таким образом, катионный состав среды гидролиза ДНК мокроты, который соответствует физиологическому раствору, одновременно включающему 0,0008 М CaCl₂×2H₂O, максимально приближают к катионному составу раствора прототипа (Препарат «Пульмозим»), который соответствует 0,88% водному раствору NaCl, одновременно включающему 0,001 М CaCl₂×2H₂O.

Для измерения ДНКазных активностей нуклеазы Serratia marcescens и «Пульмозима» за основу принимают метод кислоторастворимых фракций, ранее описанный в [33], куда заявителем внесены собственные модификации. В частности, реакционную смесь, которая для определения активности нуклеазы Serratia marcescens в стандартных условиях содержит 80 мМ Трис-HCl буфер, pH 8,5, 7 мМ MgSO₄×7H₂O и 0,1% высокомолекулярную ДНК, заменяют на реакционную смесь, которая содержит физиологический раствор и 0,0008 M CaCl₂×2H₂O (Вар. 1) и ДНК в составе мокроты.

Реакционную смесь готовят, смешивая в пробирках, предварительно помещенных на ледяную баню, свежеприготовленную мокроту в физиологическом растворе и физиологический раствор, включающий 0,002М CaCl₂×2H₂O, в объемном соотношении 5:4. К приготовленной смеси добавляют тестируемый раствор в объемном соотношении 9:1 и проводят гидролиз в термостате 15 мин при 37°C. После этого гидролиз останавливают, помещая смесь в ледяную баню и добавляя равный со смесью объем 4% хлорной кислоты. Определяют количество образовавшихся в результате гидролиза ДНК низкомолекулярных фрагментов и рассчитывают ДНКазную активность, как описано в оригинальной методике [33]. В качестве тестируемых препаратов используют «Пульмозим» (прототип) и нуклеазу Serratia marcescens, характеристика которой представлена выше, предварительно разведенные дистиллированной водой так, чтобы в гидролизованные фрагменты превращалось не более 30-50% ДНК. Параллельно с тестируемыми растворами в реакционные смеси вместо этих растворов добавляют дистиллированную воду и, проведя все аналогичные с тестируемыми образцами манипуляции, оценивают распад ДНК в составе мокроты под действием не связанных с «Пульмозимом» (прототип) и нуклеазой Serratia marcescens факторов.

Результаты приведены в Таблице 1 на Фиг. 2.

Таблица 1 состоит из четырех столбцов:

- в столбце 1 приведены номера вариантов опытов - Вариант 1 (прототип), Вариант 2 (заявленное техническое решение);

- в столбце 2 приведены сравниваемые препараты - «Пульмозим» (прототип) (Вариант 1) и Нуклеаза S.marcescens (Вариант 2);

- в столбце 3 приведено содержание ферментного белка в исследуемом препарате, равное:

• 1 мг/мл - Вариант 1 (прототип),

• 0,1 мг/мл - Вариант 2

- в столбце 4 приведены значения нуклеазной активности в ед./мл.

Как видно из результатов Таблицы 1 (Фиг. 2), препарат «Пульмозим», выбранный в качестве прототипа, проявляет ДНКазную активность в опытах in vitro при гидролизе ДНК в составе мокроты в присутствии физиологического раствора и 0,0008 M CaCl₂×2H₂O, что приближается по катионному составу к условиям действия «Пульмозима» в качестве муколитического средства in vivo (Вар. 1).

Из результатов Таблицы 1 также видно, что нуклеаза Serratia marcescens в выбранных условиях тоже проявляет ДНКазную активность (Вар. 2), что свидетельствует о ее способности гидролизовать ДНК в составе мокроты, а также о том, что гидролиз мокроты с помощью нуклеазы Serratia marcescens протекает, во-первых, при физиологических условиях среды, и, во-вторых, в условиях, приближенных к условиям действия «Пульмозима», применяемого в качестве муколитического средства in vivo.

Сопоставление полученных результатов показывает, что ДНКазная активность нуклеазы Serratia marcescens в выбранных условиях почти в 2 раза выше, чем ДНКазная активность «Пульмозима», при использовании ферментного белка в 10 раз меньше, чем белка «Пульмозима». Таким образом, из Таблицы 1 видно, что нуклеаза Serratia marcescens гидролизует ДНК в составе мокроты при физиологических условиях более эффективно и при меньшей дозе, чем муколитический препарат «Пульмозим».

Пример 3. Анализ влияния катионного состава среды на ДНКазную активность нуклеазы Serratia marcescens при гидролизе ДНК мокроты (Таблица 2 на Фиг. 3).

Препарат мокроты готовят и анализируют, как описано в Примере 1. Выделение и очистку нуклеазы Serratia marcescens и выбор фракции для анализа проводят, как описано в Примере 2.

Обоснование условий для гидролиза ДНК в составе мокроты прототипом (препаратом «Пульмозим») представлено в Примере 2.

Для измерения ДНКазных активностей нуклеазы Serratia marcescens и «Пульмозима» за основу принимают метод кислоторастворимых фракций, ранее описанный в [33], куда заявителем внесены собственные модификации.

Реакционную смесь готовят, смешивая в пробирках, предварительно помещенных на ледяную баню, в объемном соотношении 5:4 следующие варианты:

- Вар. 1 (прототип) и Вар. 3 - свежеприготовленный препарат мокроты в физиологическом растворе : физиологический раствор, включающий 0,002М CaCl₂×2H₂O;

- Вар. 2 - свежеприготовленный препарат мокроты в физиологическом растворе : физиологический раствор;

- Вар. 4 - свежеприготовленный препарат мокроты в физиологическом растворе : физиологический раствор, включающий 0,002М MgSO₄×7H₂O.

Далее проводят все манипуляции, как, соответственно, описано в Примере 2. В качестве тестируемых препаратов используют «Пульмозим» (прототип) и нуклеазу Serratia marcescens, характеристика которой представлена в Примере 2, разведенные, как описано в Примере 2. Оценку распада ДНК в составе мокроты под действием не связанных с «Пульмозимом» (прототип) и нуклеазой Serratia marcescens факторов, который учитывают при проведении расчетов, проводят, как описано в Примере 2. Результаты приведены в Таблице 2 на Фиг. 3.

Таблица 2 состоит из пяти столбцов:

- в столбце 1 приведены номера вариантов опытов - Вариант 1 (прототип), Вариант 2, Вариант 3 и Вариант 4 (заявленное техническое решение);

- в столбце 2 приведены названия препаратов - «Пульмозим» (прототип) (Вариант 1) и нуклеаза Serratia marcescens (Вариант 2, Вариант 3, Вариант 4);

- в столбце 3 приведена концентрация в инкубационной среде добавленных катионов, равная:

• физиологический раствор + 0,0008 M CaCl₂×2H₂O - Вариант 1 (прототип),

• физиологический раствор - Вариант 2,

• физиологический раствор + 0,0008 M CaCl₂×2H₂O - Вариант 3,

• физиологический раствор + 0,0008 M MgSO₄×7H₂O - Вариант 4

- в столбце 4 приведено содержание ферментного белка в исследуемом препарате, равное:

• 1 мг/мл - Вариант 1 (прототип),

• 0,1 мг/мл - Вариант 2, Вариант 3, Вариант 4

- в столбце 5 приведены значения нуклеазной активности в ед./мл.

Как видно из результатов Таблицы 2 (Фиг. 3), нуклеаза Serratia marcescens проявляет ДНКазную активность по отношению к ДНК в составе мокроты не только в условиях действия прототипа «Пульмозим» (Вар. 1), то есть в присутствии физиологического раствора и 0,0008 M CaCl₂×2H₂O (Вар. 3), но и в отсутствии CaCl₂×2H₂O (Вар. 2), а также при замещении CaCl₂×2H₂O эквимолярным количеством MgSO₄×7H₂O (Вар. 4). Из представленных в Таблице 2 результатов видно, что ДНКазная активность нуклеазы Serratia marcescens в присутствии физиологического раствора (Вар. 2) сопоставима по величине с ДНКазной активностью данного фермента в присутствии физиологического раствора и 0,0008 M CaCl₂×2H₂O (Вар. 3). Замещение 0,0008 M CaCl₂×2H₂O (Вар. 3) на 0,0008 M MgSO₄×7H₂O (Вар. 4) приводит к увеличению ДНКазной активности нуклеазы Serratia marcescens в 3 раза, по сравнению с ее активностью в условиях действия прототипа, то есть в присутствии физиологического раствора и 0,0008 M CaCl₂×2H₂O, или в 2,7 раза - по сравнению с активностью в присутствии физиологического раствора (Вар. 2), или в 6,7 раза по сравнению с активностью прототипа (Вар. 1). При этом белка нуклеазы Serratia marcescens для получения описанных результатов требуется в 10 раз меньше, чем белка препарата «Пульмозим».

Таким образом, из Таблицы 2 видно, что нуклеаза Serratia marcescens гидролизует ДНК в составе мокроты в присутствии физиологического раствора не менее эффективно, чем муколитический препарат «Пульмозим», а замена CaCl₂×2H₂O на MgSO₄×7H₂O, который используют в терапевтической практике в комбинации с физраствором для ингаляции при бронхиальной астме [http://www.tiensmed.ru/news/magniasulfat-rw0.html#nov1] [34], заметно увеличивает эффективность гидролиза ДНК в составе мокроты.

Пример 4. Анализ влияния содержания магния сульфата гептагидрата, добавленного в инкубационную среду, на ДНКазную активность нуклеазы Serratia marcescens при гидролизе ДНК в составе мокроты (Таблица 3 на Фиг. 4).

Препарат мокроты готовят и анализируют, как описано в Примере 1. Выделение и очистку нуклеазы Serratia marcescens и выбор фракции для анализа проводят, как описано в Примере 2.

Обоснование условий для гидролиза ДНК в составе мокроты прототипом (препаратом «Пульмозим») представлено в Примере 2.

Для измерения ДНКазных активностей нуклеазы Serratia marcescens и «Пульмозима» за основу принимают метод кислоторастворимых фракций, ранее описанный в [33], куда заявитель вносит собственные модификации.

Реакционную смесь готовят, смешивая в пробирках, предварительно помещенных на ледяную баню, в объемном соотношении 5:4 следующие варианты:

- Вар. 1 (прототип) - свежеприготовленный препарат мокроты в физиологическом растворе : физиологический раствор, включающий 0,002М CaCl₂×2H₂O;

- Вар. 2 - свежеприготовленный препарат мокроты в физиологическом растворе : физиологический раствор;

- Вар. 3 - свежеприготовленный препарат мокроты в физиологическом растворе : физиологический раствор, включающий 0,002М MgSO₄×7H₂O

- Вар. 4 - свежеприготовленный препарат мокроты в физиологическом растворе : физиологический раствор, включающий 0,1М MgSO₄×7H₂O.

- Вар. 5 - свежеприготовленный препарат мокроты в физиологическом растворе : физиологический раствор, включающий 0,34М MgSO₄×7H₂O.

- Вар. 6 - свежеприготовленный препарат мокроты в физиологическом растворе : физиологический раствор, включающий 0,85М MgSO₄×7H₂O.

Далее проводят все описанные манипуляции, как, соответственно, описано в Примерах 2 и 3. В качестве тестируемых препаратов используют «Пульмозим» (прототип) и нуклеазу Serratia marcescens, характеристика фракции которой представлена в Примере 2, разводя ферментные препараты и оценивая распад ДНК в составе мокроты при инкубации, как описано в Примере 2.

Результаты приведены в Таблице 3 на Фиг. 4.

Таблица 3 состоит из шести столбцов:

- в столбце 1 приведены номера вариантов опытов - Вариант 1 (прототип), Вариант 2, Вариант 3, Вариант 4, Вариант 5 и Вариант 6 (заявленное техническое решение);

- в столбце 2 приведены названия препаратов - «Пульмозим» (прототип) (Вариант 1) и нуклеаза Serratia marcescens (Вариант 2, Вариант 3, Вариант 4, Вариант 5 и Вариант 6);

- в столбце 3 приведен тип 2-х валентных катионов, добавленных в инкубационную среду:

• CaCl₂×2H₂O - Вариант 1 (прототип),

• Без добавления - Вариант 2,

• MgSO₄×7H₂O - Вариант 3, Вариант 4, Вариант 5, Вариант 6;

- в столбце 4 приведена концентрация 2-х валентных катионов, добавленных в инкубационную среду:

• 0,0008 М - Вариант 1 (прототип),

• 0; 0,0008 М; 0,04 М; 0,136 М; 0,34 М - Вариант 2, Вариант 3, Вариант 4, Вариант 5, Вариант 6, соответственно.

- в столбце 5 приведено содержание ферментного белка в исследуемом препарате, равное:

• 1 мг/мл - Вариант 1 (прототип),

• 0,1 мг/мл - Вариант 2, Вариант 3, Вариант 4, Вариант 5, Вариант 6

- в столбце 6 приведены значения нуклеазной активности в ед./мл.

Как видно из результатов Таблицы 3 (Фиг. 4), нуклеаза Serratia marcescens проявляет ДНКазную активность по отношению к ДНК в составе мокроты при широком диапазоне концентраций магния сульфата гептагидрата (Вар. 2-6), добавленного к физиологическому раствору. При этом величина ДНКазной активности нуклеазы Serratia marcescens как без добавления в реакционную смесь солей мультивалентных металлов (Вар. 2), так и при добавлении магния сульфата гептагидрата до 0,34 М включительно в 26-67 раз выше величины ДНКазной активности «Пульмозима» в присутствии физиологического раствора и 0,0008 M CaCl₂×2H₂O (Вар. 1, прототип). Опыты с содержанием MgSO₄×7H₂O в реакционной смеси в концентрации свыше 0,34 М заявителем не проводились, так как указанная концентрация является предельно допустимой в ингаляционной терапии при заболеваниях бронхолегочной системы.

Таким образом, добавление MgSO₄×7H₂O к препарату нуклеазы Serratia marcescens в широком диапазоне концентраций (0-0,34М) при гидролизе ДНК в составе мокроты в присутствии физиологического раствора не оказывает негативного влияния на результаты гидролиза.

Пример 5. Анализ влияния содержания нуклеазы Serratia marcescens в инкубационной среде на ДНКазную активность нуклеазы Serratia marcescens при гидролизе ДНК в составе мокроты в присутствии магния сульфата гептагидрата. (Таблица 4 на Фиг. 5).

Препарат мокроты готовят и анализируют, как описано в Примере 1. Выделение и очистку нуклеазы Serratia marcescens и выбор фракции для анализа проводят, как описано в Примере 2.

Обоснование условий для гидролиза ДНК в составе мокроты прототипом (препаратом «Пульмозим») представлено в Примере 2.

Для измерения ДНКазных активностей нуклеазы Serratia marcescens и «Пульмозима» за основу принимают метод кислоторастворимых фракций, ранее описанный в [33], куда заявителем внесены собственные модификации.

Учитывая, полученные в Примере 4 результаты, из которых следует, что, хотя при всем исследованном диапазоне концентраций магния сульфата гептагидрата (0-0,34 М, Таблица 3 Вар. 2 - Вар. 6) ДНКазная активность нуклеазы Serratia marcescens была в 26-67 раз выше величины ДНКазной активности «Пульмозима», для анализа влияния содержания нуклеазы Serratia marcescens в инкубационной среде на ДНКазную активность нуклеазы Serratia marcescens при гидролизе ДНК в составе мокроты была выбрана одна из исследованных концентраций магния сульфата гептагидрата, при которой результат, представленный в Таблице 3, был наилучшим, а именно 0,008 М (Вар. 3). Выбранная концентрация была выбрана в качестве примера, не является ограничением для других возможных исследованных концентраций (0-0,34 М), при которых, как показано в Таблице 3, ДНКазная активность нуклеазы Serratia marcescens многократно выше ДНКазной активности «Пульмозима».

Реакционную смесь готовят, смешивая в пробирках, предварительно помещенных на ледяную баню, в объемном соотношении 5:4 следующие варианты (в качестве тестируемых препаратов используем «Пульмозим» (прототип) и 4 разные фракции нуклеазы Serratia marcescens, различающиеся как активностью при оптимальных условиях, которую определяют методом кислоторастворимых фракций, так и содержанием ферментного белка в растворе):

- Вар. 1 (прототип) - свежеприготовленный препарат мокроты в физиологическом растворе : физиологический раствор, включающий 0,002М CaCl₂×2H₂O. Далее смешивают полученный раствор с препаратом «Пульмозим» в соотношении 9:1.

- Вар. 2 - свежеприготовленный препарат мокроты в физиологическом растворе : физиологический раствор, включающий 0,002М MgSO₄×7H₂O. Далее смешивают полученный раствор с 1-й фракцией нуклеазы Serratia marcescens в соотношении 9:1 (до конечной концентрации нуклеазы = 0,0005 мг/мл реакционной смеси).

- Вар. 3 - свежеприготовленный препарат мокроты в физиологическом растворе : физиологический раствор, включающий 0,002М MgSO₄×7H₂O. Далее смешивают полученный раствор со 2-й фракцией нуклеазы Serratia marcescens в соотношении 9:1 (до конечной концентрации нуклеазы = 0,003 мг/мл реакционной смеси).

- Вар. 4 - свежеприготовленный препарат мокроты в физиологическом растворе : физиологический раствор, включающий 0,002М MgSO₄×7H₂O. Далее смешивают полученный раствор с 3-й фракцией нуклеазы Serratia marcescens в соотношении 9:1 (до конечной концентрации нуклеазы = 0,007 мг/мл реакционной смеси).

Вар. 5 - свежеприготовленный препарат мокроты в физиологическом растворе : физиологический раствор, включающий 0,002М MgSO₄×7H₂O. Далее смешивают полученный раствор с 4-й фракцией нуклеазы Serratia marcescens в соотношении 9:1 (до конечной концентрации нуклеазы = 0,01 мг/мл реакционной смеси).

Далее проводят все описанные манипуляции, как, соответственно, описано в Примере 2.

Используемые фракции в оптимальных условиях гидролиза, а именно - при 37°C в присутствии 0,1% высокомолекулярной ДНК, 0,08 М Трис-HCl буфера, pH 8,5 и 7 мМ MgSO₄×7H₂O, проявляют ДНКазную активность, соответственно, равную, 5251 Ед./мл (Фракция 1, Вар. 2), 23800 Ед./мл (Фракция 2, Вар. 3), 45067 Ед./мл (Фракция 3, Вар. 4) и 164 800 Ед./мл (Фракция 4, Вар. 5), и содержат, соответственно, в 1 мл раствора 0,005, или 0,03, или 0,07 мг, или 0,1 мг ферментного белка, рассчитанного, как описано в Примере 2.

Все необходимые манипуляции для определения ДНКазной активности проводят, как описано в Примерах 2 и 3. Результаты приведены в Таблице 4 на Фиг. 5.

Таблица 4 состоит из шести столбцов:

- в столбце 1 приведены номера вариантов опытов - Вариант 1 (прототип), Вариант 2, Вариант 3, Вариант 4 и Вариант 5 (заявленное техническое решение);

- в столбце 2 приведены названия препаратов - «Пульмозим» (прототип) (Вариант 1) и нуклеаза Serratia marcescens (Вариант 2, Вариант 3, Вариант 4 и Вариант 5);

- в столбце 3 приведена активность препаратов в стандартных условиях;

- в столбце 4 приведена концентрация в инкубационной среде добавленных 2-х валентных катионов: 0,0008 M CaCl₂×2H₂O - Вариант 1 (прототип); 0,0008 M MgSO₄×7H₂O - Вариант 2, Вариант 3, Вариант 4 и Вариант 5 (заявленное техническое решение);

- в столбце 5 приведено содержание ферментного белка в исследуемом препарате, равное:

• 1 мг/мл - Вариант 1 (прототип),

• 0,005 мг/мл - Вариант 2,

• 0,03 мг/мл - Вариант 3,

• 0,07 мг/мл - Вариант 4,

• 0,1 мг/мл - Вариант 5;

- в столбце 6 приведены значения нуклеазной активности в ед./мл.

Как видно из результатов Таблицы 4 (Фиг. 5), нуклеаза Serratia marcescens проявляет ДНКазную активность по отношению к ДНК в составе мокроты в широком диапазоне содержания ее белка в растворах. Выбранный диапазон соответствует значениям 0,005 мг - 0,1 мг/мл, что, соответственно, в 200 - 10 раз меньше содержания белка Дорназы альфа в препарате «Пульмозим». Выбранный диапазон подтверждает, но не ограничивает, проявление ДНКазной активности нуклеазы Serratia marcescens в отношении ДНК в составе мокроты и свидетельствует о высокой эффективности препарата нуклеазы Serratia marcescens.

Пример 6. Анализ полноты гидролиза ДНК в составе при продолжительном контакте нуклеазы Serratia marcescens или препарата «Пульмозим» с мокротой при различном катионном составе среды.

Препарат мокроты готовят и анализируют, как описано в Примере 1. Выделение и очистку нуклеазы Serratia marcescens и выбор фракции для анализа проводят, как описано в Примере 2.

Готовят, смешивая в пробирках, предварительно помещенных на ледяную баню, в объемном соотношении 5:4 следующие реакционные смеси:

- свежеприготовленный препарат мокроты в физиологическом растворе : физиологический раствор,

- свежеприготовленный препарат мокроты в физиологическом растворе : физиологический раствор, включающий 0,002М MgSO₄×7H₂O,

- свежеприготовленный препарат мокроты в физиологическом растворе : физиологический раствор, включающий 0,002М CaCl₂×2H₂O.

В реакционные смеси добавляют без предварительного разведения фракцию нуклеазы Serratia marcescens, или препарат «Пульмозим», или дистиллированную воду в качестве контроля и инкубируют при 37°C 60 мин, после чего анализируют полученные смеси электрофорезом в агарозном геле, как описано в Примере 1. Результаты анализа длительного гидролиза ДНК в составе мокроты нуклеазой Serratia marcescens или препаратом «Пульмозим» представлены на Фиг. 6.

На Фиг. 6 (2А) видно, что контрольные препараты мокроты, смешанные, как описано выше, с физиологическим раствором (дорожка 2), или физиологическим раствором, включающим 0,002М MgSO₄×7H₂O (дорожка 3), или физиологическим раствором, включающим 0,002М CaCl₂×2H₂O (дорожка 4) без добавления тестируемых ферментных препаратов после 60 мин инкубации с водой при 37°C содержат фрагменты ДНК величиной от 3 килобас и выше и нуклеопротеидную фракцию, которая располагается на старте анализируемого геля и окрашивается одновременно и бромистым этидием и Кумасси ярко-синим (Фиг 6, 2А и 2Б, дорожки 2-4). Также из Фиг. 2А видно, что после 60 мин инкубации препаратов мокроты в соответствующих композициях с катионами металлов и с препаратом «Пульмозим» (Фиг. 2А, дорожки 5-7) или с нуклеазой Serratia marcerscens (Фиг. 2А, дорожки 8-10) фрагменты ДНК величиной от 3 килобас и выше в агарозном геле не наблюдаются, что свидетельствует о полном гидролизе ДНК в составе мокроты при всех вариантах катионного состава среды, под действием «Пульмозима» и нуклеазы Serratia marcescens.

Таким образом, анализ показал, что 60 минутная инкубация при 37°C мокроты с 0,1 мг/мл препарата «Пульмозим» или 0,01 мг/мл нуклеазы Serratia marcerscens приводит к полному разрушению ДНК в составе мокроты в присутствии физиологического раствора, или физиологического раствора и 0,0008М MgSO₄×7H₂O, или физиологического раствора и 0,0008М CaCl₂×2H₂O, что свидетельствует о том, что заявленная фармацевтическая композиция на основе фермента нуклеазы Serratia marcescens улучшает реологические свойства мокроты.

В конечном итоге, заявленное техническое решение - фармацевтическая композиция для улучшения реологических свойствах мокроты, включающая в качестве действующего ингредиента принципиально новый по назначению фермент нуклеазу Serratia marcescens, приводит к разрушению ДНК в составе мокроты в стандартных для прототипа «Пульмозима» условиях, которые подходят для его медицинского применения.

При равных с «Пульмозимом» условиях действия заявленная фармацевтическая композиция, включающая нуклеазу Serratia marcescens, разрушает внутримолекулярные связи молекул ДНК в составе мокроты в существенно более низких дозах и с повышенной эффективностью по сравнению с прототипом «Пульмозим». Заявленная фармацевтическая композиция также приводит к разрушению ДНК в составе мокроты и в условиях, оптимизированных для действия нуклеазы Serratia marcescens, которые также пригодны для медицинского применения и, в свою очередь, позволяют дополнительно уменьшить дозу нуклеазы Serratia marcescens, необходимую для эффективного разрушения ДНК.

Нуклеаза Serratia marcescens отличается от действующего компонента в составе прототипа - муколитического коммерческого препарата «Пульмозим» - Дорназы альфа - физико-химическими и биохимическими свойствами, первичной структурой, условиями экспрессии гена и очистки ферментного препарата. Благодаря этому причина быстрого снижения ДНКазной активности под действием актина у заявленного средства отсутствует. Нет необходимости в использовании дорогостоящей культуральной среды, какую используют при культивировании клеток животных, и в проведении сложной дорогостоящей очистки продукта, включающей стадии вирус-инактивации, так как при проведении экспрессии гена нуклеазы в бактериальной культуре риск контаминации получаемого препарата прионами и вирусами животных отсутствует. Природная уникальность экспрессии гена нуклеазы в культуре Serratia marcescens служит залогом высокой продукции данного фермента без риска лизирования бактериальных клеток под его действием.

Таким образом, из изложенного выше можно сделать вывод, что заявителем решены все поставленные задачи и достигнут заявленный технический результат, а именно - разработана фармацевтическая композиция для улучшения реологических свойств мокроты на основе фермента нуклеазы Serratia marcescens, которая при равных с прототипом («Пульмозимом») условиях действия разрушает внутримолекулярные связи молекул ДНК в мокроте с повышенной эффективностью в существенно более низких дозах с перспективой дальнейшего использования в качестве эффективного медикаментозного средства, например - муколитика прямого действия.

Заявленное техническое решение соответствует критерию «новизна», предъявляемому к изобретениям, т.к. из исследованного уровня техники заявителем не выявлено технических решений, имеющих заявленную совокупность существенных признаков.

Заявленное техническое решение соответствует критерию «изобретательский уровень», предъявляемому к изобретениям, так как не является очевидным для специалиста в анализируемой области техники.

Заявленное техническое решение соответствует критерию «промышленная применимость», предъявляемому к изобретениям, т.к. может быть реализовано в стандартных условиях.

Перечень использованных источников

[1]. Музыка И.С., Автушенко С.С., Сурков К.Г., Романов В.Д., Генкин Д.Д. Лекарственный препарат и способ улучшения реологических свойств мокроты и ингаляционное применение такого препарата. Патент РФ №2522846

[2]. http://www.medlinks.ru/article.php?sid=27801, 2-й абзац

[3]. Музыка И.С., Автушенко С.С., Сурков К.Г., Романов В.Д., Генкин Д.Д. Ингаляционная лекарственная форма полисиалированной дезоксирибонуклеазы i человека и способ ее получения. Патент РФ №2559522

[4]. Осин А.Я., Гельцер Б.И., Янсонс Т.Я., Осин В.А. Способ коррекции вторичной мукоцилиарной недостаточности нижних дыхательных путей у больных бронхолегочными заболеваниями. Патент РФ №2541835

[5]. http://cc-t1.ru/stati/fizrastvor_dlja_ingaljacij.html

[6] Орлова Н.А., Воробьев И.И. Плазмида для экспрессии в клетках бактерии, принадлежащей к роду escherichia, неактивного предшественника днказы i человека или ее мутеинов, бактерия, принадлежащая к роду escherichia, - продуцент неактивного предшественника рекомбинантной днказы i человека или ее мутеина, предшественник рекомбинантной днказы i человека или ее мутеина, способ получения рекомбинантной днказы i человека или ее мутеина, способ получения конъюгатов полиэтиленгликоля и рекомбинантного мутеина днказы i человека, ферментативно активный конъюгат мутеина рекомбинантной ДНКазы I человека Патент на изобретение РФ №2502803.

[7]. https://medi.ru/instrukciya/pulmozim_5916/

[8] https://www.9months.ru/zdorovie_malysh/1310/mukoviscidoz

[9] Fujihara J., et. al., Actin-inhibition and folding of vertebrate deoxyribonuclease I are affected by mutations at residues 67 and 114. Comparative Biochemistry and Physiology, Part В 143 (2006) 70-75

[10] Lazarus R.A., Shak S., ULMER J.S. US 2001041360 (A1). Human DNase I variants.

[11.] https://meshb.nlm.nih.gov/record/ui?name=Serratia%20marcescens%20nuclease

[12. https://enzyme.expasy.org/EC/3.1.30.2

[13]. http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?ec:3.1.30.2

[14]. https://enzyme.expasy.org/EC/3.1.30.2

[15]. http://www.sbcs.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/1/30/2.html

[16]. https://meshb.nlm.nih.gov/record/ui?name=Serratia%20marcescens%20nuclease

[17]. Benedik, M., and Strych, U. (1998). Serratia marcescens and its extracellular nuclease. FEMS Microbiology Letters 165, 1-13

[18]. Заявка на изобретение №2017124309 Способ биосинтеза нуклеазы бактерий Serratia marcescens

[19]. Romanova, J., and Filimonova, M. (2012) The Effects of Addition of Mononucleotides on Sma nuc Endonuclease Activity. The Sci. World J. DOI: 10.1100/2012/454176.

[20] Ball T.K., Saurugger P.N., Benedik M.J. The extracellular nuclease gene of Serratia marcescens and its secretion from Escherichia coli (Ген внеклеточной нуклеазы Serratia marcescens и ее секреция из Escherichia coli) // Gene. - 1987. - V. 57. - P. 183-192

[21]. Иванов А.В., Хисматуллина Н.А., Чернов А.Н., Юсупов Р.Х., Миронов А.Н., Гулюкин А.М., Филимонова М.Н. Препарат против бешенства. // Патент РФ №2420309

[22]. Филимонова М.Н., Рассохина, И.А., Зайнутдинова Э.Ф., Нигматуллина Л.Ш. Антивирусный препарат контактного действия на основе "Бетадина" и эндонуклеазы. // Патент РФ №2423136

[23]. Филимонова М.Н., Ершова Е.В., Сафин Ю.И., Тойменцева А.А., Шабаева Ю.Д., Сусарова А.Н., Валеев А.Р., Угрюмова В.С., Равилов А.З., Каримуллина И.Г., Фаткуллова А.А., Шишко А.А., Каримов М.З. Антимикробный препарат. // Патент РФ №2337139

[24] Handbook of ELISPOT. Methods and Protocols / Ed. A. Kalyuzhny. N.Y.: Humana Press, 2005. 336 p.

[25] Детиненко Л.Д., Клименко В.П., Подгорный В.Ф., Аликин Ю.С., Масычева В.И., Гробов О.Ф., Батуев Ю.М. Средство «Эндоглюкин» для профилактики и лечения вирусных заболеваний пчел и стимуляции развития пчелиных семей. // Патент РФ №2038776

[26]. Vafina, G., Bulatov, E., Zainutdinova, E., and Filimonova, M. (2016) A one-step protocol for chromatographic purification of non-recombinant exogenous bacterial enzyme: nuclease of Serratia marcescens. BioNanoSci, DOI 10.1007/s12668-016-0226-9

[27]. http://www.uniprot.org/uniprot/P13717

[28]. Gulnaz Vafina, Elmira Zainutdinova, Emil Bulatov, Maria Filimonova. Endonuclease from gram-negative bacteria Serratia marcescens is as effective as Pulmozyme in the hydrolysis of DNA in sputum, опубликованная 13 февраля 2018 г. в журнале Frontiers in Pharmacology [http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fphar.2018.00114/full?&utm_source=Email_to_authors_&utm_medium=Email&utm_content=T1_11.5e1_author&utm_campaign=Email_publication&field=&journalName=Frontiers_in_Pharmacology&id=328567

[29]. https://www.medpoisk.ru/bolezni/mukoviscidoz.html#fndtn-panel0

[30]. Практическая химия белка. Ред. А. Дарбре, М. «Мир», 1989, Стр. 300-301

[31]. Methods for General and Molecular Bacteriology. P. 544

[32] Wegrzyn, G., Neubauer, P., Krueger, S., Hecker, M., and Taylor, K. (1991) Stringent control of replication of plasmids derived from coliphage λ. Mol. Gen. Genet. 225, 94-98.

[33] Лещинская И.Б., Балабан Н.П., Егорова Г.С, Таняшин В.И., Третьяк Т.М. Получение и характеристика высокоочищенного препарата Serratia marcescens // Биохимия, 1974, Т. 39, №1, С. 116-122

[34] http://www.tiensmed.ru/news/magniasulfat-rw0.html#nov1

Изобретение относится к областям биохимии и медицины, конкретно - к области высокомолекулярных соединений, а также к области ферментов и предназначено для улучшения реологических свойств мокроты при лечении болезней дыхательной системы. Примеры болезней, при которых требуется разжижение мокроты из-за затруднения процесса ее эвакуации, включают, но ими не ограничиваются, муковисцидоз, хронический бронхит, трахеобронхит, ларингит, синдром Картагенера, эмфизему легочных тканей, хроническую обструктивную болезнь легких, бронхоэктазную болезнь, бронхиальную астму, синусит, гайморит. Сущностью технического решения является фармацевтическая композиция для улучшения реологических свойств мокроты, состоящая из физиологического раствора и фермента нуклеазы в качестве активного ингредиента, представляющего собой продукт гена nuc А, или, как синоним, nuc, найденного в геноме бактерий Serratia marcescens или полученного синтетически, обеспечивающего биосинтез каталитически активной в отношении высокополимерной ДНК мокроты формы указанного фермента при его экспрессии в клетках про- или эукариот, в количестве 0,03-0,1 мг/мл. 3 з.п. ф-лы, 6 ил.

1. Фармацевтическая композиция для улучшения реологических свойств мокроты, состоящая из физиологического раствора и фермента нуклеазы в качестве активного ингредиента, представляющего собой продукт гена nuc А, или, как синоним, nuc, найденного в геноме бактерий Serratia marcescens или полученного синтетически, обеспечивающего биосинтез каталитически активной в отношении высокополимерной ДНК мокроты формы указанного фермента при его экспрессии в клетках про- или эукариот, в количестве 0,03-0,1 мг/мл.

2. Фармацевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что дополнительно содержит 0,0008 М кальция хлорида дигидрата.

3. Фармацевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что дополнительно содержит до 0,34 М магния сульфата гептагидрата.

4. Фармацевтическая композиция по п. 3, отличающаяся тем, что количество нуклеазы Serratia marcescens составляет 0,1 мг/мл.