ШТАММ БАКТЕРИЙ SERRATIA MARCESCENS-ПРОДУЦЕНТ ЛИПАЗЫ Российский патент 2000 года по МПК C12N9/20 C12N9/20 C12R1/43 

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и касается штамма - продуцента фермента липазы. Липазы катализируют гидролиз триацилглицеридов с образованием жирных кислот и глицерина. Они находят применение в пищевой промышленности, бытовой химии, косметике. Специально очищенные препараты липаз применяют в медицине и научных исследованиях. Поиск новых бактериальных штаммов - продуцентов липазы является актуальной задачей.

Основными продуцентами липаз являются штаммы грибов Aspergillus, Fusarium, Mucor, Rhizopus, некоторые дрожжи (Candida) [1 - 4]. Известен, например, штамм грибов Fusarium oxysporum - продуцент липазы [1]. Данный штамм выращивают при температуре 30^oC в течение 150 - 200 часов на питательной среде, содержащей, г/л:
MgSO₄•7H₂O - 0,5
KH_t2PO₄ - 1,0
NaNO₃ - 3,0
Пептон - 30,0
Дрожжевой экстракт - 1,0
Оливковое масло - 10,0
Через 150 часов культивирования достигается максимальное накопление в культуральной жидкости специфической липазной активности - 150 ед. акт./мг биомассы (по сухому весу). Недостатком известного штамма является длительность культивирования (6 - 7 суток), сложность питательной среды и трудоемкость процедуры получения культуральной жидкости (освобождение от грибного мицелия).

Использование бактерий - продуцентов липаз обладает сравнению с грибами преимуществом, заключающимся в ускорении процесса культивирования. Это может сделать экономически более выгодным технологический процесс получения липазы. Среди бактерий липазная активность обнаружена у штаммов родов Pseudomonas, Achromobacter, Serratia [5 - 7].

Наиболее близким к заявляемому штамму - прототипом, является штамм Serratia marcescens 345 [5], который выращивают при температуре 30^oC на питательной среде (pH 7,0), содержащей г/л:
MgSO₄•7H₂O - 0,1
KH₂PO₄ - 0,2
Мочевина - 0,1
Отвар соевой муки - 50,0
Через 24 часа в культуральной жидкости накапливается максимальное количество липазы со специфической активностью 95 ед. акт./мг биомассы по сухому весу). Недостаком данного штамма является низкая специфическая активность продуцируемого фермента и высокая длительность культивирования.

Технической задачей изобретения является получение нового бактериального штамма, обеспечивающего высокий выход липазы при менее длительном процессе культивирования.

Поставленная цель достигается выявлением и использованием штамма Serratia marcescens B-10 L-1 - продуцента липазы.

Предлагаемый штамм получен из исходного музейного штамма Serratia marcescens B-10 [8] как спонтанный вариант. Он отличается изменением размером колоний на питательном агаре - через 24 часа образует колонии диаметром 1,5 - 2,0 мм бледно-розового цвета. Исходный штамм при росте в этих же условиях дает колонии диаметром 3,5 - 4,0 мм.

Полученный штамм Serratia marcescens B-10 L-1 депонирован в НИИ "Коллекция культур микроорганизмов" ГНЦ ВБ "Вектор" (пос. Кольцово, Новосибирской области) под регистрационном номером В-687.

Штамм Serratia marcescens B-10 L-1 характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки: клетки палочковидные, прямые, короткие, размером 0,8-3,0х0,6-0,8 мкм, подвижные, одиночные, парные или в цепочках.

Окраска по Граму: отрицательна.

На агаризованных питательных средах через 24 часа роста штамм образует округлые светлорозовые колонии с гладкими краями, диаметром 1,5 - 2,0 мм. Профиль колоний выпуклый.

Физиологические и биохимические признаки: штамм является прототрофом, не требователен к факторам роста, оптимальная температура роста 28-30^oC, pH среды 6,0-8,0.

Отношение к углеродам: ферментирует до кислотообразования глюкозу, сахарозу, мальтозу, маннит. Желатину разжижает, крахмал гидролизует, клетчатку не разжижает.

Для культивирования Ser.marc. B-10 L-1 с целью получения липазы применяют питательную среду (pH 7,0) следующего состава, г/л:
MgSO₄•7H₂O - 0,25
KH₂PO₄ - 3,0
Na₂HPO₄•2H₂O - 7,0
NHCl₄ - 1,0
CaCl₂•2H₂O - 0,02
NaCl - 0,5
Отвар соевой муки - 50,0
Культивирование проводят на качалках со встряхиванием при 28-30^oC. Через 10 часов культивирования в культуральной жидкости накапливается максимальное количество липазы со специфической активностью 800 ед.акт./мг биомассы (по сухому весу).

Количество накапливаемой биомассы штамма B-10 L-1 определяют путем подсчета числа жизнеспособных клеток в культуральной жидкости. Для этого определяют титр бактерий в 1 мл культуральной жидкости и пересчитывают его в мг биомассы (по сухому весу), исходя из того, что 10⁹ клеток бактерий весит 0,28 мг [9].

Активность липазы определяют следующим образом. К реакционной смеси, содержащей 4,5 мл 0,05 М фосфатного буфера (pH 8,0) и 5 мл 40%-ной эмульсии оливкового масла в 2%-ном поливиниловом спирте приливают 0,5 мл супернатанта культуральной жидкости. Тест-пробу инкубируют в течение 30 мин при температуре 37^oC, после чего добавляют 10 мл смеси этанол:ацетон (1:1). Степень расщепления оливкового масла определяют, оттитровывая продукты гидролиза раствором гидроокиси натрия (0,05 М NaOH), в присутствии 1%-ного тимолфталеина, до возникновения голубой окраски. Контрольную пробу обрабатывают аналогично тест-пробе, но липазу вносят непосредственно перед титрованием. Специфическую активность липазы выражают в микромолях олеиновой кислоты, освобождающейся за 1 час при гидролизе субстрата 1 мл культуральной жидкости, в пересчете на количество биомассы, содержащейся в 1 мл культуральной жидкости. Расчет специфической липазной активности (ЛА), в ед.акт./мг биомассы (по сухому весу), производят по формуле

где V - количество 0,05 М NaOH, израсходованной на титрование тест-пробы, мл;
V_k - количество 0,05 М NaOH, израсходованной на титрование контрольной пробы мл;
K - количество олеиновой кислоты, оттитровываемое 1 мл 0,05 М NaOH (K= 50), мкмоль;
t - время реакции, час;
V_E - объем культуральной жидкости, добавляемой к реакционной смеси, мл;
C - концентрация биомассы (по сухому весу), мг/мл.

В таблице представлена зависимость специфической липазной активности от продолжительности выращивания на питательной среде с 5%-ным соевым отваром заявляемого штамма Ser.marc. B-10 L-1 в сравнении с штаммом Ser.marc. 345. Данные по активности штамма Ser.marc. 345 взяты из прототипа [5].

Из таблицы видно, что предлагаемый в качестве продуцента липазы штамм Ser.marc. B-10 L-1, превосходит известный продуцент липазы по уровню специфической липазной активности. Дополнительным преимуществом предлагаемого штамма является сокращение продолжительности выращивания до 10 часов. При этом достигается липазная активность 800 ед.акт./мг, тогда как штамм 345 обеспечивает накопление максимальной липазной активности 95 ед.акт./мг только через 25 часов ращения.

Поскольку предлагаемый штамм получен впервые и никогда ранее не использовался для выделения липазы, можно сделать вывод о соответствии предлагаемого штамма критериям изобретения "новизна" и "изобретательский уровень".

Изобретение иллюстрируется следующим примером конкретного выполнения.

Культивирование штамма Serratia Marcescens B-10 L-1 проводят на питательной среде (pH 7,0), содержащей, г/л:
MgSO₄•7H₂O - 0,25
KH₂PO₄ - 3,0
Na₂HPO₄•2H₂O - 7,0
NHCl₄ - 1,0
CaCl₂•2H₂O - 0,02
NaCl - 0,5
Отвар соевой муки - 50,0
Выращивание проводят со встряхиванием на качалке при температуре 30^oC в течение 10 часов. Определяют содержание биомассы, в мг/мл (в сухом весе). После этого отделяют клетки и нерастворимые компоненты центрифугированием при 5000 об/мин в течение 30 мин. Культуральную жидкость собирают. Специфическая липазная активность составляет 800 ед.акт./мг.

Таким образом получен штамм, обладающий следующими преимуществами по сравнению с известным штаммом:
- значительно более высокая продуктивность штамма (в 10 раз);
- меньшая продолжительность культивирования (в 2,5 раза).

Получение нового доступного штамма обеспечивает расширение ассортимента штаммов - продуцентов липазы.

Источники информации
1. P.Rapp. Production, regulation and some properties of lipase activity from Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum//Enzyme and Microbial Technology. 1995. - V. 17. - 832 - 838.

2. Заявка ПНР N 265870 МКИ 4 C 12 N. Способ получения нерастворимых препаратов липазы и эстеразы Mucor racemosus A 37//Опубл. 26.05.88.

3. Заявка Японии N 4-30833 МКИ 5 C 12 N 1/14; 9/12. Способ получения микробной биомассы с высокой липазной активностью //Опубл. 22.05.92.

4. Заявка PCT (WO) N 94/01542 МКИ 5 C 12 N 9/12. Способ очистки двух изоферментных липаз Candida rugosa//Опубл. 02.07.93.

5. Н. А. Башкатова, Л.О. Северина. Влияние условий культивирования на биосинтез липазы у Serratia marcescens//Микробиология. - 1979.- Т. 68, Вып. 5. - С. 826. - прототип.

6. Международная заявка N 91/00910 МКИ 5 C 12 N 15/55. Мутантные липазы-продуцируемые Pseudomonas//Опубл. 24.01.91.

7. Заявка ЕПВ (WO) N 0528828 МКИ 5 C 12 N 9/20. Щелочные липазы Bacillus, кодирующие их последовательности ДНК и продуцирующие эти липазы бациллы//Опубл. 03.03.93.

8. Каталог культур микроорганизмов. Всероссийская коллекция культур микроорганизмов. Пущино-Москва. 1992. - С.69.

9. Д. Мецлер. Биохимия, т. 1. М.: Мир, 1980, с. 141, 157.

Изобретение может быть использовано в микробиологии, биотехнологии, медицине, косметологии. Штамм Serratia marcescens B-10L - 1 (НИИ ККМ В-687) - продуцент липазы получен из исходного музейного штамма Serratia marcescens В-10 как спонтанный вариант. Длительность культивирования снижена с 24 до 20 ч, выход фермента составляет 800 ед. акт./мг биомассы. Выявление нового штамма обеспечивает расширение ассортимента штаммов - продуцентов липазы, обладает высокой продуктивностью, уменьшает продолжительность культивирования в 2,5 раза. 1 табл.

Штамм бактерий Serratia marcescens НИИ ККМ В-687-продуцент липазы.