Способ получения рекомбинантного белка нуклеазы бактерий Serratia marcescens для гидролиза нуклеиновых кислот Российский патент 2022 года по МПК C12N9/22 C12N15/31 C12N15/52 C12P21/02 C07K1/16 

Настоящее изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и заключается в создании препарата рекомбинантной нуклеазы из грамотрицательной бактерии Serratia marcescens. Создание препарата включает экспрессию нуклеазы в цитоплазме клеток Escherichia coli в нерастворимой форме в виде «телец включения», последующий рефолдинг нативной конформации фермента и методику его очистки до гомогенного состояния.

Как известно, нуклеазы - гидролитические ферменты, расщепляющие нуклеиновые кислоты, имеют большое экономическое значение. Неспецифические нуклеазы в основном используются для гидролиза нуклеиновых кислот в различных процессах. Нуклеаза, расщепляющая только ДНК, называется «ДНКазой», а расщепляющая только РНК - «РНКазой». Типичным представителем ДНКаз является ДНКаза I из поджелудочной железы млекопитающих. Типичными представителями РНКаз являются, например, РНКазы Т1 и Т2 из Aspergillus oryzae или РНКаза А из поджелудочной железы млекопитающих.

Помимо очистки ДНК или РНК с помощью РНКаз или ДНКаз соответственно, существуют другие представляющие экономический интерес приложения, в которых образец очищается от обеих нуклеиновых кислот. Это относится, например, к производству широкого спектра молекул белкового или небелкового происхождения, в которых продукт не состоит из нуклеиновых кислот: белков, таких как антитела или ферменты; полисахаридов; липидов; антибиотиков и др. Необходимость удаления нуклеиновых кислот становится особенно важной задачей, если продукция молекул происходит внутриклеточно или если часть продуцирующих клеток лизируется во время продукции. В результате этого во время получения нарабатываемого вещества в препарате оказываются большие количества нуклеиновых кислот, которые загрязняют нарабатываемое вещество или затрудняют его дальнейшую очистку. Очистка затрудняется, среди прочего из-за того, что нуклеиновые кислоты увеличивают вязкость препаратов до такой степени, что последующие стадии, такие как фильтрация или хроматография становятся невозможны.

Следовательно, существует интерес к способам полного или частичного удаления нуклеиновых кислот. Такие способы могут снять производственные ограничения на дальнейших стадиях наработки вещества и исключить присутствие нуклеиновых кислот в фармпрепаратах. Одним из подходов удаления нуклеиновых кислот является осаждение нуклеиновых кислот различными агентами. Другой подход состоит в расщеплении нуклеиновых кислот нуклеазами на достаточно малые фрагменты. Такой подход позволяет снизить вязкость образцов, а полученные продукты гидролиза могут быть в последующем удалены с использованием доступных методов, таких как ультрафильтрация или колоночная хроматография.

Использование нуклеаз, которые могут расщеплять как РНК, так и ДНК, особенно полезно для удаления всех видов нуклеиновых кислот, то есть как РНК, так и ДНК, из различных образцов. В этом случае используемая нуклеаза должна обладать высокой активностью и достаточной стабильностью. Фермент, который проявляет эти свойства, представляет собой нуклеазу грамотрицательной бактерии S. marcescens [ЕС 3.1.30.2; SEQ ID NO: 1; Филимонова М. Н. и др. Биохимия, 1980, 45 (11): 2096-2104; Филимонова М. Н. и др. Биохимия, 1981, 46 (9): 1660-1666; Biedermann К et al. Res Commun. 1989, 54 (1): 17-27]. Этот фермент также продается под торговой маркой Benzonase [Molin S et al. US 5,173,418 Dec. 22, 1992] и далее именуется «нуклеаза S. marcescens».

Известны многочисленные технические решения, имеющие отношение к биосинтезу нуклеазы бактериями Serratia marcescens (Авт. Св. СССР №230052, 1967 г.; Авт. Св. СССР №340691,1970 г.; Авт. Св. СССР №992568; патент RU 2665550).

Недостатком описанных выше разработок является использование в качестве штамма продуцента Serratia marcescens. Данный продуцент является условно-патогенным организмом и требует особых условий культивирования, питательных средсложного состава, а также использования в качестве индуктора антибиотика митомицина С.

Чтобы иметь возможность экономично производить белки в достаточных количествах и с требуемой чистотой, их часто получают с использованием промышленных организмов методом гетерологичной экспрессии, т.е. ДНК, кодирующая ген интересуемого белка вводится в организм-продуцент, который затем осуществляет экспрессию, т.е. синтез чужеродного для него белка. Это подход может иметь ряд преимуществ: повышенная продуктивность организма-продуцента по сравнению с исходным организмом, более оптимизированные процессы культивирования, наработки и очистки продукта.

Нуклеазы могут оказывать токсическое действие на организм-продуцент в случае внутриклеточной экспрессии. В цитоплазме активная нуклеаза гидролизует нуклеиновые кислоты клетки хозяина, что может привести к гибели или подавлению роста клеток. Нарушение секреции также может привести к гибели или задержке роста продуцента.

Рекомбинантная секреторная экспрессия нуклеазы S. marcescens в грамотрицательной бактерии Escherichia coli описана в патенте [Molin S et al. ЕР 229866 В1 1992] SEQ 10 NO1 и представлена в сравнении с выходом экспрессии в диком штамме - S. marcescens W225. Показано, что в использованной системе экспрессии выход нуклеазы составлял 35000 ед/мл культуры, полученной с рекомбинантным штаммом Е. coli, и 7000 единиц/мл с исходным штаммом. Более того, показано, что приблизительно половина ферментативной активности остается в периплазме Е. coli и не секретируется в среду (таблица 4 в ЕР 229866 В1 1992). Biedermann K et al. (Appl. Environ. Microbiol. 1990, 56(6): 1833-1838) также описывают секрецию нуклеазы S. marcescens (из штамма S. marcescens W280 SEQ ID NO1) в синтезирующих ее клетках Е. coli. Исследование показывает сравнение скорости секреции нуклеазы в гомологичном грамотрицательном организме-хозяине S. marcescens и аналогичном грамотрицательном модельном организме Е. coli. Выход нуклеазы на мл культуральной жидкости в условиях ферментации штамма продуцента Е. coli составляет 17000 ед/мл.

Грамотрицательные бактерии в целом и кишечная палочка в частности отличаются некоторыми недостатками. С одной стороны, секреция часто возможна только с небольшими выходами и обычно ведется только в периплазму, а не непосредственно в среду, что затрудняет последующую очистку. В таком варианте приходится обрабатывать большие объемы препаратов, полученных из периплазмы бактерии.

Также известно изобретение, в котором при гетерологичной экспрессии нуклеазы S. marcescens в грамположительном хозяине Bacillus subtilis [ Greiner-Stoeffele T and Schoenert S US 9,796,994 B2 2017) выход нуклеазы составляет 7 200 ед/мл культуральной жидкости.

Задачей заявленного технического решения является устранение недостатков прототипов, а именно - разработка способа биосинтеза нуклеазы S. Е. marcescens в клетках coli, позволяющего достичь увеличения биосинтеза нуклеазы S. marcescens под действием индуктора изопропил-бета-О-тиогалактопиранозида (ИПТГ) с использованием стандартных сред и технологий, разработанных для Е. coli. Сущность изобретения заключается в создании непатогенного продуцента нуклеазы S. marcescens, экспрессирующего ген этого фермента без сигнальной последовательности в неактивной, нетоксичной и нерастворимой форме в виде телец включения в цитоплазме клеток Е. coli и получении препарата рекомбинантного белка нуклеазы S. marcescens, рефолдированного до нативной конформации, легко поддающегося очистке и обладающего высокой удельной активностью. Другая техническая проблема, на решение которой направлена заявляемая группа изобретений, заключается в разработке препарата на основе указанного белка пригодного для применения в биотехнологической практике. Следует отметить, что аминокислотная последовательность рекомбинантного белка по данному изобретению соответствует зрелой (mature - англ.) форме нуклеазы S. marcescens с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2, которая соответствует последовательности SEQ ID NO: 1 без сигнала транспорта нуклеазы SEQ ID NO: 3. SEQ ID NO: 2 содержит дополнительные аминокислотные остатки (выделено жирным шрифтом) для инициации трансляции и генно-инженерных манипуляций (введены сайты эндонуклеаз рестрикции для клонирования).

Указанный технический результат достигается за счет получения рекомбинантного белка с молекулярной массой 27 кДа SEQ ID NO: 2, включающего фрагмент белка нуклеазы S. marcescens SEQ ID NO: 1 без сигнальной последовательности SEQ ID NO: 3.

Технический результат также достигается за счет способа получения рекомбинантного белка нуклеазы S. marcescens, который включает:

- выращивание клеток штамма Е. coli, экспрессирующих ген нуклеазы S. marcescens без сигнальной последовательности в неактивной и нетоксичной форме - в виде телец включения внутри бактериальных клеток;

- разрушение клеток штамма Е. coli, выделение и отмывку телец включения от штаммовых белков;

- растворение телец включения в мочевине и последующую процедуру диализа - рефолдинга нуклеазы Serratia marcescens до нативной конформации;

- двухступенчатую хроматографическую очистку нуклеазы S. marcescens от побочных белков.

Таким образом, создан штамм Е. coli, экспрессирующий ген нуклеазы Serratia marcescens без сигнальной последовательности в неактивной, нерастворимой и нетоксичной форме - в виде телец включения в цитоплазме бактериальной клетки, разработана процедура рефолдинга нуклеазы Serratia marcescens до нативного состояния и высокоэффективная процедура очистки нуклеазы Serratia marcescens от побочных белков.

Заявленное техническое решение поясняется в перечне последовательностей, в которых представлены варианты аминокислотной последовательности нуклеазы S. marcescens.

Перечень последовательностей, поясняющих сущность изобретения:

В SEQ ID NO: 1 приведена полная аминокислотная последовательность нуклеазы S. marcescens, сигнальная последовательность подчеркнута.

В SEQ ID NO: 2 приведена аминокислотная последовательность зрелой формы нуклеазы S. marcescens без сигнальной последовательности.

В SEQ ID NO: 3 приведена аминокислотная последовательность сигнальной последовательности нуклеазы S. marcescens.

фрагмент белка нуклеазы S. marcescens без сигнальной последовательности с последующим его клонированием.

Ген нуклеазы S. marcescens получен химико-ферментативным методом. Был создан олигонуклеотидный дуплекс, кодирующий соответствующий ген, оптимизированный для экспрессии в E. coli. Затем осуществлено получение плазмиды pNucA, содержащей последовательность гена нуклеазы S. marcescens.

Пример 2. Получение штамма Е. coli - продуцента.

Для получения штамма Е. coli - продуцента рекомбинантного белка нуклеазы S. marcescens клетки Е. coli BL21 трансформировали плазмидой pNucA. В культуру добавляли 3 мкл 0,1 М раствора ИПТГ и выращивали в течение 3 часов при температуре 37°С. При сравнении спектра белков, синтезированных клетками штамма Е. coli BL21 [pNucA], с белками нетрансформированного штамма, выявили появление дополнительной белковой полосы. Молекулярная масса дополнительной полосы соответствовала ожидаемой для рекомбинантного белка нуклеазы S. marcescens массе - 27 кДа. Уровень синтеза белков в Е. coli определяли, сравнивая интенсивность окрашивания полосы рекомбинантного белка с полосой соответствующего белка - стандарта молекулярной массы. Было показано, что рекомбинантный белок нуклеазы S. marcescens синтезируется в клетках Е. coli в нерастворимой форме в виде телец включения. Уровень синтеза целевого белка составлял 10% от суммарного белка бактериальной клетки.

Пример 3. Отмывка телец включения и рефолдинг рекомбинантной нуклеазы S. marcescens

Разрушение клеток штамма продуцента проводили в стандартных условиях 50 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 0,25 М NaCl 0,5% на френч-прессе. Центрифугирование телец включения проводили при 10000 об/мин, 30 мин, 10°С. Отмывку телец включения проводили в лизирующем буфере (3 раза), осаждая центрифугированием в том же режиме.

Тельца включения растворяли в буфере: 8 М мочевины, 20 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 0,1% Triton Х-100. Нерастворимые компоненты удаляли центрифугированием при 10000 об/мин, 30 мин, 20°С. Раствор телец включения диализовали, снижая концентрацию мочевины от 8 М до 0 М в буфере 25 мМ ацетата натрия рН 5,3. Нерастворимые компоненты удаляли центрифугированием при 10000 об/мин, 30 мин, 10°С.

Пример 4. Очистка на ионообменной смоле WorkBeads 40 S

Хроматографию на колонке с сорбентом WorkBeads 40 S проводили в 25 мМ ацетате натрия, рН 5,3. Элюцию целевого белка проводили градиентом NaCl от 0 до 1 М в 25 мМ ацетате натрия, рН 5.3. Полученные фракции белка анализировали методом электрофореза в 12%-ном ПААГ-SDS по Лэммли. Концентрацию белка определяли спектрофотометрически по методу Бредфорда. Фракции, содержащие белок, диализовали против 20 мМ Трис-HCl, рН 8,0 с двукратной сменой буфера при температуре 4°С.

Пример 5. Очистка на ионообменной смоле WorkBeads 40 DEAE

Хроматографию на колонке с сорбентом WorkBeads 40 DEAE, проводили в буфере 20 мМ Трис-HCl, рН 8,0. Сорбент с иммобилизованным на нем белком промывают буфером 20 мМ Трис-HCl, рН 8,0 до падения и стабилизации сигнала УФ-детектора. Элюцию целевого белка проводили градиентом NaCl от 0 до 0,5 М в 20 мМ Трис-HCl, рН 8,0.

Полученные фракции белка анализировали методом электрофореза в 12%-ном ПААГ-SDS по Лэммли. Концентрацию белка определяли спектрофотометрически по методу Бредфорда. Очищенный белок диализовали против буфера 20 мМ Трис-HCl, рН 8,0.

Диализованный раствор белка фильтровали в стерильные флаконы через фильтр 0.20 мкм. Концентрацию белка определяли спектрофотометрически по методу Бредфорда.

Пример 6. Измерение ДНКазной активности нуклеазы S. marcescens

Для измерения ДНКазной активности нуклеазы S. marcescens за основу был взят метод кислоторастворимых фракций [Лещинская И.Б. и др. Биохимия, 1974, Т. 39, №1, С. 116-122]. Реакционная смесь для определения активности нуклеазы S. marcescens в стандартных условиях содержала буфер 50 мМ Трис-HCl, рН 8,0; 2 мМ MgSO₄ и 0,1% высокомолекулярную ДНК.

Реакционную смесь готовили, смешивая в пробирках, предварительно помещенных на ледяную баню. К приготовленной смеси добавляли тестируемый фермент в объемном соотношении 1:9 в различных разведениях и проводили гидролиз в термостате 15 мин. при 37°С. После этого гидролиз останавливали, помещали смесь в ледяную баню и добавляли равный со смесью объем 4%-раствор хлорной кислоты. Определяли количество образовавшихся в результате гидролиза ДНК низкомолекулярных фрагментов и рассчитывали ДНКазную активность, как описано в оригинальной методике [Лещинская И.Б. и др. Биохимия, 1974, Т. 39, №1, С. 116-122]. В качестве тестируемого препарата сравнения использовали Benzonase фирмы Merck США (прототип) и нуклеазу S. marcescens по данному изобретению, предварительно разведенную буфером 20 мМ Трис-HCl, рН 8,0 так, чтобы в гидролизованные фрагменты превращалось не более 30-50% ДНК. Параллельно с тестируемыми растворами в реакционные смеси вместо этих растворов добавляли дистиллированную воду и, проведя все аналогичные манипуляции с тестируемыми образцами, оценивали гидролиз ДНК.

ДНКазная активность нуклеазы S. marcescens штамма Е. coli BL21 [pNucA] по данному изобретению составляла 48500 ед/мл культуральной жидкости. Сравнение с другими разработками: ЕР 229866 В1 - 35000 ед/мл, Biedermann K et al. - 17000 ед/мл, US 9,796,994 В2 - 7200 ед/мл показывает, что достигнутый уровень превышает описанный ранее в других изобретениях и статьях.

Достигнутая степень чистоты препарата нуклеазы S. marcescens по данному изобретению составляла 99%. Удельная активность - 250-300 ед/мкл. Препарат нуклеазы сохранял активность в течение года при хранении в 50% глицерине при температуре (-) 20°С.

Т.о., в предлагаемой разработке продемонстрировано, что рекомбинантный белок - нуклеаза S. marcescens без сигнальной последовательности, может синтезироваться в бактериях E. coli в неактивной, нерастворимой и нетоксичной форме в виде «телец включения». Такое техническое решение обеспечивает высокий уровень биосинтеза нуклеазы бактериями Е. coli. Использование стандартных процедур рефолдинга и хроматографической очистки позволяет получить препарат соответствующей чистоты, пригодный для биотехнологической практики. Достигнутая степень чистоты препарата нуклеазы S. marcescens по данному изобретению составляла 99%. Удельная активность - 250-300 ед/мкл. Следует отметить, что созданный препарат нуклеазы сохранял активность в течение года при определенном хранении. Способ получения также позволяет сократить время технологического цикла очистки нуклеазы при увеличении выхода целевого белка. Настоящая разработка может быть применена в прикладной микробиологии, биотехнологии, а также в микробиологической и фармацевтической промышленности.

--->

Перечень последовательностей

<210> 1

<211> 266

<212> PRT

<213> Serratia marcescens

<400> 1

Met Arg Phe Asn Asn Lys Met Leu Ala Leu Ala Ala Leu Leu Phe Ala

1 5 10 15

Ala Gln Ala Ser Ala Asp Thr Leu Glu Ser Ile Asp Asn Cys Ala Val

20 25 30

Gly Cys Pro Thr Gly Gly Ser Ser Asn Val Ser Ile Val Arg His Ala

35 40 45

Tyr Thr Leu Asn Asn Asn Ser Thr Thr Lys Phe Ala Asn Trp Val Ala

50 55 60

Tyr His Ile Thr Lys Asp Thr Pro Ala Ser Gly Lys Thr Arg Asn Trp

65 70 75 80

Lys Thr Asp Pro Ala Leu Asn Pro Ala Asp Thr Leu Ala Pro Ala Asp

85 90 95

Tyr Thr Gly Ala Asn Ala Ala Leu Lys Val Asp Arg Gly His Gln Ala

100 105 110

Pro Leu Ala Ser Leu Ala Gly Val Ser Asp Trp Glu Ser Leu Asn Tyr

115 120 125

Leu Ser Asn Ile Thr Pro Gln Lys Ser Asp Leu Asn Gln Gly Ala Trp

130 135 140

Ala Arg Leu Glu Asp Gln Glu Arg Lys Leu Ile Asp Arg Ala Asp Ile

145 150 155 160

Ser Ser Val Tyr Thr Val Thr Gly Pro Leu Tyr Glu Arg Asp Met Gly

165 170 175

Lys Leu Pro Gly Thr Gln Lys Ala His Thr Ile Pro Ser Ala Tyr Trp

180 185 190

Lys Val Ile Phe Ile Asn Asn Ser Pro Ala Val Asn His Tyr Ala Ala

195 200 205

Phe Leu Phe Asp Gln Asn Thr Pro Lys Gly Ala Asp Phe Cys Gln Phe

210 215 220

Arg Val Thr Val Asp Glu Ile Glu Lys Arg Thr Gly Leu Ile Ile Trp

225 230 235 240

Ala Gly Leu Pro Asp Asp Val Gln Ala Ser Leu Lys Ser Lys Pro Gly

245 250 255

Val Leu Pro Glu Leu Met Gly Cys Lys Asn

260 265

<210> 2

<211> 248

<212> PRT

<213> Serratia marcescens

<400> 2

Met Gly Ser Asp Thr Leu Glu Ser Ile Asp Asn Cys Ala Val Gly Cys

1 5 10 15

Pro Thr Gly Gly Ser Ser Asn Val Ser Ile Val Arg His Ala Tyr Thr

20 25 30

Leu Asn Asn Asn Ser Thr Thr Lys Phe Ala Asn Trp Val Ala Tyr His

35 40 45

Ile Thr Lys Asp Thr Pro Ala Ser Gly Lys Thr Arg Asn Trp Lys Thr

50 55 60

Asp Pro Ala Leu Asn Pro Ala Asp Thr Leu Ala Pro Ala Asp Tyr Thr

65 70 75 80

Gly Ala Asn Ala Ala Leu Lys Val Asp Arg Gly His Gln Ala Pro Leu

85 90 95

Ala Ser Leu Ala Gly Val Ser Asp Trp Glu Ser Leu Asn Tyr Leu Ser

100 105 110

Asn Ile Thr Pro Gln Lys Ser Asp Leu Asn Gln Gly Ala Trp Ala Arg

115 120 125

Leu Glu Asp Gln Glu Arg Lys Leu Ile Asp Arg Ala Asp Ile Ser Ser

130 135 140

Val Tyr Thr Val Thr Gly Pro Leu Tyr Glu Arg Asp Met Gly Lys Leu

145 150 155 160

Pro Gly Thr Gln Lys Ala His Thr Ile Pro Ser Ala Tyr Trp Lys Val

165 170 175

Ile Phe Ile Asn Asn Ser Pro Ala Val Asn His Tyr Ala Ala Phe Leu

180 185 190

Phe Asp Gln Asn Thr Pro Lys Gly Ala Asp Phe Cys Gln Phe Arg Val

195 200 205

Thr Val Asp Glu Ile Glu Lys Arg Thr Gly Leu Ile Ile Trp Ala Gly

210 215 220

Leu Pro Asp Asp Val Gln Ala Ser Leu Lys Ser Lys Pro Gly Val Leu

225 230 235 240

Pro Glu Leu Met Gly Cys Lys Asn

245

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> Serratia marcescens

<400> 3

10 20

Met Arg Phe Asn Asn Lys Met Leu Ala Leu Ala Ala Leu Leu Phe Ala

1 5 10 15

Ala Gln Ala Ser Ala

20

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантному получению ферментов в Е. coli, и может быть использовано для получения рекомбинантного белка нуклеазы Serratia marcescens. Способ включает получение олигонуклеотидного дуплекса, кодирующего соответствующий ген SEQ ID NO: 2 S. marcescens, оптимизированного для экспрессии в Е. coli; создание плазмиды, содержащей последовательность гена SEQ ID NO: 2 нуклеазы S. marcescens, и получение штамма продуцента; выращивание клеток продуцентов штамма Е. coli, экспрессирующих ген нуклеазы S. marcescens без сигнальной последовательности, в неактивной, нетоксичной и нерастворимой форме - в виде телец включения внутри бактериальных клеток; разрушение созданных клеток продуцентов, выделение, отмывку телец включения от штаммовых белков для получения конечного продукта; последующее восстановление полученной нуклеазы Serratia marcescens до нативной конформации и очистку. Изобретение обеспечивает высокий уровень биосинтеза нуклеазы в Е. coli, позволяет сократить время технологического цикла очистки нуклеазы при увеличении выхода целевого белка. 6 пр.

Способ получения рекомбинантного белка нуклеазы S. marcescens молекулярной массы 27 кДа, основанный на экспрессии гена, кодирующего SEQ ID NO: 2 нуклеазы S. marcescens без сигнальной последовательности в клетке продуценте Е. coli, позволяющий получить конечный продукт для гидролиза нуклеиновых кислот со степенью чистоты 99% и удельной активностью - 250-300 ед./мкл и включающий:

- получение олигонуклеотидного дуплекса, кодирующего соответствующий ген SEQ ID NO: 2 S. marcescens, оптимизированного для экспрессии в Е. coli;

- создание плазмиды, содержащей последовательность гена SEQ ID NO: 2 нуклеазы S. marcescens, и получение штамма продуцента;

- выращивание клеток продуцентов штамма Е. coli, экспрессирующих ген нуклеазы S. marcescens без сигнальной последовательности, в неактивной, нетоксичной и нерастворимой форме - в виде телец включения внутри бактериальных клеток;

- разрушение созданных клеток продуцентов, выделение, отмывку телец включения от штаммовых белков для получения конечного продукта;

- последующее восстановление полученной нуклеазы Serratia marcescens до нативной конформации и очистку.