Питательная среда для выращивания SеRRатIа маRсеSсеNS 24-продуцента нуклеазы Советский патент 1983 года по МПК C12N9/22 C12N1/20 

(54} ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА. ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ SERRATIA MARCESCENS 2А- ПРОДУЦЕНТА Изобретение относится к ферментной промышленности и касается получения ферментов нуклеаз, в частности нуклезы Serrate а marcescens , которая находит применение в научных исследованиях в качестве объекта я инструмента исследований, в экспериментальных исследованиях по изучению противоопухолевых- и прртивошфусных свойств нуклеазы, в ветери нарии в качестве лечебного препарата против вирусных заболеваний насекомых, для получения 5 - дезоксирибомононуклеотидов и др. Известна питательная среда для Soлучения ДНКазы Serratio tnoircescens 41 (пигментный штамп), содержащая глюкозу, сернокислый аммоний, двузамещенный фосфат калия, литий сернокислый, железо сернокислое хлористый натрий в количестве 2,0, 2,0, 1,0, 0,004, О,О02, О,ОО2 г и кислотный гидролизат казеина, дрожжевой экстракт в количестве О,О5 л на I л среды. ДНКазная активность указанного вьпие штамма НУКЛЕАЗЫ 600 виск. ея. в мл культуральной жидкости Cl. Недостатком среды является низкая активность, нуклеазы. Известна питательная среда для вырашивания Serratia marcescensr- продуцента нуклеазы, содержащая источники углерода, азота, фи:жологически активHbix веществ, а тёкже хлористый натрий, другие миндальные соли и воду, которая в качестве источников углерода, азота и физиологически активных веществ содержнт глицерин, нитрат аммония, гидролизат казеина и дрожжевой экстракт при соотношении компонентов, г/л воды: . Глицерин Цитрат аммония Двузамешенный ф осфат калия Сернокислый магнийСернокислое железо Хлористый натрий 9 Гицролизаг казеина О Д южжевой экстракт3,О А ивностъ нуклеазы в кульгутзальной жидкости равняется 50-6О тысяч виск. ед или мкМ расщепленного субстрата i ДНК в мин/мл С 2 3. Недостатком данной питательной среды также является относительно низкая активность нуклеазы в культуральной жидкости. Цешь изобретения - увеличение нукле азной активности продуцента -Serrc tia tnarcescens 24. Псютавленная цель достигается тем, ;что питательная среда для выращивания Serratid marceecens 24 - продуцента нуклеазы, содержащая источники углерода, азота, физиологически активных веществ, а также хлористый натрий и дистиллированную воду, в качес-тве источни ков углерода, азота и физиологически активных веществ содержит галактозу; о сяную муку и бактериологический пептон при следующем соотношении компонентов г/л воды: Овсяная мука 2,0-8,О Галактоза2,5-10,0 Хлористый натрий2,5-7,5 Бактериологический пептон5,0-15,0 Пример. Культуру Serratia marcescens 24 вьфащивают в течение суток в пробирках со скошенной средой, содержащей, г/л воды: Овсяная мука4,0 Галактоза .5,0 Хлористый натрий5,0 Бактериологический пептон.. 1О,О Агар-агар2О,0 Дистиллированная водаОстально рН равняется 7,6. Йогевной материал смывают О,5% физиологическим раствором и засевают в две колбы, содержащие-по 200 мл жидкой среды того же состава (исключая агар) ,из расчёта I мл инокуляга на ЮО мл сроды. 8 Через 12ч выращивания на качалке ( 2ОО об/мин) ПРИ 28 С содержимое колб переносят в ферментер F Е М - ЗО с 18 л среды. Процесс культивирования осуществляют 36 ч при аэрации л воз- духа/л среды {минимум 1:1). Нуклеазную активность определяют высокозиметрическим методом в модификации Бенинга и по продуктам гидролиза вискополимерной ДНК, растворимым в 2%-ной ней О и oпpeдeляиvIым по поглощению при 26О нм. Реакционная смесь объемом I мл содержит: I мг. ДНК, 0,07 М трис-НСС буфера (рН 8,5), 0,ОО7 М(5 5O/J и О,1 мл культуральной жидкости. За единицу активности принимают количество фермента, которое дает увеличение поглощения при 26О нм в опытных образцах по сравнению с контрольными (реакционная смесь без фермента) на I оптическую единицу за час инкубации при 37 С в пересчете на мл культуральной жидкости (Агьо ед/мл/ч). В качестве субстрата используют препарат высокополимерной ДНК, выделенной из тимуса теленка. . Активность нуклеазы в культуральной жидкости достигает виск. ед. на I мл или 40-5О мкМ расщепленной ДНК на мл/мин. Культуральную жидкость насьпцают сульфатом аммония до 20%, вьгаавший при 4° С осадок вместе с бактериальными клетками отделяют центрифугированием и отбрасывают, надосадочную жидкость повторно насыщают сульфате аммония до 9О%, оставляют при на 1О-18 ч. Затем осадок отделящт при 6ООО д на рефрижераторной центрифуге, растворяют в небольшом количестве дистиллироваввой воды, подвергаю т диализу и очистке на ДЭАЗ-целлюлозе я фосфоцеллюлозе. Сравнительное изучение продукции нуклеазы щтаммом 24 Serrrttia in«rCescens на предлагаемой и известной средах показывает, что на предлагаемой среде активносгь нуклеазы выше в 2 раза в расчете на 1 мл культуральной жидкости (табл. I). , I Т а б л и ц а I

250ОО8,0 270100

8000021,0-25,0 9000О

4700

60 130OO 152OO . 70-75

В габп. 2 приведены значения огно-. сигепьной активности нуклеазы в завиПродопжение табп. 1

симости от-соотношения компонентов среды,

Т а б л и ц а 2