Способ получения рабочего элемента сенсора, модифицированного наночастицами гексацианоферрата никеля, для определения концентрации глюкозы Российский патент 2024 года по МПК G01N27/26 B01J19/10 B82B3/00 

Изобретение относится к области электрохимических сенсоров для определения анализируемых веществ в биологических жидкостях и, в частности, к новому способу модификации токопроводящих покрытий наночастицами гексацианоферрата никеля. Разработанный рабочий элемент сенсора, модифицированный наночастицами гексацианоферрата никеля, для определения концентрации глюкозы будет использоваться в качестве основного компонента химических сенсоров для определения концентрации глюкозы, используемых в рамках медицинской лабораторной и персональной диагностики.

Среди сенсоров на основе наночастиц благородных металлов известен «Электрод с поперечно-сшитым ферментом для непрерывного контроля аналита» (RU 2731646 С1). Изобретение относится к области ферментных электродов для определения аналита. В данном изобретении проводится двухэтапное получение электрода и сенсора на его основе. На первом этапе проводят получение конъюгата путём связывания платиновых наночастиц с глюкозооксидазой путём смешивания глюкозооксидазы с функциональным сульфидом – реагентом Ломанта (ди-N-гидроксисукцинимидовый сложный эфир 3,3’-дитиодипропионовой кислоты) в молярном соотношении глюкозооксидазы к реактиву Ломанта от 1:1 до 1:10. Далее к полученной смеси добавляют 1 мл дисперсии платиновых наночастиц (0,5 мг/мл; размер частиц <15 нм) и выдерживают в течение 12 часов при комнатной температуре для получения ковалентной связи частиц с модифицированной сульфидными группами глюкозооксидазой. После выдерживания у раствора измеряют размер частиц методом динамического рассеяния света для определения размеров частиц. На втором этапе проводят снабжение электрода покрытием, используя в качестве основы для рабочего электрода золотую стружку QFX301. На золотую стружку пипеткой наносят 80 мкл реакционной смеси глюкозооксидазы, реактива Ломанта и наночастиц платины, и выдерживают в течение 10 минут при комнатной температуре для получения ковалентной связи свободных сульфидных групп на конъюгатах с золотой поверхности. После выдерживания не связавшийся материал удаляют многократным помещением электрода в фосфатный буферный раствор. Полученный сенсор испытывают на потенциостате при трёх уровнях напряжения (200 мВ, 350 мВ, 200 мВ) хроноамперометрически в течение 10 минут в фосфатном буферном растворе в качестве контрольного измерения и в растворе глюкозы с концентрацией 26 ммоль/л. В результате наблюдается увеличение тока в присутствии глюкозы, что свидетельствует о том, что снабженный покрытием рабочий электрод обладает чувствительностью к глюкозе.

Недостатком данного изобретения является использование дорогостоящих материалов – благородных металлов для получения сенсора, что значительно повышает стоимость конечного продукта, а также многостадийная технология его получения.

Также известен «Сенсорный элемент для анализа биологически активных соединений в растворах» (RU 44483 U1). Полезная модель относится к области аналитической биохимии, более конкретно, к устройству сенсорных элементов для проведения селективного биохимического и иммунологического анализа биологически активных соединений в растворах. Сенсорный элемент изготавливается путём многократно повторяющейся адсорбции на поверхность платинового электрода водорастворимого комплекса фермента холиноксидазы с полиэлектролитом и противоположно заряженным водорастворимым полиэлектролитом. В результате получается сенсорное устройство, которое работает посредством контакта рабочей части сенсорного устройства с анализируемым раствором, содержащим холин, который под действием холиноксидазы окисляется до бетаина, выделяя перекись водорода, концентрация которой определяется с помощью платинового электрода при наложении на него потенциала + 600 мВ относительно референсного хлоридсеребряного электрода. Разработанный сенсорный элемент возможно модифицировать, изменяя фермент и рабочий электрод, что позволит измерять концентрацию глюкозы, спиртов, лактата и другое.

Недостатком данной полезной модели является многостадийная подготовка, а также использование ферментов в процессе получения сенсорного элемента. В общей сложности данная технология получения сенсорного элемента для анализа биологически активных соединений в растворах не является экономически целесообразной и эффективной.

Существует «Способ получения биосенсорного электрода для определения моно- и полисахаридов» (RU 2454458 С1). Данное изобретение относится к области биотехнологии и пищевой промышленности. Получение биосенсорного электрода включает три этапа. На первом этапе полипиролл осаждают на платиновую пластинку площадью 6 см2 путём полимеризации пиррола при сканировании потенциала электрода между 0 и 0,9 В при скорости развёртки потенциала 50 мВ/с. На втором этапе проводится получение биорецептора, представляющего собой фермент, иммобилизированный на наночастицах Fe3O4 путём нагревания при перемешивании в атмосфере азота до 220 °C смеси полиакриловой кислоты, хлорида железа (III) и диэтиленгликоля, последующего добавления раствора гидроксида натрия в диэтиленгликоле, отделения наночастиц центрифугированием и последующим связыванием фермента с наночастицами через поверхностные карбоксильные группы. На третьем этапе биорецептор фиксируют на поверхности платинового электрода с помощью специальных магнитов. Биосенсор работает посредством погружения датчика в исследуемый раствор, после чего происходит химическая реакция между ферментом и анализируемым компонентом, в результате чего появляется пероксид водорода, который при подаче 600 мВ на платиновый электрод распадается на 2 протона водорода, 2 электрона и кислород O2. С помощью цифроаналогового преобразователя происходит детекция электронов и генерация тока, по которому можно судить о концентрации компонента в анализируемом растворе.

Недостатком данного изобретения является многостадийная и экономически невыгодная технология получения биосенсорного электрода, которая обусловлена использованием дорогостоящих материалов для получения биосенсорного электрода.

Среди сенсоров на основе гексацианоферратов известно несколько изобретений. Так, известен «Способ изготовления высокостабильного покрытия сенсора на пероксид водорода» (RU 2703316 C1). Изобретение относится к области электроанализа и электрохимических сенсоров и может быть использовано в аналитической химии, при конструировании биосенсоров и других областях. В данном патенте на изобретение проводится осаждение берлинской лазури на поверхность рабочего электрода посредством погружения электрода в ростовой раствор, содержащий 0,5-5,0 мМ гексацианоферрата калия, 0,5-5,0 мМ хлорида железа (III) и 0,1 М хлорида калия в 0,1 М соляной кислоты. После электрод промывают дистиллированной водой и помещают в ростовой раствор, содержащий 0,1-1,0 мМ гексацианоферрата калия, 0,5-2,0 мМ хлорида никеля и 0,5 М хлорида калия в 0,1 М соляной кислоты. Электроосаждение берлинской лазури и гексацианоферрата никеля проводили в потенциодинамическом режиме. После электрод подвергают термической обработке при 100 °C в течение 1 часа и охлаждают до комнатной температуры.

Недостатком данного изобретения является сложность производства данных покрытий в промышленных масштабах, которая объясняется длительностью процесса получения покрытий (около 1,5 часов) и использовании сложного электрохимического оборудования, вследствие чего полученный электрод обладает высокими шумами, что негативно сказывается на точности измерения. Это подтверждается зависимостью плотности тока от времени для электродов, рассматриваемых в рамках данного изобретения, на которой наблюдается большое количество шумов.

Известно изобретение «Способ изготовления модифицированных электродов, электроды, полученные указанным способом, и энзимные биосенсоры, включающие указанные электроды» (RU 2442130 C2). Изобретение относится к области модифицированных электродов для определения анализируемых веществ в биологических жидкостях. В данном изобретении применяются кислые растворы, содержащие как минимум одно поверхностно-активное вещество в количестве от 0,002 до 20 мас. %, содержащие ионы железа(III) или железа(II) с концентрацией между 20 мМ и 2 М и ионы гексацианоферрата(III) с концентрацией между 20 мМ и 2 М в 0,01 М растворе HCl. Электрод отпечатывается трафаретным способом на инертном материале. Растворы смешивают и оставляют на время от 2 минут до 2 часов, а поверхность рабочего электрода промывают промывочным раствором, а после – дистиллированной водой. Модифицированный электрод высушивают в печи при температуре 50°C – 200°C в течение 10 минут – 3 часов. Разработанный электрод может быть использован для энзимных биосенсоров на различные соединения, например, глюкозу.

Недостатком данного изобретения является использование органического фермента для определения концентрации глюкозы, что приводит к повышению стоимости и уменьшению срока годности сенсора.

Также известно изобретение «Способ изготовления микросенсора для определения глюкозы или лактата (RU 2580288 C2)». В данном изобретении рассматривается способ изготовления микробиосенсора на основе гексацианоферрата железа. В данной работе на рабочий электрод наносят гексацианоферрат железа, а поверх него наносят фермент-оксидазу, иммобилизированную в матрицу на основе перфторсульфонированного полимера или гамма-аминопропилсилоксана. В качестве фермента-оксидазы используют глюкозооксидазу.

Недостатком данного изобретения является использование перфторсульфонированного полимера или гамма-аминопропилсилоксана, которые являются труднодоступными веществами в качестве матрицы для фермента-оксидазы, а также непосредственно использование фермента-оксидазы, что в совокупности приводит к повышению стоимости таких сенсоров.

Известно изобретение «Биосенсор для одновременного определения глюкозы и лактата в крови» (RU 2696499 C1). В данном изобретении разработан планарный биосенсор для определения глюкозы и лактата в жидкой пробе. Он включает в себя размещённые на подложке хлоридсеребряный электрод сравнения, два рабочих электрода и вспомогательный электрод, размещённый между рабочими электродами. На один из рабочих электродов нанесена плёнка берлинской лазури и мембрана, содержащая глюкозооксидазу, а на второй рабочий электрод нанесена плёнка берлинской лазури, содержащая лактооксидазу. Плёнка берлинской лазури имеет поликристаллическую структуру, выполнена толщиной 60-80 нм, и покрывает поверхность электрода сплошным однородным слоем.

Данное изобретение в отличие от RU 2580288 C2 обладает преимуществом в виде схемы, способной одновременно определять глюкозу и лактат в крови. Недостатком данного изобретения является ограниченность в использовании прибора только в лабораторных исследованиях с измерением концентрации соединений в разбавленной крови посредством проточно-инжекторного анализа. Использование биосенсора только с помощью данного метода не даёт возможности измерения концентрации глюкозы в рамках персональной диагностики.

Также известно изобретение «Биосенсор с повышенным коэффициентом чувствительности» (RU 2731411 C1). Изобретение относится к электроаналитическим системам анализа. Данный планарный биосенсор включает в себя размещённые на подложке хлоридсеребряный электрод сравнения, рабочий и вспомогательный электроды. На рабочий электрод последовательно наносят плёнку берлинской лазури (БЛ) и мембрану на основе геля полиалкоксисилана, содержащую фермент глюкозооксидазу. За счёт использования технологии печати электродов на листе полиэтилентерефталата и технологии химического осаждения БЛ может производиться мелкосерийное производство биосенсоров на глюкозу.

Недостатком данного изобретение является использование поли-γ-аминопропилтриэтоксисилана и фермента-глюкозооксидазы, для формирования поверхности сенсора, а также потенциостата для измерения концентрации глюкозы, что приводит к серьёзному повышению стоимости прибора для измерения глюкозы.

Известно изобретение «Электрохимический элемент» (RU 2243545 C2), в котором предложен сенсор для аналитического определения жидкой пробы, представляющий собой плоскую полоску, имеющую две боковые кромки, принимающие элемент, два сообщающихся с указанным элементом электрода и прорезь в боковой кромке, сообщающуюся с элементом и обеспечивающую ввод жидкой пробы в элемент. Так для определения глюкозы используют палладиевый электрод и систему «фермент глюкозооксидаза/феррицианид ([Fe(CN)₆]_3-)», где феррицианид является посредником, который возвращает активированную глюкозооксидазу в каталитическое состояние. Недостатком данного изобретения является использование палладия для электрохимического элемента, что приводит к повышению его стоимости, а также использование феррицианида ([Fe(CN)₆]^3-) в качестве «посредника» для перехода фермента-глюкозооксидазы из «активного» состояния в каталитическое, который безвозвратно переходит в ферроцианид ([Fe(CN)₆]^4-), ограничивая возможное количество измерений одним электрохимическим элементом.

Принципиальное отличие заявленного изобретения от существующих аналогов заключается в использовании экономически и практически выгодной технологии получения золя наночастиц гексацианоферрата никеля и плёнок на их основе на любом токопроводящем покрытии. Заявленный рабочий элемент сенсора, модифицированный наночастицами гексацианоферрата никеля, для определения концентрации глюкозы может использоваться как основа для измерительных приборов для медицинского лабораторного или персонального определения концентрации глюкозы.

Задача, на решение которой направлено изобретение, заключается в разработке способа получения рабочего элемента сенсора, модифицированного наночастицами гексацианоферрата никеля, для определения концентрации глюкозы.

Технический результат, который может быть достигнут с помощью предлагаемого изобретения, сводится к использованию экономически и практически выгодной технологии получения золя наночастиц гексацианоферрата никеля и формирование рабочего элемента сенсора, имеющего большую чувствительность для определения глюкозы, имея при этом более низкую стоимость, а также возможность многократного использования.

Технический результат достигается с помощью осуществления синтеза золя наночастиц гексацианоферрата никеля путём смешивания 0,01 М растворов гексацианоферрата калия, хлорида никеля, а также 0,3 % Tween 80 в условиях воздействия ультразвукового излучения со следующими значениями параметров:

Частота озвучивания рабочего раствора 20-48 кГц Время озвучивания рабочего раствора 5-60 минут Частота модуляции УЗ-излучения 5-100 Гц Относительная мощность УЗ-излучения 50-100 Вт/л

После получения золя наночастиц гексацианоферрата никеля проводится формирование рабочего элемента сенсора путём трёхкратного процесса перенесения в сосуд с вертикально помещённым токопроводящим покрытием золя наночастиц гексацианоферрата никеля с помощью перистальтического насоса со скоростью 10 об/мин, последующего осушения сосуда со скоростью 10 об/мин, и последующего высушивания токопроводящего покрытия в течение 15 мин.

Особенностью изобретения является осуществление синтеза золя наночастиц гексацианоферрата никеля, стабилизированных Tween 80, используемого для формирования рабочего элемента сенсора для определения концентрации глюкозы в условиях воздействия ультразвукового излучения.

Осуществление изобретения

Пример 1.

Получение рабочего элемента сенсора, модифицированного наночастицами гексацианоферрата никеля, для определения концентрации глюкозы.

На первой стадии получают золь наночастиц гексацианоферрата никеля путём диспергации эквимолярных 0,01 М растворов гексацианоферрата калия и хлорида никеля в присутствии 0,3 % Tween 80 с помощью ультразвука при следующих параметрах:

Частота озвучивания рабочего раствора 10-20 кГц Время озвучивания рабочего раствора 1-5 минут Частота модуляции УЗ-излучения 1-5 Гц Относительная мощность УЗ-излучения 10-50 Вт/л

На второй стадии полученный золь наночастиц гексацианоферрата никеля с помощью перистальтического насоса со скоростью 10 об/мин переносят в сосуд с вертикально помещённым токопроводящим покрытием и после осушают сосуд со скоростью 10 об/мин, высушивают при 100 ◦C в течение 15 минут. Процедуру нанесения и высушивания проводят в трёхкратной повторности, таким образом формируя слой наночастиц гексацианоферрата никеля на поверхности токопроводящего покрытия. Пример 2.

Проводят аналогично примеру 1, но при следующих параметрах синтеза золя наночастиц гексацианоферрата никеля:

Частота озвучивания рабочего раствора 20-48 кГц Время озвучивания рабочего раствора 5-60 минут Частота модуляции УЗ-излучения 5-100 Гц Относительная мощность УЗ-излучения 50-100 Вт/л

Пример 3.

Проводят аналогично примеру 1, но при следующих параметрах синтеза золя наночастиц гексацианоферрата никеля:

Частота озвучивания рабочего раствора 48-60 кГц Время озвучивания рабочего раствора 60-120 мин Частота модуляции УЗ-излучения 100-150 Гц Относительная мощность УЗ-излучения 100-150 Вт/л

С целью определения влияния параметров синтеза золя наночастиц гексацианоферрата никеля на морфологию плёнок гексацианоферрата никеля на поверхности токопроводящего покрытия, морфологию поверхности полученных в примерах 1-3 рабочих элементов сенсора для определения концентрации глюкозы, модифицированных наночастицами гексацианоферрата никеля, стабилизированными различными поверхностно-активными веществами (ПАВ) исследовали на атомно-силовом микроскопе (АСМ) «NT-MDT Ntegra Aura» («NT-MDT», Россия) (фиг 1-3). У полученных в примерах 1-3 рабочих элементов сенсора для определения концентрации глюкозы, модифицированных наночастицами гексацианоферрата никеля, стабилизированными различными ПАВ, исследовали сенсорные свойства потенциометрическим методом посредством помещения рабочего элемента сенсора и электрода сравнения в буферный раствор (фосфатный буфер 0,05 М, 0,1 М KCl), соединённых последовательно вольтметром, последующего установления постоянного потенциала и добавления 1 мл растворов глюкозы с концентрацией 0,1, 1, 10 или 100 мМ с последующим установлением полученного значения потенциала. Исходя из результатов измерения уровня глюкозы построены зависимости потенциала от концентрации глюкозы (фиг. 4-6).

На фиг. 1 представлены результаты АСМ поверхности рабочего элемента сенсора для определения концентрации глюкозы, модифицированного наночастицами гексацианоферрата никеля, выполненное в соответствие с Примером 1: а – 3D-изображение поверхности, б – усреднённый профиль сечения, в – плотность распределения шероховатости.

На фиг. 2 представлены результаты АСМ поверхности рабочего элемента сенсора для определения концентрации глюкозы, модифицированного наночастицами гексацианоферрата никеля, выполненное в соответствие с Примером 2: а – 3D-изображение поверхности, б – усреднённый профиль сечения, в – плотность распределения шероховатости

На фиг. 3 представлены результаты АСМ поверхности рабочего элемента сенсора для определения концентрации глюкозы, модифицированного наночастицами гексацианоферрата никеля, выполненное в соответствие с Примером 3: а – 3D-изображение поверхности, б – усреднённый профиль сечения, в – плотность распределения шероховатости

На фиг. 4 представлена зависимость потенциала от концентрации глюкозы в соответствии с Примером 1.

На фиг. 5 представлена зависимость потенциала от концентрации глюкозы в соответствии с Примером 2.

На фиг. 6 представлена зависимость потенциала от концентрации глюкозы в соответствии с Примером 3.

Анализ фиг. 1-3 показал, что наименьшей толщиной плёнки наночастиц гексацианоферрата никеля и наибольшим количеством частиц на поверхности токопроводящего покрытия обладает Пример 2, имеющий на поверхности 854 кристаллита диаметром до 275 нм и высотой до 80 нм. Морфология рабочих элементов сенсора, полученный в соответствии с Примером 1, представляет собой 36 агрегатов частиц с диаметром до 20 мкм и высотой до 2,5 мкм соответственно. Морфология рабочего элемента сенсора, полученного в соответствии с Примером 3, представляет собой неоднородную поверхность с высотой до 3,5 мкм.

Анализ фиг. 4-6 показал, что рабочий элемент сенсора для определения концентрации глюкозы, модифицированный наночастицами гексацианоферрата никеля, полученный в соответствии с Примером 1, обладает минимальным откликом на глюкозу (|∆E| < 6 мВ) и является непригодным для измерения концентрации глюкозы. Рабочий элемент сенсора для определения концентрации глюкозы, модифицированный наночастицами гексацианоферрата никеля, полученный в соответствии с Примером 3, также не является оптимальным вследствие минимального отклика на глюкозу (|∆E| < 6 мВ), а также приводит к нелинейному изменению потенциала при добавлении глюкозы. Установлено, что рабочий элемент сенсора для определения концентрации глюкозы, модифицированный наночастицами гексацианоферрата никеля, полученный в соответствии с Примером 2, обладает наибольшим откликом на глюкозу в диапазоне от 0,1 до 100 мМ, предел обнаружения заявленного рабочего элемента сенсора для определения концентрации глюкозы, модифицированного наночастицами гексацианоферрата никеля, полученного в соответствии с Примером 2 составляет 55 мкМ, точность
измерений – 95,5 %. В связи с этим можно сделать вывод, что для получения высокой чувствительности рабочего элемента сенсора необходимо формирование на поверхности токопроводящего покрытия плёнки гексацианоферрата никеля наименьшей толщины.

Изобретение относится к области электрохимических сенсоров для определения анализируемых веществ в биологических жидкостях. Раскрыт способ получения рабочего элемента сенсора, модифицированного наночастицами гексацианоферрата никеля, для определения концентрации глюкозы, включающий синтез золя наночастиц гексацианоферрата никеля путём диспергации 0,01 М растворов гексацианоферрата калия и хлорида никеля в присутствии 0,3% Tween 80 в условиях воздействия ультразвукового излучения при следующих значениях параметров ультразвуковой обработки: частота озвучивания рабочего раствора 20-48 кГц, время озвучивания рабочего раствора 5-60 минут, частота модуляции УЗ-излучения 5-100 Гц, относительная мощность УЗ-излучения 50-100 Вт/л, перенесение в сосуд с вертикально помещённым токопроводящим покрытием золя наночастиц гексацианоферрата никеля с помощью перистальтического насоса со скоростью 10 об/мин и последующим осушением сосуда, высушивание при 100°С в течение 15 минут с трёхкратной повторностью процедур. Изобретение обеспечивает использование практически выгодной технологии получения золя наночастиц гексацианоферрата никеля и формирование рабочего элемента сенсора, имеющего большую чувствительность для определения глюкозы, имея при этом возможность многократного использования. 3 пр., 6 ил.

Способ получения рабочего элемента сенсора, модифицированного наночастицами гексацианоферрата никеля, для определения концентрации глюкозы, включающий синтез золя наночастиц гексацианоферрата никеля путём диспергации 0,01 М растворов гексацианоферрата калия и хлорида никеля в присутствии 0,3% Tween 80 в условиях воздействия ультразвукового излучения при следующих значениях параметров ультразвуковой обработки:

Частота озвучивания рабочего раствора 20-48 кГц Время озвучивания рабочего раствора 5-60 минут Частота модуляции УЗ-излучения 5-100 Гц Относительная мощность УЗ-излучения 50-100 Вт/л,

перенесение в сосуд с вертикально помещённым токопроводящим покрытием золя наночастиц гексацианоферрата никеля с помощью перистальтического насоса со скоростью 10 об/мин и последующим осушением сосуда, высушивание при 100°С в течение 15 минут с трёхкратной повторностью процедур.