Перекрестная ссылка на родственные заявки
Настоящая заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке на патент США № 61/968297, поданной 20 марта 2014, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к анализу на гликированные белки.
Предпосылки создания изобретения
Последующее обсуждение приводится только для лучшего понимания материала и не является допущением, что любая обсуждаемая информация или ссылка из процитированных в настоящем описании является прототипом настоящего изобретения.
Показано, что контроль за концентрацией глюкозы в крови у больных диабетом снижает частоту и тяжесть отдаленных осложнений, типа микрососудистых и неврологических заболеваний. Обнаружено, что скорость образования гликированного гемоглобина непосредственно связана с концентрацией глюкозы в крови. В результате при управлении уровнями глюкозы для определения, насколько хорошо управляли концентрацией глюкозы в крови в течение длительных периодов времени, используют измерение гликированного гемоглобина.
Как правило среднее время жизни красных клеток крови составляет приблизительно 90-120 дней. Следовательно, определение процента гликирования гемоглобина коррелирует со средней концентрацией глюкозы в крови в течение этого периода времени и особенно в предыдущие 2-3 месяца. Поэтому процент гликирования гемоглобина является индикатором гликемического контроля в этот период времени.
Варианты гемоглобина, такие как HbS, HbC, HbD, HbE, могут иметь более короткое среднее время жизни и различные степени гликирования и могут оказывать влияние на корреляцию %HbA1C со средней концентрацией глюкозы в крови, воздействуя поэтому на клинический показатель результата по HbA1C.
Знание того, присутствует ли обычный вариант, является важным фактором при оценке гликемического контроля, особенного при скрининге.
Также обнаружено, что глюкоза присоединяется в крови к белкам негемоглобинам, например, к распространенному белку альбумину. Так как период полувыведения альбумина из кровотока составляет примерно 20 дней, концентрация (или отношение) гликированного альбумина является мерой средней концентрации глюкозы в крови в предыдущие 2-3 недели.
В некоторых способах определения концентрации или процента гликированных белков используют дигидроксиборил-содержащие соединения, которые связываются с 1,2-цис-диолами углевода гликированных белков, для отделения их от негликированных белков. Такие способы включают способы, описанные в патентах США 4269605, 5284777, 5110745, 4861728, заявке PCT WO 96/03657 и заявке PCT WO 9840750, которые полностью включены в настоящее описании в качестве ссылок.
Краткое изложение сущности изобретения
Данное изобретение относится к анализам и соответствующим устройствам и реагентам для детекции гликированного белка, в частности, включая гликированный гемоглобин. Как известно, такая детекция используется при управлении уровнями глюкозы в крови у больных диабетом и для мониторинга статуса преддиабетических индивидуумов. В настоящем описании описываются анализы, которые являются быстрыми высокоточными анализами, подходящими для применения в различных условиях, особенно, в условиях обслуживания больных.
В данном изобретении описывается формат анализов для правильного и точного количественного определения процента гемоглобина А1С (т.е. гликированного гемоглобина). Кроме того, в некоторых воплощениях данный мультиплексный анализ будет определять, присутствует ли обычный вариант в исследуемом образце. В некоторых воплощениях анализ дает количественный результат по проценту гемоглобина А1С путем измерения как гемоглобина А1С, так и общего гемоглобина по отдельности и последующего установления соотношения двух результатов. Обычные варианты гемоглобина HbS, HbC, HbD и HbE можно измерить количественно, полуколичественно или качественно. При желании результаты по вариантам гемоглобина можно объединить или отразить по отдельности, показав присутствие или количество каждого варианта. Такая детекция применима при скрининге больных диабетом и для мониторинга статуса диабетических индивидуумов. В настоящем описании описываются анализы, которые являются быстрыми высокоточными анализами, подходящими для применения в различных условиях, включая условия обслуживания больных.
Первый аспект изобретения относится к способу определения фракции гликированного белка в образце. Способ включает контактирование (i) меченого элемента специфического связывания, специфического для общего белка или пептида, соответствующего общему белку (т.е. всего количества специфического белка в гликированной или негликированной форме, например, гликированного или негликированного гемоглобина), или для негликированного белка или пептида, и (ii) меченого элемента специфического связывания, специфического для гликированного белка (например, гликированного гемоглобина), или пептида, с
а) образцом, содержащим указанный белок или пептид белка, чувствительный к гликированию; и
b) указанным белком или пептидом или негликированным вариантом белка или пептида, любые из которых являются конкурентными белками и не из образца, и в некоторых воплощениях являются биотинилированными; и/или
с) гликированным вариантом белка или пептида, любой из которых является конкурентным белком и не из образца, и в некоторых воплощениях являются биотинилированными.
Способ включает последующее детектирование множества сигналов, где по меньшей мере первый сигнал показывает уровень гликированного белка (например, А1с), и по меньшей мере второй сигнал показывает уровень негликированного белка или общего белка (например, общего количества гемоглобина (гликированного и негликированного) и, необязательно, вариантов гемоглобина); и определение соотношения между гликированным белком и негликированным белком или между гликированным белком и общим белком как показателя фракции указанного белка, который в указанном образце является гликированным. В анализе контактирование осуществляют в условиях конкурентного связывания, и первый сигнал и второй сигнал являются различимыми, например, пространственно, или различимо различными сигналами (например, по различной длине волны испускаемого света и/или различным свойствам временной эмиссии).
В одном аспекте способ включает предоставление
1) первого меченого элемента специфического связывания для
а) негликированного белка (например, гемоглобина) или
b) его (а) пептидного фрагмента, специфически характерного для негликированного белка;
с) или общего (гликированного и негликированного) белка (например, гликированного и негликированного гемоглобина);
d) или его (с) пептидного фрагмента, характерного для общего (гликированного и негликированного) белка; и
2) второго меченого элемента специфического связывания для гликированной формы белка или пептидного фрагмента (например, гликированного гемоглобина (HbA1с) или его пептида, включающего гликированную аминокислоту).
Первый и второй элементы связывания приводят в контакт со смесью, включающей интересующий белок (например, гемоглобин, полученный из образца крови пациента). В образце гемоглобина человека, как правило, имеется некоторое количество гликированного гемоглобина и некоторое количество негликированного гемоглобина. Как описано в настоящем описании в другом месте, белок (представляющий интерес) можно предварительно обработать эндопептидазой для получения пептидных фрагментов белка. В таком случае первый и второй элементы связывания приводят в контакт со смесью, включающей пептидные фрагменты.
Затем можно определить относительные количества (i) гликированного и (ii) общего белка и негликированного. В конкурентном анализе полученная смесь элементов связывания и белка или пептидов состоит из (1) элементов связывания, связанных с белком или пептидом, и (2) несвязанных избыточных элементов связывания. Затем детектируют количество избыточных элементов связывания. Количество несвязанных избыточных элементов связывания обратно пропорционально количеству целевого белка или пептида в смеси. В некоторых воплощениях меченый элемент специфического связывания, специфический для общего белка гемоглобина, специфически связывает пептид, выбранный из группы, состоящей из 8KSAVTALWGKVNV20, 11VTALW15, 45FGDLSTP51, 76AHLDNLKGTFAT87, 49STPDAVMGNPKVKAHGKKVLGA70 и 122FTPPVQ127.
Формат анализа можно изменять по желанию. В некоторых воплощениях элементы связывания (например, антитела) соединяют с твердым носителем, который может включать, но не ограничиваться указанным, гранулы или частицы, которые необязательно могут быть мечеными. В некоторых воплощениях применяют латеральный поток к смеси элементов связывания и белков или их пептидов из образца для продвижения смеси к зонам захвата для несвязанных элементов связывания. Например, первая зона захвата на пути латерального потока может включать пептид, узнаваемый первым элементом связывания, где посредством этого иммобилизуется несвязанный первый элемент связывания. Вторая зона на пути латерального потока может включать пептид, узнаваемый вторым элементом связывания, с иммобилизацией второго элемента связывания. Первая и вторая зоны захвата могут находиться в одном или в разных местах на пути потока.
В других воплощениях смесь может дополнительно включать добавочные элементы связывания, специфические для белков (например, вариантов гемоглобина). Как пример, смесь может дополнительно включать третий элемент связывания, специфический для HbS, и четвертый элемент связывания, специфический для HbС. Такие элементы связывания также могут быть соединены с твердым носителем и, необязательно, помечены. Кроме того, третий и четвертый элементы связывания могут быть иммобилизованы в латеральном потоке с использованием пептидов, с которыми соответствующие элементы связывания специфически связываются. Это позволит пользователю дополнительно определять, получен ли образец от донора, который имеет вариант белок.
В некоторых воплощениях способ включает лизис клеток для высвобождения белка (например, красных клеток крови, содержащих гемоглобин), и/или по меньшей мере частичное денатурирование белка (например, гемоглобина или альбумина) и/или высвобождение N-концевого пептида белка или релевантного полипептида белка с использованием гидролиза эндопептидазой (например, пепсином или эндопротеазой GluC (S. aureus)).
В отдельном воплощении белок представляет собой человеческий гемоглобин, например, гемоглобин А1с. В некоторых воплощениях пептид представляет собой N-концевой пептид бета-цепи человеческого гемоглобина, например, длиной в 5-14, 5-11, 5-8, 5-7, 5, 6, 7 или 8 аминокислотных остатков. В некоторых воплощениях белок представляет собой человеческий сывороточный альбумин; пептид представляет собой N-концевой пептид человеческого сывороточного альбумина, например, пептид длиной в 4-17, 4-16, 4-15, 4-14, 4-10, 4-8, 6-17, 6-16, 6-15, 6-14, 6-10, 6-8 аминокислотных остатков. В некоторых воплощениях пептид включает Lue585, Lys525, Lys199, Lys439 или Lys281 человеческого сывороточного альбумина; используют ряд пептидов, которые включают пептиды, которые по отдельности включают 2, 3, 4 или 5 N-концевую аминокислоту Leu585, Lys525, Lys199, Lys439 и Lys281 пептида альбумина, включая каждую из возможных комбинаций. В некоторых воплощениях пептид отщепляют (например, от гемоглобина или альбумина в образце) с использованием эндопептидазы, например, пепсина или эндопептидазы GluC; пептид представляет собой множество пептидов, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или даже больше различных пептидов.
Метка, присоединяемая к элементам специфического связывания, может быть, например, флуоресцентной, для флуоресценции с разрешением во времени (TRF), хемилюминесцентной, колориметрической/поглощения или электрической/редоксной по природе. Как отмечалось выше, можно создать отдельные зоны детекции в устройстве для анализа в латеральном потоке, где устройство включает зону детекции с сайтом иммобилизации для гемоглобина А1С или соответствующей пептидной последовательности и сайтом иммобилизации для негликированного гемоглобина или соответствующего пептида, и где сигналы детектируются в отдельных зонах. Дополнительные зоны детекции могут быть включены для детекции вариантов. Это может быть одна зона для всех четырех вариантов или отдельные зоны для каждого специфического варианта. В некоторых воплощениях каждый элемент специфического связывания соединяется с различными копями одной и той же метки (например, TRF), и детекция происходит по отдельности путем захвата различных элементов связывания в различных зонах захвата в устройстве с латеральным потоком. В некоторых воплощениях сигнал, детектируемый от метки, представляет собой фосфоресценцию.
Для некоторых воплощений набор реагентов для анализа также включает буферный раствор; набор реагентов для анализа также включает эндопептидазу, например, трипсин, пепсин, эндопептидазу GluC, папаин или пролилэндоптидазу.
В некоторых воплощениях сигналы первого и второго элементов связывания являются флуоресцентными сигналами или сигналами флуоресценции с разрешением во времени (TRF). В некоторых воплощениях детекцию выполняют в устройстве для анализа в латеральном потоке, где устройство включает зону детекции с сайтом иммобилизации для элементов связывания, специфических для гликированного белка или пептида, и сайтом иммобилизации элементов связывания, специфических для общего белка или пептида (или негликированного белка или пептида), и где сигнал, соответствующий элементам связывания, специфическим для гликированного белка или пептида, и сигнал, соответствующий элементам связывания, специфическим для общего белка или пептида (или негликированного белка или пептида), детектируются по отдельности. В некоторых воплощениях устройство для анализа является специфическим, и сайт иммобилизации для элементов связывания, специфических для гликированного белка или пептида, и сайт иммобилизации элементов связывания, специфических для негликированного белка или пептида, физически разделены. В некоторых воплощениях устройство для анализа является таким, как указано выше, и сайт иммобилизации для гликированного белка или пептида и сайт иммобилизации для общего белка или пептида (или негликированного белка или пептида), является одним и тем же, и первый и второй сигналы различаются и, таким образом, детектируются по отдельности.
В отдельных воплощениях первый и второй сигналы идут от меток в анализе Luminescent Oxygen Channeling assay (LOCI), которые включают донорные и акцепторные метки.
В некоторых воплощениях с использованием LOCI общий белок или пептид (или негликированный вариант белка или пептида) и гликированный вариант пептида иммобилизуются или связываются с донорными метками LOCI, и элемент специфического связывания, специфический для общего белка или пептида (или негликированного белка или пептида), и элемент специфического связывания, специфический для гликированного белка или пептида, соединяются с акцепторными метками LOCI, например, где донорные метки LOCI представляют собой или включают гранулы (которые могут иметь покрытие), которые включают множество молекул донорных меток LOCI, и несколько белков или пептидов иммобилизованы или иммобилизуются на поверхностях гранул (например, с помощью ковалентной связи с гранулой или специфического связывания, такого как связывание биотин/стрептавидин).
В других воплощениях с использованием LOCI общий белок или пептид, соответствующий общему белку (или негликированный вариант пептида), и гликированный вариант пептида иммобилизуются с акцепторными метками LOCI, и элемент специфического связывания, специфический для гликированного белка или пептида, соединяется с донорными метками LOCI.
В отдельных воплощениях с использованием LOCI анализ выполняют как гомогенный анализ, или анализ выполняют с использованием анализа однородной суспензии мелких частиц (или обменного иммуноанализа).
В некоторых воплощениях коэффициент вариации вычисленных уровней гликированного белка или пептида (например, HbA1c) для образца в пределах диапазона измерений аналитической системы составляет менее 3,0, 2,7, 2,5, 2,3, 2,1, 2,0, 1,9, 1,8, 1,7, 1,6, 1,5, 1,4, 1,3 или 1,2% относительно минимума из 20 повторных измерений.
Связанный аспект относится к набору реагентов для анализа LOCI, включающему гликированный вариант определенного белка или гликированный пептид, полученный из него, гликированный в сайте гликироваия; меченый агент специфического связывания, который включает агент специфического связывания, специфический для гликированного варианта определенного белка или специфический для гликированного пептида, полученного из него, связанный с первым элементом первой пары донорной и акцепторной меток LOCI; меченый агент специфического связывания, который включает агент специфического связывания, специфический для негликированного варианта определенного белка или специфический для негликированного пептида, полученного из него, связанный с первым элементом второй пары донорной и акцеторной меток LOCI; и второй элемент первой пары донорной и акцеторной меток LOCI, соединенный или способный соединяться с гликированным вариантом определенного белка или гликированного пептида, полученного из него; и второй элемент второй пары донорной и акцеторной меток LOCI, соединенный или способный соединяться с негликированным вариантом определенного белка или негликированного пептида, полученного из него. Первая и вторая пара донорной и акцеторной меток LOCI могут быть одинаковыми или различными.
В некоторых воплощениях донорная метка LOCI соединена или может соединяться с негликированным белком или пептидом и с гликированным вариантом указанного белка или пептида, например, когда донорная метка LOCI включает гранулу, которая имеет много иммобилизованного белка или пептида, или несколько сайтов связывания для специфического связывания белка или пептида.
В некоторых воплощениях набор реагентов или их компонентов находятся в устройстве для анализа; компоненты набора реагентов объединены с образцом, содержащим определенный белок, который может быть гликирован in vivo, или пептид, полученный из него, который включает сайт гликирования.
Для некоторых воплощений набор реагентов для анализа также включает буферный раствор; набор реагентов для анализа также включает эндопептидазу, например, трипсин, пепсин, эндопептидазу GluC, папаин или пролилэндоптидазу.
В некоторых воплощениях определенный белок представляет собой человеческий гемоглобин; набор реагентов для анализа включает пептид Hb A1c; набор реагентов для анализа включает N-концевой пептид бета-цепи человеческого гемоглобина, например, длиной в 5-14, 5-11, 5-8, 5-7, 5, 6, 7 или 8 аминокислотных остатков; определенный белок представляет собой человеческий сывороточный альбумин; пептид в наборе реагентов представляет собой N-концевой пептид человеческого сывороточного альбумина, например, пептид длиной в 4-17, 4-16, 4-15, 4-14, 4-10, 4-8, 6-17, 6-16, 6-15, 6-14, 6-10, 6-8 аминокислотных остатков; пептид в наборе реагентов включает Lue585, Lys525, Lys199, Lys439 или Lys281 человеческого сывороточного альбумина; набор реагентов включает несколько пептидов; набор реагентов включает несколько пептидов, которые по отдельности включают, по меньшей мере, 2, 3, 4 или 5 N-концевую аминокислоту Leu585, Lys525, Lys199, Lys439 и Lys281 пептида альбумина, включая каждую из возможных комбинаций; набор реагентов включает один или несколько реагентов, специфических для первого аспекта, или описанных иначе в настоящем описании для настоящего изобретения.
В некоторых аспектах предлагается устройство с латеральным потоком (например, описанное в настоящем описании). В некоторых воплощениях устройство с латеральным потоком включает по ходу потока в указанном порядке область добавления образца; область эндопептидазы (область, содержащая эндопептидазу, раскрытую в настоящем описании); необязательно, область нейтрализации (например, при необходимости, область, включающая реагенты для нейтрализации растворов, выходящих из участка с кислой эндопептидазой, или, необязательно, включающая реагенты, которые связывают или иначе инактивируют эндопептидазу); одна или несколько областей смешивания реагентов; одну или несколько полосок для латерального потока и участок абсорбента. В некоторых воплощениях, по меньшей мере, одна область смешивания реагентов включает (i) меченый элемент специфического связывания, специфический для общего белка или пептида, соответствующего общему белку, или негликированного белка или пептида, (ii) меченый элемент специфического связывания, специфический для гликированного белка или пептида, и (iii) гликированный вариант указанного белка или пептида не из образца. В некоторых воплощениях указанный белок представляет собой человеческий гемоглобин. В некоторых воплощениях указанный гликированный белок представляет собой HbA1C. В некоторых воплощениях меченый элемент специфического связывания, специфический для общего белка, специфически связывает пептид, выбранный из группы, включающей 8KSAVTALWGKVNV20, 11VTALW15, 45FGDLSTP51, 76AHLDNLKGTFAT87, 49STPDAVMGNPKVKAHGKKVLGA70 и 122FTPPVQ127. В некоторых воплощениях гликированный вариант указанного белка или пептида не из образца является биотинилированным, и, по меньшей мере, одна из одной или нескольких полосок для латерального потока включает зону иммобилизации, включающую стрептавидин. В некоторых воплощениях, по меньшей мере, одна из одной или нескольких полосок для латерального потока включает следующие отдельные зоны иммобилизации: зона иммобилизации, включающая общий белок или пептид, соответствующий общему белку; зона иммобилизации, включающая гликированный белок или гликированный пептид. В некоторых воплощениях одна и та же или другая полоска для латерального потока включает зону иммобилизации, включающую одну или несколько изоформ белка. В некоторых воплощениях изоформы белка включают, по меньшей мере, одну из HbC, HbD Punjab, HbE или HbS. В некоторых воплощениях одна полоска для латерального потока включает следующие отдельные зоны иммобилизации: зона иммобилизации, включающая общий белок или пептид, соответствующий общему белку; зона иммобилизации, включающая гликированный белок или гликированный пептид; и вторая полоска для латерального потока включает зону иммобилизации, включающую одну или несколько изоформ белка. В некоторых воплощениях гликированный белок представляет собой человеческий белок; полоска для латерального потока включает мишень, не относящуюся к человеческой; и зона смешивания реагентов включает контрольный меченый элемент связывания, который специфически связывает мишень, не относящуюся к человеческой. В некоторых воплощениях метки являются флуоресцентными или метками флуоресценции с разрешением во времени (TRF). В некоторых воплощениях метки элементов связывания представляют собой одну и ту же метку.
Другие воплощения будут очевидны из подробного описания и из формулы изобретения.
Краткое описание фигур
Фиг. 1 является схематическим представлением рациометрической системы анализа на А1с. Смесь TRF-функционализированных гранул анти-Hb, анти-А1с и контроля (контрольный меченый элемент связывания) смешивают с гидролизованным пепсином образцом крови и биотинилированным синтетическим пептидом А1с. Реакционную смесь перемещают с помощью капиллярного эффекта на нитроцеллюлозную мембрану с полосками стрептавидина (для детекции А1с), синтетического пептида Hb (для детекции Hb) и контрольных антител. Высвобожденные пептиды Hb и А1с конкурируют за соответствующую зону, что приводит к ослаблению сигнала с возрастанием концентрации пептида. Зона контроля дает сигнал для нормализации иррегулярностей потока, дефектов мембраны и изменений концентраций реагентов. В зависимости от стандартных кривых аналитические сигналы можно получить или путем деления сигнала любой зоны аналита (Hb, А1с) на сигнал зоны контроля или путем деления сигналов зон аналитов друг на друга.
Фиг. 2 является схематическим представлением системы анализа для детекции варианта гемоглобина, называемого в настоящем описании «SCDE», для четырех вариантов, детектируемых в данной определенной конфигурации. Смесь TRF-функционализированных гранул анти-HbS, анти-HbC, анти-HbD и анти-HbE смешивают с гидролизованным пепсином образцом крови. Реакционную смесь перемещают с помощью капиллярного эффекта на нитроцеллюлозную мембрану с полосками конъюгатов синтетических SCDE-пептидов. Если один из SCDE-пептидов присутствует в образце, будет происходить конкуренция в соответствующей зоне, ведущая к ослабления связывания. Присутствие/отсутствие каждой изоформы выявляют по определенному снижению уровня сигнала.
Фиг. 3 является схематическим представлением конфигурации анализа для детекции как уровней А1С, так и того, имеет ли пациент вариант гемоглобина. Емкость с разбавленным буфером обеспечивает разбавитель, который смешивают с образцом крови. Смесь перемещают (например, с помощью вакуума или капиллярного эффекта, например) по каналу в камеру, содержащую эндопептидазу (описанную как «пепсин», когда белки крови переводят в пептиды). Полученную пептидную смесь перемещают в область нейтрализации (нейтрализации активности эндопептидазы, например, изменения рН раствора для инактивации эндопептидазы с кислотной активностью, такой как пепсин) и затем смешивают с элементами связывания (например, TRF-функционализированными гранулами анти-Hb, анти-А1с и эталона (контрольный меченый элемент связывания)) и конкурентом А1с (например, биотинилированным синтетическим пептидом А1с) в жидкой фазе. Смесь необязательно можно разделить (или не разделять) в различные полоски для латерального потока, в одной из которых детектируют уровни гемоглобина и А1с и эталона, и в одной из которых детектируют белки вариантов гемоглобина, если они присутствуют. Последний слой абсорбирует жидкость из реакционной смеси, где посредством этого жидкость пропускают по полоске(ам).
Фиг. 4 показывает отбор данных, показывающих преимущества рациометрического измерения гемоглобина и А1с. Различные графики показывают преимущество различной нормализации для уменьшения вариации при анализе.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к способам анализа для определения уровней конкретных гликированных белков. Такие способы применимы, например, для мониторинга средних уровней глюкозы в крови у индивидуума (обычно, человека, но способы также применимы для других животных, особенно, других млекопитающих). Хотя доступно множество способов определения уровней глюкозы в определенный момент времени, также полезна возможность мониторинга средних уровней со временем. Обнаружено, что уровни гликирования некоторых белков, в частности, гемоглобина и сывороточного альбумина, прочно коррелируют со средними уровнями глюкозы в предшествующий период времени, соответствующий среднему времени жизни определенного белка в организме. Поскольку приблизительное время жизни гемоглобина в крови 90-120 дней, гликированный гемоглобин применим в качестве индикатора средних уровней глюкозы в предшествующие 2-3 месяца с большим перевесом на предыдущий один месяц, в то время как альбумин можно использовать как индикатор уровней глюкозы в предыдущие 1-3 недели. Поскольку варианты гемоглобина имеют различную продолжительность жизни в крови, это может быть полезным для интерпретации анализа для указания того, имеется ли у испытываемого пациента одна или несколько форм вариантов гемоглобина. Количественные или полуколичественные сведения о количестве изоформы гемоглобина могут показать, что пациент является гетерозиготным или гомозиготным по определенному варианту, и врач может учесть это при оценке результатов анализа.
Таким образом, способы по настоящему изобретению можно использовать, например, для количественного определения уровней гликированного гемоглобина, но также можно использовать для количественного определения уровней гликированных белков не-гемоглобина, например, альбумина. В большинстве случаев анализы по настоящему изобретению выстраивают для получения соотносительных количеств гликированного белка и негликированного белка для определенного белка, представляющего интерес.
Последующее описание сосредоточено на определении гликированного гемоглобина, но следует иметь в виду, что способы также применимы для детекции других гликированных белков с заменой молекул связывания, специфических для гемоглобина, на молекулы связывания, специфические для другого нужного белка, вместе с другими соответствующими материалами и эмпирически выбранными регулировками процесса. Хотя в анализах можно использовать полноразмерные белки или полипептиды, во многих случаях лучше использовать короткие пептиды, обычно, длиной примерно в 4-20 аминокислотных остатков. Такие пептиды можно отщепить от полноразмерного полипептида с использованием эндопептидазы со специфичностью для подходящего сайта расщепления.
В некоторых аспектах определение процента гликированного гемоглобина (% HbA1C) проводят с детекцией варианта гемоглобина. Хотя в анализах можно использовать полноразмерные белки или полипептиды, в некоторых случаях полезно использовать короткие пептиды, обычно, длиной примерно в 4-20 аминокислотных остатков. Указанный пептид может быть внутреннего пептида. Такие пептиды можно отщепить от полноразмерного полипептида с использованием эндопептидазы со специфичностью для подходящего сайта расщепления. Детекция пептидов (фрагментов полипептидов) может улучшить точность и тщательность анализа.
А. Формы анализа гемоглобина
Форматы анализа, описанные в настоящем описании, подходят для применения с различными метками и запланированной детекцией, включая, но не ограничиваясь перечисленным, флуоресценцию, флуоресценцию с разрешением во времени (TRF), хемилюминесценцию, колориметрию/поглощение или электрохимию. Для того, чтобы получить мультиплексированные результаты (несколько результатов в одном испытании), такую форму анализа можно выполнить с использованием конфигурации латерального потока с отдельными зонами связывания/детекции для негликированного Hb (или всего Hb) и гликированного Hb (HbA1C).
Разработаны две различные конфигурации анализа на гликированный гемоглобин, и их можно адаптировать к анализам на другие гликированные белки. В первой используют люминесцентную метку, такую как флуоресцентная, фосфоресцентная метка или метка флуоресценции с разрешением во времени (TRF). Такую конфигурацию анализа можно выполнить, например, с использованием конфигурации латерального потока, как правило, с отдельными зонами связывания/детекции для Hb и для гликированного Hb (HbA1C), хотя можно использовать мультиплексирование. Сигнал TRF можно обнаружить путем детекции фосфоресценции. В некоторых воплощениях обнаруживают сигнал TRF, когда минимизируется флуоресценция или автофлуоресценция. Измерения фосфоресценции можно достичь с помощью прерывистого оптического возбуждения при одной длине волны (например, в ультрафиолетовой области) и последующего измерения сигнала затухающей люминесценции при другой длине волны (как правило, в видимой области). В этом отношении фосфоресценцию, которая имеет относительно длительное время затухания (как правило где-нибудь в области микросекунд-секунд), можно отличить от флуоресценции, которая имеет относительно короткое время затухания (как правило+ меньше 1 микросекунды). Примеры детекции сигнала TRF описаны, например, в РСТ/GB2012/051645. Например, в РСТ/GB2012/051645 описывается прибор для использования при измерении способности образца к люминесценции, где прибор включает источник возбуждающего света для излучения для возбуждения указанного образца под контролем управляющего сигнала; источник сигнала для генерации указанного управляющего сигнала для модуляции интенсивности испускаемого излучения, где указанный управляющий сигнал имеет первый компонент с первой частотой, имеющей период, который меньше или того же порядка, что и ожидаемая постоянная времени указанной способности к люминесценции, и второй компонент со второй частотой, имеющей период, который больше, чем указанная ожидаемая постоянная времени указанной способности к люминесценции; фотодетектор для приема люминесцентного излучения указанного образца в результате указанного возбуждения и для генерации сигнала детекции, представляющего интенсивность указанного принятого излучения; и демодулятор для демодуляции указанного сигнала детекции, посредством чего получают сигнал, представляющий указанную способность к люминесценции указанного образца.
Также можно использовать другие конфигурации. Во второй конфигурации используют метод с меткой зазора, обычно, анализ Luminescent Oxygen Channelling Assay (LOCI), который можно выполнять, например, с использованием композиции разделенной пробы или с использованием мультиплексирования. Каждая из таких конфигураций описана подробнее ниже.
1. Обработка образца
Для определения уровня гликированного гемоглобина в большинстве случаев используют образец крови (человека). Образец крови или ресуспендированные клетки приводят в контакт с лизирующим агентом (например, подходящим лизирующим детергентом или комбинацией детергентов) для высвобождения гемоглобина из красных клеток крови. Во многих случаях образец вводят в контакт с агентом, лизирующим красные клетки крови, перед добавлением в устройство для анализа, например, как предварительная обработка образца. Однако лизирующий агент вместо этого может содержаться в устройстве для анализа. Известны и могут быть использованы многие такие агенты, лизирующие красные клетки крови, например, различные детергентсодержащие композиции. Подходящие агенты, лизирующие красные клетки крови, включают, например, тритон Х-100 и игепал СА-630, и могут быть использованы другие агенты, известные специалисту в данной области техники..
Кроме лизиса красных клеток крови обработка образца может включать обработку для денатурации нативного гемоглобина, например, для диссоциации тетрамера гемоглобина, и также можно дополнительно денатурировать бета-цепи. Например, может быть благоприятной обработка гемоглобина при низком рН (например, при рН приблизительно 4 или 1-3) для более хорошего воздействия на N-концевой пептид бета-цепи для отщепления для высвобождения N-концевого пептида. В случае отщепления пепсином такие кислые среды (или даже более кислые среды) также подходят для активности пепсина.
Кроме того, обработка может включать разбавление образца для получения соответствующих пониженных концентраций Hb для детекции. Выбирают разбавление, совместимое с чувствительностью и динамическим диапазоном используемого анализа.
Обработка образца для других белков будет зависеть от белка, представляющего интерес. В то время как гемоглобин является внутренним компонентом красных клеток крови, другие способные к гликированию белки являются в крови внеклеточными (например, человеческий сывороточный альбумин), включенными в или присоединенными к стенкам клеток, или внутриклеточными в других типах клеток. Например, в случае внеклеточных белков часто будет желательно удаление клеточных компонентов из образца, например, фильтрацией или другими способами удаления клеток. Подобным образом, в случае белков клеточных мембран, включенных в или присоединенных к мембранам, обычно применяют высвобождение белка из мембраны, например, с использованием подходящих детергентов.
Как и в случае гемоглобина, можно применять денатурацию многокомпонентных белков и/или, по меньшей мере, частичную денатурацию вторичной и/или третичной структуры белка для того, чтобы сделать более доступными сайты связывания или расщепления. Необходимость такой денатурации можно легко определить для каждого белка и выбрать соответствующие агенты и/или условия денатурации.
2. Отщепление пептидов гемоглобина
Как указано выше, анализы по настоящему изобретению можно проводить с использованием или интактных белков или полипептидов или коротких пептидов, полученных из белка. Хотя анализ можно выполнять с использованием интактного гемоглобина (обычно денатурированного для диссоциации на субъединицы), в способах по настоящему изобретению обычно проводят детекцию гликированного пептидного фрагмента вместо интактного белка.
Гемоглобин преимущественно гликируется по N-концевому валиновому остатку бета-цепи (обычно только на одной из двух бета-цепей в нативной тетрамерной структуре). Таким образом, обработка образца также может включать расщепление гемоглобина для получения пептидного фрагмента, который включает N-концевой валин. Это можно выполнить с использованием подходящей(их) пептидазы(пептидаз), например, эндопептидазы, например, гидролиза пепсином или эндопротеиназой GluC. В зависимости от выбранной(ых) пептидазы(пептидаз) и условий гидролиза в некоторых воплощениях полученный N-концевой пептид бета-цепи будет составлять в длину приблизительно 5-11 остатков.
Когда для расщепления используют пепсин, как правило, раствор делают кислым, например, с рН приблизительно 1,1-4,5 (часто с рН приблизительно 1,2-2,0), и проводят расщепление в течение подходящего времени, определенного эмпирически. Для пепсина обычно подходящее время гидролиза будет составлять приблизительно 0,1-60 минут при 37оС, а в некоторых воплощениях 0,3-30 минут. Затем пепсин можно инактивировать денатурацией, повышая рН до приблизительно рН 8,0.
Эндопептидазу можно привести в контакт с образцом в жидкой или в твердой композиции. Например, эндопептидазу можно включить в композицию в виде лиофилизованной или высушенной иначе композиции, которая легко растворяется при контакте с жидким образцом. После гидролиза эндопептидазой полученный раствор можно ввести в контакт с буфером для повышения рН раствора, например, до значения между рН 6-8, например, 7,2-7,8, например, 7,4.
3. Детекция изоформ гемоглобина
Обнаружено, что способы по настоящему изобретению имеют существенное преимущество, предоставляя мультиплексную детекцию и измерение нескольких изоформ гемоглобина или как интактных белков (или интактных субъединиц) или путем детекции характеристических пептидов изоформ (различимых пептидов, которые включают соответствующий мутированный остаток). В некоторых воплощениях характеристический пептид изоформы включает соответствующие мутированные остатки HbC (E6K), HbS (E6V), HbE (E26K) и HbD Punjab (E121Q). Ссылка на такие изоформы гемоглобина является стандартом в этой области. Ссылка в настоящем описании на HbD без дополнительной идентификации полиморфизма должна обозначать HbD Punjab (HbD Los Angeles).
Наиболее часто встречающимся гемоглобином является HbA (нормальный зрелый Hb) с вариантными изоформами HbC, HbD, HbE, и HbS, встречающийся с различной частотой в человеческой популяции. Все эти перечисленные вариантные изоформы включают мутации в бета-цепи. Изоформы, представляющие интерес, можно детектировать в анализах на гликированный гемоглобин по настоящему изобретению с использованием антител с хорошей специфичностью в отношении соответствующих изоформ (или, что предпочтительнее, имеющих хорошую специфичность в отношении характеристических изоформ пептидов) с образованием комплексов (например, для захвата и мечения с образованием комплекса, детектируемого детекцией TRF). Различные изоформы можно детектировать в одной мультиплексированной зоне или в различных зонах. Специфичность антител и варианты гемоглобина описаны, например, в патенте США № 8603828 В2. Можно выбрать моноклональные антитела, которые детектируют общий гемоглобин, которые связываются с эпитопом, свойственным для Hba, и вариантами гемоглобина. Можно выбрать моноклональные антитела, которые специфически детектируют негликированный гемоглобин, которые связываются с пептидом гемоглобина, который имеет сайт потенциального гликирования, но который не является гликированным. Примеры пептидов, применимых для появления антител, способных точно детектировать белок общий гемоглобин, включают, например, 8KSAVTALWGKVNV20, 11VTALW15, 45FGDLSTP51, 76AHLDNLKGTFAT87, 49STPDAVMGNPKVKAHGKKVLGA70, 122FTPPVQ127.
Детекция изоформ, описанная выше, обеспечивает детекцию без вмешательства HbF (α2γ2), поскольку соответствующие бета-цепи (пептиды бета-цепей) не присутствуют в HbF, и соответственно специфические к изоформе антитела не будут связывать белок или пептиды HbF.
Также обнаружено, что гидролиз пепсинами, используемый для высвобождения пептида А1с, также высвобождает подходящие характеристические изоформы пептидов для HbC, HbD Punjab, HbE и HbS. В результате можно осуществить один гидролиз для любого или всех из HbA1c, HbC, HbD, HbD и HbS в одной реакции гидролиза пепсином. Это можно выполнить в устройстве для анализа с последующей детекцией изоформ на основании специфического связывания с характеристическими изоформами пептидов.
Гидролиз для А1с также будет высвобождать соответствующие N-концевые пептиды из других изоформ. В результате определение отношения А1с/негликированный пептид будет включать другие изоформы Hb при определении отношения.
Также можно использовать другие эндопептидазы, когда подтверждается, что определенная пептидаза высвобождает подходящий(е) пептид(ы). При использовании такой другой пептидазы обычно будет желательно завершать реакцию гидролиза в некоторый момент. Такое завершение можно выполнить с использованием соответствующего ингибитора или другого способа, подходящего для эндопептидазы, представляющей интерес. В некоторых случаях может быть желательно использование двух или больше различных эндопептидаз, обычно по отдельности.
4. Анализ на HbA1c в латеральном потоке
Как указано выше, анализ можно выполнять с использованием конфигурации латерального потока или с негидролизованным Hb или с одним или несколькими пептидами из бета-цепи. Способы можно осуществлять как конкурентный анализ, включающий определение всего Hb и гликированного Hb, где посредством этого получают отношение (которое можно выразить в процентах) HbA1C ко всему Hb, хотя также возможно построить неконкурентный анализ. Таким образом, анализ включает, по меньшей мере, два определения: 1) определение всего Hb (или, с другой стороны, негликированного Hb) и 2) определение гликированного Hb. Так, в некоторых случаях в анализе определяют уровень негликированного Hb и гликированного Hb, и затем общий Hb определяют как сумму негликированного Hb и гликированного Hb. Это может определенно применяться для улучшения точности, когда значения как негликированного Hb, так и гликированного Hb получают в анализе одного и того же типа, так что неточности, которые могут иметь место при одном измерении, могут «вычеркнуть» или уменьшить подобную ошибку в другом измерении, например, когда используется такое отношение, как следующее далее.
Затем можно вычислить % HbA1C:
%HbA1C = [HbA1C]/([HbA1C + негликированный Hb] x 100
= [HbA1C]/[общий Hb] x 100.
Описание в данном разделе фокусируется на конкурентном анализе с использованием конкурентного пептида. В некоторых воплощениях для определения всего Hb пептид, отщепленный от образца Hb (образец), и конкурентный негликированный N-концевой пептид (экзогенный пептид не из образца, часто синтетический) конкурируют за связывание с меченым агентом специфического связывания для пептида негликированного Hb, например, антитела против пептида Hb. В некоторых воплощениях пептид состоит из или включает аминокислотные остатки 49-70 Hb, но в любом случае имеется пептид, который включает общий или часть эпитопа, узнаваемого агентом связывания для негликированного Hb. Агент связывания может быть меченым, связанным с гранулой или частицей или тем и другим. В некоторых воплощениях агент связывания иммобилизован или может быть захвачен в зоне детекции (например, с использованием связывания биотин-стрептавидин или путем специфического связывания элемента связывания с иммобилизованным пептидом). Два пептида (один из образца и один, являющийся конкурентным пептидом) конкурируют за связывание со специфическим агентом связывания, и детектируют количество связывания пептида образца или конкурентного пептида со специфическим агентом связывания. Такой аспект поясняется на фиг. 1.
Например, в некоторых воплощениях обработанный эндопептидазой и нейтрализованный образец вводят в контакт с меченым элементом специфического связывания, специфическим для пептида, представляющего общий белок, и затем полученную смесь вводят в контакт с иммобилизованным пептидом, который конкурирует за связывание с элементом специфического связывания. Связывание с иммобилизованным пептидом обратно пропорционально количеству пептида-мишени в образце. Детектируемый сигнал имеет обратную связь с уровнем всего Hb в образце.
Подобным образом в той же реакции для определения HbA1C N-концевой пептид, отщепленный от образца HbA1C (образец), и негликированный N-концевой пептид (не из образца, обычно синтетический) конкурируют за связывание с меченым агентом специфического связывания (например, антителами) для N-концевого пептида HbA1C. Агент связывания иммобилизован или может быть захвачен в зоне детекции (например, с использованием связывания биотин-стрептавидин). Два пептида конкурируют за связывание со специфическим агентом связывания. Детектируемый сигнал имеет обратную связь с уровнем всего Hb в образце.
Например, в некоторых воплощениях обработанный эндопептидазой и нейтрализованный образец вводят в контакт с меченым элементом специфического связывания, специфическим для пептида, представляющего гликированный Hb (например, А1с), и затем полученную смесь вводят в контакт с пептидом А1с, который конкурирует за связывание с элементом специфического связывания. Пептид А1с может быть иммобилизован изначально, или, в другом воплощении, пептид А1с может быть биотинилирован. В последнем случае А1с в образце конкурирует с конкурентным пептидом А1с за связывание с элементом связывания, и впоследствии конкурентный биотинилированный пептид А1с захватывается в зоне, включающей иммобилизованный стрептавидин, где посредством этого захватывается биотинилированный конкурентный А1с и любой элемент специфического связывания, связанный с биотинилированным конкурентным А1с. Связывание с иммобилизованным пептидом обратно пропорционально количеству пептида-мишени в образце. Детектируемый сигнал имеет обратную связь с уровнем А1с в образце.
Зоны детекции для негликированного Hb и HbA1C являются различными в анализах, в которых используют одну и ту же метку для обеих детекций, но зоны детекции могут быть одной и той же зоной в анализах, в которых используют различные метки, которые обеспечивают отличимые сигналы.
В аспектах, где следует детектировать варианты Hb, образец можно ввести в контакт с мечеными элементами связывания, специфическими для вариантов (например, различными элементами специфического связывания для каждого детектируемого варианта), и затем ввести в контакт с конкурентным пептидом, для которого детектируют вариант. Как в анализах, обсуждаемых выше, в некоторых воплощениях конкурентный пептид для каждого варианта может быть иммобилизован, и связывание меченого элемента специфического связывания с конкурентным пептидом обратно пропорционально количеству варианта в образце. Меченые элементы специфического связывания, специфические для вариантов, могут захватываться в той же полоске для латерального потока, где детектируется общий и гликированный белок, или с другой стороны, может детектироваться в отдельной полоске для латерального потока. См., например, фиг. 2 и 3.
В некоторых воплощениях смешивание происходит в жидкой фазе (например, в канале микропотока, но не в полоске или слое латерального потока), и смесь доставляется непосредственно из жидкой фазы в полоску для латерального потока. Такой аспект позволит избежать некоторых проблем, которые могут иметь место в стандартных анализах в латеральном потоке, где смешивание происходит в «сухой фазе» (т.е. в слое или на мембране), где стыки между слоями и мембранами могут препятствовать движению частиц, что приводит к некоторой дополнительной степени неточности.
В некоторых воплощениях также можно выполнить контрольные реакции связывания и использовать для нормализации сигнала от реакций связывания, описанных выше. Например, в некоторых воплощениях смесь элементов связывания может дополнительно включать контрольный меченый элемент связывания, который специфически связывается с мишенью, возможной не в образце. Как пример, контрольный меченый элемент связывания (например, антитела) может иметь специфичность связывания для белка из различных видов (например, козьего IgG). Контрольный меченый элемент связывания может подчиняться латеральному потоку с оставшимся раствором и затем захватываться в зоне, включающей белок, который специфически связывает контрольный меченый элемент связывания (например, антикозий IgG). Количество связывания должно оставаться довольно постоянным, но будет изменяться в зависимости от переменных в анализе иных, чем аффиность специфического связывания. Затем сигнал, генерируемый контролем, можно использовать для нормализации сигналов других мишеней, где посредством этого уменьшается разброс в анализе.
5. Анализ LOCI на HbA1c
Обнаружено, что анализ на HbA1c можно эффективно построить с использованием анализа Luminescent Oxygen Channeling (LOCI). Эффективной формой является формат конкурентного анализа. Во многих случаях агент специфического связывания вводят в контакт сначала с отщепленным пептидом и затем с синтетическим пептидом, но порядок может быть обратным, или контакт может быть одновременным.
Так, в конкурентном анализе LOCI компоненты могут включать синтетический или очищенный пептид Hb, соединенный с донорной или акцепторной меткой LOCI (например, любой связан с меткой или может быть связан с меткой, например, путем использования пары стрептавидин/биотин), и подобным синтетическим или очищенным пептидом А1с. Также существуют антитела против пептида Hb и против пептида HbA1С (или другой агент специфического связывания), каждый связан с другой парой донорной и акцепторной меток LOCI.
В одной форме образец расщепляют после обработки образца, так что уровни пептида Hb и пептида HbA1С соответственно определяют в отдельных пространствах или местоположениях, например, в отдельных объемах раствора. Как пример, образец может быть осажден в отдельных лунках или может стекать в отдельные протоки.
Как альтернатива расщеплению образца, анализ может быть мультиплексированным, например, путем использования акцепторных меток LOCI, которые испускают свет с различимо различными длинами волн и/или в различимо различное время. Ряд таких акцепторов известен и может быть использован.
В некоторых воплощениях базовый анализ с использованием пептида А1с включает использование и негликированного N-концевого пептида и гликированного N-концевого пептида. Негликированный N-концевой пептид и гликированный N-концевой пептид можно использовать в различных реакциях конкурентного связывания или можно использовать в одной реакции связывания в конъюгации с мультиплексированием. Реакция для гликированного пептида будет описана; реакция для негликированного пептида, по существу, такая же за исключением того, что она включает антитела, специфические для негликированного пептида. В некоторых воплощениях пептид соединяют с биотином, но вместо этого его можно соединить непосредственно с донорной гранулой LOCI. Смесь связывания также включает антитела против пептида HbA1С, соединенного с акцепторной меткой LOCI. (Как примечание, другая реакция будет включать антитела против N-концевого пептида Hb.) Такие реагенты и образец, содержащий отщепленный N-концевой пептид (пептид HbA1С), соединяют и создают возможность для конкурентного связывания отщепленного N-концевого пептида и пептида, который может соединяться или соединен с донорной меткой LOCI. Результат таков, что конъюгат антитело-акцепторная метка будет связываться с отщепленным пептидом, и пептидом, соединенным или который может соединяться с донорной меткой в соотношениях, соответствующих их соответствующим количествам в реакционной смеси для связывания.
Когда донорную метку LOCI вводят в контакт со светом с длиной волны, соответствующей метке, донорная метка генерирует синглетный кислород. Поскольку синглетный кислород имеет очень короткое время жизни в водной среде, будет выявляться только слабое испускание света от акцепторной метки, если расстояние между донорной и акцепторной метками мало, т.е. если пептид, соединенный с донорной меткой, связан с конъюгатом антитело-акцепторная метка. В случае конъюгата антитело-акцепторная метка, который связан с пептидом из образца, испускание света не будет происходить, поскольку отсутствует близко соединенная донорная метка LOCI (т.е. генератор синглетного кислорода).
В результате, когда полная смесь для конкурентного связывания облучается светом с длиной волны, подходящей для генерации синглетного кислорода из донорной метки LOCI, интенсивность испускаемого светового сигнала будет иметь обратную зависимость от концентрации отщепленного пептида в реакционной смеси для связывания. Таким образом, чем выше концентрация отщепленного N-концевого пептида, тем более слабым будет полученный сигнал, и наоборот, чем ниже концентрация отщепленного N-концевого пептида, тем сильнее будет полученный сигнал. Сигнал, соответствующий гликированному пептиду, и сигнал, соответствующий негликированному пептиду, коррелируют с соответствующими концентрациями соответствующих пептидов. Затем фракцию пептида, который гликирован, можно вычислить как отношение гликированного пептида ко всему пептиду в виде
гликированная фракция = [г Hb]/([г Hb + Hb] = [г Hb]/([общий Hb]
В некоторых случаях анализ с использованием LOCI обеспечивает высокую точность, давая результаты для вычисленного процента HbA1c с CV менее 3,0, 2,7, 2,5, 2,3, 2,1, 2,0, 1,9, 1,8, 1,7, 1,6 или 1,5 % относительно минимума из 20 повторов.
6. Примеры анализа на HbA1c
Анализы выполняют с использованием метки TRF в конфигурации латерального потока и с использованием конкурентного LOCI.
Гидролиз пепсином и подготовка к анализу
Условия гидролиза пептидазой могут существенно изменяться. Пример условия с пепсином можно найти в Thomas et al., Reg. Toxicol. Pharmacol., 39 (2004) 87-98. С учетом возможного изменения можно проверить различные условия для высвобождения N-концевого пептида Hb, в том числе указанные далее.
1. Hb (как А1с, так и негликированный Hb) разбавляют до 5 мг/мл (3х).
2. Получают 1 мг/мл пепсина в 84 мМ HCl, 35 мМ NaCl, при рН 1,3 (имитация желудочного сока - SGF).
3. Распределяют 100 мкл SGF в 12 пробирок и нагревают до 37оС.
4. В 6 пробирок добавляют 5 мкл всего Hb (5 мг/мл), в последней пробирке пепсин отсутствует.
5. В другие 6 пробирок добавляют 5 мкл А1с (5 мг/мл), в последней пробирке пепсин отсутствует.
6. Пробирки как с Hb, так и с А1с вынимают через 5, 10, 20, 30 и 60 минут, гасят реакцию 35 мкл 0,2 М раствора NaHCO3, pH 11, и затем греют при 85оС в течение 10 мин.
Пример анализа TRF
Для пробного анализа используют гидролиз с SGF в небольшом масштабе. В таком протоколе гидролиза 2 мкл образца для гидролиза ([Hb] = 180 мкг/мл) добавляют к 149 мкл SGF (содержит пепсин), рН 1,3, при 37оС. Гидролиз проводят в течение 1 мин, затем реакцию гасят, добавляя 50 мкл 0,2 М раствора NaHCO3, pH 11 (также содержащего фруктозилвалин в концентрации 5 мг/мл), получая конечную [Hb] = 1,8 мкг/мл.
Для фактического анализа 16 мкл гидролизата соединяют с 2 мкл антител TRF против пептида (5 мкг/мл) и 2 мкл биотинилированного пептида (20 мкг/мл).
Смесь наносят на аналитическую полоску с полоской стрептавидина. Антитела конкурентно связывают как пептид из гидролизата, так и биотинилированный пептид, но только комплексы биотинилированный пептид-Аb будут иммобилизовываться на стрептавидиновой полоске (зона захвата аналитической полоски). Анализ можно проводить для получения количественных результатов по гликированному пептиду, или можно проводить как с гликированными, так и негликированными пептидами и получить результаты по соотношению (например, в процентах). Когда анализируют как гликированные, так и негликированные пептиды, их можно пропускать по отдельности (например, с использованием одного образца и двух различных полосок) или вместе с мультиплексированием (например, метками, которые испускают свет с детектируемо различной длиной волны и/или детектируемо различными временными характеристиками, или с помощью захвата в различных участках аналитической полоски).
Результаты рациометрического измерения и нормализации при уменьшенной вариации в анализе
Составляют план рациометрического анализа, в котором один ряд резервируют для конкурентного анализа А1с, и другой содержит антикозьи антитела, с которыми модифицированные козьими антителами частицы TRF, смешанные с модифицированными Ab анти-А1с, могут связываться с образованием контрольной линии. Полоска, используемая в этом анализе, содержит две линии: стрептавидина и антикозьих антител. Анализ на А1с проводят путем смешивания анти-А1с гранул TRF с биотинилированным пептидом А1с и ингибируя связывание с калибратором гидролизованного А1с на линии стрептавидина. Антикозьи Ab наносят на вторую линию и они служат в качестве постоянного контроля. Гранулы анти-А1с TRF и козьи TRF смешивают, и их относительные концентрации подгоняют для получения приблизительно равных сигналов при нулевом ингибировании.
На Фиг. 4 представлены данные вышеописанного анализа. Когда общий Hb и контрольный сигнал измеряют независимо, измеряют вариацию с 17 и 19% CV, соответственно (фиг. 4, А и В). Деление сигнала Hb на контрольный сигнал снижает CV до 7% (фиг. 4, С и D). Когда А1с и контрольный сигнал измеряют независимо, измеряют вариацию при 20 и 17% CV, соответственно. Деление сигнала Hb на контрольный сигнал снижает CV до 8% (фиг. 4, Е и F). Когда сигналы А1с и Hb измеряют независимо, измеряют вариацию при CV 20 и 19%, соответственно. Деление сигнала Hb на контрольный сигнал снижает CV до 6%.
Детекция вариантов Hb (изоформ)
Взятые у пациентов образцы, о которых известно, что они содержат изоформы Hb, гидролизуют пепсином в имитированном желудочном соке (SGF) при 37оС. Гидролизованный образец разбавляют до полного 500х разбавителем для анализа. Восемнадцать микролитров описанного выше образца добавляют к лиофилизованному осадку, содержащему четыре типа гранул SCED. Реакционную смесь пропускают через иммунохроматографическую мембрану с полосками пептидов Hbs, HbC. HbD и HbE (фигура 2). Затем полоску прямо считывают в TRF-ридере. В таблица 1 показан процент сигнала, остающегося в каждой зоне полоски, относительно среднего сигнала неизоформного отрицательного контроля HbAA, демонстрируя тем самым, что с помощью анализа можно детектировать различные изоформы.
Таблица 1
Пример анализа LOCI
При проведении анализа как анализ LOCI с использованием пептида Hb A1с получают высокоточные результаты. Далее «акцептор» относится к акцепторной метке LOCI, и «донор» относится к донорной метке LOCI. В примере анализа LOCI используют такой же гидролиз, как в примере TRF. Для того, чтобы выполнить анализ, 14 мкл гидролизата соединяют с 2 мкл раствора комплекса акцептор-антипептидные антитела в концентрации 200 мкг/мл, 2 мкл раствора биотинилированного пептида в концентрации 2 мкг/мл и 2 мкл конъюгата стрептавидин-донор. Смесь выдерживают один час в темноте и затем считывают сигнал. Как и в примере TRF, анализ на гликированный пептид и на негликированный пептид можно проводить так, что сигналы находятся в различных локациях, или сигнал может быть мультиплексирован.
7. Другие конфигурации анализа
Кроме анализа в описанной основной конфигурации анализы по настоящему изобретению можно конфигурировать другими путями.
В некоторых аспектах, снова иллюстрирующих конфигурации с HbA1C, тем не менее также применимы другие конфигурации для других гликированных белков, анализ в латеральном потоке или в формате LOCI можно выполнить с использованием первых антител против пептида, представляющего интерес, например, пептида HbA1C из образца пациента, и синтетического конкурентного пептида А1с. В случае латерального потока пептид А1с иммобилизуется или свободен, но способен к иммобилизации (например, с использованием пары стрептавидин-биотин, например, где синтетический пептид А1с соединяется с биотином и может быть иммобилизован в некоем местоположении через связь со стрептавидином) в первом положении аналитической полоски. В результате синтетический пептид А1с связывается с первыми антителами и иммобилизуется или способен к иммобилизации в первом положении. Таким образом, при конкурентном связывании между синтетическим пептидом А1с и отщепленным пептидом А1с из образца пациента меченый конъюгат с антителами против пептида, который не связывается с отщепленным пептидом из образца пациента, будет связывать иммобилизованный или способный к иммобилизации синтетический пептид А1с. Иммобилизованная метка с синтетическим пептидом дает сигнал, связанный в обратном соотношении с концентрацией пептида А1с в образце. Меченый конъюгат с антителами, который связывается с отщепленным пептидом из образца пациента, не будет связываться в первом положении, поскольку он не несет связывающей частицы (такой как биотин).
В некоторых воплощениях также предлагаются вторые антитела, специфические для HbA1C. В таком воплощении вторые антитела со связанным отщепленным пептидом из образца пациента будут связываться во втором положении. Если концентрация вторых антител титруется так, что, по существу, все вторые антитела связаны с отщепленным пептидом из образца пациента, сигнал во втором положении будет соотноситься с концентрацией отщепленного пептида в образце, который поэтому может коррелировать с концентрацией HbA1C в исходном образце. В таком формате второе положение действует как контроль на конкурентное связывание и сигнал в первом положении.
Другая альтернатива включает использование антител против гликированного пептида и антител против полноразмерного белка или против пептида, который взаимосвязан с полноразмерным белком. Она также включает гидролиз белка для высвобождения определенного гликированного пептида, например, N-концевого пептида. Если используют антитела против полноразмерного белка, в некоторых воплощениях гидролиз происходит только частично, причем в то же время остается критическая структура эпитопа для узнавания антителами против белка. Если используют дополнительный гидролиз, подходящими являются антитела против второго пептида, взаимосвязанного со всем белком. В случае конфигурации с латеральным потоком раствор для гидролиза, содержащий отщепленный гликированный пептид и частично гидролизованный белок (или другой пептид, взаимосвязанный со всем белком), наносят на полоску, на которой имеется иммобилизованный синтетический пептид (или стрептавидин или другой элемент связывания для иммобилизации синтетического пептида) в первом положении. Отщепленный гликированный пептид из образца пациента конкурируют за связывание со способным к иммобилизации (например, с использованием пары стрептавидин/биотин) или иммобилизованным синтетическим пептидом. В результате связывание в первом положении приводит к сигналу, который соотносится в обратном порядке с концентрацией отщепленного пептида в образце. Второе положение содержит агент иммобилизации для конъюгата антитело-белок (или антитело-второй пептид).
Анализы с использованием LOCI также можно сконструировать для двойного определения, включающего гликированный пептид и общий белок или пептид, взаимосвязанный со всем белком (для определенного белка). В таких анализах компоненты включают одну из пар меток LOCI, соединенную или способную соединяться с синтетическим гликированным пептидом, и другую пару меток LOCI, соединенную с антителом против пептида. Отщепленный пептид конкурирует с синтетическим пептидом за связывание с меченым антителом. Как описано ранее, сигнал соотносится в обратном порядке с концентрацией отщепленного (из образца) пептида. Детекция гликированного пептида происходит вместе с детекцией белка или пептида, взаимосвязанного со всем белком. Соответствующую детекцию можно провести в отдельных объемах или в одном объеме с мультиплексированием, обеспечивающем различимые сигналы.
В. Формы анализа на альбумин
Другим белковым объектом для неферментативного гликирования in vivo является человеческий сывороточный альбумин, который имеет время полужизни в сыворотке примерно 20 дней. Определение уровня гликирования альбумина предложено как мера, применимая при лечении диабета.
Хотя различные формы, описанные для анализа А1с гемоглобина, можно использовать для гликированного альбумина, метод LOCI является преимущественным для такого применения. Как и раньше, в этом способе используют LOCI, и его можно выполнить, например, с использованием размещения расщепленного образца или с использованием мультиплексирования. Сообщается, что альбумин преимущественно гликируется по природе по четырем сайтам с преобладанием по N-концу.
Анализ может иметь структуру для использования одного или нескольких природных сайтов гликирования, например, лизиновых остатков, которые доступны для гликирования. В некоторых случаях выбранные сайты гликирования будут включать N-конец и/или один из Lys525, Lys199, Lys439 и Lys281. Как показано, можно выбрать и использовать пептид или пептиды, которые включают один или несколько таких сайтов гликирования и/или других. Другие сайты гликирования включают, например, доступные аргининовые остатки и другие доступные лизиновые остатки. Полезно определить фракцию гликированного альбумина по одному или нескольким остаткам вместо определения абсолютного уровня гликирования. Использование гликированных фракций помогает устранить некоторые источники изменчивости, включая многие вариабельности от пациента к пациенту и обработки образцов.
Различные сайты гликирования могут гликироваться с различной скоростью и поэтому могут быть гликированы в различной степени, которая зависит от средней концентрации глюкозы в крови. В результате для определения картин гликирования и/или степени гликирования могут быть использованы несколько сайтов гликирования в комбинации. Подобно анализу одного сайта гликирования это применимо для определения отношения гликирования для каждого сайта. Иными словами, определяют отношение гликированного остатка к негликированному остатку в каждом сайте. При низких уровнях глюкозы в крови только более чувствительный остаток или остатки будут гликированы, например, 5-концевой остаток. При более высоких уровнях глюкозы в крови будет гликирована прогрессивно большая пропорция более чувствительных остатков, и будет начинаться гликирование умеренно чувствительных остатков. При еще более высоких уровнях глюкозы в крови наиболее чувствительные остатки будут гликированы до еще большей степени, будет гликирована прогрессивно большая пропорция умеренно чувствительных остатков, и будет начинаться гликирование малочувствительных остатков. В результате картина и/или степень гликирования каждого набора остатков, подвергнувшихся гликированию, могут быть использованы для получения подтверждающей или дополнительной информации о средних уровнях глюкозы в крови. Это можно применить, например, для мониторинга эффективности различных стратегий медицинского вмешательства или вмешательства в образ жизни и/или рисков для пациента.
С. Регулирование точности анализа
Обработка образца может включать разведение образца для получения соответствующих уменьшенных концентраций аналита для детекции. В некоторых воплощениях выбирают разведение, совместимое с чувствительностью и динамическим интервалом используемого анализа. Полезно использовать анализ, который обеспечивает, по меньшей мере, 4, 4,5 или 5 порядки величины динамического интервала сигнала или даже больший интервал.
В более широком смысле путем использования соответствующего разведения образца, нагрузки меткой и конструкции зоны детекции в системе детекции с соответствующей меткой в широком динамическом интервале релевантный (например, клинически релевантный) интервал концентрации аналита можно расширить сверх динамического интервала детектируемого сигнала, получая в результате повышенную клиническую точность. Такое преимущество можно получить, поскольку в широком интервале неточность из-за анализа и системы детекции является относительно постоянной. Таким образом, при осуществлении этого желательно избегать зон на кривой сигнал-концентрация, где шум системы становится существенно большим. Такой подход можно использовать во многих применениях анализа, например, где релевантная величина интервала концентрации существенно меньше, чем динамический интервал системы детекции. Так, например, если релевантный интервал концентрации расширяется на 1 или 2 порядка величины, в то время как динамический интервал сигнала имеет 5 порядков величины, сигнал, соответствующий 1 или 2 порядкам величины, может быть усилен сверх 5 порядков интервала сигнала.
Наклон кривой сигнал-концентрация можно регулировать путем подбора любого из нескольких различных параметров. Во многих случаях наклон и место сигнала-концентрации регулируются так, что сигнал, соответствующий наивысшей концентрации, представляющей интерес, будет находиться вблизи вершины динамического интервала системы детекции (обычно это можно реверсировать для анализа конкурентного типа). В этом отношении можно использовать полный динамический интервал системы или, по меньшей мере, отодвинуть интервал сигнала, соответствующего интервалу концентрации аналита, представляющего интерес, от режима слабого сигнала. Результатом этого является снижение относительного действия собственного шума системы.
Точку сигнала высокого уровня можно регулировать различными путями. Они включают, например, разведение образца и/или размер образца, которые регулируют количество аналита в образце и, следовательно, количество образца, который будет помечен для детекции (предполагая, что система анализа не будет перегружена аналитом).
С другой стороны, или кроме того, можно регулировать сигнал на аналит, например, путем подбора детектируемой метки (т.е. изменяя интенсивности сигнала на частицу-метку), усиления сигнала, регулирования числа сайтов захвата и/или регулирования числа частиц, генерирующих сигнал, на аналит.
Определения
Термин «общий белок» относится к общему количеству определенного белка (например, гемоглобина) в образце несмотря на то, гликирован белок или нет. «Пептид, соответствующий общему белку» обозначает пептидную часть белка, представляющего интерес (например, гемоглобина), которая при детекции создает представление о количестве белка в образце. Такой пептид, как правило, будет являться частью белка, не включающей потенциальный сайт гликирования белка.
Используемый в настоящем описании термин «устройство для анализа» (также называемое «картриджем для анализа» или просто «картриджем») относится к устройству, используемому при выполнении анализа, которое включает области на и/или в устройстве для нанесения образца, реакции и считывания сигнала. Во многих, но не во всех, устройствах для анализа будет существовать зона локации, где аналит иммобилизован, например, в устройствах для анализа в латеральном потоке.
Термин «метка» используется так, как обычно используется в биологических или биохимических анализах и относится к частице молекулы или комплексу, которые прямо или косвенно можно детектировать способом, обеспечивающим детекцию присутствия или количества присутствующей метки. Примеры включают люминофоры, хемилюминесцентные частицы, светопоглощающие частицы, частицы резонансного рассеяния света, ферменты и т.п., а также частицы специфического связывания, такие как биотин, которые можно использовать для соединения с другой частицей для детекции. Используемый в настоящем описании термин «детектируемая метка» эквивалентен термину «метка». Указание, что метка является «детектируемой непосредственно» означает, что метка непосредственно вовлечена в генерацию сигнала (например, флуорофон или частица, имеющая характеристические свойства поглощения, отражения или рассеяния света, или радиоактивная частица). Напротив, «метка, детектируемая косвенно» требует присутствия, по меньшей мере, одного дополнительного вещества для генерации детектируемого сигнала. Примеры меток, детектируемых косвенно, включают фермент, который взаимодействует с субстратом с образованием окрашенных, флуоресцентных или хемилюминесцентных частиц, и частицу специфического связывания, которая специфически связывается с другой парой специфического связывания, где посредством этого вещество или частица, генерирующие сигнал, ассоциируются с косвенной меткой.
Термин «полностью покрытая метка» относится к конструкции, обычно частице, которая несет или включает детектируемые частицы, и которая представляет собой слоистую метку, определенную ниже, или имеет, по меньшей мере, одно белковое покрытие, которое по существу полностью соединено с поверхностью ниже (т.е. «метка с полностью соединенным покрытием»), например, с поверхностью частицы. В большинстве случаев белок будет полностью присоединен через амины, например, так, что доступные амины, по существу, истощены. В большинстве случаев такая полностью покрытая метка имеет одно или несколько покрытий, которые, по существу, полностью закрывают частицу с покрытием или внутренние части слоистой конструкции, которые не имеют сердцевины из твердой частицы.
Термин «слоистая метка» относится к конструкции, обычно, частице, которая несет или включает детектируемые частицы, и которая имеет, по меньшей мере, два слоя полимерного материала или материалов. Во многих случаях между слоями существуют ковалентные связи. В большинстве случаев слои будут гидрофильными. Слоистая метка может иметь коровую частицу, например, полистирольную частицу, или может быть образована без сердцевины. Детектируемые частицы могут быть, например, покрыты слоями и/или могут быть распределены в или между слоями. В случае слоистых меток с коровой частицей и детектируемыми частицам, покрытыми слоями, детектируемые частицы могут быть введены в коровые частицы и/или находиться на поверхности коровых частиц.
Термин «фазовая метка» относится к конструкции, обычно, частице, которая представляет собой белок с покрытием из ковалентно присоединенного белка. Белок присоединен таким образом, что по существу в белке истощаются функциональные группы, по меньшей мере, одного типа.
Затем в белке создают дополнительные функциональные группы, например, путем восстановления дисульфидных связей. Такие конструкции, например, частицы, несут или включают детектируемые частицы. Белковое покрытие имеет одну или несколько дополнительных частиц, соединенных через группы –SH, являющиеся результатом восстановления дисульфидных связей, или через функциональные группы, образовавшиеся из таких восстановленных дисульфидных связей. Такие дополнительные частицы могут быть различных типов, например, элементами пар специфического связывания (например, антигеном в случае пары антиген-антитело, или биотином в случае пары со стрептавидином), детектируемыми частицами или дополнительными видами покрытия, которые могут быть из одного и того же или другого белка или другого типа, например, полисахарида или синтетического полимера.
Термины «анализ в латеральном потоке» и «анализ на полоске» используются в настоящем описании равнозначно как относящиеся к форматам анализов, обычно иммуноанализов, в которых испытываемый образец течет вдоль твердофазного субстрата (обычно мембраны, такой как нитроцеллюлоза, которая может быть приклеена к веществу подложки, непроницаемому для жидкости, используемой в анализе) за счет капиллярного эффекта из зоны нанесения образца в слив для жидкости. Образец обычно встречается с реагентом для детекции (обычно сухим в слое реагента ниже зоны нанесения образца; обычно окрашенным реагентом), который смешивается с образцом и проходит твердофазный субстрат, встречая одну или несколько линий или зон, которые предварительно обработаны соответствующей частицей специфического связывания (типично антителами или антигеном).
В зависимости от аналитов, присутствующих в образце, реагент для детекции может начать связываться на тестовой линии или зоне. После прохождения над линиями или зонами детекции жидкость поступает поглотитель (обычно абсорбент).
Термин «аналит» используется в настоящем описании в обычном смысле для биологических анализов in vitro, относясь к веществу, например, иону, молекуле или комплексу, которое в анализе детектируют и/или определяют количественно или, по меньшей мере, предполагается для детекции или количественного определения.
Используемый в настоящем описании термин «аналит-специфический реагент связывания» и «агент связывания аналита» относится к молекуле или комплексу, которые специфически связываются с нужным аналитом, и также может включать частицы, имеющие другие функции, такие как мечение молекулы или комплекса. В некоторых, но не во всех воплощениях агент связывания аналита претерпевает заметное структурное изменение после связывания аналита (например, аллостерическое структурное изменение).
Термин «антитело» используется в настоящем описании в самом широком смысле и, как предполагается, включает интактные моноклональные антитела и поликлональные антитела, а также их производные, варианты, фрагмент и/или любые другие модификации до тех пор, пока они проявляют желательную активность связывания. Антитела охватывают молекулы иммуноглобулина и иммунологически активные части молекул иммуноглобулина (Ig), т.е. молекулы, которые содержат сайт связывания антигена, который специфически связывает антиген (вступает в иммунную реакцию). Они включают, но не ограничиваются перечисленным, поликлональные, моноклональные, химерные, одноцепочечные антитела, фрагменты Fc, Fab, Fab' и Fab2 и библиотеку экспрессии Fab. Молекулы антител относятся к любому из классов IgG, IgM, IgA, IgE и IgD, которые отличаются один от другого по природе тяжелой цепи, присутствующей в молекуле. Эти классы также включают подклассы, такие как IgG1, IgG2 и другие. Легкая цепь может представлять собой каппа-цепь или лямбда-цепь. В настоящем описании ссылка на антитела включает ссылку на все классы, подклассы и типы.
Антитела могут быть получены из различных источников, например, среди прочего, от человека, козы, мыши, кролика, крысы, овцы, верблюда и акулы. Также включаются химерные антитела, например, моноклональные антитела или их модификации, которые являются специфическими для более одного источника, например, последовательности мыши или человека. Также включаются антитела из верблюдовых или нанотела. Антитела также включают полиспецифические, например, биспецифические (например, поливалентные или мультимерные) антитела и их функциональные фрагменты. Следует иметь в виду, что каждая ссылка на «антитела» или любой подобный термин в настоящем описании включает интактные антитела, а также их любые модификации.
Используемые в связи с настоящем изобретением термины «гликирование» и «гликированный» и подобные относятся к неферментативному гликозилированию.
Упоминание «фракции гликированного белка в образце» и подобные термины обозначают, для определенного идентифицированного белка, отношение уровня гликированного белка к уровню общего белка или, с другой стороны, отношение гликированного белка к негликированному белку. Отношение может быть выражено различными способами, например, обычной фракции, десятичной фракции или в виде процента. Во многих случаях определения уровней гликированного белка, негликированного белка и/или общего белка выполняют с использованием пептидных фрагментов белка.
В связи с анализами по настоящему изобретению термин «общий белок» относится к уровню определенного белка, является этот белок гликированным или негликированным, и не относится к комбинированному уровню всех белков в образце или организме(ах), у которого(ых) взят образец.
Указание, что белок или пептид «чувствителен к гликированию» означает, что белок или пептид содержит, по меньшей мере, один сайт или остаток, который может быть гликирован in vivo в условиях высокого содержания глюкозы в крови, предпочтительно, глюкозы в крови в клинически значимом интервале. Неограничивающими примерами таких сайтов гликирования являются N-концевые аминокислоты бета-цепей гемоглобина. Во многих случаях замены боковых аминогрупп испытывающих воздействие лизиновых остатков могут быть гликированы in vivo.
В контексте данного изобретения упоминаются пептиды, отщепленные от белка образца (которые могут упоминаться как «пептиды образца»), и пептиды, используемые для конкуренции за связывание с пептидами образца (которые могут упоминаться как «конкурентные пептиды»). Для определенного пептида образца не требуется, чтобы конкурентный пептид был идентичным (например, он может быть другой длины), но взамен он ведет себя, по существу, одинаково в отношении критических для анализа характеристик, например, связывания антител. Например, N-концевой пептид, отщепленный от белка образца, может быть длиннее или короче, чем соответствующий конкурентный пептид, и/или конкурентный пептид может быть биотинилированнм, а пептид образца небиотинилированным, но с соответствующим антителом оба связываются, по существу, эквивалентно.
Для белков или полипептидов, которые имеют различные изоформы, «характеристическая изоформа пептида» представляет собой пептид, который включает последовательность, соответствующую последовательности полипептида с мутированным остатком, характерным для определенной изоформы, вместе с дополнительными аминокислотными остатками, соответствующими полипептиду, с одной или обеих сторон мутированного остатка. Например, для HbS характеристический пептид изоформы HbS будет включать остаток Е6V вместе с соседней ак последовательностью Hb с одной или обеих сторон валинового остатка. Термин применим как к пептидам, полученным гидролизом из полноразмерного полипептида, так и к синтетическим пептидам.
В настоящем описании упоминаются «негликированный вариант» белка или пептида и «гликированный вариант» белка или пептида. «Гликированный вариант» обозначает определенный белок или пептид, который гликирован, в то время как «негликированный вариант» относится к тому же белку или пептиду, который не гликирован или, по меньшей мере, не гликирован в сайте для детекции в релевантном анализе.
В контексте данного изобретения термин «условия конкурентного связывания» относится к условиям анализа, в котором все элементы пар специфического связывания приведены в контакт в растворе или в суспензии, и в котором присутствуют два различимых элемента пар специфического связывания, так что они эффективно конкурируют друг с другом за связывание с родственным элементом пары специфического связывания. Например, в конкурентном анализа на пептид Hb A1c условия таковы, что N-концевой пептид из образца эффективно конкурирует с иммобилизованным или способным к иммобилизации N-концевым пептидом за связывание с соответствующим меченым антителом.
Все патенты и другие ссылки, цитированные в описании, показывают существующий уровень техники, к которой относится изобретение, и включены в настоящее описание в качестве ссылок полностью, включая любые таблицы и фигуры, в такой степени, как если бы каждая ссылка включалась полностью по отдельности.
Специалист в данной области техники может легко признать, что настоящее изобретение можно адаптировать для получения конечных результатов и упомянутых преимуществ, также свойственных изобретению. Способы, варианты и композиции, описанные в настоящем описании как характерные представители предпочтительных воплощений, являются примерами и не предназначены для ограничения объема изобретения. Для специалистов в данной области техники будут иметь место изменения в них и другие применения, которые охватываются сущностью изобретения и определяются объемом формулы изобретения.
Для специалистов в данной области техники будет вполне очевидно, что можно осуществить различные изменения и модификации при осуществлении изобретения, раскрытого в настоящем описании, без отхода от объема и сущности изобретения. Например, можно сделать изменения в конкретных используемых метках. Таким образом, такие дополнительные воплощения входят в объем настоящего изобретения и следующую далее формулу изобретения.
Изобретение, описанное в настоящем описании иллюстративно, можно осуществить на практике в отсутствие любого элемента или элементов, ограничения или ограничений, которые не раскрыты конкретно в настоящем описании. Так, например, в каждом случае в настоящем описании любой из терминов «включающий», «состоящий по существу» и «состоящий из» могут заменять любой из двух других терминов. Термины и выражения, которые использованы, использованы как термины описания, а не ограничения, и без намерения применения таких терминов и выражений, исключая любые эквиваленты показанных и описанных особенностей или их частей, но с пониманием, что различные модификации возможны в объеме заявленного изобретения. Таким образом, следует иметь в виду, что хотя настоящее изобретение конкретно описано с помощью предпочтительных воплощений и необязательных особенностей, модификация и изменения концепций, раскрытых в настоящем описании, могут быть рассмотрены специалистами в данной области техники, и что такие модификации и изменения могут рассматриваться в пределах объема данного изобретения, который определяется прилагаемой формулой изобретения.
Кроме того, когда особенности или аспекты изобретения описываются в терминах групп Маркуша или других группировок или альтернатив, специалистам в данной области техники будет понятно, что изобретение посредством этого также описывается в терминах любого отдельного элемента или подгруппы или элементов группы Маркуша или другой группы.
Также, если не указано противоположное, когда в воплощениях предоставляются различные числовые величины или конечные точки интервалов величин, дополнительные воплощения описываются путем взятия любых 2 различных величин в качестве конечных точек интервала, или путем взятия двух различных конечных точек интервала из конкретных интервалов в качестве конечных точек дополнительного интервала. Такие интервалы также находятся в объеме описанного изобретения. Кроме того, описание числового интервала, включающего величины больше, чем интервал, включает конкретное описание каждой целой величины в пределах интервала.
Таким образом, дополнительные воплощения находятся в объеме изобретения и в объеме следующей далее формулы изобретения.
Изобретение относится к анализу на гликированные белки. Изобретение описывает способ определения фракции гликированного белка и устройство с латеральным потоком для детекции гликированных белков. Способ определения фракции гликированного белка в образце включает определение соотношения между гликированным белком и негликированным белком. 2 н. и 14 з.п. ф-лы, 2 пр., 4 ил., 1 табл.
1. Способ определения фракции гликированного белка в образце, включающий
контактирование (i) меченого полипептид-специфического связывающего реагента, специфического для общего белка или пептида, соответствующего общему белку, или для негликированного белка или пептида, и (ii) меченого полипептид-специфического связывающего реагента, специфического для гликированного белка или пептида, с
а) образцом, содержащим указанный белок или пептид указанного белка, чувствительный к гликированию; и
b) конкурирующим пептидом, который является гликированным вариантом указанного белка или пептида, полученным не из образца; или
с) конкурирующим пептидом, который является негликированным вариантом указанного белка или пептида, полученным не из образца;
детекцию множества сигналов, где по меньшей мере первый сигнал показывает уровень гликированного белка, и по меньшей мере второй сигнал показывает уровень общего белка или негликированного белка; и
определение соотношения между гликированным белком и негликированным белком или между гликированным белком и общим белком как показателя фракции указанного белка, который в указанном образце является гликированным,
где указанное контактирование осуществляют в условиях конкурентного связывания, и при этом указанный первый сигнал и указанный второй сигнал являются различимыми,
и где образец вводят в контакт с контрольным меченым полипептид-специфическим связывающим реагентом, который специфически связывает мишень не в образце, и указанный контрольный меченый полипептид-специфический связывающий реагент затем детектируют, где обнаруженное количество контрольного меченого полипептид-специфического связывающего реагента используют для нормализации сигналов для уровня гликированного белка или общего белка или того и другого.
2. Способ по п. 1, где указанный белок представляет собой человеческий гемоглобин, предпочтительно указанный гликированный пептид представляет собой N-концевой пептид HbA1C.
3. Способ по любому из пп. 1, 2, где гликированный вариант указанного белка, полученного не из образца, или пептида представляет собой биотинилированный HbA1с, и указанную детекцию выполняют в устройстве с латеральным потоком, и биотинилированный HbA1с захватывается в сайте иммобилизации, включающем стрептавидин.
4. Способ по п. 2, где
(i) указанный пептид представляет собой N-концевой пептид длиной в 5-14 аминокислотных остатков; или
(ii) указанный пептид отщепляется пепсином или эндопептидозой GluC.
5. Способ по п. 1, где
(i) указанный белок представляет собой человеческий сывороточный альбумин, предпочтительно (а) указанный пептид представляет собой N-концевой пептид длиной в 4-16 аминокислотных остатков, (b) указанный пептид включает, по меньшей мере, один из Lys525, Lys199, Lys439 и Lys281, или (c) указанный пептид представляет собой множество пептидов, наиболее предпочтительно указанное множество пептидов включает пептиды, включающие, по меньшей мере, два из Lys585, Lys525, Lys199, Lys439 или Lys281; или
(ii) где указанный пептид представляет собой внутренний пептид, предпочтительно где указанный пептид имеет длину в 5-20 аминокислот; или
(iii) где указанный пептид расщеплен трипсином, эндопептидозой GluC, пепсином или пролилэндопептидазой.
6. Способ по любому из пп. 1-5, где указанные первый и второй сигналы являются флуоресцентными сигналами или сигналами TRF.
7. Способ по любому из пп. 1-6, где указанную детекцию выполняют в устройстве с латеральным потоком, при этом указанное устройство включает зону детекции, включающую сайт иммобилизации для гликированного белка или пептида и сайт иммобилизации для указанного общего белка или пептида, соответствующего общему белку, где сигнал, соответствующий гликированному белку или пептиду, и сигнал, соответствующий общему белку или пептиду, соответствующему общему белку, детектируют раздельно.
8. Способ по п. 7, где указанный сайт иммобилизации для гликированного белка или пептида и указанный сайт иммобилизации для общего белка или пептида, соответствующего общему белку, физически разделены.
9. Способ по п. 7, где указанный сайт иммобилизации для гликированного белка или пептида и указанный сайт иммобилизации для указанного общего белка или пептида, соответствующего общему белку, являются одинаковыми, и указанные первый и второй сигналы мультиплексированы.
10. Способ по любому из пп. 7-9, где указанный контрольный меченый полипептид-специфический связывающий реагент иммобилизован в сайте иммобилизации, содержащем иммобилизованные варианты мишени не в образце, и количество контрольного меченого полипептид-специфического связывающего реагента, локализованного связью с указанным сайтом иммобилизации, используют для нормализации сигналов для уровня гликированного белка или общего белка или того и другого, предпочтительно:
(i) где указанная мишень не в образце представляет собой белок от вида, не относящегося к человеку; и/или
(ii) где указанный контрольный меченый полипептид-специфический связывающий реагент , который специфически связывает мишень не в образце, представляет собой меченое антитело.
11. Способ по любому из пп. 1-10, где указанную детекцию выполняют в устройстве для анализа в латеральном потоке, где указанное устройство включает зону детекции, включающую сайт иммобилизации для гликированного белка или пептида и сайт иммобилизации для негликированного белка или пептида, и сайт иммобилизации для указанного контрольного меченого полипептид-специфического связывающего реагента, при этом сигнал, соответствующий гликированному белку или пептиду, и сигнал, соответствующий негликированному белку или пептиду, детектируют раздельно, предпочтительно:
(i) где указанный сайт иммобилизации для гликированного белка или пептида и указанный сайт иммобилизации для негликированного белка или пептида, физически разделены; или
(ii) где указанный сайт иммобилизации для гликированного белка или пептида и указанный сайт иммобилизации для негликированного белка или пептида, являются одинаковыми, и указанные первый и второй сигналы мультиплексированы.
12. Способ по п. 1, где указанные первый и второй сигналы являются сигналами меток анализа Luminescent Oxygen Channeling (LOCI), включающих донорные и акцепторные метки, предпочтительно
(i) где указанные негликированный вариант указанного пептида и гликированный вариант указанного пептида иммобилизованы с донорными метками LOCI, и указанный полипептид-специфический связывающий реагент, специфический для негликированного белка или пептида или для общего белка или пептида, соответствующего общему белку, и указанный полипептид-специфический связывающий реагент, специфический для гликированного белка или пептида, присоединены к акцепторным меткам LOCI, более предпочтительно, где указанные донорные метки LOCI включают гранулы, включающие множество молекул донорной метки LOCI, и множество указанных белков или пептидов иммобилизовано или иммобилизуется на поверхностях указанных гранул, еще более предпочтительно, где указанные гранулы имеют покрытие; или
(ii) где указанный негликированный вариант указанного пептида и указанный гликированный вариант указанного пептида иммобилизованы с акцепторными метками LOCI, и указанный полипептид-специфический связывающий реагент, специфический для негликированного белка или пептида или для общего белка или пептида, соответствующего общему белку, и указанный полипептид-специфический связывающий реагент, специфический для гликированного белка или пептида, присоединены к донорным меткам LOCI; или
(iii) где указанный анализ выполняют как гомогенный анализ; или
(iii) где в указанном анализе используют микрочастицы, равномерно суспендированные в жидкой реакционной смеси.
13. Способ по п. 1, где
(i) указанный анализ обеспечивает, по меньшей мере, 4 порядка величины динамического интервала и обеспечивает повышенную клиническую точность за счет регулирования наклона кривой сигнал-концентрация, предпочтительно, где указанный клинический коэффициент вариации (CV) составляет менее 5%; (b) где указанный клинический CV составляет менее 3%; или (c) где указанный клинический CV составляет менее 2%; или
(ii) где указанный анализ имеет динамический интервал сигнала, по меньшей мере, в 4 порядка величины; или
(iii) где указанный анализ имеет динамический интервал сигнала, по меньшей мере, в 5 порядков величины.
14. Способ по п.11, где
(i) множество изоформ указанного белка или его пептида детектируют различимо, предпочтительно (а) где указанное множество изоформ детектируют в одной зоне;
(b) где указанные изоформы детектируют в отдельных зонах,
(с) где указанный белок представляет собой бета-цепь гемоглобина, и указанные изоформы включают, по меньшей мере, две из HbA, HbC, HbD Punjab, HbE и HbS, (d) где указанный белок представляет собой бета-цепь гемоглобина, и указанные изоформы включают HbC, HbD Punjab, HbE и HbS, или
(е) где указанный белок представляет собой бета-цепь гемоглобина, и указанные изоформы включают HbE и HbS.
15. Способ по любому из пп. 1-14, где
(i) указанная мишень не в образце представляет собой белок от вида, не относящегося к человеку; и/или
(ii) где указанный контрольный меченый полипептид-специфический связывающий реагент, который специфически связывает мишень не в образце, представляет собой меченое антитело.
16. Устройство с латеральным потоком для детекции гликированных белков, включающее элементы коммуникации для потока в следующем порядке:
область внесения образца, где образец смешивается с жидкой средой;
область эндопептидазы, где разбавленный образец смешивается и взаимодействует с эндопептидазой;
область нейтрализации, где реакционная смесь смешивается с реагентом, который прекращает действие эндопептидазы;
область смешивания одного или нескольких реагентов, где вся реакционная смесь или ее часть смешивается и взаимодействует с антителами или другими лигандами, связанными с поверхностью микрочастиц;
одна или несколько полосок для латерального потока, где указанные микрочастицы связываются с дискретными реакционными зонами; и
участок абсорбента,
где по меньшей мере одна область смешивания реагентов включает
(i) меченый элемент специфического связывания, специфический для общего белка или пептида, соответствующего общему белку, или негликированного белка или пептида,
(ii) меченый элемент специфического связывания, специфический для гликированного белка или пептида человека, и
(iii) конкурирующий пептид, который является гликированным вариантом указанного белка или пептида не из образца,
(iv) контрольный меченый полипептид-специфический связывающий реагент, который специфически связывает мишень, которая является полипептидом от вида, не относящегося к человеку,
и где указанные по меньшей мере одна или несколько полосок для латерального потока включают следующие отдельные зоны иммобилизации:
зона иммобилизации, включающая общий белок или пептид, соответствующий общему белку;
зона иммобилизации, включающая гликированный белок или гликированный пептид;
зона иммобилизации, включающая мишень, которая является полипептидом от вида, не относящегося к человеку.
| US 5110745 A, 05.05.1992 | |||
| US 2014073532 A1, 13.03.2014 | |||
| US 2008145272 A1, 19.06.2008 | |||
| US 2009099269, 16.04.2009 | |||
| СИСТЕМА ИЗ ИЗМЕРИТЕЛЬНОГО УСТРОЙСТВА УРОВНЯ АНАЛИЗИРУЕМЫХ ВЕЩЕСТВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ И КАССЕТЫ ДЛЯ ВЫПОЛНЕНИЯ КОМБИНИРОВАННЫХ ОБЩИХ ХИМИЧЕСКИХ И СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНАЛИЗОВ СВЯЗЫВАНИЯ | 2005 |
|
RU2377069C2 |
