СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СВОБОДНОГО СВЯЗЫВАЮЩЕГО ПАРТНЕРА МУЛЬТИСПЕЦИФИЧНОГО СВЯЗУЮЩЕГО Российский патент 2017 года по МПК G01N33/543 

Данное изобретение относится к способу определения свободного, т.е. не входящего в состав комплекса, связывающего партнера, который может быть специфически связан в образце с мультиспецифическим связующим, при этом перед детекцией свободного связывающего партнера из образца элиминируют связывающий партнер, связанный с мультиспецифическим связующим.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Стандартный твердофазный иммуноферментный анализ с использованием антител подразумевает образование комплекса между антителом, адсорбированным/иммобилизованным на твердой фазе (захватывающим антителом), антигеном и антителом, распознающим другой эпитоп антигена, конъюгированным с ферментом или детектируемой меткой (меченым антителом). В ходе определения происходит образование «сэндвича»: твердая фаза/захватывающее антитело/антиген/меченое антитело. В реакции, катализируемой в анализе сэндвич-типа, активность фермента, конъюгированного с антителом, пропорциональна концентрации антигена в инкубационной среде. Исследования с использованием антиидиотипических антител упоминаются, например, в патентах US 5,219,730; WO 87/002778; ЕР 0139389 и ЕР 0170302. Wadhwa, М., et al. (J. Immunol. Methods 278 (2003) 1-17) предложили способ определения, измерения и характеризации нежелательных антител, образование которых вызывают терапевтически активные биопрепараты. Способ получения антиидиотипических антител описан в ЕР 1917854.

Chen, Y.-P., et al. (Clin. Vac. Immunol. 14 (2007) 720-725) предложили способ быстрого определения поверхностного антигена вируса гепатита В методом агглютинации, опосредованной биспецифическим диателом, направленным против человеческих эритроцитов и поверхностного антигена вируса гепатита В. Bruynck, A., et al. описали гуманизированное биспецифическое моноклональное антитело для лечения рака (J. Cancer 67 (1993) 436-440). В WO 2006/096697 предложены способы определения бивалентных терапевтически активных белков и антител.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данной заявке предложен способ обнаружения и/или определения концентрации свободного, т.е. не входящего в состав комплекса связывающего партнера, который может быть специфически связан по меньшей мере с одной областью связывания мультиспецифического связующего. Было обнаружено, что перед определением наличия или концентрации свободного связывающего партнера предпочтительно элиминировать из образца связывающий партнер, который специфически связан с мультиспецифическим связующим, т.е. комплекс связывающий партнер-мультиспецифическое связующее. Согласно способам, предложенным в данной заявке, элиминацию мультиспецифического связующего осуществляют путем инкубации образца с моноспецифическим связующим, которое специфически связывается с одной областью связывания мультиспецифического связующего, при этом моноспецифическое связующее специфически связывается с областью связывания мультиспецифического связующего, которая не связывается со связывающим партнером, подлежащим определению (см. Фиг. 2).

Один аспект данного описания относится к способу определения in vitro наличия и/или концентрации связывающего партнера (антигена, мишени, аналита), который может быть специфически связан с первой областью связывания мультиспецифического связующего, причем связывающий партнер, связанный с мультиспецифическим связующим, элиминируют перед определением связывающего партнера путем инкубации образца с моноспецифическим связующим, специфически связывающимся со второй областью связывания мультиспецифического связующего.

В одном воплощении связывающий партнер, подлежащий определению, является связывающим партнером, не входящим в состав комплекса, или свободным связывающим партнером.

Таким образом, один аспект данного описания представляет собой способ определения in vitro наличия и/или концентрации связывающего партнера мультиспецифического связующего, причем связывающий партнер может быть специфически связан с первой областью связывания мультиспецифического связующего, включающий этап:

- инкубации образца, содержащего связывающий партнер и мультиспецифическое связующее, с моноспецифическим связующим, которое специфически связывается со второй областью связывания мультиспецифического связующего, отличной от первой области связывания.

В одном воплощении способ включает этапы:

- инкубации образца, содержащего связывающий партнер и мультиспецифическое связующее, с моноспецифическим связующим, которое специфически связывается со второй областью связывания мультиспецифического связующего, отличной от первой области связывания, и

- определения концентрации связывающего партнера в образце, из которого элиминировано мультиспецифическое связующее.

В одном воплощении способ включает этапы:

- инкубации образца, содержащего связывающий партнер и мультиспецифическое связующее, с моноспецифическим связующим, которое специфически связывается со второй областью связывания мультиспецифического связующего, отличной от первой области связывания,

- элиминации из образца комплекса моноспецифическое связующее-мультиспецифическое связующее перед определением наличия или концентрации свободного связывающего партнера, и

- определения концентрации связывающего партнера в образце, из которого элиминировано мультиспецифическое связующее.

При инкубации с моноспецифическим связующим, которое специфически связывается со второй областью связывания мультиспецифического связующего, из образца элиминируют мультиспецифическое связующее. Одновременно из образца также удаляют комплексы связывающий партнер-мультиспецифическое связующее.

В одном воплощении мультиспецифическое связующее выбрано из антитела, химерного полипептида, содержащего антитело или фрагмент антитела и полипептид, не являющийся антителом, химерного полипептида, содержащего антитело или фрагмент антитела и растворимый рецептор, или химерного полипептида, содержащего антитело или фрагмент антитела и пептидную связывающую молекулу.

В одном воплощении мультиспецифическое связующее представляет собой антитело. В одном воплощении антитело представляет собой биспецифическое антитело или триспецифическое антитело, или тетраспецифическое антитело, или пентаспецифическое антитело, или гексаспецифическое антитело. В одном воплощении антитело представляет собой биспецифическое антитело.

В одном воплощении моноспецифическое связующее представляет собой антиидиотипическое антитело.

В одном воплощении область связывания представляет собой сайт связывания или пару вариабельных доменов тяжелой цепи антитела и легкой цепи антитела.

В одном воплощении антиидиотипическое антитело связано с твердой фазой.

В одном воплощении антиидиотипическое антитело биотинилировано, а поверхность твердой фазы покрыта стрептавидином. В одном воплощении твердая фаза представляет собой покрытые стрептавидином парамагнитные гранулы или покрытые стрептавидином гранулы сефарозы.

Один аспект данного описания представляет собой способ иммунологического определения наличия и/или концентрации связывающего партнера мультиспецифического связующего в образце с помощью иммунологического анализа, в котором мультиспецифическое связующее элиминируют из образца перед определением связывающего партнера.

В одном воплощении всех аспектов данного описания связывающий партнер представляет собой свободный связывающий партнер, т.е. связывающий партнер, который не связан или не находится в комплексе с мультиспецифическим связующим.

В одном воплощении антиидиотипическое антитело представляет собой биотинилированное антиидиотипическое антитело, направленное против мультиспецифического связующего и конъюгированное с твердой фазой при помощи стрептавидина.

В одном воплощении способов данного описания антиидиотипическое антитело представляет собой смесь, содержащую по меньшей мере два антиидиотипических антитела с различными сайтами, по которым они конъюгированы с твердой фазой.

В одном воплощении конъюгацию антитела с его партнером по конъюгации осуществляют путем химического связывания по N-концевым и/или ε-аминогруппам (лизина), ε-аминогруппам различных лизинов, карбоксильным, сульфгидрильным, гидроксильным и/или фенольным функциональным группам аминокислотного скелета терапевтически активного антитела и/или спиртовым группам углеводных компонентов терапевтически активного антитела.

В одном воплощении смесь антиидиотипических антител содержит антиидиотипическое антитело, конъюгированное с твердой фазой по меньшей мере через две различные аминогруппы. Такое присоединение через различные аминогруппы может осуществляться путем ацилирования на первом этапе части ε-аминогрупп при помощи химических защитных агентов, например, путем введения цитраконильных групп. На втором этапе конъюгирование осуществляют через оставшиеся аминогруппы. Впоследствии цитраконильные группы удаляют, а антитело конъюгируют с твердой фазой через оставшиеся свободные аминогруппы, т.е. полученное антитело конъюгируют с твердой фазой через аминогруппы, которые не были защищены цитраконильными группами. Подходящие химические защитные агенты образуют связи с незащищенными аминогруппами боковых цепей, которые являются менее стабильными и отличаются от N-концевых связей. Известно множество химических защитных агентов (см., например, ЕР 0651761). В одном воплощении химические защитные агенты включают циклические ангидриды дикарбоновых кислот, такие как ангидрид малеиновой или цитраконовой кислот.

В одном воплощении антиидиотипическое антитело конъюгируют с твердой фазой при помощи пассивной адсорбции. Пассивная адсорбция описана, например Butler, J.E., "Solid Phases in Immunoassay" (1996) 205-225 и Diamandis, E.P., and Christopoulos, T.K. (Editors), "Immunoassays" (1996) Academic Press (San Diego).

В одном воплощении антиидиотипическое антитело конъюгировано (иммобилизовано) при помощи специфически связывающейся пары. В одном воплощении такая связывающаяся пара (первый компонент/второй компонент) выбрана из стрептавидина или авидина/биотина, антитела/антигена (см., например, Hermanson, G.T., et al., Bioconjugate Techniques, Academic Press (1996)), лектина/полисахарида, стероида/стероид-связывающего белка, гормона/рецептора гормона, фермента/субстрата, IgG/белка А и/или G и т.д. В одном воплощении антиидиотипическое антитело конъюгировано с биотином, а иммобилизация осуществляется через иммобилизованный авидин или стрептавидин.

Один аспект данного описания представляет собой способ определения in vitro наличия и/или концентрации антигена мультиспецифического антитела в образце, в котором антиген, подлежащий определению, может быть специфически связан с первой областью связывания мультиспецифического антитела, включающий этап:

- инкубации образца, содержащего мультиспецифическое антитело, антиген, связанный с мультиспецифическим антителом, и свободный антиген, с антиидиотипическим антителом, которое специфически связывается со второй областью связывания мультиспецифического антитела, отличной от первой области связывания.

В одном воплощении способ включает этапы:

- инкубации образца, содержащего антиген и мультиспецифическое антитело, с антиидиотипическим антителом, которое специфически связывается со второй областью связывания мультиспецифического антитела, отличной от первой области связывания, и

- определения концентрации антигена в образце, из которого элиминировано мультиспецифическое антитело.

В одном воплощении способ включает этапы:

- инкубации образца, содержащего антиген и мультиспецифическое антитело, с антиидиотипическим антителом, которое специфически связывается со второй областью связывания мультиспецифического антитела, отличной от первой области связывания,

- элиминации комплекса антиидиотипическое антитело-мультиспецифическое антитело из образца перед определением наличия или концентрации свободного антигена, и

- определения концентрации антигена в образце, из которого элиминировано мультиспецифическое антитело.

При инкубации с антиидиотипическим антителом, которое специфически связывается со второй областью связывания мультиспецифического антитела, мультиспецифическое антитело удаляют из образца. Одновременно из образца также удаляют комплексы антиген-мультиспецифическое антитело.

В одном воплощении образец содержит мультиспецифическое антитело, свободный антиген и комплексы мультиспецифическое антитело-антиген, и определяют свободный антиген мультиспецифического антитела.

В одном воплощении антиидиотипическое антитело конъюгировано с парамагнитной гранулой.

В одном воплощении антиидиотипическое антитело конъюгировано с твердой фазой.

В одном воплощении антиидиотипическое антитело биотинилировано, а поверхность твердой фазы покрыта стрептавидином. В одном воплощении твердая фаза представляет собой покрытые стрептавидином парамагнитные гранулы или покрытые стрептавидином гранулы сефарозы.

В одном воплощении константа ассоциации k_a, характеризующая связывание антиидиотипического антитела со второй областью связывания мультиспецифического антитела, равна 10⁵ л/моль*с или более.

В одном воплощении связывание антиидиотипического антитела со второй областью связывания мультиспецифического антитела характеризуется значением K_D, равным 5*10^-8 моль/л или менее.

В одном воплощении область связывания представляет собой сайт связывания. В одном воплощении сайт связывания представляет собой пару вариабельных доменов тяжелой цепи антитела и легкой цепи антитела.

В одном воплощении инкубация антиидиотипического антитела составляет приблизительно от 10 мин до приблизительно 36 часов.

В одном воплощении концентрацию мультиспецифического антитела в образце доводят до значений приблизительно от 2 мкг/мл приблизительно до 15 м кг/мл.

В одном воплощении общую концентрацию антигена в образце доводят до значений приблизительно от 1 нг/мл до приблизительно 250 нг/мл.

В одном воплощении способ включает следующие этапы:

- инкубацию образца, содержащего мультиспецифическое антитело, связанный с мультиспецифическим антителом антиген и свободный антиген, с антиидиотипическим антителом, которое специфически связывается со второй областью связывания мультиспецифического антитела, отличной от первой области связывания, для образования комплекса антиидиотипическое антитело - мультиспецифическое антитело, и

- удаление из образца комплекса антиидиотипическое антитело-мультиспецифическое антитело.

В одном воплощении комплекс антиидиотипическое антитело-мультиспецифическое антитело представляет собой смесь комплекса антиидиотипическое антитело-мультиспецифическое антитело и комплекса антиидиотипическое антитело-мультиспецифическое антитело-антиген.

В одном воплощении способ включает следующие этапы:

- инкубацию образца, содержащего антиген и мультиспецифическое антитело, с антиидиотипическим антителом, которое специфически связывается со второй областью связывания мультиспецифического антитела, отличной от первой области связывания, для образования комплекса антиидиотипическое антитело-мультиспецифическое антитело,

- удаление из образца комплекса антиидиотипическое антитело-мультиспецифическое антитело, и

- определение концентрации антигена в образце, из которого элиминировано мультиспецифическое-антитело.

В одном воплощении определение концентрации антигена включает следующие этапы:

- инкубацию образца, из которого элиминировано мультиспецифическое антитело, с захватывающим антителом, которое специфически связывается с антигеном, для образования комплекса захватывающее антитело-антиген, и

- установление зависимости между образованием комплекса захватывающее антитело-антиген и концентрацией в образце антигена.

В одном воплощении определение концентрации антигена включает следующие этапы:

- инкубацию образца, из которого элиминировано мультиспецифическое антитело, с захватывающим антителом, которое специфически связывается с антигеном, для образования комплекса захватывающее антитело- антиген,

- инкубацию комплекса захватывающее антитело-антиген с меченым антителом, в ходе которой захватывающее антитело и меченое антитело связываются с неперекрывающимися эпитопами антигена, и

- установление зависимости между образованием комплекса захватывающее антитело-антиген-меченое антитело и концентрацией в образце антигена.

В одном воплощении определение концентрации антигена включает следующие этапы:

- инкубацию образца, из которого элиминировано мультиспецифическое антитело, с захватывающим антителом, которое специфически связывается с антигеном, для образования комплекса захватывающее антитело- антиген,

- инкубацию комплекса захватывающее антитело-антиген с меченым антителом, в ходе которой захватывающее антитело и меченое антитело связываются с неперекрывающимися эпитопами антигена,

- инкубацию комплекса захватывающее антитело-антиген-меченое антитело с детектирующим антителом, содержащим детектируемую метку, в ходе которой детектирующее антитело специфически связывается с эпитопом меченого антитела, находящимся за пределами вариабельных доменов меченого антитела, и

- установление зависимости между образованием комплекса захватывающее антитело-антиген-меченое антитело и концентрацией в образце антигена.

В одном воплощении мультиспецифическое антитело представляет собой биспецифическое антитело, которое имеет первую область связывания, которая специфически связывается с первым антигеном или первым эпитопом антигена, и которое имеет вторую область связывания, которая специфически связывается со вторым антигеном или вторым эпитопом антигена.

Один аспект данного описания представляет собой применение антиидиотипического антитела, которое специфически связывается с первой областью связывания мультиспецифического антитела, для элиминации из образца антигена, связанного со второй областью связывания мультиспецифического антитела.

СВЕДЕНИЯ, ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ

ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данном документе описан способ предварительной обработки образца in vitro для детекции "свободного связывающего партнера" мультиспецифических связующих, таких как биспецифические антитела/лекарственные средства, в образцах для доклинических и клинических исследований.

Было обнаружено, что перед детекцией свободного связывающего партнера необходимо элиминировать из образца мультиспецифическое связующее.

В данном документе описано применение антиидиотипических антител, которые специфически связываются с областью связывания терапевтически активного мультиспецифического антитела для определения уровня антигена, который может быть но не является связанным со второй отличной областью связывания терапевтически активного мультиспецифического антитела. Антиидиотипическое антитело применяют для элиминации из образца мультиспецифического антитела и комплексов мультиспецифическое антитело-антиген, подлежащий определению.

Таким образом, в данном документе описан способ детекции in vitro свободного связывающего партнера (антигена, мишени, аналита) мультиспецифического связующего, который может быть специфически связан с первой областью связывания мультиспецифического связующего, где мультиспецифическое связующее элиминируют из образца перед определением свободного связывающего партнера путем инкубации образца с моноспецифическим связующим, которое специфически связывается со второй областью связывания мультиспецифического связующего, отличной от первой области связывания, и таким образом элиминации из образца мультиспецифического связующего и комплексов мультиспецифическое связующее-связывающий партнер.

Определение общего антигена, связанного с биспецифическим антителом антигена и свободного антигена может быть полезным при мониторинге лечения с применением терапевтически активных антител. Общий антиген представляет сумму свободного антигена и связанного с биспецифическим антителом антигена.

Ниже способ по данному описанию проиллюстрирован на примере мультиспецифического антитела, специфически связывающегося с множеством антигенов или эпитопов одного и того же антигена, как воплощения мультиспецифического связующего, и антигена, который специфически связывается с одной областью связывания мультиспецифического антитела, как воплощения связывающего партнера.

Термин "антитело" в данном документе используется в широком смысле и охватывает антитела с различной структурой, включая моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител, при условии, что они проявляют желаемую антигенсвязывающую активность, но не ограничивается ими.

В некоторых воплощениях антитело представляет собой мультиспецифическое антитело, например, биспецифическое антитело. Мультиспецифические антитела представляют собой моноклональные антитела, имеющие области связывания по меньшей мере для двух различных сайтов. В некоторых воплощениях одна из областей связывания предназначена для первого антигена, а другая - для отличающегося второго антигена. В некоторых воплощениях биспецифические антитела могут связывать два различных эпитопа одного и того же антигена. Биспецифические антитела могут быть созданы в виде полноразмерных антител или фрагментов антител. В одном воплощении антитело представляет собой биспецифическое антитело, которое специфически связывается с первым и вторым антигеном. В одном воплощении биспецифическое антитело имеет i) первую область связывания, которая специфически связывается с первым антигеном или первым эпитопом антигена, и ii) вторую область связывания, которая специфически связывается со вторым антигеном или вторым эпитопом того же самого антигена. В одном воплощении второй эпитоп того же самого антигена представляет собой неперекрывающийся эпитоп.

Мультиспецифические антитела описаны в WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254, WO 2010/112193, WO 2010/115589, WO 2010/136172, WO 2010/145792 или WO 2010/145793.

"Фрагмент антитела" обозначает молекулу, отличную от интактного антитела, содержащую часть интактного антитела, которая связывается с антигеном, связывающимся с интактным антителом. Примеры фрагментов антител включают Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂, диатела, линейные антитела, молекулы одноцепочечных антител (например, scFv) и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител, но не ограничиваются ими.

"Класс" антитела обозначает тип константного домена или константного участка его тяжелой цепи. Существует пять основных классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них можно подразделить на подклассы (изотипы), например, IgG₁, lgG₂, lgG₃, IgG₄, IgA₁ и lgA₂. Константные домены тяжелых цепей, соответствующие различным классам иммуноглобулинов, обозначаются α, δ, ε, γ и μ, соответственно.

Термин "свободный антиген" обозначает антиген, который может быть специфически связан с областью связывания антитела, но в данный момент не связан с данной областью связывания. В одном воплощении свободный антиген представляет собой антиген, не связанный с антителом, или антиген, не находящийся в комплексе с антителом.

Термин "Fc-фрагмент" в данном документе используется для обозначения С-концевого участка тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащего по меньшей мере часть константного участка. Термин включает Fc-фрагменты с нативной последовательностью и варианты Fc-фрагментов. В одном воплощении Fc-фрагмент тяжелой цепи IgG человека простирается от Cys226 или от Pro230 до карбокси-конца тяжелой цепи. При этом, С-концевой лизин (Lys447) Fc фрагмента может присутствовать или отсутствовать. Если не указано иначе, нумерация аминокислотных остатков Fc-фрагмента или константного участка соответствует системе нумерации EU, также носящей название «EU index», согласно описанию Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242.

"Каркасные участки" или "FR" обозначают остатки вариабельного домена, отличные от остатков гипервариабельного участка (HVR). FR вариабельного домена, как правило, состоит из 4 FR доменов: FR1, FR2, FR3 и FR4. Соответственно, последовательности HVR и FR в составе VH (или VL), как правило, располагаются в следующем порядке: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

"Человеческое антитело" представляет собой антитело, аминокислотная последовательность которого соответствует последовательности антитела, продуцируемого в организме или в клетках человека или полученного из источника, не относящегося к человеку, но задействующего репертуар антител человека или иные последовательности, кодирующие антитела человека. Данное определение человеческого антитела, в частности, исключает гуманизированные антитела, содержащие антиген-связывающие остатки, не являющиеся человеческими.

"Гуманизированное" антитело обозначает химерное антитело, содержащее аминокислотные остатки гипервариабельных участков, не являющиеся человеческими, и аминокислотные остатки каркасных участков человека. В определенных воплощениях гуманизированное антитело содержит по существу все из по меньшей мере одного, а обычно двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все гипервариабельные участки (например, CDR) соответствуют участкам антитела, не являющегося человеческим, и все или по существу все каркасные участки соответствуют участкам человеческого антитела. Гуманизированное антитело может содержать по меньшей мере часть константного участка антитела, полученного из человеческого антитела. "Гуманизированная форма" антитела, например, антитела не являющегося человеческим, обозначает антитело, прошедшее гуманизацию.

Термин "гипервариабельный участок" или "HVR" в данном документе обозначает каждый из участков вариабельного домена антитела, имеющих гипервариабельную последовательность и/или формирующих петли определенной структуры ("гипервариабельные петли"). Как правило, нативные состоящие из четырех цепей антитела имеют 6 HVR; три в VH (Н1, Н2, Н3) и три в VL (L1, L2, L3). Как правило, HVR содержат аминокислотные остатки гипервариабельных петель и/или "участков, определяющих комплементарность" (CDR), последние характеризуются наибольшей вариабельностью последовательности и/или задействованы в распознавании антигена. Приведенные в качестве примера гипервариабельные петли находятся между аминокислотными остатками 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (Н1), 53-55 (Н2) и 96-101 (Н3) (Chothia, С. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917). Приведенные в качестве примера CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3) находятся между аминокислотными остатками 24-34 в L1, 50-56 в L2, 89-97 в L3, 31-35 В в Н1, 50-65 в Н2 и 95-102 в Н3 (Kabat, Е.А. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242). Как правило, CDR содержат аминокислотные остатки, образующие гипервариабельные петли, за исключением CDR1 в составе VH. CDR также включают "остатки, определяющие специфичность", или "SDR," которые представляют собой остатки, контактирующие с антигеном. SDR находятся в составе участков CDR, обозначаемых «укороченными CDR», или a-CDR (от англ. abbreviated-CDRs). Приведенные в качестве примера a-CDR (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 и a-CDR-H3) образованы аминокислотными остатками в положениях 31-34 в L1, 50-55 в L2, 89-96 в L3, 31-35 В в Н1, 50-58 в Н2 и 95-102 в Н3 (Almagro, J.С. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633). Если не указано иначе, гипервариабельные остатки и иные остатки вариабельного домена (например, остатки FR) в данном документе пронумерованы в соответствии с Kabat et al., см. выше.

Термин "моноклональное антитело" в данном документе используется для обозначения антитела, полученного из популяции по существу гомогенных антител, т.е. отдельные антитела, составляющие популяцию, идентичны и/или связываются с одним и тем же эпитопом, за исключением возможных вариантов антител, например, содержащих мутации, возникающие естественным путем или в ходе получения препарата моноклонального антитела, при этом подобные варианты, как правило, присутствуют в минорном количестве. В противоположность препаратам поликлональных антител, обычно содержащим различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело в препарате моноклональных антител направлено против единственной детерминанты антигена. Таким образом, определение "моноклональное" указывает на характер антитела, полученного из по существу гомогенной популяции антител, и не должно рассматриваться как необходимость получения антитела определенным способом. Например, моноклональные антитела, предназначенные для применения согласно настоящему изобретению, могут быть произведены с помощью различных технологий, включая гибридомную технологию, технологию рекомбинантной ДНК, технологию фагового дисплея и технологии с использованием трансгенных животных, имеющих все локусы человеческих иммуноглобулинов или их часть, но не ограничиваясь ими; данные способы и другие приведенные в качестве примера способы производства моноклональных антител описаны в данном документе.

Термин "вариабельный участок" или "вариабельный домен" обозначает домен легкой или тяжелой цепи антитела, задействованный в связывании антитела с антигеном. Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи (VH и VL, соответственно) нативного антитела, как правило, имеют одинаковую структуру, при этом каждый домен содержит четыре консервативных каркасных участка (FR) и три гипервариабельных участка (HVR) (см., например, Kindt, T.J. et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), page 91). Единственного VH или VL домена может быть достаточно для обеспечения специфичности связывания антигена. Более того, антитела, связывающие конкретный антиген, могут быть выделены при помощи VH или VL домена антитела, связывающего этот же антиген, при скрининге библиотеки на комплементарные VL или VH домены, соответственно. См., например, Portolano, S. et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628).

Термин "антиидиотипическое антитело" обозначает антитело, которое специфически связывается с областью связывания, такой как сайт связывания родительского антитела, т.е. направленное, например, против антигенсвязывающего сайта родительского антитела. В одном воплощении антиидиотипическое антитело специфически связывается с одним или несколькими CDR родительского антитела. В одном воплощении родительское антитело представляет собой терапевтически активное антитело. В одном воплощении родительское антитело представляет собой мультиспецифическое антитело. В одном воплощении родительское антитело представляет собой биспецифическое антитело.

Два эпитопа являются перекрывающимися, если при использовании иммобилизованного антитела и растворимого антигена, или наоборот, при концентрации указанного эпитопа 20-50 нМ и концентрации антитела, с эпитопом которого определяется перекрывание, 100 нМ, методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR, от англ. surface plasmon resonance) детектируется уменьшение сигнала на 50% или более, в одном воплощении на 75% или более. В альтернативном случае, можно применять способ, в котором перекрывание эпитопов двух антител, связывающихся с тем же антигеном, определяется при помощи конкурентного анализа. С этой целью, например, при помощи иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием клеток, экспрессирующих эпитопы рекомбинантного антигена, определяют, конкурирует ли антитело, с эпитопом которого определяется перекрывание, с другим антителом за связывание с иммобилизованным антигеном. Для этой цели иммобилизованный антиген инкубируют с меченой формой антитела и избытком антитела, с эпитопом которого определяют перекрывание. Перекрывание эпитопов можно легко установить, определяя связанную метку. Если регистрируется снижение сигнала более чем на 70%, в одном воплощении более чем на 80% при той же концентрации, или вытеснение более чем на 80%, в одном воплощении более чем на 90% при более высоких концентрациях, в одном случае при 105-кратном избытке антитела, у которого определяют перекрывание эпитопов с известным антителом, то эпитопы являются идентичными или перекрывающимися, а оба антитела связываются с тем же самым или с перекрывающимися эпитопами того же самого антигена.

Принцип различных видов иммунологического анализа описан, например, Hage, D.S. (Anal. Chem. 71 (1999) 294R-304R). Lu, В., et al. (Analyst 121 (1996) 29R-32R) предложили применять в иммунологических анализах ориентированную иммобилизацию антител. Иммунологические анализы с использованием авидина-биотина описаны, например, Wilchek, М., and Bayer, Е.А., in Methods Enzymol. 184 (1990) 467-469.

Моноклональные антитела и их константные домены, имея белковую природу, содержат ряд реакционноспособных боковых цепей для присоединения связывающего партнера, такого как поверхность, белок, полимер (например, ПЭГ, целлюлоза или полистирол), фермент или член связывающейся пары. Реакционноспособными химическими группами антител являются, например, аминогруппы (лизины, альфа-аминогруппы), тиоловые группы (цистины, цистеины и метионины), карбоксильные группы (аспарагиновые кислоты, глутаминовые кислоты) и спиртовые группы. Такие способы описаны, например, Aslam М., and Dent, A., in "Bioconjugation", MacMillan Ref. Ltd. 1999, pp. 50-100.

Одной из наиболее распространенных реакционноспособных групп белков является алифатическая ε-аминогруппа аминокислоты лизина. Как правило, практически все антитела богаты лизином. Аминогруппы лизина являются достаточно хорошими нуклеофилами при pH выше 8,0 (pK_a=9,18) и таким образом, легко и полностью реагируют с различными реагентами с образованием стабильных связей. Реагенты, вступающие в реакцию с аминогруппами, в первую очередь реагируют с лизинами и α-аминогруппами белков. Реакционноспособные сложные эфиры, в частности N-гидрокси-сукцинимидные (NHS) эфиры, относятся к наиболее широко употребляемым реагентам для модификации аминогрупп. Оптимальные значения pH для протекания реакции в водной среде составляют от pH 8,0 до 9,0. Изотиоцианаты являются реагентами, модифицирующими аминогруппы, и образуют с белками тиомочевинные соединения. Они вступают в реакцию с аминогруппами белков в водном растворе (оптимальные значения pH 9,0-9,5). Альдегиды вступают в реакцию в мягких условиях в водной среде с алифатическими и ароматическими аминами, гидразинами и гидразидами с образованием промежуточного имина (основания Шиффа). Основание Шиффа может быть селективно восстановлено при помощи слабых или сильных восстанавливающих агентов (таких как борогидрид натрия или цианоборогидрид натрия) с образованием стабильных алкиламинных связей. Другими реагентами, которые применяют для модификации аминогрупп, являются ангидриды кислот. Например, ангидрид диэтилентриаминпентауксусной кислоты (DTPA) является бифункциональным хелатирующим агентом, содержащим две ангидридные группы, вступающие в реакцию с аминогруппами. Он может вступать в реакцию с N-концевыми и ε-аминогруппами белков с образованием амидных связей. Ангидридные циклы размыкаются с образованием мультивалентных хелатирующих ионы металлов «клешней», способных прочно связываться с ионами металлов с образованием координационного комплекса.

Другой распространенной реакционноспособной группой антител является тиоловый остаток серосодержащей аминокислоты цистина и продукта его восстановления цистеина (или полуцистина). Цистеин содержит свободную тиоловую группу, которая обладает более выраженными нуклеофильными свойствами, чем аминогруппы и как правило представляет собой наиболее реакционноспособную функциональную группу в составе белка. Тиоловые группы, как правило, являются реакционноспособными при нейтральных значениях pH, и таким образом могут селективно связываться с другими молекулами в присутствии аминогрупп. Поскольку свободные сульфгидрильные группы являются относительно реакционноспособными, белки, содержащие эти группы, часто содержат их в окисленной форме в виде дисульфидных групп или дисульфидных связей. В таких белках для образования реакционноспособной свободной тиоловой группы необходимо восстановление дисульфидных связей с использованием такого реагента, как дитиотрейтол (ДТП). Реагенты, способные вступать в реакцию с тиолами, представляют собой реагенты, которые связываются с тиоловыми группами белков, с образованием тиоэфирных связей. Эти реагенты быстро вступают в реакцию при слабокислых или нейтральных значениях pH и таким образом могут избирательно реагировать в присутствии аминогрупп. В литературе описано применение нескольких тиолирующих сшивающих реагентов, таких как реагент Трота (2-иминотиолан), сукцинимидил-(ацетилтио)-ацетат (SATA), и сульфосукцинимидил-6-[3-(2-пиридилдитио)-пропионамидо]-гексанат (сульфо-LC-SPDP) для эффективного введения множества сульфгидрильных групп с использованием реакционносопособных аминогрупп. Галоацетильные производные, например иодоацетамиды, образуют тиоэфирные связи и также являются реагентами для модификации тиоловых групп. Другими подходящими реагентами являются малеимиды. Реакция малеимидов с реагентами, способными вступать в реакцию с тиоловыми группами, по существу аналогична реакции иодоацетамидов. Малеимиды быстро вступают в реакцию при слабокислых или нейтральных значениях pH.

Другими распространенными реакционноспособными группами антител являются карбоксильные группы. Карбоксильные группы находятся на С-конце белков и в составе боковых цепей аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты. Относительно низкая реакционная способность карбоксильных групп в воде обычно затрудняет применение этих групп для селективной модификации белков и других биомолекул. При ее осуществлении карбоксильная группа обычно превращается в реакционноспособную сложноэфирную группу при использовании водорастворимого карбодиимида и вступает в реакцию с нуклеофильным реагентом, таким как амин, гидразид или гидразин. Реагент, содержащий аминогруппу, должен обладать слабоосновными свойствами, чтобы избирательно реагировать с активированными карбоксильными группами в присутствии ε-аминогрупп лизина, проявляющих более сильные основные свойства, с образованием стабильных амидных связей. Образование поперечных сшивок в белках происходит при повышении pH выше 8,0.

Для окисления спиртовой группы углевода в составе углеводного компонента, присоединенного к антителу, до альдегида можно применять периодат натрия. Каждая альдегидная группа может вступать в реакцию с амином, гидразином или гидразидом, как описано для карбоксильных групп. Поскольку углеводный компонент преимущественно обнаруживается в составе кристаллизуемого фрагмента (Fc, от англ. crystallizable fragment) антитела, конъюгацию можно осуществлять при помощи сайт-специфической модификации углевода за пределами антигенсвязывающего сайта. Образуется промежуточный продукт - основание Шиффа, который может быть восстановлен до алкиламина за счет восстановления промежуточного продукта с помощью таких водорастворимых восстанавливающих реагентов, как цианоборогидрид натрия (слабый и селективный) или борогидрид натрия (сильный).

Термин "образец" включает любое количество субстанции, взятой из живого организма или бывшего живым организма, но не ограничивается ими. Такие живые организмы включают людей, мышей, обезьян, крыс, кроликов и других животных, но не ограничивается ими. В одном воплощении образец получен у обезьяны, в частности, яванского макака, или у кролика, или мыши, или крысы. В одном воплощении такие субстанции включают цельную кровь, сыворотку или плазму, полученные у индивида, представляющие собой наиболее широко используемые источники образцов в клинической практике, но не ограничиваются ими.

Термин "твердая фаза" обозначает нетекучую субстанцию и включает частицы (включая микрочастицы и гранулы), сделанные из такого материала, как полимер, металл (парамагнитные, ферромагнитные частицы), стекло и керамика; гелевые субстанции, такие как силикагель, алюмогель и полимерные гели; капилляры, которые могут быть сделаны из полимера, металла, стекла и/или керамики; цеолиты и другие пористые субстанции; электроды; планшеты для микротитрования; твердые стрипы; а также кюветы, пробирки или другие контейнеры для образцов, применяемые в спектрометрии. Компонент, представляющий собой твердую фазу, отличается от инертной твердой поверхности тем, что на поверхности "твердой фазы" имеется по меньшей мере одна функциональная группа, предназначенная для взаимодействия с субстанцией в образце. Твердая фаза может быть неподвижным элементом, таким как пробирка, стрип, кювета или планшет для микротитрования, или может быть подвижным элементом, таким как гранулы или микрочастицы. Можно применять разнообразные микрочастицы, которые обеспечивают нековалентное или ковалентное присоединение белков и других субстанций. Такие частицы включают частицы полимеров, такие как полистирен и поли-(метилметакрилат); частицы золота, такие как наночастицы золота и коллоидные частицы золота; а также керамические частицы, такие как частицы кремния, стекла и оксидов металлов. См., например Martin, C.R., et al., Analytical Chemistry-News & Features, 70 (1998) 322A-327A, или Butler, J.E., Methods 22 (2000) 4-23.

В одном воплощении детектируемая метка выбрана из хромогенов (флуоресцентных или люминесцентных групп и красителей), ферментов, ЯМР-активных групп, частиц металлов или гаптенов, таких как дигоксигенин. Детектируемая метка также может быть фотоактивируемой сшивающей группой, например, азидогруппой или азириновой группой. В одном воплощении, группами, испускающими сигнал, который можно детектировать электрохемилюминесцентным методом, также являются хелаты металлов, наибольшее предпочтение отдается хелатам рутения, например, бипиридильному комплексу рутения Ru(bpy)₃²⁺ (bpy=бипиридил). Подходящие группы для введения рутениевой метки описаны, например, в ЕР 0580979, WO 90/05301, WO 90/11511 или WO 92/14138.

В данном документе предложен способ определения наличия и/или концентрации (свободного) антигена мультиспецифического антитела в образце, содержащем иммобилизованное на твердой фазе антиидиотипическое антитело, которое специфически связывается с одной областью связывания мультиспецифического антитела, которая не является областью связывания мультиспецифического антитела, специфически связывающей (свободный) антиген, подлежащий определению, для элиминации из образца мультиспецифического антитела, как находящегося, так и не находящегося в составе комплекса, перед определением концентрации (свободного) антигена.

В одном воплощении определение наличия и/или концентрации антигена в образце, из которого элиминировано мультиспецифическое антитело, проводится методом иммуноанализа сэндвич-типа, где антиген выполняет роль мостика между двумя антителами. В одном воплощении в иммунологическом анализе используют захватывающее антитело и меченое антитело, при этом захватывающее антитело конъюгировано с твердой фазой, а меченое антитело конъюгировано с детектируемой меткой.

В одном воплощении способ включает элиминацию из образца комплекса моноспецифическое связующее-мультиспецифическое связующее перед определением наличия или концентрации свободного связующего партнера.

Один аспект данного описания представляет собой способ определения in vitro наличия и/или концентрации антигена мультиспецифического антитела в образце, где антиген, подлежащий определению, может быть специфически связан с первой областью связывания мультиспецифического антитела, включающий этап:

- инкубации образца, содержащего антиген и мультиспецифическое антитело, с антиидиотипическим антителом, которое специфически связывается со второй областью связывания мультиспецифического антитела, отличной от первой области связывания, и таким образом удаления мультиспецифического антитела из образца.

Специалисту в данной области техники известно, что согласно равновесной термодинамике, образец, содержащий антиген и антитело, которое может специфически связываться с антигеном, содержит смесь свободного антигена, связанного с антителом антигена и свободного антитела.

В одном воплощении способ включает следующие этапы:

- инкубацию образца, содержащего антиген и мультиспецифическое антитело, с антиидиотипическим антителом, которое специфически связывается со второй областью связывания мультиспецифического антитела, отличной от первой области связывания, для образования комплекса антиидиотипическое антитело-мультиспецифическое антитело, и

- удаление из образца комплекса антиидиотипическое антитело-мультиспецифическое антитело.

В одном воплощении способ включает следующие этапы:

- инкубацию образца, содержащего антиген и мультиспецифическое антитело, с антиидиотипическим антителом, которое специфически связывается со второй областью связывания мультиспецифического антитела, отличной от первой области связывания, для образования комплекса антиидиотипическое антитело-мультиспецифическое антитело,

- удаление из образца комплекса антиидиотипическое антитело-мультиспецифическое антитело, и

- определение концентрации антигена в образце, из которого элиминировано мультиспецифическое антитело.

В одном воплощении способ включает этап:

- элиминации из образца комплекса моноспецифическое связующее-мультиспецифическое связующее перед определением наличия или концентрации свободного связывающего партнера.

В одном воплощении способ включает этапы:

- инкубации образца, содержащего связывающий партнер и мультиспецифическое связующее, с моноспецифическим связующим, которое специфически связывается со второй областью связывания мультиспецифического связующего, отличной от первой области связывания,

- элиминации из образца комплекса моноспецифическое связующее-мультиспецифическое связующее перед определением наличия или концентрации свободного связывающего партнера, и

- определения концентрации связывающего партнера в образце, из которого элиминировано мультиспецифическое связующее.

В одном воплощении определение наличия и/или концентрации антигена осуществляют при помощи иммуноанализа сэндвич-типа.

В одном воплощении определение наличия и/или концентрации антигена представляет собой определение концентрации свободного антигена.

В одном воплощении определение наличия и/или концентрации антигена включает следующие этапы:

- инкубацию образца, из которого элиминировано мультиспецифическое антитело, с захватывающим антителом, которое специфически связывается с антигеном, для образования комплекса захватывающее антитело-антиген, и

- установление зависимости между образованием комплекса захватывающее антитело-антиген и концентрацией в образце антигена.

В одном воплощении определение наличия и/или концентрации антигена включает следующие этапы:

- инкубацию образца, из которого элиминировано мультиспецифическое антитело, с захватывающим антителом, которое специфически связывается с антигеном, для образования комплекса захватывающее антитело- антиген,

- инкубацию комплекса захватывающее антитело-антиген с меченым антителом, в ходе которой захватывающее антитело и меченое антитело связываются с неперекрывающимися эпитопами антигена, и

- установление зависимости между образованием комплекса захватывающее антитело-антиген-меченое антитело и концентрацией антигена в образце.

В одном воплощении меченое антитело содержит детектируемую метку.

В одном воплощении определение наличия и/или концентрации антигена включает следующие этапы:

- инкубацию образца, из которого элиминировано мультиспецифическое антитело, с захватывающим антителом, которое специфически связывается с антигеном, для образования комплекса захватывающее антитело- антиген,

- инкубацию комплекса захватывающее антитело-антиген с меченым антителом, в ходе которой захватывающее антитело и меченое антитело связываются с неперекрывающимися эпитопами антигена,

- инкубацию комплекса захватывающее антитело-антиген-меченое антитело с детектирующим антителом, содержащим детектируемую метку, в ходе которой детектирующее антитело специфически связывается с эпитопом меченого антитела, находящимся за пределами вариабельных доменов меченого антитела, и

- установление зависимости между образованием комплекса захватывающее антитело-свободный антиген-меченое антитело и концентрацией антигена в образце.

В одном воплощении захватывающее антитело и меченое антитело связываются с неперекрывающимися эпитопами антигена.

В одном воплощении антиидиотипическое антитело и/или захватывающее антитело конъюгированы с твердой фазой.

Антиидиотипическое антитело и/или захватывающее антитело, которые могут найти применение в способе по данному описанию, могут быть конъюгированы с твердой фазой. В одном воплощении конъюгацию осуществляют путем химического связывания по N-концевым и/или ε-аминогруппам (лизин), ε-аминогруппам различных лизинов, по карбоксильным, сульфгидрильным, гидроксильным и/или фенольным функциональным группам аминокислотного остова антитела и/или спиртовым группам углеводного компонента антитела. В одном воплощении антиидиотипическое антитело и/или захватывающее антитело представляют собой смесь по меньшей мере двух антител, конъюгированных с твердой фазой, где по меньшей мере два антитела, конъюгированных с твердой фазой, различаются сайтами, по которым они конъюгированы с твердой фазой. Например, смесь по меньшей мере двух антител, конъюгированных с твердой фазой, может содержать антитело, конъюгированное с твердой фазой по аминокислоте аминокислотного остова антитела и по спиртовой группе углеводного компонента антитела. Кроме того, например, смесь по меньшей мере двух антител, конъюгированных с твердой фазой, может включать антитела, конъюгированные с твердой фазой по различным аминокислотным остаткам их аминокислотного остова. Выражение "различные аминокислотные остатки" обозначает либо два различных типа аминокислот, например, таких как лизин и аспарагиновая кислота, или тирозин и глутаминовая кислота, либо два аминокислотных остатка аминокислотного остова, различающиеся своим расположением в аминокислотной последовательности антитела. В последнем случае аминокислота может быть того же типа или другого типа. Выражение "антитела различаются сайтами" обозначает различия либо в типе сайта, например, аминокислоту или спиртовую группу, или в порядковом номере аминокислоты в аминокислотном остове, например, по которой антитело конъюгировано с твердой фазой. То же самое относится и к меченому антителу, которое может найти применение в способе согласно данному описанию.

В одном воплощении способа в иммунологическом анализе используют захватывающее антитело, меченое антитело и детектирующее антитело, где захватывающее антитело представляет собой биотинилированное антитело, направленное против антигена, конъюгированного с твердой фазой через стрептавидин, меченое антитело представляет собой антитело, направленное против антигена, конъюгированного с дигоксигенином, а детектирующее антитело представляет собой антитело, направленное против дигоксигенина, конъюгированное с пероксидазой хрена.

Стандартный способ элиминации комплексов, имеющих в своем составе биспецифические антитела, которые специфически связываются с антигеном X и антигеном Y, из образцов, содержащих антиген X и/или антиген Y, для определения антигена X или антигена Y, соответственно, включает следующие этапы:

- формирование комплексов между биспецифическим антителом, которое специфически связывается с антигеном X и антигеном Y (анти-X/Y антитело):

Антиген X в постоянной концентрации инкубируют с возрастающими концентрациями биспецифического моноклонального антитела, которое специфически связывается с антигеном X первой областью связывания и которое специфически связывается с антигеном Y второй областью связывания (анти-X/Y антитело), при комнатной температуре в течение 1 часа. После этого образец используют в качестве положительного контроля на этапе элиминации.

- этап элиминации:

Для элиминации антигена X, связанного с анти-X/Y антителом, биотинилированное антиидиотипическое антитело, направленное против области связывания, которая специфически связывается с антигеном Y (антиидиотипическое Y антитело-BI) связывают с магнитными гранулами, покрытыми стрептавидином (SA-гранулы) в концентрации приблизительно 10 мкг/мл. Для каждого образца отмывают и отделяют от надосадочной жидкости с использованием магнитного сепаратора по 600 мкл SA-гранул. 600 мкл раствора, содержащего биотинилированное антиидиотипическое Y антитело, смешивают с SA-гранулами и инкубируют приблизительно в течение 1 ч при комнатной температуре. Избыток несвязанного антиидиотипического антитела удаляют путем 3-кратного отмывания гранул с использованием магнитного сепаратора. После этого гранулы, покрытые антиидиотипическим антителом, инкубируют приблизительно с 250 мкл образца, содержащего комплексы анти-X/Y антитела и антигена X. Смесь инкубируют при комнатной температуре при перемешивании приблизительно в течение 1 ч. После инкубации гранулы удаляют из образца при помощи магнитного сепаратора. Надосадочную жидкость используют для анализа "свободного" антигена X методом ИФА (см., например, Пример 2). Оставшиеся гранулы переносят в контейнер ELECSYS и определяют антиген X, связанный с гранулами (антиген X, связанный с биспецифическим антителом), на анализаторе ELECSYS 2010, согласно стандартным рабочим процедурам, описанным в руководстве пользователя (см., например, Пример 3).

Для элиминации антигена Y, связанного с анти-X/Y антителом, биотинилированное антиидиотипическое антитело, направленное против области связывания, которая специфически связывается с антигеном X (антиидиотипическое X антитело-BI) связывают с магнитными гранулами, покрытыми стрептавидином (SA-гранулы) в концентрации приблизительно 10 мкг/мл. Для каждого образца отмывают и отделяют от надосадочной жидкости с использованием магнитного сепаратора по 600 мкл SA-гранул. 600 мкл раствора, содержащего биотинилированное антиидиотипическое антитело X, смешивают с SA-гранулами и инкубируют приблизительно в течение 1 ч при комнатной температуре. Избыток несвязанного антиидиотипического антитела затем удаляют путем 3-кратного отмывания гранул с использованием магнитного сепаратора. После этого гранулы, покрытые антиидиотипическим антителом, инкубируют приблизительно с 250 мкл образца, содержащего комплексы анти-X/Y антитела и антигена Y. Смесь инкубируют при комнатной температуре при перемешивании приблизительно в течение 1 ч. После инкубации гранулы удаляют из образца при помощи магнитного сепаратора. Надосадочную жидкость используют для анализа "свободного" антигена Y методом ИФА (см., например, Пример 2). Оставшиеся гранулы переносят в контейнер ELECSYS и определяют антиген Y, связанный с гранулами (антиген Y, связанный с биспецифическим антителом), на анализаторе ELECSYS 2010, согласно стандартным рабочим процедурам, описанным в руководстве пользователя (см., например, Пример 3).

В одном воплощении антиидиотипическое антитело характеризуется константой ассоциации k_a, равной 10⁵ л/моль*с или более. В одном воплощении антиидиотипическое антитело характеризуется константой ассоциации, равной 1*10⁵ л/моль*с или более. В одном воплощении антиидиотипическое антитело также характеризуется значением K_D, равным 5*10^-8 моль/л или менее. В одном воплощении антиидиотипическое антитело также характеризуется значением K_D, равным 1*10^-9 моль/л или менее.

В одном воплощении инкубация на этапе элиминации составляет приблизительно от 5 минут приблизительно до 36 часов. В одном воплощении инкубация на этапе элиминации составляет приблизительно от 15 минут приблизительно до 30 часов.

В одном воплощении концентрацию мультиспецифического антитела в образце доводят до значений приблизительно от 2 мкг/мл приблизительно до 15 мкг/мл. В одном воплощении концентрацию мультиспецифического антитела в образце доводят до значений приблизительно от 3 мкг/мл приблизительно до 12 мкг/мл.

В одном воплощении общую концентрацию антигена в образце доводят до значений приблизительно от 1 пг/мл приблизительно до 1 мкг/мл. В одном воплощении общую концентрацию антигена в образце доводят до значений приблизительно от 10 пг/мл приблизительно до 500 нг/мл. В одном воплощении общую концентрацию антигена в образце доводят до значений приблизительно от 100 пг/мл приблизительно до 250 нг/мл. В одном воплощении общую концентрацию антигена в образце доводят до значений приблизительно от 1 нг/мл приблизительно до 100 нг/мл.

В случае биспецифического антитела, направленного против ангиопоэтина-2 (ANG2, от англ. angiopoietin-2) и фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF, от англ. vascular endothelium growth factor), механизм действия представляет собой блокирование связывания обоих антигенов с их соответствующими рецепторами. В отсутствие свободного антигена (способного связываться с рецептором), передача сигнала подавляется. Предпочтительно различать свободный(е) антиген(ы) и связанный(е) с антителом антиген(ы).

Следующие примеры и графические материалы дают возможность лучше понять настоящее изобретение, объем которого ограничен прилагаемой формулой. Следует понимать, что указанные методики могут быть модифицированы, но при этом суть изобретения сохранится.

Конкретные воплощения изобретения

1. Способ определения in vitro наличия и/или концентрации связывающего партнера, который может быть специфически связан с областью связывания мультиспецифического связующего, в котором связывающий партнер, связанный с мультиспецифическим связующим, элиминируют из образца перед детекцией связывающего партнера путем инкубации образца с моноспецифическим связующим, специфически связывающимся со второй областью связывания мультиспецифического связующего.

2. Способ иммунологического определения в образце наличия и/или концентрации связывающего партнера мультиспецифического связующего с помощью иммунологического анализа, в котором мультиспецифическое связующее элиминируют из образца перед детекцией связывающего партнера.

3. Способ определения in vitro наличия и/или концентрации связывающего партнера мультиспецифического связующего, в котором связывающий партнер может быть специфически связан с первой областью связывания мультиспецифического связующего, включающий этап:

инкубации образца, содержащего связывающий партнер и мультиспецифическое связующее, с моноспецифическим связующим, которое специфически связывается со второй областью связывания мультиспецифического связующего, отличной от первой области связывания.

4. Способ определения in vitro наличия и/или концентрации антигена мультиспецифического антитела в образце, в котором антиген, подлежащий определению, может быть специфически связан с первой областью связывания мультиспецифического антитела, включающий этап:

- инкубации образца, содержащего мультиспецифическое антитело, связанный с мультиспецифическим антителом антиген и свободный антиген, с антиидиотипическим антителом, которое специфически связывается со второй областью связывания мультиспецифического антитела, отличной от первой области связывания.

5. Способ по любому из пп. 3-4, отличающийся тем, что в качестве второго этапа он включает этап:

- элиминации из образца комплекса моноспецифическое связующее -мультиспецифическое связующее перед определением наличия и/или концентрации свободного связывающего партнера.

6. Способ по любому из пп. 3-5, отличающийся включением в качестве заключительного этапа:

- определения концентрации связывающего партнера в образце, из которого элиминировано мультиспецифическое связующее.

7. Способ по любому из пп. 2-6, отличающийся включением следующих этапов:

- инкубации образца, содержащего связывающий партнер и мультиспецифическое связующее, с моноспецифическим связующим, которое специфически связывается со второй областью связывания мультиспецифического связующего, отличной от первой области связывания,

- элиминации из образца комплекса моноспецифическое связующее -мультиспецифическое связующее перед определением наличия или концентрации свободного связывающего партнера, и

- определения концентрации связывающего партнера в образце, из которого элиминировано мультиспецифическое связующее.

8. Способ по любому из пп. 1-7, отличающийся тем, что связывающий партнер выбран из группы, включающей антиген, мишень и аналит.

9. Способ по любому из пп. 1-8, отличающийся тем, что связывающий партнер представляет собой не входящий в состав комплекса связывающий партнер, или свободный связывающий партнер.

10. Способ по любому из пп. 1-9, отличающийся тем, что область связывания представляет собой сайт связывания или пару вариабельных доменов тяжелой цепи антитела и легкой цепи антитела.

11. Способ по любому из пп. 1-10, отличающийся тем, что мультиспецифическое связующее выбрано из антитела, химерного полипептида, содержащего антитело или фрагмент антитела и полипептид, не являющийся антителом, химерного полипептида, содержащего антитело или фрагмент антитела и растворимый рецептор, или химерного полипептида, содержащего антитело или фрагмент антитела и пептидную связывающую молекулу.

12. Способ по любому из пп. 1-11, отличающийся тем, что мультиспецифическое связующее представляет собой антитело.

13. Способ по любому из пп. 8-12, отличающийся тем, что определение наличия и/или концентрации антигена включает следующие этапы:

- инкубацию образца, из которого элиминировано мультиспецифическое антитело, со связывающим антителом, которое специфически связывается с антигеном, для образования комплекса захватывающее антитело - антиген, и

- установление зависимости между формированием комплекса захватывающее антитело - антиген и концентрацией антигена в образце.

14. Способ по любому из пп. 8-13, отличающийся тем, что определение концентрации антигена включает следующие этапы:

- инкубацию образца, из которого элиминировано мультиспецифическое антитело, с захватывающим антителом, которое специфически связывается с антигеном, для образования комплекса захватывающее антитело - антиген,

- инкубацию комплекса захватывающее антитело - антиген с меченым антителом, в ходе которой захватывающее антитело и меченое антитело связываются с неперекрывающимися эпитопами антигена, и

- установление зависимости между формированием комплекса захватывающее антитело - антиген - меченое антитело и концентрацией антигена в образце.

15. Способ по любому из пп. 8-14, отличающийся тем, что определение концентрации антигена включает следующие этапы:

- инкубацию образца, из которого элиминировано мультиспецифическое антитело, с захватывающим антителом, которое специфически связывается с антигеном, для образования комплекса захватывающее антитело - антиген,

- инкубацию комплекса захватывающее антитело - антиген с меченым антителом, в ходе которой захватывающее антитело и меченое антитело связываются с неперекрывающимися эпитопами антигена,

- инкубацию комплекса захватывающее антитело - антиген - меченое антитело с детектирущим антителом, содержащим детектируемую метку, в ходе которой детектирующее антитело специфически связывается с эпитопом меченого антитела, находящимся за пределами вариабельных доменов меченого антитела, и

- установление зависимости между формированием комплекса захватывающее антитело - антиген - меченое антитело и концентрацией антигена в образце.

16. Способ по любому из пп. 11-15, отличающийся тем, что антитело представляет собой биспецифическое антитело или триспецифичское антитело или тетраспецифическое антитело или пентаспецифическое антитело или гексаспецифическое антитело.

17. Способ по любому из пп. 11-16, отличающийся тем, что антитело представляет собой биспецифическое антитело.

18. Способ по любому из пп. 11-17, отличающийся тем, что антитело представляет собой биспецифическое антитело, имеющее первую область связывания, которая специфически связывается с первым антигеном или первым эпитопом антигена, а также имеющее вторую область связывания, которая специфически связывается со вторым антигеном или вторым эпитопом антигена.

19. Способ по любому из пп. 1-18, отличающийся тем, что моноспецифическое связующее представляет собой антиидиотипическое антитело.

20. Способ по п. 19, отличающийся тем, что способ включает следующие этапы:

- инкубацию образца, содержащего мультиспецифическое антитело, связанный с мультиспецифическим антителом антиген и свободный антиген, с антиидиотипическим антителом, которое специфически связывается со второй областью связывания мультиспецифического антитела, отличной от первой области связывания, для образования комплекса антиидиотипическое антитело - мультиспецифическое антитело,и

- удаление из образца комплекса антиидиотипическое антитело - мультиспецифическое антитело.

21. Способ по любому из пп. 19-20, отличающийся тем, что способ включает следующие этапы:

- инкубацию образца, содержащего антиген и мультиспецифическое антитело, с антиидиотипическим антителом, которое специфически связывается со второй областью связывания мультиспецифического антитела, отличной от первой области связывания, для образования комплекса антиидиотипическое антитело - мультиспецифическое антитело,

- удаление из образца комплекса антиидиотипическое антитело - мультиспецифическое антитело, и

- определение концентрации антигена в образце, из которого элиминировано мультиспецифическое антитело.

22. Способ по любому из пп. 20-21, отличающийся тем, что комплекс антиидиотипическое антитело - мультиспецифическое антитело представляет собой смесь комплекса антиидиотипическое антитело - мультиспецифическое антитело и комплекса антиидиотипическое антитело - мультиспецифическое антитело - антиген.

23. Способ по любому из пп. 19-22, отличающийся тем, что константа ассоциации k_a, характеризующая связывание антиидиотипического антитела со второй областью связывания мультиспецифического антитела, равна 10⁵ л/моль*с или более.

24. Способ по любому из пп. 19-23, отличающийся тем, что значение K_D, характеризующее связывание антиидиотипического антитела со второй областью связывания мультиспецифического антитела, равно 5*10^-8 моль/л или менее.

25. Способ по любому из пп. 19-24, отличающийся тем, что инкубация с антиидиотипическим антителом составляет приблизительно от 10 минут приблизительно до 36 часов.

26. Способ по любому из пп. 1-25, отличающийся тем, что концентрацию мультиспецифического антитела в образце доводят до значения приблизительно от 2 мкг/мл приблизительно до 15 мкг/мл.

27. Способ по любому из пп. 1-26, отличающийся тем, что общую концентрацию антигена в образце доводят до значения приблизительно от 1 нг/мл приблизительно до 250 нг/мл.

28. Способ по любому из пп. 19-27, отличающийся тем, что антиидиотипическое антитело связано или конъюгировано с твердой фазой.

29. Способ по любому из пп. 19-28, отличающийся тем, что антиидиотипическое антитело конъюгировано (иммобилизовано) с использованием специфически связывающейся пары.

30. Способ по п. 29, отличающийся тем, что связывающаяся пара (первый компонент/второй компонент) выбрана из стрептавидина или авидина/биотина, антитела/антигена, лектина/полисахарида, стероида/стероид-связывающего белка, гормона/рецептора гормона, фермента/субстрата, IgG/белка А и/или G.

31. Способ по любому из пп. 29-30, отличающийся тем, что антиидиотипическое антитело конъюгировано с биотином и иммобилизовано с использованием иммобилизованного авидина или стрептавидина.

32. Способ по любому из пп. 19-31, отличающийся тем, что антиидиотипическое антитело биотинилировано, а твердая фаза покрыта стрептавидином.

33. Способ по любому из пп. 19-31, отличающийся тем, что антиидиотипическое антитело представляет собой биотинилированное антиидиотипическое антитело, направленное против мультиспецифического связующего и конъюгированное с твердой фазой при помощи стрептавидина.

34. Способ по любому из пп. 28-33, отличающийся тем, что твердая фаза представляет собой покрытые стрептавидином парамагнитные гранулы или покрытые стрептавидином гранулы сефарозы.

35. Способ по любому из пп. 19-34, отличающийся тем, что антиидиотипическое антитело представляет собой смесь, содержащую по меньшей мере два антиидиотипических антитела, которые различаются сайтами, по которым они конъюгированы с твердой фазой.

36. Способ по любому из пп. 19-35, отличающийся тем, что смесь антиидиотипических антител содержит антиидиотипическое антитело, конъюгированное с твердой фазой по меньшей мере через две различные аминогруппы.

37. Способ по любому из пп. 28-36, отличающийся тем, что конъюгацию антиидиотипического антитела с его партнером для конъюгации осуществляют путем химического связывания по N-концевым и/или ε-аминогруппам (лизина), и/или ε-аминогруппам различных лизинов, карбоксильным, сульфгидрильным, гидроксильным и/или фенольным функциональным группам аминокислотного скелета терапевтически активного антитела и/или спиртовым группам углеводной структуры терапевтически активного антитела.

38. Способ по любому из пп. 28-37, отличающийся тем, что антиидиотипическое антитело конъюгировано с твердой фазой при помощи пассивной адсобрции.

39. Способ по любому из пп. 1-38, отличающийся тем, что образец содержит мультиспецифическое антитело, свободный антиген и комплексы мультиспецифическое антитело - антиген, а определению подлежит свободный антиген мультиспецифического антитела.

40. Применение антиидиотипического антитела, которое специфически связывается с первой областью связывания мультиспецифического антитела, для элиминации из образца антигена, связанного со второй областью связывания мультиспецифического антитела.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг. 1 Равновесие между связанной с лекарством мишени (антиген, связанный с биспецифическим антителом) и свободной мишени (свободный антиген).

Фиг. 2 Элиминация VEGF, связанного с биспецифическим анти-ANG2/VEGF антителом, с помощью антиидиотипического антитела, направленного против области связывания биспецифического антитела для ANG2; биотинилированное антиидиотипическое антитело, направленное против области связывания биспецифического антитела для ANG2, иммобилизовано на покрытых стрептавидином магнитных гранулах; после инкубации этих магнитных гранул с образцом, например, образцом сыворотки, биспецифическое анти-ANG2/VEGF антитело связывается и элиминируется иммобилизованным антиидиотипическим антителом; VEGF, связанный с биспецифическим антителом, также элиминируется; свободный VEGF (не связанный с биспецифическим антителом) остается в супернатанте образца сыворотки.

Фиг. 3 «Сэндвич»-ИФА для определения VEGF: иммобилизованное анти-VEGF антитело связывает VEGF, а другое меченое анти-VEGF антитело позволяет детектировать связанный VEGF; анализ используют для обнаружения "свободного" VEGF в супернатанте образца после элиминации; для обнаружения с-МЕТ применяли аналогичный вариант анализа с использованием двух анти-с-МЕТ антител.

Фиг. 4 Уровень с-МЕТ до и после иммуно-опосредованной элиминации: из образцов, содержащих 50 нг/мл с-МЕТ и возрастающие концентрации бипецифического анти-HER3/с-МЕТ антитела, элиминировали биспецифическое антитело при помощи антиидиотипического антитела, специфически связывающегося с областью связывания биспецифического антитела для HER3; на диаграмме показаны концентрации с-МЕТ до и после элиминации, измеренные методом ИФА; уровни с-МЕТ до элиминации одинаковы, независимо от концентрации биспецифического антитела; при элиминации удаляют с-МЕТ, связанный с биспецифическим антителом (мишень, связанная с лекарством); измеренная концентрация с-МЕТ (свободного с-МЕТ) после элиминации составила приблизительно 1 нг/мл в присутствии биспецифического антитела в концентрации 2 м кг/мл.

Фиг. 5 Сравнение нескольких антиидиотипических антител, использовавшихся для иммуноопосредованной элиминации: четыре антиидиотипических антитела, специфически связывающиеся с областью связывания биспецифического антитела для HER3, использовали для элиминации "связанного" с биспецифическим антителом с-МЕТ; эксперимент проводили, как показано на Фиг. 4; элиминация с использованием антитела М2.11.125 оказалась менее эффективной по сравнению с тремя другими антиидиотипическими антителами.

Фиг. 6 Концентрация VEGF в супернатанте образцов буфера и сыворотки после элиминации: в образцах буфера и сыворотки, содержащих 50 нг/мл VEGF и биспецифическое анти-ANG2/VEGF антитело в возрастающих концентрациях, осуществляли элиминацию с использованием антиидиотипического антитела, специфически связывающегося с областью связывания биспецифического антитела для ANG2; концентрацию VEGF до и после иммуноопосредованной элиминации определяли методом ИФА (Фиг. 3); элиминация связанной с лекарством мишени в сыворотке/плазме оказалась так же эффективна, как и в буфере; зависимость сигнала от концентрации биспецифического антитела до элиминации обусловлена форматом анализа и перекрыванием эпитопов VEGF, специфически связывающихся с мультиспецифическим связующим и одним из использующихся в анализе антител, направленных против VEGF.

Фиг. 7 Детекция связанной с лекарством мишени после иммуноопосредованной элиминации с использованием антиидиотипических антител, иммобилизованных на покрытых стрептавидином гранулах: выделенные магнитные гранулы переносили в анализатор ELECSYS 2010; VEGF, входящий в состав связанного с гранулами комплекса антиидиотипическое антитело/биспецифическое антитело/VEGF, определяли с использованием меченного рутением антитела, направленного против VEGF.

ОПИСАНИЕ ПРИМЕРОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Пример 1

Элиминация связанной с лекарством мишени (антигена, связанного с антителом) в случае биспецифических молекул лекарств

Элиминация из образца комплексов анти-ANG2/VEGF антитело-VEGF

A) Формирование комплексов анти-ANG2/VEGF антитело и VEGF

VEGF в постоянной концентрации инкубировали с возрастающими концентрациями биспецифического антитела, которое специфически связывается с ANG2 первой областью связывания и которое специфически связывается с VEGF втоой областью связывания (анти-ANG2/VEGF антитело) при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем эти образцы использовали в качестве положительного контроля на этапе элиминации.

B) Этап элиминации

Для элиминации VEGF, связанного с анти-ANG2/VEGF антителом, биотинилированное антиидиотипическое антитело, направленное против области связывания, специфически связывающейся с ANG2 (антиидиотипическое ANG2 антитело-BI) в концентрации 10 мкг/мл связывали с поверхностью магнитных гранул, покрытых стрептавидином (SA-гранулы). Для каждого образца отмывали и отделяли от надосадочной жидкости с использованием магнитного сепаратора по 600 мкл SA-гранул. Приблизительно 600 мкл раствора, содержащего антиидиотипическое ANG2 антитело, смешивали с покрытыми стрептавидином гранулами и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Избыток несвязанного антитела удаляли путем 3-кратного отмывания гранул с использованием магнитного сепаратора. После этого гранулы, покрытые антигеном, инкубировали с 250 мкл образца, содержащего комплексы анти-ANG2/VEGF антитела и VEGF. Образцы инкубировали при комнатной температуре при перемешивании приблизительно в течение 1 ч. После инкубации гранулы удаляли из образца при помощи магнитного сепаратора.

Надосадочную жидкость использовали для анализа "свободного" VEGF методом ИФА (см. Пример 2). Оставшиеся гранулы переносили в контейнер ELECSYS и определяли связанный с гранулами VEGF (VEGF, связанный с анти-ANG2/VEGF антителом) на анализаторе ELECSYS 2010 согласно инструкциям производителя (см. Пример 3).

Для элиминации VEGF использовали два различных антиидиотипических антитела, направленных против области связывания для ANG2 (см. также Пример 5):

i) поликлональное антиидиотипическое ANG2 антитело, Rb-IgG-BI,

ii) моноклональное антиидиотипическое ANG2 антитело M-2.3.55-BI. Элиминация из образца комплексов анти-HER3/c-MET антитела и с-МЕТ

A) Формирование комплексов анти-HER3/c-MET антитело и с-МЕТ

с-МЕТ в постоянной концентрации инкубировали с возрастающими концентрациями биспецифического антитела, которое специфически связывается с HER3 первой областью связывания и которое специфически связывается с с-МЕТ второй областью связывания (анти-HER3/c-MET антитело) при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем данный образец смешивали с гранулами для элиминации комплексов анти-HERS/c-Met антитело-с-МЕТ.

B) Этап элиминации

Для элиминации с-МЕТ, связанного с анти-HER3/c-MET антителом, биотинилированное антиидиотипическое антитело, направленное против области связывания, которая специфически связывается с HER3 (антиидиотипическое HER3 антитело-BI), в концентрации приблизительно 10 мкг/мл связывали с поверхностью магнитных гранул, покрытых стрептавидином (SA-гранул). Для каждого образца отмывали и отделяли от надосадочной жидкости с использованием магнитного сепаратора по 600 мкл SA-гранул. Приблизительно 600 мкл раствора, содержащего антиидиотипическое HER3 антитело M1.1.10-BI, смешивали с SA-гранулами и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. Избыток несвязанного антитела удаляли путем 3-кратного отмывания гранул с использованием магнитного сепаратора. Затем покрытые антителом гранулы инкубировали с 250 мкл образцов, содержащих комплексы анти-HER3/c-MET антитела и с-МЕТ. Образцы инкубировали при комнатной температуре при перемешивании в течение 1 часа. После инкубации гранулы удаляли из образца при помощи магнитного сепаратора. Надосадочную жидкость использовали для анализа "свободного" с-МЕТ методом ИФА.

Для элиминации с-МЕТ, связанного с анти-HER3/с-МЕТ антителом, использовали четыре антиидиотипических антитела, направленных против области связывания для HER3 (см. также Пример 4):

i) моноклональное антиидиотипическое HER3 антитело M-1.1.10-IgG,

ii) моноклональное антиидиотипическое HER3 антитело M-2.11.123-IgG,

iii) моноклональное антиидиотипическое HER3 антитело M-2.5.45-IgG,

iv) моноклональное антиидиотипическое HER3 антитело M-2.9.55-IgG.

Пример 2

Твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА)

ИФА для определения VEGF

Доступные для приобретения наборы для "сэндвич"-ИФА использовали согласно инструкциям производителя (R+D Systems, кат # DVE00).

Образец супернатанта, полученного на этапе элиминации (см. Пример 1), разводили в 10 раз и добавляли в лунки планшета для микротитрования с предварительно нанесенным покрытием (R+D Systems). Свободный VEGF, содержащийся в образце, связывался с анти-VEGF антителом, нанесенным на поверхность лунок планшета. Через 2 часа инкубации при комнатной температуре несвязанный VEGF исследуемого образца удаляли путем 3-кратного отмывания планшета. Затем в лунки добавляли поликлональное меченное HRP анти-VEGF антитело (конъюгированное с пероксидазой хрена анти-VEGF антитело) и инкубировали еще в течение 2 часов при комнатной температуре. После следующего этапа отмывки в лунки добавлял раствор субстрата ТМВ. Цветную реакцию останавливали путем добавления серной кислоты непосредственно перед измерением (см. Фиг. 3).

ИФА для определения с-МЕТ

Использовали доступный для приобретения набор для "сэндвич"-ИФА (R+D Systems Cat# DY358).

Мышиное моноклональное анти-с-МЕТ антитело разводили в фосфатно-солевом буфере (PBS) до рабочей концентрации приблизительно 180 мкг/мл.

Приблизительно 100 мкл этого раствора закапывали в каждую лунку планшета Nunc Maxisorb и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. После иммобилизации захватывающего антитела на поверхности лунок планшет трижды промывали PBS с добавлением 0,05% (вес/об) Tween и блокировали свободные сайты связывания PBS, содержащим 1% (вес/об) бычий сывороточный альбумин (БСА) в течение 1 часа при комнатной температуре. Перед внесением образцов планшет трижды промывали PBS.

Надосадочную жидкость, полученную после элиминации с-МЕТ (см. Пример 1), разводили в 10 раз. После иммобилизации и блокирования в лунки планшета раскапывали приблизительно по 100 мкл каждого разведенного образца, а также серии разведений калибровочных стандартов в дубликатах и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре.

После инкубации несвязавшийся с-МЕТ образцов удаляли путем 3-кратного промывания планшета. Затем в лунки добавляли поликлональное меченное биотином анти-с-МЕТ антитело и инкубировали еще в течение 2 часов при комнатной температуре. После дополнительного этапа отмывки конъюгат стрептавидин-HRP (R+D systems) разводили в 200 раз и в каждую лунку планшета для микротитрования закапывали по 100 мкл этого раствора и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. После следующего этапа отмывки в лунки добавляли раствор ТМВ и непосредственно перед измерением останавливали цветную реакцию путем добавления серной кислоты (см. Фиг. 4).

Пример 3

Определение связанных комплексов антигена X и анти-X/Y антитела на анализаторе ELECSYS

Гранулы, которые использовали на этапе элиминации (см. Пример 1) трижды промывали в буфере для проведения анализа ELECSYS и отделяли с использованием магнитного сепаратора для удаления несвязанных соединений. Гранулы из каждого образца смешивали с 600 мкл буфера для проведения анализа ELECSYS и использовали для определения.

Вкратце, 170 мкл гранул инкубировали с 10 мкл буфера и 20 мкл меченного рутением антитела, направленного против антигена X (15 мкг/мл) в течение 15 мин. Детектировали меченное рутением антитело, связанное с иммобилизованным на поверхности SA-гранул комплексом антиген X - анти-X/Y антитело - антиидиотипическое антитело (см., например, Stockmann, W., et al., Wien. Klin. Wochenschr. 110 (1998) Suppl. 3:10-21; Forest, J.C., et al., Clin. Biochem. 31 (1998)81-88).

Пример 4

Оценка антиидиотипических антител как средств для элиминации

Согласно способу, описанному в Примере 1, для элиминации анти-HER3/C-MET антитела и его комплексов использовали различные антиидиотипические антитела, характеризующиеся различными кинетическими константами межмолекулярных взаимодействий.

Определение кинетических констант специфического связывания антиидиотипических антител с областью связывания анти-HER3/c-MET антитела для HER3, методом поверхностного плазмонного резонанса

Все измерения проводили на приборе BIAcore^® Т100 с использованием чипа СМ5. Для иммобилизации лигандов на поверхности чипа использовали стандартную методику присоединения по аминогруппам. Если не указано иначе, для инкубации использовали буфер HBS (HEPES, NaCl, pH 7,4) при 25°C. Поликлональное антитело козы, специфическое к Fc фрагменту иммуноглобулинов мыши присоединяли через аминогруппы к поверхности чипа СМ5 в одной проточной ячейке. Затем в течение 60 сек инжектировали различные моноклональные мышиные антитела, направленные против области связывания анти-HER3/c-MET антитела, специфически связывающейся с HER3, при скорости 30 мкл/мин, которые связывались с антителом, специфическим к Fc фрагменту иммуноглобулинов мыши. Все образцы сыворотки животных разводили в буфере HBS. Связывание (ассоциацию) анализировали при инжектировании анти-HER3/c-MET антитела в течение 60 сек при скорости 30 мкл/мин. Для анализа диссоциации поверхность чипа промывали в течение 180 сек буфером HBS. Значения констант диссоциации (=k_a; kd; K_D) рассчитывали в программе BIAevaluation (BIAcore®), используя модель связывания 1:1, предложенную Ленгмюром.

Результаты также показаны на Фиг. 5.

Как показано на Фиг. 5, элиминация анти-HER3/c-Met антитела с использованием моноклонального антиидиотипического HER3 антитела M-2.11.123-IgG является не такой эффективной, как с использованием других антител.

Элиминация связанного с лекарством с-МЕТ и детекция свободного с-МЕТ

Связанный с анти-HER3/c-MET антителом с-МЕТ, элиминировали с использованием антиидиотипических антител, как описано в Примере 1. Надосадочную жидкость использовали для определения с-МЕТ методом ИФА, как описано в Примере 2.

Пример 5

Элиминация связанного с лекарством VEGF из человеческой сыворотки и буфера

Как описано в Примере 1, анти-ANG2/VEGF антитело разводили до концентраций 10/5/1/0,5/0,25 и 0 мкг/мл и инкубировали с VEGF в постоянной концентрации 50 нг/мл. Разведения готовили в 2 различных средах:

- буфере Low Cross (Candor Bioscience GmbH, #100500)

- человеческой пулированной сыворотке (Trina, NHS Base matrix)

Образцы инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем образцы подвергали элиминации, как описано в Примере 1.

Для захвата комплексов VEGF с анти-ANG2A/EGF антителом использовали моноклональное антиидиотипическое ANG2 антитело M-2.3.55-BI.

После элиминации в супернатанте определяли VEGF методом ИФА, как описано в Примере 2.

Остаточную концентрацию VEGF в надосадочной жидкости после элиминации сопоставляли с контрольным образцом (50 нг/мл), инкубировавшимся в отсутствие биспецифического антитела. Результаты показаны в следующей ниже Таблице как относительный выход, выраженный в процентах.

Пример 6

Влияние концентрации свободного антигена на элиминацию, показанное на примере анти-HER3/с-МЕТ антитела

Согласно Примеру 1, с-МЕТ, связанный с анти-HER3/с-МЕТ антителом, элиминировали из образцов, содержащих различные концентрации с-МЕТ. Инкубировали с-МЕТ в трех различных концентрациях (5, 10, 50 нг/мл) с возрастающими концентрациями анти-HER3/с-МЕТ антитела при комнатной температуре. Инкубацию осуществляли в течение 1 часа и в течение ночи. Затем из этих образцов элиминировали комплексы анти-HER3/с-МЕТ антитело - с-МЕТ, как описано в Примере 1.

Результаты приведены ниже в Таблицах «а» и «б» как выход с-МЕТ в каждом образце относительно его исходной концентрации.

Пример 7

Влияние VEGF на элиминацию

Биспецифическое анти-ANG2/VEGF антитело добавляли к 500 мкл пулированной плазмы яванского макака до достижения концентрации 100 мкг/мл. Образцы сыворотки с добавленным антителом делили на 5 аликвот по 100 мкл. В каждую аликвоту добавляли VEGF в различных концентрациях в диапазоне от 0 нг/мл до 100 нг/мл.

Образцы смешивали с покрытыми стрептавидином магнитными гранулами с присоединенным антиидиотипическим VEGF антителом M2.45.51-BI. Образцы инкубировали с гранулами в течение ночи при комнатной температуре.

После инкубации магнитные гранулы удаляли из образцов с использованием магнитного сепаратора.

Уровень анти-ANG2/VEGF антитела, оставшегося в супернатанте после применения гранул/элиминации с использованием гранул, определяли методом ИФА.

На первом этапе ИФА биотинилированный VEGF иммобилизовали на поверхности покрытых стрептавидином планшетов для микротитрования (SA-МТП). Избыток несвязанного VEGF удаляли путем отмывки. Образцы/стандарты, например, плазму яванского макака с добавлением анти-ANG2/VEGF антитела, инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. После отмывания для детекции добавляли меченное дигоксигенином моноклональное антитело R10Z8E9, распознающее константный участок СН2 домена IgG всех изотипов (обозначенное anti-human-Fcy pan), и инкубировали в течение 1 часа. После отмывания для детекции связанного меченного дигоксигенином моноклинального антитела R10Z8E9 использовали конъюгат антитела, направленного против дигоксигенина, с пероксидазой хрена (HRP). Фермент в составе конъюгата катализирует цветную реакцию в присутствии субстрата ABTS. Величину сигнала измеряли при помощи считывающего устройства при длине волны 405 нм (референтная длина волны: 490 нм). Значения оптической плотности для каждого образца сыворотки измеряли в трипликатах. Результаты показаны в следующей ниже Таблице.

Как показано в Таблице выше, элиминация биспецифического моноклонального антитела не зависит от концентрации в образце первого антигена (т.е. VEGF, как в данном Примере). Следовательно, можно сделать вывод, что концентрация второго антигена не влияет на определение концентрации свободного первого антигена (т.е. свободного ANG2, как в данном Примере).

Не ограничиваясь теорией, авторы полагают, что малая чувствительность к возможному влиянию первого антигена достигается, например, i) благодаря применению антиидиотипического антитела с более высокой аффинностью к биспецифическому антителу, по сравнению с аффинностью первого антигена к биспецифическому антителу, или ii) благодаря применению ненейтрализующего антиидиотипического антитела, которое не связывается с той же частью CDR, что и антиген.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использована для определения свободного антигена мультиспецифического антитела в образце. Способ определения in vitro наличия и/или концентрации связывающего партнера мультиспецифического связующего, в котором связывающий партнер может быть специфически связан с первой областью связывания мультиспецифического связующего, включающий этапы: инкубацию образца, содержащего связывающий партнер и мультиспецифическое связующее, с моноспецифическим связующим, которое специфически связывается со второй областью связывания мультиспецифического связующего, отличной от первой области связывания. Элиминацию из образца комплекса моноспецифическое связующее - мультиспецифическое связующее перед определением наличия или концентрации свободного связывающего партнера. И определение концентрации связывающего партнера в образце, из которого элиминировано мультиспецифическое связующее. Группа изобретений относится также к применению антиидиотипического антитела, которое специфически связывается со второй областью связывания мультиспецифического антитела в вышеуказанном способе. Использование данной группы изобретений позволяет перед определением наличия или концентрации свободного связывающего партнера элиминировать из образца связывающий партнер, который специфически связан с мультиспецифическим связующим, т.е. комплекс связывающий партнер - мультиспецифическое связующее. 3 н. и 32 з.п. ф-лы, 7 ил.

1. Способ определения in vitro наличия и/или концентрации связывающего партнера мультиспецифического связующего, в котором связывающий партнер может быть специфически связан с первой областью связывания мультиспецифического связующего, включающий этап:

- инкубации образца, содержащего связывающий партнер и мультиспецифическое связующее, с моноспецифическим связующим, которое специфически связывается со второй областью связывания мультиспецифического связующего, отличной от первой области связывания,

- элиминации из образца комплекса моноспецифическое связующее - мультиспецифическое связующее перед определением наличия или концентрации свободного связывающего партнера, и

- определения концентрации связывающего партнера в образце, из которого элиминировано мультиспецифическое связующее.

2. Способ определения in vitro наличия и/или концентрации антигена мультиспецифического антитела в образце, в котором антиген, подлежащий определению, может быть специфически связан с первой областью связывания мультиспецифического антитела, включающий этап:

- инкубации образца, содержащего мультиспецифическое антитело, связанный с мультиспецифическим антителом антиген и свободный антиген, с антиидиотипическим антителом, которое специфически связывается со второй областью связывания мультиспецифического антитела, отличной от первой области связывания,

- элиминации из образца комплекса антиидиотипическое антитело - мультиспецифическое антитело перед определением наличия или концентрации свободного антигена, и

- определения концентрации антигена в образце, из которого элиминировано мультиспецифическое антитело.

3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что в способе связывающий партнер выбран из группы, включающей антиген, мишень и аналит.

4. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что в способе связывающий партнер представляет собой не входящий в состав комплекса связывающий партнер или свободный связывающий партнер.

5. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что область связывания представляет собой сайт связывания или пару вариабельных доменов тяжелой цепи антитела и легкой цепи антитела.

6. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что мультиспецифическое связующее выбрано из антитела, химерного полипептида, содержащего антитело или фрагмент антитела и полипептид, не являющийся антителом, химерного полипептида, содержащего антитело или фрагмент антитела и растворимый рецептор, или химерного полипептида, содержащего антитело или фрагмент антитела и пептидную связывающую молекулу.

7. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что мультиспецифическое связующее представляет собой антитело.

8. Способ по п. 3, отличающийся тем, что определение наличия и/или концентрации антигена включает следующие этапы:

- инкубацию образца, из которого элиминировано мультиспецифическое антитело, со связывающим антителом, которое специфически связывается с антигеном, для образования комплекса захватывающее антитело - антиген, и

- установление зависимости между формированием комплекса захватывающее антитело - антиген и концентрацией антигена в образце.

9. Способ по п. 3, отличающийся тем, что определение концентрации антигена включает следующие этапы:

- инкубацию образца, из которого элиминировано мультиспецифическое антитело, с захватывающим антителом, которое специфически связывается с антигеном, для образования комплекса захватывающее антитело - антиген,

- инкубацию комплекса захватывающее антитело - антиген с меченым антителом, в ходе которой захватывающее антитело и меченое антитело связываются с неперекрывающимися эпитопами антигена, и

- установление зависимости между формированием комплекса захватывающее антитело - антиген - меченое антитело и концентрацией антигена в образце.

10. Способ по п. 3, отличающийся тем, что определение концентрации антигена включает следующие этапы:

- инкубацию образца, из которого элиминировано мультиспецифическое антитело, с захватывающим антителом, которое специфически связывается с антигеном, для образования комплекса захватывающее антитело - антиген,

- инкубацию комплекса захватывающее антитело - антиген с меченым антителом, в ходе которой захватывающее антитело и меченое антитело связываются с неперекрывающимися эпитопами антигена,

- инкубацию комплекса захватывающее антитело - антиген - меченое антитело с детектирущим антителом, содержащим детектируемую метку, в ходе которой детектирующее антитело специфически связывается с эпитопом меченого антитела, находящимся за пределами вариабельных доменов меченого антитела, и

- установление зависимости между формированием комплекса захватывающее антитело - антиген - меченое антитело и концентрацией антигена в образце.

11. Способ по п. 6, отличающийся тем, что антитело представляет собой биспецифическое антитело, или триспецифичское антитело, или тетраспецифическое антитело, или пентаспецифическое антитело, или гексаспецифическое антитело.

12. Способ по п. 6, отличающийся тем, что антитело представляет собой биспецифическое антитело.

13. Способ по п. 6, отличающийся тем, что антитело представляет собой биспецифическое антитело, имеющее первую область связывания, которая специфически связывается с первым антигеном или первым эпитопом антигена, а также имеющее вторую область связывания, которая специфически связывается со вторым антигеном или вторым эпитопом антигена.

14. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что моноспецифическое связующее представляет собой антиидиотипическое антитело.

15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что способ включает следующие этапы:

- инкубацию образца, содержащего мультиспецифическое антитело, связанный с мультиспецифическим антителом антиген и свободный антиген, с антиидиотипическим антителом, которое специфически связывается со второй областью связывания мультиспецифического антитела, отличной от первой области связывания, для образования комплекса антиидиотипическое антитело - мультиспецифическое антитело, и

- удаление из образца комплекса антиидиотипическое антитело - мультиспецифическое антитело.

16. Способ по п. 14, отличающийся тем, что способ включает следующие этапы:

- инкубацию образца, содержащего антиген и мультиспецифическое антитело, с антиидиотипическим антителом, которое специфически связывается со второй областью связывания мультиспецифического антитела, отличной от первой области связывания, для образования комплекса антиидиотипическое антитело - мультиспецифическое антитело,

- удаление из образца комплекса антиидиотипическое антитело - мультиспецифическое антитело и

- определение концентрации антигена в образце, из которого элиминировано мультиспецифическое антитело.

17. Способ по п. 15 или 16, отличающийся тем, что комплекс антиидиотипическое антитело - мультиспецифическое антитело представляет собой смесь комплекса антиидиотипическое антитело - мультиспецифическое антитело и комплекса антиидиотипическое антитело - мультиспецифическое антитело - антиген.

18. Способ по п. 14, отличающийся тем, что константа ассоциации k_a, характеризующая связывание антиидиотипического антитела со второй областью связывания мультиспецифического антитела, равна 10⁵ л/моль*с или более.

19. Способ по п. 14, отличающийся тем, что значение K_D, характеризующее связывание антиидиотипического антитела со второй областью связывания мультиспецифического антитела, равно 5*10^-8 моль/л или менее.

20. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что инкубация с антиидиотипическим антителом составляет от приблизительно 10 минут до приблизительно 36 часов.

21. Способ по п. 7, отличающийся тем, что концентрацию мультиспецифического антитела в образце доводят до значения приблизительно от 2 мкг/мл до приблизительно 15 мкг/мл.

22. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что общую концентрацию антигена в образце доводят до значения приблизительно от 1 нг/мл до приблизительно 250 нг/мл.

23. Способ по п. 14, отличающийся тем, что антиидиотипическое антитело связано или конъюгировано с твердой фазой.

24. Способ по п. 14, отличающийся тем, что антиидиотипическое антитело конъюгировано с использованием специфически связывающейся пары.

25. Способ по п. 24, отличающийся тем, что связывающаяся пара выбрана из стрептавидина или авидина/биотина, антитела/антигена, лектина/полисахарида, стероида/стероид-связывающего белка, гормона/рецептора гормона, фермента/субстрата, IgG/белка А и/или G.

26. Способ по п. 24 или 25, отличающийся тем, что антиидиотипическое антитело конъюгировано с биотином и иммобилизовано с использованием иммобилизованного авидина или стрептавидина.

27. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что антиидиотипическое антитело биотинилировано, а твердая фаза покрыта стрептавидином.

28. Способ по п. 14, отличающийся тем, что антиидиотипическое антитело представляет собой биотинилированное антиидиотипическое антитело, направленное против мультиспецифического связующего и конъюгированное с твердой фазой при помощи стрептавидина.

29. Способ по п. 23, отличающийся тем, что твердая фаза представляет собой покрытые стрептавидином парамагнитные гранулы или покрытые стрептавидином гранулы сефарозы.

30. Способ по п. 14, отличающийся тем, что антиидиотипическое антитело представляет собой смесь, содержащую по меньшей мере два антиидиотипических антитела, которые различаются сайтами, по которым они конъюгированы с твердой фазой.

31. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что смесь антиидиотипических антител содержит антиидиотипическое антитело, конъюгированное с твердой фазой по меньшей мере через две различные аминогруппы.

32. Способ по п. 23, отличающийся тем, что конъюгацию антиидиотипического антитела с его партнером для конъюгации осуществляют путем химического связывания по N-концевым, и/или ε-аминогруппам, и/или ε-аминогруппам различных лизинов, карбоксильным, сульфгидрильным, гидроксильным и/или фенольным функциональным группам аминокислотного скелета терапевтически активного антитела и/или спиртовым группам углеводной структуры терапевтически активного антитела.

33. Способ по п. 23, отличающийся тем, что антиидиотипическое антитело конъюгировано с твердой фазой при помощи пассивной адсобрции.

34. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что образец содержит мультиспецифическое антитело, свободный антиген и комплексы мультиспецифическое антитело - антиген, а определению подлежит свободный антиген мультиспецифического антитела.

35. Применение антиидиотипического антитела, которое специфически связывается со второй областью связывания мультиспецифического антитела, в способе по любому из пп. 1-2 для элиминации из образца антигена, связанного с первой областью связывания мультиспецифического антитела.