СПОСОБ ДЕТЕКЦИИ ПАРТНЕРА ПО СВЯЗЫВАНИЮ МУЛЬТИСПЕЦИФИЧЕСКОГО СВЯЗЫВАЮЩЕГО АГЕНТА Российский патент 2017 года по МПК G01N33/543 

Данное изобретение относится к способу детекции/определения свободного, т.е. не входящего в состав комплекса, партнера по связыванию мультиспецифического связывающего агента, который может специфически связываться с мультиспецифическим связывающим агентом в образце, при этом перед детекцией свободного партнера по связыванию из образца элиминируют партнер по связыванию, связанный с мультиспецифическим связывающим агентом. Подвергшийся элиминации мультиспецифический связывающий агент может использоваться для детекции/определения партнера по связыванию, входящего в состав комплекса.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Стандартный твердофазный иммуноферментный анализ с использованием антител включает образование комплекса между антителом, адсорбированным/иммобилизованным на твердой фазе (захватывающее антитело), антигеном и антителом, распознающим другой эпитоп антигена, конъюгированным с ферментом или детектируемой меткой (меченое антитело). В анализе происходит образование «сэндвича»: твердая фаза/захватывающее антитело/антиген/меченое антитело. В реакции, катализируемой в анализе сэндвич-типа, активность фермента, конъюгированного с антителом, пропорциональна концентрации антигена в инкубационной среде. Исследования с использованием антиидиотипических антител упоминаются, например, в патентах US 5,219,730; WO 87/002778; ЕР 0139389 и ЕР 0170302. Wadhwa, Μ., et al. (J. Immunol. Methods 278 (2003) 1-17) предложили способ детекции, измерения и характеризации нежелательных антител, образование которых вызывают терапевтически активные биопрепараты. Способ получения антиидиотипических антител описан в ЕР 1917854.

Chen, Y.-P., et al. (Clin. Vac. Immunol. 14 (2007) 720-725) предложили способ быстрой детекции поверхностного антигена вируса гепатита В методом агглютинации, опосредованной биспецифическим диателом, направленным против человеческих эритроцитов и поверхностного антигена вируса гепатита В. Porter, R., et al. предложили электроактивную систему для иммунологического анализа (EASI assay, от англ. electro-active system of immuno-assay), в котором применяются электроды с самособирающимся монослоем (Biosensors Bioelec. 16 (2001) 9-12). Иммуноферментный анализ для определения человеческого фактора некроза опухоли-альфа (hTNF-alpha) с применением биспецифических антител к hTNF-alpha и пероксидазе хрена разработан Berkova, Ν., et al. (Biotechnol. Appl. Biochem. 23 (1996) 163-171). EP 0 962 771 описывает детектирующее устройство и способ его работы. Reinhartz, H.W., et al. (Analyst 121 (1996) 767-771) предложили биспецифическое мультивалентное антитело, охарактеризованное методом изучения непосредственного взаимодействия биомолекул в режиме реального времени, для проведения непрямого конкурентного (ингибиторного) иммуноферментного анализа. Получение биспецифических антител химическим методом описано Doppalapudi, V.R., et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (2010) 22611-22616).

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данной заявке предложен способ детекции наличия или определения концентрации свободного, т.е. не входящего в состав комплекса партнера по связыванию в образце, где партнер по связыванию может быть специфически связан по меньшей мере с одной связывающей детерминантой мультиспецифического связывающего агента, т.е. с первой связывающей детерминантой.

Было обнаружено, что перед определением концентрации свободного партнера по связыванию предпочтительно элиминировать из образца партнер по связыванию, который специфически связан с мультиспецифическим связывающим агентом, т.е. комплекс партнер по связыванию-мультиспецифический связывающий агент.

Согласно способам, предложенным в данной заявке, элиминация мультиспецифического связывающего агента осуществляется путем инкубации образца либо с партнером по связыванию, т.е. со вторым партнером по связыванию, который может быть специфически связан с другой, т.е. со второй связывающей детерминантой мультиспецифического связывающего агента, которая не связывается с партнером по связыванию, подлежащим определению, т.е. с первым партнером по связыванию, либо с моноспецифическим связывающим агентом, который специфически связывается с одной связывающей детерминантой мультиспецифического связывающего агента, при этом моноспецифический связывающий агент специфически связывается со связывающей детерминантой мультиспецифического связывающего агента, которая не связывается с партнером по связыванию, подлежащим определению (см. Фиг. 2).

Один аспект данного описания относится к способу определения in vitro наличия и/или концентрации (первого) антигена биспецифического антитела в образце, где антиген, подлежащий определению, может быть специфически связан с первой связывающей детерминантой биспецифического антитела и причем антиген находится в комплексе с биспецифическим антителом (комплекс антиген-биспецифическое антитело), включающему этап:

- инкубации образца, содержащего антиген и биспецифическое антитело, с антиидиотипическим антителом, которое специфически связывается со второй связывающей детерминантой биспецифического антитела, отличной от первой связывающей детерминанты, при этом антиидиотипическое антитело связано с твердой фазой.

В одном воплощении способ включает этапы:

- инкубации образца, содержащего антиген и биспецифическое антитело, с антиидиотипическим антителом, которое специфически связывается со второй связывающей детерминантой биспецифического антитела, отличной от первой связывающей детерминанты, при этом антиидиотипическое антитело связано с твердой фазой, и

- детекции комплекса антиген-биспецифическое антитело-антиидиотипическое антитело и таким образом, определения наличия и/или концентрации антигена биспецифического антитела.

В одном воплощении способ включает этапы:

- инкубации образца, содержащего антиген и биспецифическое антитело, с антиидиотипическим антителом, которое специфически связывается со второй связывающей детерминантой биспецифического антитела, отличной от первой связывающей детерминанты, при этом антиидиотипическое антитело связано с твердой фазой, и

- инкубации комплекса, образованного на первом этапе, с антителом, которое специфически связывается с эпитопом антигена, отличным от эпитопа, связанного с биспецифическим антителом, и таким образом определения наличия и/или концентрации антигена биспецифического антитела в образце.

В одном воплощении способ предназначен для определения наличия и/или концентрации антигена биспецифического антитела, находящегося в комплексе с биспецифическим антителом.

В одном воплощении способ включает следующие этапы:

- получение образца, содержащего антиген и биспецифическое антитело, где по меньшей мере 90% антигена находится в комплексе с биспецифичским антителом,

- инкубацию образца, содержащего антиген и биспецифическое антитело, с антиидиотипическим антителом, которое специфически связывается со второй связывающей детерминантой биспецифического антитела, отличной от первой связывающей детерминанты, при этом антиидиотипическое антитело связано с твердой фазой, и

- инкубацию комплекса, образованного на первом этапе, с антителом, которое специфически связывается с эпитопом антигена, отличным от эпитопа, связанного с биспецифическим антителом, и таким образом определения наличия и/или концентрации антигена биспецифического антитела в образце.

В одном воплощении способ включает следующие этапы:

- инкубацию образца, содержащего антиген и биспецифическое антитело, с таким количеством биспецифического антитела, чтобы в образце по меньшей мере 90% антигена находилось в составе комплекса с биспецифическим антителом,

- инкубацию образца, содержащего антиген, находящийся в комплексе с биспецифическим антителом, с антиидиотипическим антителом, которое специфически связывается со второй связывающей детерминантой биспецифического антитела, отличной от первой связывающей детерминанты, при этом антиидиотипическое антитело связано с твердой фазой, и

- инкубацию комплекса, образованного на предыдущем этапе, с антителом, которое специфически связывается с эпитопом антигена, отличным от эпитопа, связанного с биспецифическим антителом и таким образом определения наличия и/или концентрации антигена биспецифического антитела в образце.

В одном воплощении концентрация биспецифического антитела составляет приблизительно от 1 мкг/мл до 10 мкг/мл, предпочтительно приблизительно 1,5 мкг/мл.

В одном воплощении коцентрация биспецифического антитела составляет 1 мг/мл образца.

В одном воплощении по меньшей мере 95% антигена находится в комплексе с биспецифическим антителом. В одном воплощении по меньшей мере 98% антигена находится в комплексе с биспецифическим антителом.

Один аспект данного описания представляет собой способ определения in vitro концентрации связанного с антителом (первого) антигена биспецифического антитела в образце, причем антиген может быть специфически связан с первой связывающей детерминантой биспецифического антитела, включающий этапы:

- инкубации первой аликвоты образца, содержащего антиген и биспецифическое антитело, с таким количеством биспецифического антитела, чтобы в образце по меньшей мере 90% антигена находилось в комплексе с биспецифическим антителом,

- инкубации образца, содержащего антиген, находящийся в комплексе с биспецифическим антителом, с антиидиотипическим антителом, которое специфически связывается со второй связывающей детерминантой биспецифического антитела, отличной от первой связывающей детерминанты, при этом антиидиотипическое антитело связано с твердой фазой, и

- инкубации комплекса, образованного на предыдущем этапе, с антителом, которое специфически связывается с эпитопом антигена, отличным от эпитопа, связанного с биспецифическим антителом, и таким образом определения наличия и/или концентрации антигена биспецифического антитела в образце и таким образом определения общей концентрации антигена, присутствующего в образце,

- инкубации второй аликвоты образца, содержащего антиген и биспецифическое антитело, с антиидиотипическим антителом, которое специфически связывается со второй связывающей детерминантой биспецифического антитела, отличной от первой связывающей детерминанты, при этом антиидиотипическое антитело связано с твердой фазой, и

- инкубации образованного комплекса с антителом, которое специфически связывается с эпитопом антигена, отличным от эпитопа, связанного с биспецифическим антителом, и таким образом определения концентрации свободного антигена биспецифического антитела, присутствующего в образце, и

- определения концентрации связанного с антителом антигена биспецифического антитела по разнице между общей концентрацией антигена, присутствующего в образце, и концентрацией свободного антигена, присутствующего в образце.

В одном воплощении концентрация биспецифического антитела составляет приблизительно от 1 мкг/мл до 10 мкг/мл, предпочтительно приблизительно 1,5 мкг/мл.

В одном воплощении концентрация биспецифического антитела составляет 1 мг/мл образца.

Один аспект данного описания представляет собой способ определения in vitro наличия и/или концентрации партнера по связыванию (антигена, мишени, аналита), который может быть специфически связан с первой связывающей детерминантой мультиспецифического связывающего агента, причем фракцию партнера по связыванию, связанного с мультиспецифическим связывающим агентом, присутствующую в образце, элиминируют перед определением партнера по связыванию путем инкубации образца со вторым партнером по связыванию, который может специфически связываться со второй связывающей детерминантой мультиспецифического связывающего агента, или с моноспецифическим связывающим агентом, специфически связывающимся со второй связывающей детерминантой мультиспецифического связывающего агента.

В одном воплощении партнер по связыванию, подлежащий определению, является партнером по связыванию, не входящим в состав комплекса, или свободным партнером по связыванию.

Таким образом, один аспект данного описания представляет собой способ определения in vitro наличия и/или концентрации (первого) партнера по связыванию мультиспецифического связывающего агента, причем партнер по связыванию может быть специфически связан с первой связывающей детерминантой мультиспецифического связывающего агента, включающий этап:

- инкубации образца, содержащего (первый) партнер по связыванию и мультиспецифический связывающий агент, со вторым партнером по связыванию, который может быть специфически связан со второй связывающей детерминантой мультиспецифического связывающего агента, отличной от первой связывающей детерминанты.

В одном воплощении способ включает этапы:

- инкубации образца, содержащего (первый) партнер по связыванию и мультиспецифический связывающий агент, с моноспецифическим связывающим агентом, который специфически связывается со второй связывающей детерминантой мультиспецифического связывающего агента, отличной от первой связывающей детерминанты, и

- определения концентрации (свободного первого) партнера по связыванию в образце, из которого элиминирован мультиспецифический связывающий агент.

В одном воплощении способ включает этапы:

- инкубации образца, содержащего (первый) партнер по связыванию и мультиспецифический связывающий агент, с моноспецифическим связывающим агентом, который специфически связывается со второй связывающей детерминантой мультиспецифического связывающего агента, отличной от первой связывающей детерминанты,

- элиминации из образца комплекса моноспецифический связывающий агент-мультиспецифический связывающий агент перед определением наличия или концентрации свободного партнера по связыванию, и

- определения концентрации (свободного первого) партнера по связыванию в образце, из которого элиминирован мультиспецифический связывающий агент.

При инкубации со вторым партнером по связыванию, который может специфически связываться со второй связывающей детерминантой мультиспецифического связывающего агента, из образца элиминируют мультиспецифический связывающий агент. Одновременно из образца также удаляют комплексы (первый) партнер по связыванию-мультиспецифический связывающий агент.

В одном воплощении мультиспецифический связывающий агент выбран из антитела, химерного полипептида, содержащего антитело или фрагмент антитела и полипептид, не являющийся антителом, химерного полипептида, содержащего антитело или фрагмент антитела и растворимый рецептор, или химерного полипептида, содержащего антитело или фрагмент антитела и пептидную связывающую молекулу.

В одном воплощении мультиспецифический связывающий агент представляет собой антитело. В одном воплощении антитело представляет собой биспецифическое антитело или триспецифическое антитело, или тетраспецифическое антитело, или пентаспецифическое антитело, или гексаспецифическое антитело. В одном воплощении антитело представляет собой биспецифическое антитело.

В одном воплощении моноспецифический связывающий агент представляет собой антиидиотипическое антитело.

В одном воплощении связывающая детерминанта представляет собой сайт связывания или пару вариабельных доменов тяжелой цепи антитела и легкой цепи антитела.

В одном воплощении второй партнер по связыванию или моноспецифический связывающий агент связан с твердой фазой.

В одном воплощении второй партнер по связыванию биотинилирован, а поверхность твердой фазы покрыта стрептавидином. В одном воплощении твердая фаза представляет собой покрытые стрептавидином парамагнитные частицы или покрытые стрептавидином гранулы сефарозы.

Один аспект данного описания представляет собой способ иммунологического определения наличия и/или концентрации партнера по связыванию мультиспецифического связывающего агента в образце с помощью иммунологического анализа, в котором мультиспецифический связывающий агент элиминирован из образца перед определением партнера по связыванию.

В одном воплощении всех аспектов данного описания партнер по связыванию представляет собой свободный партнер по связыванию, т.е. партнер по связыванию, который не связан или не находится в комплексе с мультиспецифическим связывающим агентом.

В одном воплощении второй партнер по связыванию представляет собой биотинилированный второй партнер по связыванию и конъюгирован с твердой фазой при помощи стрептавидина.

В одном воплощении способов данного описания второй партнер по связыванию представляет собой смесь, содержащую по меньшей мере два вторых партнера по связыванию, у которых различаются сайты, по которым они конъюгированы с твердой фазой. В одном воплощении сайт представляет собой аминокислотную позицию в аминокислотной последовательности второго партнера по связыванию.

В одном воплощении первый партнер по связыванию представляет собой полипептид.

В одном воплощении второй партнер по связыванию представляет собой полипептид.

В одном воплощении конъюгацию полипептида с его партнером по конъюгации осуществляют путем химического связывания по N-концевым и/или ε-аминогруппам (лизина), ε-аминогруппам различных лизинов, карбоксильным, сульфгидрильным, гидроксильным и/или фенольным функциональным группам аминокислотного скелета полипептида и/или спиртовым группам углеводных компонентов полипептида.

В одном воплощении второй партнер по связыванию представляет собой смесь, содержащую второй партнер по связыванию, конъюгированный с твердой фазой по меньшей мере через две различные аминогруппы. Такое присоединение через различные аминогруппы может осуществляться путем ацилирования на первом этапе части ε-аминогрупп при помощи химических защитных агентов, например, путем введения цитраконильных групп. На втором этапе конъюгирование осуществляется через оставшиеся аминогруппы. Впоследствии цитраконильные группы удаляют, а партнер по связыванию конъюгируют с твердой фазой через оставшиеся свободные аминогруппы, т.е. полученный партнер по связыванию конъюгируют с твердой фазой через аминогруппы, которые не были защищены цитраконильными группами. Подходящие химические защитные агенты образуют связи с незащищенными аминогруппами боковых цепей, которые являются менее стабильными и отличаются связей, образующихся на N-конце. Известно множество химических защитных агентов (см., например, ЕР 0651761). В одном воплощении химические защитные агенты включают циклические ангидриды дикарбоновых кислот, такие как ангидрид малеиновой или цитраконовой кислот.

В одном воплощении второй партнер по связыванию конъюгируют с твердой фазой при помощи пассивной адсорбции. Пассивная адсорбция описана, например Butler, J.Ε., "Solid Phases in Immunoassay" (1996) 205-225 и Diamandis, E.P., and Christopoulos, Т.К. (Editors), "Immunoassay" (1996) Academic Press (San Diego).

В одном воплощении второй партнер по связыванию конъюгирован (иммобилизован) при помощи специфически связывающейся пары. В одном воплощении такая связывающаяся пара (первый компонент/второй компонент) выбрана из стрептавидина или авидина/биотина, антитела/антигена (см., например, Hermanson, G.T., et al., Bioconjugate Techniques, Academic Press (1996)), лектина/полисахарида, стероида/стероид-связывающего белка, гормона/рецептора гормона, фермента/субстрата, IgG/белка А и/или G и т.д. В одном воплощении второй партнер по связыванию конъюгирован с биотином, а иммобилизация осуществляется через иммобилизованный авидин или стрептавидин.

Один аспект данного описания представляет собой способ определения in vitro наличия и/или концентрации (первого) антигена мультиспецифического антитела в образце, в котором антиген, подлежащий определению, может быть специфически связан с первой связывающей детерминантой мультиспецифического антитела, включающий этап:

- инкубации образца, содержащего мультиспецифическое антитело, (первый) антиген, связанный с мультиспецифическим антителом, и свободный (первый) антиген, со вторым антигеном, который может быть специфически связан со второй связывающей детерминантой мультиспецифического антитела, отличной от первой связывающей детерминанты.

В одном воплощении способ включает этапы:

- инкубации образца, содержащего мультиспецифическое антитело, (первый) антиген, связанный с мультиспецифическим антителом, и свободный (первый) антиген, со вторым антигеном, который может быть специфически связан со второй связывающей детерминантой мультиспецифического антитела, отличной от первой связывающей детерминанты, и

- определения концентрации (первого) антигена в образце, из которого элиминировано мультиспецифическое антитело.

В одном воплощении способ включает этапы:

- инкубации образца, содержащего (первый) антиген и мультиспецифическое антитело, со вторым антигеном, который может быть специфически связан со второй связывающей детерминантой мультиспецифического антитела, отличной от первой связывающей детерминанты,

- элиминации комплекса второй антиген-мультиспецифическое антитело из образца перед определением наличия или концентрации свободного антигена, и

- определения концентрации (первого) антигена в образце, из которого элиминировано мультиспецифическое антитело.

При инкубации со вторым антигеном, который может быть специфически связан со второй связывающей детерминантой мультиспецифического антитела, мультиспецифическое антитело удаляют из образца. Одновременно из образца также удаляют комплексы (первый) антиген-мультиспецифическое антитело.

В одном воплощении образец содержит мультиспецифическое антитело, свободный (первый) антиген и комплексы мультиспецифическое антитело-антиген, и осуществляют детекцию свободного (первого) антигена мультиспецифического антитела.

В одном воплощении второй антиген конъюгирован с парамагнитной частицей.

В одном воплощении второй антиген конъюгирован с твердой фазой.

В одном воплощении второй антиген биотинилирован, а поверхность твердой фазы покрыта стрептавидином. В одном воплощении твердая фаза представляет собой покрытые стрептавдином парамагнитные частицы или покрытые стрептавидином гранулы сефарозы.

В одном воплощении связывающая детерминанта представляет собой сайт связывания. В одном воплощении сайт связывания представляет собой пару вариабельных доменов тяжелой цепи антитела и легкой цепи антитела.

В одном воплощении способ включает следующие этапы:

- инкубацию образца, содержащего мультиспецифическое антитело, связанный с мультиспецифическим антителом (первый) антиген и свободный (первый) антиген, со вторым антигеном, который может быть специфически связан со второй связывающей детерминантой мультиспецифического антитела, отличной от первой связывающей детерминанты, для образования комплекса второй антиген-мультиспецифическое антитело, и

- удаление из образца комплекса второй антиген-мультиспецифическое антитело.

В одном воплощении комплекс второй антиген-мультиспецифическое антитело представляет собой смесь комплекса второй антиген-мультиспецифическое антитело и комплекса второй антиген-мультиспецифическое антитело-(первый) антиген.

В одном воплощении способ включает следующие этапы:

- инкубацию образца, содержащего (первый) антиген и мультиспецифическое антитело, со вторым антигеном, который может быть специфически связан со второй связывающей детерминантой мультиспецифического антитела, отличной от первой связывающей детерминанты, для образования комплекса второй антиген-мультиспецифическое антитело,

- удаление из образца комплекса второй антиген-мультиспецифическое антитело, и

- определение концентрации (первого) антигена в образце, из которого элиминировано мультиспецифическое-антитело.

В одном воплощении определение концентрации (первого) антигена включает следующие этапы:

- инкубацию образца, из которого элиминировано мультиспецифическое антитело, с захватывающим антителом, которое специфически связывается с (первым) антигеном, для образования комплекса захватывающее антитело-(первый) антиген, и

- установление зависимости между образованием комплекса захватывающее антитело-(первый) антиген и концентрацией в образце (первого) антигена.

В одном воплощении определение концентрации (первого) антигена включает следующие этапы:

- инкубацию образца, из которого элиминировано мультиспецифическое антитело, с захватывающим антителом, которое специфически связывается с (первым) антигеном, для образования комплекса захватывающее антитело-(первый) антиген,

- инкубацию комплекса захватывающее антитело-(первый) антиген с меченым антителом, где захватывающее антитело и меченое антитело связываются с неперекрывающимися эпитопами (первого) антигена, и

- установление зависимости между образованием комплекса захватывающее антитело-(первый) антиген-меченое антитело и концентрацией в образце антигена.

В одном воплощении определение концентрации (первого) антигена включает следующие этапы:

- инкубацию образца, из которого элиминировано мультиспецифическое антитело, с захватывающим антителом, которое специфически связывается с (первым) антигеном, для образования комплекса захватывающее антитело-(первый) антиген,

- инкубацию комплекса захватывающее антитело-(первый) антиген с меченым антителом, при которой захватывающее антитело и меченое антитело связываются с неперекрывающимися эпитопами (первого) антигена,

- инкубацию комплекса захватывающее антитело-(первый) антиген-меченое антитело с детектирующим антителом, содержащим детектируемую метку, где детектирующее антитело специфически связывается с эпитопом меченого антитела, находящимся за пределами вариабельных доменов меченого антитела, и

- установление зависимости между образованием комплекса захватывающее антитело-(первый) антиген-меченое антитело и концентрацией в образце (первого) антигена.

В одном воплощении мультиспецифическое антитело представляет собой биспецифическое антитело, которое имеет первую связывающую детерминанту, которая специфически связывается с первым антигеном или первым эпитопом антигена, и которое имеет вторую связывающую детерминанту, которая специфически связывается со вторым антигеном или вторым эпитопом антигена.

В одном воплощении первый антиген и второй антиген представляют собой один и тот же антиген, и первая связывающая детерминанта связывается с первым эпитопом антигена, а вторая связывающая детерминанта связывается со вторым эпитопом антигена, причем второй эпитоп представляет собой эпитоп, не перекрывающийся с первым эпитопом, а связывание первой связывающей детерминанты не препятствует связыванию второй связывающей детерминанты.

В одном воплощении способ включает этап:

- элиминации из образца образованного комплекса перед определением наличия или концентрации (первого) антигена.

Один аспект данного описания представляет собой способ определения in vitro наличия и/или концентрации (первого) антигена мультиспецифического антитела в образце, где антиген, подлежащий определению, может быть специфически связан с первой связывающей детерминантой мультиспецифического антитела, включающий этап:

- инкубации образца, содержащего (первый) антиген, с комплексом биспецифического антитела и второго антигена или с комплексом биспецифического антитела и антиидиотипического антитела, которое специфически связывается со второй связывающей детерминантой биспецифического антитела, отличной от первой связывающей детерминанты.

В одном воплощении второй антиген представляет собой меченый второй антиген. В одном воплощении второй антиген иммобилизован на твердой фазе при помощи специфически связывающейся пары. В одном воплощении специфически связывающаяся пара представляет собой биотин и стрептавидин.

В одном воплощении способ включает в качестве второго этапа:

- инкубацию комплекса, образованного на первом этапе, с антителом, которое специфически связывается с эпитопом первого антигена, отличным от эпитопа, связанного с биспецифическим антителом.

Один аспект данного описания представляет собой способ определения in vitro наличия и/или концентрации (первого) антигена биспецифического антитела в образце, в котором антиген, подлежащий определению, может быть специфически связан с первой связывающей детерминантой биспецифического антитела, включающий этап:

- инкубации образца, содержащего (первый) антиген, с биспецифическим антителом и вторым антигеном или с биспецифическим антителом и антиидиотипическим антителом, которое специфически связывается со второй связывающей детерминантой биспецифического антитела, отличной от первой связывающей детерминанты, где второй антиген или антиидиотипическое антитело связаны с твердой фазой.

В одном воплощении способ включает в качестве второго этапа:

- инкубацию комплекса, образованного на первом этапе, с антителом, которое специфически связывается с эпитопом первого антигена, отличным от эпитопа, связанного с биспецифическим антителом, и таким образом определения в образце концентрации (первого) антигена биспецифического антитела.

Один аспект данного описания представляет собой способ определения in vitro наличия и/или концентрации (первого) антигена биспецифического антитела в образце, находящегося в комплексе с биспецифическим антителом (комплекс первый антиген-биспецифическое антитело), где антиген, подлежащий определению, может быть специфически связан с первой связывающей детерминантой биспецифического антитела, включающий этап:

- инкубации образца, содержащего (первый) антиген и биспецифическое антитело, с антиидиотипическим антителом, которое специфически связывается со второй связывающей детерминантой биспецифического антитела, отличной от первой связывающей детерминанты, где антиидиотипическое антитело связано с твердой фазой.

В одном воплощении способ включает в качестве второго этапа:

- инкубацию комплекса, образованного на первом этапе, с антителом, которое специфически связывается с эпитопом первого антигена, отличным от эпитопа, связанного с биспецифическим антителом, и таким образом определения в образце концентрации (первого) антигена биспецифического антитела, находящегося в комплексе с биспецифическим антителом (комплекс первый антиген-биспецифическое антитело).

В одном воплощении способ включает этап:

- элиминации образованного комплекса из образца перед определением наличия или концентрации (первого) антигена.

СВЕДЕНИЯ, ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данном документе описан способ предварительной обработки образца in vitro для детекции "свободного и/или общего партнера по связыванию" мультиспецифических связывающих агентов, таких как биспецифические антитела/лекарственные средства, в образцах для доклинических и клинических исследований.

Было обнаружено, что перед детекцией свободного партнера по связыванию предпочтительно осуществлять элиминацию из образца мультиспецифического связывающего агента.

Было обнаружено, что для перевода общего партнера по связыванию, присутствующего в образце, в соответствующий комплекс предпочтительно инкубировать образец с мультиспецифическим связывающим агентом.

Было обнаружено, что предпочтительно осуществлять захват мультиспецифического связывающего агента с помощью антиидиотипического антитела.

В данном документе описано применение второго партнера по связыванию, который может специфически связываться со второй связывающей детерминантой терапевтически активного мультиспецифического антитела при определении уровня (свободного первого) антигена, который может быть но не является связанным с первой связывающей детерминантой терапевтически активного мультиспецифического антитела. Второй антиген применяют для элиминации из образца мультиспецифического антитела и комплексов мультиспецифическое антитело-антиген, подлежащий определению.

Таким образом, в данном документе описан способ детекции in vitro свободного (первого) партнера по связыванию (антигена, мишени, аналита) мультиспецифического связывающего агента, который может быть специфически связан с первой связывающей детерминантой мультиспецифического связывающего агента, где мультиспецифический связывающий агент элиминирован из образца перед определением свободного партнера по связыванию путем инкубации образца со вторым партнером по связыванию, который может быть специфически связан со второй связывающей детерминантой мультиспецифического связывающего агента, отличной от первой связывающей детерминанты, и таким образом элиминации из образца мультиспецифического связывающего агента и комплексов мультиспецифический связывающий агент-(первый) партнер по связыванию.

Ниже способ по данному описанию проиллюстрирован на примере мультиспецифического антитела, специфически связывающегося с множеством антигенов или эпитопов того же антигена, как воплощения мультиспецифического связывающего агента и (первого) антигена, который может быть специфически связан с первой связывающей детерминантой мультиспецифического антитела, как воплощения (первого) партнера по связыванию.

Термин "антитело" здесь используется в широком смысле и охватывает антитела с различной структурой, включая моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител, при условии, что они проявляют желаемую антигенсвязывающую активность, но не ограничивается ими.

В некоторых воплощениях антитело представляет собой мультиспецифическое антитело, например, биспецифическое антитело. Мультиспецифические антитела представляют собой моноклональные антитела, имеющие связывающие детерминанты по меньшей мере для двух различных сайтов. В некоторых воплощениях одна из связывающих детерминант предназначена для первого антигена, а другая - для отличающегося второго антигена. В некоторых воплощениях биспецифические антитела могут связывать два различных эпитопа одного и того же антигена. Биспецифические антитела могут быть созданы в виде полноразмерных антител или фрагментов антител. В одном воплощении антитело представляет собой биспецифическое антитело, которое специфически связывается с первым и вторым антигеном. В одном воплощении биспецифическое антитело имеет i) первую связывающую детерминанту, которая специфически связывается с первым антигеном или первым эпитопом антигена, и ii) вторую связывающую детерминанту, которая специфически связывается со вторым антигеном или вторым эпитопом того же самого антигена. В одном воплощении второй эпитоп того же самого антигена представляет собой неперекрывающийся эпитоп.

Мультиспецифические антитела описаны в WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254, WO 2010/112193, WO 2010/115589, WO 2010/136172, WO 2010/145792 или WO 2010/145793.

Фрагмент антитела" обозначает молекулу, отличную от интактного антитела, содержащую часть интактного антитела, которая связывается с антигеном, связывающимся с интактным антителом. Примеры фрагментов антител включают Fv, Fab, Fabʹ, Fabʹ-SH, F(abʹ)₂, диатела, линейные антитела, молекулы одноцепочечных антител (например, scFv) и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител, но не ограничиваются ими.

"Класс" антитела обозначает тип константного домена или константного участка его тяжелой цепи. Существует пять основных классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них можно подразделить на подклассы (изотипы), например, IgG₁, lgG₂, lgG₃, lgG₄, IgA₁ и IgA₂. Константные домены тяжелых цепей, соответствующие различным классам иммуноглобулинов, обозначаются α, δ, ε, γ и μ, соответственно.

Термин "свободный антиген" обозначает антиген, который может быть специфически связан со связывающей детерминантой антитела, но в данный момент не связан с данной связывающей детерминантой. В одном воплощении свободный антиген представляет собой антиген, не связанный с антителом, или антиген, не находящийся в комплексе с антителом.

Термин "Fc-фрагмент" здесь используется для обозначения С-концевого участка тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащего по меньшей мере часть константного участка. Термин включает Fc-фрагменты с нативной последовательностью и варианты Fc-фрагментов. В одном воплощении Fc-фрагмент тяжелой цепи IgG человека простирается от Cys226 или от Pro230 до карбокси-конца тяжелой цепи. При этом, С-концевой лизин (Lys447) Fc фрагмента может присутствовать или отсутствовать. Если не указано иначе, нумерация аминокислотных остатков Fc-фрагмента или константного участка соответствует системе нумерации EU, также носящей название «EU index», согласно описанию Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242.

"Каркасные участки" или "FR" обозначают остатки вариабельного домена, отличные от остатков гипервариабельного участка (HVR). FR вариабельного домена, как правило, состоит из 4 FR доменов: FR1, FR2, FR3 и FR4. Соответственно, последовательности HVR и FR в составе VH (или VL), как правило, располагаются в следующей последовательности: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

"Человеческое антитело" представляет собой антитело, аминокислотная последовательность которого соответствует последовательности антитела, продуцируемого в организме или в клетках человека или полученного из источника, не относящегося к человеку, но задействующего репертуар антител человека или иные последовательности, кодирующие антитела человека. Данное определение человеческого антитела, в частности, исключает гуманизированные антитела, содержащие антиген-связывающие остатки, не являющиеся человеческими.

"Гуманизированное" антитело обозначает химерное антитело, содержащее аминокислотные остатки гипервариабельных участков, не являющиеся человеческими, и аминокислотные остатки каркасных участков человека. В определенных воплощениях гуманизированное антитело содержит по существу все из по меньшей мере одного, а обычно двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все гипервариабельные участки (например, CDR) соответствуют участкам антитела, не являющегося человеческим, и все или по существу все каркасные участки соответствуют участкам человеческого антитела. Гуманизированное антитело может содержать по меньшей мере часть константного участка антитела, полученного из человеческого антитела. "Гуманизированная форма" антитела, например, антитела не являющегося человеческим, обозначает антитело, прошедшее гуманизацию.

Термин "гипервариабельный участок" или "HVR" в данном документе обозначает каждый из участков вариабельного домена антитела, имеющих гипервариабельную последовательность и/или формирующих петли определенной структуры ("гипервариабельные петли"). Как правило, нативные состоящие из четырех цепей антитела имеют 6 HVR; три в VH (Н1, Н2, Н3) и три в VL (L1, L2, L3). Как правило, HVR содержат аминокислотные остатки гипервариабельных петель и/или "участков, определяющих комплементарность" (CDR), последние характеризуются наибольшей вариабельностью последовательности и/или задействованы в распознавании антигена. Приведенные в качестве примера гипервариабельные петли находятся между аминокислотными остатками 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (Н1), 53-55 (Н2) и 96-101 (Н3) (Chothia, С.and Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917). Приведенные в качестве примера CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3) находятся между аминокислотными остатками 24-34 в L1, 50-56 в L2, 89-97 в L3, 31-35 В в Н1, 50-65 в Н2 и 95-102 в НЗ (Kabat, Е.А. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242). Как правило, CDR содержат аминокислотные остатки, образующие гипервариабельные петли, за исключением CDR1 в составе VH. CDR также включают "остатки, определяющие специфичность", или "SDR," которые представляют собой остатки, контактирующие с антигеном. SDR находятся в составе участков CDR, обозначаемых «укороченными CDR», или a-CDR (от англ. abbreviated-CDRs). Приведенные в качестве примера a-CDR (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 и a-CDR-H3) образованы аминокислотными остатками в положениях 31-34 в L1, 50-55 в 12, 89-96 в L3, 31-35 В в Н1, 50-58 в Н2 и 95-102 в Н3 (Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633). Если не указано иначе, гипервариабельные остатки и иные остатки вариабельного домена (например, остатки FR) в данном документе пронумерованы в соответствии с Kabat et а1.,см. выше.

Термин "моноклональное антитело" в данном документе используется для обозначения антитела, полученного из популяции по существу гомогенных антител, т.е. отдельные антитела, составляющие популяцию, идентичны и/или связываются с одним и тем же эпитопом, за исключением возможных вариантов антител, например, содержащих мутации, возникающие естественным путем или в ходе получения препарата моноклонального антитела, при этом подобные варианты, как правило, присутствуют в минорном количестве. В противоположность препаратам поликлональных антител, обычно содержащим различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело в препарате моноклональных антител направлено против единственной детерминанты антигена. Таким образом, определение "моноклональное" указывает на характер антитела, полученного из по существу гомогенной популяции антител, и не должно рассматриваться как необходимость получения антитела определенным способом. Например, моноклональные антитела, предназначенные для применения согласно настоящему изобретению, могут быть произведены с помощью различных технологий, включая гибридомную технологию, технологию рекомбинантной ДНК, технологию фагового дисплея и технологии с использованием трансгенных животных, имеющих все локусы человеческих иммуноглобулинов или их часть, но не ограничиваясь ими; данные способы и другие приведенные в качестве примера способы производства моноклональных антител описаны в данном документе.

"Полипептид" представляет собой полимер, состоящий из аминокислот, соединенных пептидными связями, полученный естественным способом или синтезированный искусственным путем. Полипептиды, состоящие менее чем приблизительно из 20 аминокислотных остатков, могут обозначаться "пептидами", тогда как молекулы, состоящие из двух или более полипептидов, или содержащие один полипептид, состоящий более чем из 100 аминокислотных остатков, могут обозначаться "белками". В состав полипептида также могут входить компоненты, не относящиеся к аминокислотам, такие как углеводные группы, ионы металлов или сложные эфиры карбоновых кислот.Компоненты, не относящиеся к аминокислотам, могут быть добавлены клеткой, в которой экспрессируется полипептид, и могут варьироваться в зависимости от типа клетки. В данном документе полипептиды описаны последовательностью своего аминокислотного каркаса или кодирующей ее нуклеиновой кислоты. Добавление, например, углеводных групп, как правило, не указывается отдельно, но тем не менее, может иметь место.

Термин "вариабельный участок" или "вариабельный домен" обозначает домен легкой или тяжелой цепи антитела, задействованный в связывании антитела с антигеном. Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи (VH и VL, соответственно) нативного антитела, как правило, имеют одинаковую структуру, при этом каждый домен содержит четыре консервативных каркасных участка (FR) и три гипервариабельных участка (HVR) (см., например, Kindt, T.J. et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), page 91). Единственного VH или VL домена может быть достаточно для обеспечения специфичности связывания антигена. Более того, антитела, связывающие конкретный антиген, могут быть выделены при помощи VH или VL домена антитела, связывающего этот же антиген, при скрининге библиотеки на комплементарные VL или VH домены, соответственно. См., например, Portolano, S. et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628).

Термин "антиидиотипическое антитело" обозначает антитело, которое специфически связывается со связывающей детерминантой, такой как сайт связывания родительского антитела, т.е. направленное, например, против антигенсвязывающего сайта родительского антитела. В одном воплощении антиидиотипическое антитело специфически связывается с одним или несколькими CDR родительского антитела. В одном воплощении родительское антитело представляет собой терапевтически активное антитело. В одном воплощении родительское антитело представляет собой мультиспецифическое антитело. В одном воплощении родительское антитело представляет собой биспецифическое антитело.

Два эпитопа являются перекрывающимися, если при использовании иммобилизованного анитела и растворимого антигена, или наоборот, методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR, от англ. surface plasmon resonance) детектируется уменьшение сигнала на 50% или более, в одном воплощении на 75% или более, при концентрации указанного эпитопа 20-50 нМ и концентрации антитела, с эпитопом которого определяется перекрывание, 100 нМ. В альтернативном случае, можно применять способ, в котором перекрывание эпитопов двух антител, связывающихся с тем же антигеном, определяется при помощи конкурентного аналаза. С этой целью, например, при помощи иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием клеток, экспрессирующих эпитопы рекомбинантного антигена, определяют, конкурирует ли антитело, с эпитопом которого определяется перекрывание, с другим антителом за связывание с иммобилизованным антигеном. Для этой цели иммобилизованный антиген инкубируют с меченой формой антитела и избытком антитела, с эпитопом которого определяют перекрывание. Детекция связанной метки позволяет легко установить перекрывание эпитопов. Если регистрируется снижение сигнала более чем на 70%, в одном воплощении более чем на 80% при той же концентрации, или вытеснение более чем на 80%, в одном воплощении более чем на 90% при более высоких концентрациях, в одном случае при 10⁵-кратном избытке антитела, у которого определяют перекрывание эпитопов с известным антителом, то эпитопы являются идентичными или перекрывающимися, а оба антитела связываются с тем же самым или с перекрывающимися эпитопами того же самого антигена.

Принцип различных иммунологических анализов описан, например, Наде, D.S. (Anal. Chem. 71 (1999) 294R-304R). Lu, В., et al. (Analyst 121 (1996) 29R-32R) предложили ориентированную иммобилизацию антител для применения в иммунологических анализах. Иммунологические анализы с использованием авидина-биотина описаны, например, Wilchek, Μ., and Bayer, E.A., in Methods Enzymol. 184(1990)467-469.

Полипептиды и моноклональные антитела и их константные домены содержат ряд реакционноспособных боковых цепей аминокислот для присоединения партнера по связыванию, такого как поверхность, белок, полимер (например, ПЭГ, целлюлоза или полистирол), фермент или член связывающейся пары. Реакционноспособными химическими группами аминокислот являются, например, аминогруппы (лизины, альфа-аминогруппы), тиоловые группы (цистины, цистеины и метионины), карбоксильные группы (аспарагиновые кислоты, глутаминовые кислоты) и спиртовые группы. Такие способы описаны, например, Aslam Μ., and Dent, Α., in "Bioconjugation", MacMillan Ref. Ltd. 1999, pp.50-100.

Одной из наиболее распространенных реакционноспособных групп полипептидов и антител является алифатическая ε-аминогруппа аминокислоты лизина. Как правило, практически все полипептиды и антитела богаты лизином. Аминогруппы лизина являются достаточно хорошими нуклеофилами при рН выше 8,0 (pK_a=9,18) и таким образом, легко и полностью реагируют с различными реагентами с образованием стабильных связей. Реагенты, вступающие в реакцию с аминогруппами, в первую очередь реагируют с лизинами и α-аминогруппами белков. Реакционноспособные сложные эфиры, в частности N-гидрокси-сукцинимидные (NHS) эфиры, относятся к наиболее широко употребляемым реагентам для модификации аминогрупп. Оптимальные значения рН для протекания реакции в водной среде составляют от рН 8,0 до 9,0. Изотиоцианаты являются реагентами, модифицирующими аминогруппы, и образуют с белками тиомочевинные соединения. Они вступают в реакцию с аминогруппами белков в водном растворе (оптимальные значения рН 9,0-9,5). Альдегиды вступают в реакцию в мягких условиях в водной среде с алифатическими и ароматическими аминами, гидразинами и гидразидами с образованием промежуточного имина (основания Шиффа). Основание Шиффа может быть селективно восстановлено при помощи слабых или сильных восстанавливающих агентов (таких как борогидрид натрия или цианоборогидрид натрия) с образованием стабильных алкиламинных связей. Другими реагентами, которые применяют для модификации аминогрупп, являются ангидриды кислот. Например, ангидрид диэтилентриаминпентауксусной кислоты (DTPA) является бифункциональным хелатирующим агентом, содержащим две ангидридные группы, вступающие в реакцию с аминогруппами. Он может вступать в реакцию с N-концевыми и ε-аминогруппами аминокислот с образованием амидных связей. Ангидридные циклы размыкаются с образованием мультивалентных хелатирующих ионы металлов «клешней», способных прочно связываться с ионами металлов с образованием координационного комплекса.

Другой распространенной реакционноспособной группой полипептидов и антител является тиоловый остаток серосодержащей аминокислоты цистина и продукта его восстановления цистеина (или полуцистина). Цистеин содержит свободную тиоловую группу, которая обладает более выраженными нуклеофильными свойствами, чем аминогруппы и как правило представляет собой наиболее реакционноспособную функциональную группу в составе белка. Тиоловые группы, как правило, являются реакционноспособными при нейтральных значениях рН, и таким образом могут селективно связываться с другими молекулами в присутствии аминогрупп. Поскольку свободные сульфгидрильные группы являются относительно реакционноспособными, белки, содержащие эти группы, часто содержат их окисленную форму в виде дисульфидных групп или дисульфидных связей. В таких белках для образования реакционноспособной свободной тиоловой группы необходимо восстановление дисульфидных связей с использованием такого реагента, как дитиотрейтол (ДТТ). Реагенты, способные вступать в реакцию с тиолами, представляют собой реагенты, которые связываются с тиоловыми группами полипептидов, с образованием тиоэфирных связей. Эти реагенты быстро вступают в реакцию при слабокислых или нейтральных значениях рН и таким образом могут избирательно реагировать в присутствии аминогрупп. В литературе описано применение нескольких тиолирующих сшивающих реагентов, таких как реагент Трота (2-иминотиолан), сукцинимидил-(ацетилтио)-ацетат (SATA), и сульфосукцинимидил-6-[3-(2-пиридилдитио)-пропионамидо]-гексанат (сульфо-LC-SPDP) для эффективного введения множества сульфгидрильных групп с использованием реакционносопособных аминогрупп. Галоацетильные производные, например иодоацетамиды, образуют тиоэфирные связи и также являются реагентами для модификации тиоловых групп. Другими подходящими реагентами являются малеимиды. Реакция малеимидов с тиоловыми группами по существу аналогична реакции иодоацетамидов. Малеимиды быстро вступают в реакцию при слабокислых или нейтральных значениях рН.

Другими распространенными реакционноспособными группами полипептидов и антител являются карбоксильные группы. Карбоксильные группы находятся на С-конце полипептидов и антител и в составе боковых цепей аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты. Относительно низкая реакционная способность карбоксильных групп в воде обычно затрудняет применение этих групп для селективной модификации полипептидов и антител. При ее осуществлении карбоксильная группа обычно превращается в реакционноспособную сложноэфирную группу при использовании водорастворимого карбодиимида и вступает в реакцию с нуклеофильным реагентом, таким как амин, гидразид или гидразин. Реагент, содержащий аминогруппу, должен обладать слабоосновными свойствами, чтобы избирательно реагировать с активированными карбоксильными группами в присутствии ε-аминогрупп лизина, проявляющих более сильные основные свойства, с образованием стабильных амидных связей. Образование поперечных сшивок в белках происходит при повышении рН выше 8,0.

Для окисления спиртовой группы углевода в составе углеводного компонента, присоединенного к антителу, до альдегида можно применять периодат натрия. Каждая альдегидная группа может вступать в реакцию с амином, гидразином или гидразидом, как описано для карбоксильных групп. Поскольку углеводный компонент преимущественно обнаруживается в составе кристаллизуемого фрагмента (Fc, от англ. crystallizable fragment) антитела, конъюгацию можно осуществлять при помощи сайт-специфической модификации углевода за пределами антигенсвязывающего сайта. Образуется промежуточный продукт - основание Шиффа, который может быть восстановлен до алкиламина за счет восстановления промежуточного продукта с помощью таких водорастворимых восстанавливающих реагентов, как цианоборогидрид натрия (слабый и селективный) или борогидрид натрия (сильный).

Термин "образец" включает любое количество субстанции, взятой из живого организма или бывшего живым организма, но не ограничивается ими. Такие живые организмы включают людей, мышей, обезьян, крыс, кроликов и других животных, но не ограничивается ими. В одном воплощении образец получен у обезьяны, в частности, яванского макака, или у кролика, или мыши, или крысы. В одном воплощении такие субстанции включают цельную кровь, сыворотку или плазму, полученные у индивида, представляющие собой наиболее широко используемые источники образцов в клинической практике, но не ограничиваются ими.

Термин "твердая фаза" обозначает нетекучую субстанцию и включает частицы (включая микрочастицы и гранулы), сделанные из такого материала, как полимер, металл (парамагнитные, ферромагнитные частицы), стекло и керамика; гелевые субстанции, такие как силикагель, алюмогель и полимерные гели; капилляры, которые могут быть сделаны из полимера, металла, стекла и/или керамики; цеолиты и другие пористые субстанции; электроды; планшеты для микротитрования; твердые стрипы; а также кюветы, пробирки или другие контейнеры для образцов, применяемые в спектрометрии. Компонент, представляющий собой твердую фазу, отличается от инертной твердой поверхности тем, что на поверхности "твердой фазы" имеется по меньшей мере одна функциональная группа, предназначенная для взаимодействия с субстанцией в образце. Твердая фаза может быть неподвижным элементом, таким как пробирка, стрип, кювета или планшет для микротитрования, или может быть подвижным элементом, таким как гранулы или микрочастицы. Можно применять разнообразные микрочастицы, которые обеспечивают нековалентное или ковалентное присоединение белков и других субстанций. Такие частицы включают частицы полимеров, такие как полистирен и поли-(метилметакрилат); частицы золота, такие как наночастицы золота и коллоидные частицы золота; а также керамические частицы, такие как частицы кремния, стекла и оксидов металлов. См., например Martin, C.R., et al., Analytical Chemistry-News & Features, 70 (1998) 322A-327A, или Butler, J.E., Methods 22 (2000) 4-23.

В одном воплощении детектируемая метка выбрана из хромогенов (флуоресцентных или люминесцентных групп и красителей), ферментов, ЯМР-активных групп, частиц металлов или гаптенов, таких как дигоксигенин. Детектируемая метка также может быть фотоактивируемой сшивающей группой, например, азидогруппой или азириновой группой. В одном воплощении, группами, испускающими сигнал, который можно детектировать электрохемилюминесцентным методом, также являются хелаты металлов, наибольшее предпочтение отдается хелатам рутения, например, бипиридильному комплексу рутения Ru(bpy)₃²⁺ (bpy = бипиридил). Подходящие группы для введения рутениевой метки описаны, например, в ЕР 0580979, WO 90/05301, WO 90/11511 или WO 92/14138.

В данном документе предложен способ определения наличия и/или концентрации (свободного первого) антигена мультиспецифического антитела в образце, содержащем иммобилизованный на твердой фазе второй антиген, который может быть специфически связан с одной связывающей детерминантой мультиспецифического антитела, которая не является связывающей детерминантой мультиспецифического антитела, специфически связывающей (свободный первый) антиген, подлежащий определению, для элиминации из образца мультиспецифического антитела, как находящегося, так и не находящегося в составе комплекса, перед определением концентрации (свободного первого) антигена.

В одном воплощении способ включает элиминацию из образца комплекса второй антиген-мультиспецифическое антитело перед определением наличия или концентрации свободного (первого) антигена.

В одном воплощении определение наличия и/или концентрации (свободного первого) антигена в образце, из которого элиминировано мультиспецифическое антитело, проводится методом иммуноанализа сэндвич-типа, где антиген выполняет роль мостика между двумя антителами. В одном воплощении в иммунологическом анализе используют захватывающее антитело и меченое антитело, при этом захватывающее антитело конъюгировано с твердой фазой, а меченое антитело конъюгировано с детектируемой меткой.

Один аспект данного описания представляет собой способ определения in vitro наличия и/или концентрации (свободного первого) антигена мультиспецифического антитела в образце, где антиген, подлежащий определению, может быть специфически связан с первой связывающей детерминантой мультиспецифического антитела, включающий этап:

- инкубации образца, содержащего (первый) антиген и мультиспецифическое антитело, со вторым антигеном, который может быть специфически связан со второй связывающей детерминантой мультиспецифического антитела, отличной от первой связывающей детерминанты, и таким образом удаления мультиспецифического антитела из образца.

Специалисту в данной области техники известно, что согласно равновесной термодинамике, образец, содержащий антиген и антитело, которое может специфически связываться с антигеном, содержит смесь свободного антигена, связанного с антителом антигена и свободного антитела.

В одном воплощении способ включает следующие этапы:

- инкубацию образца, содержащего (первый) антиген и мультиспецифическое антитело, со вторым антигеном, который может быть специфически связан со второй связывающей детерминантой мультиспецифического антитела, отличной от первой связывающей детерминанты, для образования комплекса второй антиген-мультиспецифическое антитело, и

- удаление из образца комплекса второй антиген-мультиспецифическое антитело.

В одном воплощении способ включает следующие этапы:

- инкубацию образца, содержащего (первый) антиген и мультиспецифическое антитело, со вторым антигеном, который может быть специфически связан со второй связывающей детерминантой мультиспецифического антитела, отличной от первой связывающей детерминанты, для образования комплекса второй антиген-мультиспецифическое антитело,

- удаление из образца комплекса второй антиген-мультиспецифическое антитело,и

- определение концентрации (первого) антигена в образце, из которого элиминировано мультиспецифическое антитело.

В одном воплощении способ включает этап:

- элиминации комплекса второй антиген-мультиспецифическое антитело из образца перед определением наличия или концентрации свободного (первого) антигена.

В одном воплощении способ включает этапы:

- инкубации образца, содержащего (первый) антиген и мультиспецифическое антитело, со вторым антигеном, который может быть специфически связан со второй связывающей детерминантой мультиспецифического антитела, отличной от первой связывающей детерминанты,

- элиминации комплекса второй антиген-мультиспецифическое антитело из образца перед определением наличия или концентрации свободного (первого) антигена, и

- определения концентрации (первого) антигена в образце, из которого элиминировано мультиспецифическое антитело.

В одном воплощении определение наличия и/или концентрации (первого) антигена осуществляют при помощи иммуноанализа сэндвич-типа.

В одном воплощении определение наличия и/или концентрации (первого) антигена представляет собой определение концентрации свободного (первого) антигена.

В одном воплощении определение наличия и/или концентрации (первого) антигена включает следующие этапы:

- инкубацию образца, из которого элиминировано мультиспецифическое антитело, с захватывающим антителом, которое специфически связывается с (первым) антигеном, для образования комплекса захватывающее антитело-антиген, и

- установление зависимости между образованием комплекса захватывающее антитело-(первый) антиген и концентрацией в образце антигена.

В одном воплощении определение наличия и/или концентрации (первого) антигена включает следующие этапы:

- инкубацию образца, из которого элиминировано мультиспецифическое антитело, с захватывающим антителом, которое специфически связывается с (первым) антигеном, для образования комплекса захватывающее антитело-(первый) антиген,

- инкубацию комплекса захватывающее антитело-(первый) антиген с меченым антителом, где захватывающее антитело и меченое антитело связываются с неперекрывающимися эпитопами (первого) антигена, и

- установление зависимости между образованием комплекса захватывающее антитело-(первый) антиген-меченое антитело и концентрацией в образце (первого) антигена.

В одном воплощении меченое антитело содержит детектируемую метку.

В одном воплощении определение наличия и/или концентрации (первого) антигена включает следующие этапы:

- инкубацию образца, из которого элиминировано мультиспецифическое антитело, с захватывающим антителом, которое специфически связывается с (первым) антигеном, для образования комплекса захватывающее антитело-(первый) антиген,

- инкубацию комплекса захватывающее антитело-(первый) антиген с меченым антителом, где захватывающее антитело и меченое антитело связываются с неперекрывающимися эпитопами (первого) антигена,

- инкубацию комплекса захватывающее антитело-(первый) антиген-меченое антитело с детектирующим антителом, содержащим детектируемую метку, где детектирующее антитело специфически связывается с эпитопом меченого антитела, находящимся за пределами вариабельных доменов меченого антитела, и

- установление зависимости между образованием комплекса захватывающее антитело-(первый) антиген-меченое антитело и концентрацией в образце (первого) антигена.

В одном воплощении захватывающее антитело и меченое антитело связываются с неперекрывающимися эпитопами (первого) антигена.

В одном воплощении способов согласно данному описанию (первый) антиген представляет собой свободный (первый) антиген.

В одном воплощении второй антиген и/или захватывающее антитело конъюгированы с твердой фазой.

Второй антиген и/или захватывающее антитело, которые могут найти применение в способе по данному описанию, могут быть конъюгированы с твердой фазой. В одном воплощении конъюгацию осуществляют путем химического связывания по N-концевым и/или ε-аминогруппам (лизин), ε-аминогруппам различных лизинов, по карбоксильным, сульфгидрильным, гидроксильным и/или фенольным функциональным группам аминокислотного остова антигена или антитела и/или спиртовым группам углеводного компонента антигена и/или антитела. В одном воплощении второй антиген и/или захватывающее антитело представляют собой смесь по меньшей мере двух вторых антигенов и/или антител, конъюгированных с твердой фазой, где по меньшей мере два вторых антигена и/или антитела, конъюгированных с твердой фазой, различаются сайтами, по которым они конъюгированы с твердой фазой. Например, смесь по меньшей мере двух вторых антигенов и/или двух антител, конъюгированных с твердой фазой, может быть конъюгирована с твердой фазой по аминокислоте аминокислотного остова и по спиртовой группе углеводного компонента. Кроме того, например, смесь по меньшей мере двух вторых антигенов и/или двух антител, конъюгированных с твердой фазой, может включать вторые антигены и/или антитела, конъюгированные с твердой фазой по различным аминокислотным остаткам их аминокислотного остова. Выражение "различные аминокислотные остатки" обозначает либо два различных типа аминокислот, например, таких как лизин и аспарагиновая кислота, или тирозин и глутаминовая кислота, либо два аминокислотных остатка аминокислотного остова, различающиеся своим расположением в аминокислотной последовательности второго антигена и/или антитела. В последнем случае аминокислота может быть того же типа или другого типа. Выражение "антитела различаются сайтами" обозначает различия либо в типе сайта, например, аминокислоту или спиртовую группу, или в порядковом номере аминокислоты в аминокислотном остове, например, по которой второй антиген и/или антитело конъюгированы с твердой фазой. То же самое относится и к меченому антителу, которое может найти применение в способе согласно данному описанию.

В одном воплощении способа в иммунологическом анализе используют захватывающее антитело, меченое антитело и детектирующее антитело, где захватывающее антитело представляет собой биотинилированное антитело, направленное против антигена, конъюгированного с твердой фазой через стрептавидин, меченое антитело представляет собой антитело, направленное против антигена, конъюгированного с дигоксигенином, а детектирующее антитело представляет собой антитело, направленное против дигоксигенина, конъюгированное с пероксидазой хрена.

Стандартный способ элиминации комплексов, имеющих в своем составе биспецифические антитела, которые специфически связываются с антигеном X и антигеном Y, из образцов, содержащих антиген X и/или антиген Υ для определения антигена X или антигена Υ, соответственно, включает следующие этапы:

- формирование комплексов между биспецифическим антителом, которое специфически связывается с антигеном X и антигеном Υ (анти-X/Y антитело):

Антиген X в постоянной концентрации инкубируют с возрастающим количеством биспецифического моноклонального антитела, которое специфически связывается с антигеном X первой связывающей детерминантой и которое специфически связывается с антигеном Υ второй связывающей детерминантой (анти-X/Y антитело), при комнатной температуре в течение 1 часа. После этого образец используют в качестве положительного контроля на этапе элиминации.

- этап элиминации:

Для элиминации антигена X, связанного с анти-X/Y антителом, биотинилированный антиген (Υ-ΒΙ) связывают с магнитными частицами, покрытыми стрептавидином (SA-частицы) в концентрации приблизительно 10 мкг/мл. Для каждого образца отмывают и отделяют от надосадочной жидкости с использованием магнитного сепаратора по 600 мкл SA-частиц. 600 мкл раствора, содрежащего биотинилированный антиген Υ, смешивают с SA-частицами и инкубируют приблизительно в течение 1 ч при комнатной температуре. Избыток несвязанного антигена удаляют путем 3-кратного отмывания частиц с использованием магнитного сепаратора. После этого частицы, покрытые антигеном Υ, инкубируют приблизительно с 250 мкл образца, содержащего комплексы анти-X/Y антитела и антигена X. Смесь инкубируют при комнатной температуре при перемешивании приблизительно в течение 1 ч. После инкубации частицы удаляют из образца при помощи магнитного сепаратора. Надосадочную жидкость берут для анализа "свободного" антигена X методом ИФА (см., например, Пример 2).

Оставшиеся частицы переносят в контейнер ELECSYS и выполняют анализ антигена X, связанного с частицами (антиген X, связанный с биспецифическим антителом), при помощи анализатора ELECSYS 2010, согласно стандартным рабочим процедурам, описанным в руководстве пользователя.

Для элиминации антигена Y, связанного с анти-X/Y антителом, биотинилированный антиген Χ (X-BI) связывают с магнитными частицами, покрытыми стрептавидином (SA-beads) в концентрации приблизительно 10 мкг/мл. Для каждого образца отмывают и отделяют от надосадочной жидкости с использованием магнитного сепаратора по 600 мкл SA-частиц. 600 мкл раствора, содрежащего биотинилированный антиген X, смешивают с SA-частицами и инкубируют приблизительно в течение 1 ч при комнатной температуре. Избыток несвязанного антигена X затем удаляют путем 3-кратного отмывания частиц с использованием магнитного сепаратора. После этого частицы, покрытые антигеном X, инкубируют приблизительно с 250 мкл образца, содержащего комплексы анти-X/Y антитела и антигена Y. Смесь инкубируют при комнатной температуре при перемешивании приблизительно в течение 1 ч. После инкубации частицы удаляют из образца при помощи магнитного сепаратора. Надосадочную жидкость берут для анализа "свободного" антигена Υ методом ИФА (см., например, Пример 2). Оставшиеся частицы переносят в контейнер ELECSYS и выполняют анализ антигена Y, связанного с частицами (антиген Y, связанный с биспецифическим антителом), при помощи анализатора ELECSYS 2010, согласно стандартным рабочим процедурам, описанным в руководстве пользователя.

Для определения фармакокинетических свойств мультиспецифического антитела in vivo, можно определять распределение или концентрацию свободного первого антигена, свободного второго антигена, свободного мультиспецифического антитела, а также комплекса мультиспецифическое антитело-первый и/или второй антиген.

Один аспект данного описания представляет собой способ, подходящий для определения in vitro наличия и/или концентрации свободного (первого) антигена биспецифического антитела, где (первый) антиген может быть специфически связан с первой связывающей детерминантой биспецифического антитела, включающий этап:

- инкубации образца, содержащего (первый) антиген и биспецифическое антитело, с антиидиотипическим антителом, которое специфически связывается со второй связывающей детерминантой биспецифического антитела, отличной от первой связывающей детерминанты.

В одном воплощении способ включает этапы:

- инкубации образца, содержащего (первый) антиген и биспецифическое антитело, с антиидиотипическим антителом, которое специфически связывается со второй связывающей детерминантой биспецифического антитела, котрая отличается от первой связывающей детерминанты,

- удаления из образца комплекса антиидиотипическое антитело-биспецифическое антитело, и

- определения концентрации антигена в образце, из которого элиминировано биспецифическое антитело.

Антиидиотипическое антитело может быть связано с твердой фазой.

Определение биспецифического антитела можно осуществлять при помощи иммунологического анализа сэндвич-типа с использованием захватывающей молекулы, меченой молекулы и детектирующей молекулы.

Захватывающая молекула может быть связана с твердой фазой. Захватывающая молекула в общем может быть любым партнером по связыванию биспецифического антитела (например, одним из антигенов), неспецифическим комплексообразующим агентом биспецифического антитела (например, Fc-рецептором или антителом, направленным против Fc-фрагмента в случае полноразмерного антитела), или антиидиотипическим антителом, которое специфически связывается с одной связывающей детерминантой биспецифического антитела.

Меченая молекула может быть любым партнером по связыванию мультиспецифического связывающего агента (например, одним из антигенов биспецифического антитела, но если один антиген применяется в качестве захватывающей молекулы, в качестве меченой молекулы должен использоваться другой антиген), неспецифическим комплексообразующим агентом биспецифического антитела (например, Fc-рецептором в случае полноразмерного антитела при условии, что данная молекула еще не использована в качестве захватывающей молекулы, или антителом, направленным против Fc-фрагмента, в случае полноразмерного антитела, при условии, что данное антитело связывается с другим эпитопом, если антитело того же типа также используется в качестве захватывающей молекулы), или первым партнером связывающей пары, если биспецифическое антитело образует производное со вторым партнером связывающей пары (при условии, что для иммобилизации захватывающей молекулы используется другая связывающая пара), или антиидиотипическим антителом, которое специфически связывается со связывающей детерминантой биспецифического антитела (при условии, что оно связывается с другой связывающей детерминантой в отличие от антиидиотипического антитела, использовавшегося в качестве захватывающей молекулы).

Один аспект данного описания представляет собой способ определения in vitro наличия и/или концентрации (первого) антигена биспецифического антитела в образце, находящегося в комплексе с биспецифическим антителом (комплекс первый антиген-биспецифическое антитело), где антиген, подлежащий определению, может быть специфически связан с первой связывающей детерминантой биспецифического антитела, включающий этап:

- инкубации образца, содержащего (первый) антиген и биспецифическое антитело, с антиидиотипическим антителом, которое специфически связывается со второй связывающей детерминантой биспецифического антитела, отличной от первой связывающей детерминанты, где антиидиотипическое антитело связано с твердой фазой.

В одном воплощении на первом этапе способа образуется комплекс антиидиотипическое антитело-биспецифическое антитело-(первый) антиген.

В одном воплощении способ включает в качестве второго этапа:

- инкубацию комплекса, образованного на первом этапе, с антителом, которое специфически связывается с эпитопом (первого) антигена, отличным от эпитопа, связанного с биспецифическим антителом, и таким образом определения в образце наличия и/или концентрации (первого) антигена биспецифического антитела, находящегося в комплексе с биспецифическим антителом (комплекс (первый) антиген-биспецифическое антитело).

Определение общего, связанного с антителом и свободного антигена важно для мониторинга лечения с использованием терапевтически активных антител. Например, механизм действия биспецифического антитела, специфически связывающегося с ангиопоэтином-2 (ANG2, от англ. angiopoietin-2) и фактором роста сосудистого эндотелия (VEGF, от англ. vascular endothelium growth factor) представляет собой блокирование связывания обоих антигенов с их соответствующими рецепторами. В отсутствие свободного лиганда путь передачи сигнала блокируется. Таким образом, возможность определения фракции свободного антигена и связанного с антителом антигена имеет важное значение для терапии, в частности для подбора дозы и частоты приема препарата. Общий антиген представляет сумму свободного и связанного с антителом антигена.

При лечении пациентов антиген и терапевтически активное антитело присутствуют в организме пациента одновременно и образуют комплексы. Таким образом, in vivo существует равновесие между связанным с антителом и свободным антигеном. На установление равновесия in vitro может повлиять, например, разведение образца или выбор антител для детекции или захвата. В частности, для свободного антигена, может наблюдаться расхождение между существующей "in vivo" и определенной "in vitro" концентрацией. Этого можно избежать с помощью предварительной обработки, а также с помощью аналитического определения связанного с антителом и общего антигена и последующего определения свободного антигена по их концентрации. Часто формат анализов для определения связанного с антителом и общего антигена различается, например в анализах для определения связанного с антителом антигена и анализах для определения общего антигена может различаться тип анализа, антитела, использованные для захвата и детекции, последовательность и длительность этапов инкубации.

Напротив, в Примере 9 и на Фиг. 13 описан анализ, который можно применять как для определения общего антигена, так и связанного с антителом антигена. Это уникальное свойство основано на использовании биспецифического (терапевтически активного) антитела и антиидиотипического антитела, направленного против второй связывающей детерминанты.

Связанную мишень определяют непосредственно в образце in vivo, например, в образце плазмы.

При добавлении in vitro избытка биспецифического антитела свободный антиген, присутствующий в образце, конвертируется в связанный с антителом антиген. Таким образом, при повторном выполнении абсолютно такого же анализа, что и для связанной мишени, как описано выше, определяют общий антиген. Разница между результатами анализа с добавлением и без добавления in vitro биспецифического антитела отражает концентрацию конвертированной мишени, т.е. присутствующей исходно свободной мишени.

Следующие примеры и графические материалы дают возможность лучше понять настоящее изобретение, объем которого ограничен прилагаемой формулой. Следует понимать, что указанные методики могут быть модифицированы, но при этом суть изобретения сохранится.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг. 1 Равновесие между связанной с лекарством мишени (антиген, связанный с биспецифическим антителом) и свободной мишени (свободный антиген).

Фиг. 2 Элиминация с-МЕТ, связанного с биспецифическим анти-с-MET/HER3 антителом, с помощью HER3; биотинилированный HER3 иммобилизован на покрытых стрептавидином магнитных частицах; после инкубации этих магнитных частиц с образцом, например, образцом сыворотки, биспецифическое анти-c-MET/HER3 антитело оказывается связанным и элиминируется иммобилизованным HER3; с-МЕТ, связанный с биспецифическим антителом, также элиминируется; свободный с-МЕТ (не связанный с биспецифическим антителом) остается в супернатанте образца.

Фиг. 3 «Сэндвич»-ИФА для определения с-МЕТ: биотинилированное антитело к с-МЕТ связано с поверхностью планшета для микротитрования, покрытой стрептавидином; иммобилизованное анти-с-МЕТ антитело специфически связывает свободный с-МЕТ, а второе меченое дигоксигенином (DIG) анти-с-МЕТ антитело позволяет детектировать связанный с-МЕТ; анализ используется для определения "свободного" с-МЕТ в супернатанте образца после элиминации.

Фиг. 4(A) Уровень сигнала при анализе с-МЕТ в буфере до и после иммуно-опосредованной элиминации: готовили образцы, содержащие с-МЕТ в концентрации 100 нг/мл и увеличивающееся количество биспецифического анти-c-MET/HER3 антитела; комплексы биспецифического моноклонального антитела и связанного с-МЕТ элиминировали при помощи биотинилированного HER3, связанного с магнитными частицами; на диаграмме показаны концентрации с-МЕТ до и после элиминации, измеренные методом ИФА.

Фиг.4(B) Уровень сигнала при анализе с-МЕТ в сыворотке до и после иммуно-опосредованной элиминации: готовили образцы, содержащие с-МЕТ в концентрации 100 нг/мл и увеличивающееся количество биспецифического анти-c-MET/HER3 антитела; комплексы биспецифического моноклонального антитела и связанного с-МЕТ элиминировали при помощи биотинилированного HER3, связанного с магнитными частицами; на диаграмме показаны концентрации с-МЕТ до и после элиминации, измеренные методом ИФА.

Фиг. 5(A) ИФА для детекции антигена биспецифического антитела при помощи другого антигена: биотинилированный HER3 связан с поверхностью планшета для микротитрования, покрытой стрептавидином, и использован для иммобилизации биспецифического анти-c-MET/HER3 антитела; с-МЕТ связан с иммобилизованным биспецифическим анти-c-MET/HER3 антителом; второе анти-с-МЕТ антитело (меченое DIG) вместе с поликлональным меченым HRP анти-DIG антителом позволяет детектировать связанный с-МЕТ.

Фиг. 5(B) ИФА для детекции антигена биспецифического антитела при помощи антиидиотипического антитела, направленного против другой связывающей детерминанты этого биспецифического антитела: биотинилированное антиидиотипическое антитело, направленное против связывающей детерминанты, специфически связывающейся с HER3 (idmAb<HER3>-BI), связано с поверхностью планшета для микротитрования, покрытой стрептавидином, и использовано для иммобилизации биспецифического анти-с-MET/HER3 антитела; с-МЕТ связан с иммобилизованным биспецифическим анти-c-MET/HER3 антителом; второе анти-с-МЕТ антитело (меченое DIG) вместе с поликлональным меченым HRP анти-DIG антителом позволяет детектировать связанный с-МЕТ.

Фиг. 6 Калибровочная кривая ИФА для детекции антигена биспецифического антитела при помощи другого антигена.

Фиг. 7 «Сэндвич»-ИФА для определения VEGF с использованием анти-ANG2/VEGF антитела (VEGF, связанного с биспецифическим антителом): биотинилированное антиидиотипическое антитело, направленное против связывающей детерминанты биспецифического антитела для ANG2, связано с поверхностью планшета для микротитрования, покрытой стрептавидином. Иммобилизованное антиидиотипическое анти-ANG2 антитело образует комплекс с анти-ANG2/VEGF антителом. Второе меченое дигоксигенином анти-VEGF антитело используют для определения VEGF, связанного с биспецифическим антителом.

Фиг. 8 Калибровочная кривая ИФА для детекции комплексов VEGF с анти-ANG2/VEGF антителом. Серию разведений VEGF от 0 нг/мл до 50 нг/мл добавляли к сыворотке, содержащей анти-ANG2/VEGF антитело в концентрации 500 мкг/мл, и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Образцы анализировали, как описано в Примере 6.

Фиг. 9 «Сэндвич»-ИФА для определения комплексов ANG2 с анти-ANG2/VEGF антителом (ANG2, связанного с биспецифическим антителом): биотинилированное антиидиотипическое антитело, направленное против связывающей детерминанты биспецифического антитела для VEGF, связано с поверхностью планшета для микротитрования, покрытой стрептавидином. Иммобилизованное антиидиотипическое анти-VEGF антитело образует комплекс с анти-ANG2/VEGF антителом. Второе меченое дигоксигенином анти-ANG2 антитело используют для определения связанного ANG2.

Фиг. 10 Калибровочная кривая ИФА для детекции комплексов ANG2 с анти-ANG2/VEGF антителом. Серию разведений ANG2 от 0 нг/мл до 5000 нг/мл добавляли к сыворотке, содержащей анти-ANG2/VEGF антитело в концентрации 5 мкг/мл, и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Образцы анализировали, как описано в Примере 7.

Фиг. 11 «Сэндвич»-ИФА для определения комплексов VEGF с анти-ANG2/VEGF антителом (VEGF, связанного с биспецифическим антителом): биотинилированное анти-VEGF антитело связано с поверхностью планшета для микротитрования, покрытой стрептавидином. Иммобилизованное анти-VEGF антитело образует комплекс с комплексом анти-ANG2/VEGF антитело-VEGF. Меченое дигоксигенином антиидиотипическое анти-ANG2 антитело используют для определения связанного с антителом комплекса.

Фиг. 12 Калибровочная кривая ИФА для детекции комплексов VEGF с анти-ANG2/VEGF антителом. Серию разведений VEGF от 0 нг/мл до 10 нг/мл добавляли к сыворотке, содержащей анти-ANG2/VEGF антитело, и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре.

Фиг. 13 «Сэндвич»-ИФА для определения комплексов ANG2 с анти-ANG2/VEGF антителом (ANG2, связанного с биспецифическим антителом): свободный ANG2 переводят в связанный с антителом ANG2 путем инкубации образца с биспецифическим анти-ANG2/VEGF антителом. Биотинилированное антиидиотипическое антитело, направленное против связывающей детерминанты биспецифического антитела для VEGF, связано с поверхностью планшета для микротитрования, покрытой стрептавидином. Иммобилизованное антиидиотипическое анти-VEGF антитело образует комплекс с комплексом ANG2-анти-ANG2/VEGF антитело. Второе меченое дигоксигенином анти-ANG2 антитело, которое специфически связывается с другим эпитопом ANG2 в отличие от анти-ANG2/VEGF антитела, используют для определения общего ANG2.

ОПИСАНИЕ ПРИМЕРОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Пример 1

Элиминация мишени, связанной с молекулой лекарственного средства (антиген, связанный с антителом), в случае биспецифических молекул лекарственных средств

А) Формирование комплексов биспецифическое анти-с-МЕТ/HER3 антитело и с-МЕТ.

с-МЕТ в постоянной концентрации инкубировали с возрастающим количеством биспецифического антитела, которое специфически связывается с с-МЕТ первой связывающей детерминантой и которое специфически связывается с HER3 второй связывающей детерминантой (биспецифическое анти-c-MET/HER3 антитело) при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем эти образцы использовали в качестве положительного контроля на этапе элиминации.

В) Этап элиминации

Для элиминации с-МЕТ, связанного с биспецифическим анти-c-MET/HER3 антителом, биотинилированный HER3 (HER3-BI) связывали с поверхностью магнитных частиц, покрытых стрептавидином (SA-частицы) в концентрации 10 мкг/мл. Для каждого образца отмывали и отделяли от надосадочной жидкости с использованием магнитного сепаратора по 600 мкл SA-частиц. Приблизительно 600 мкл раствора, содрежащего HER3-BI, смешивали с SA-частицами и инкубировали приблизительно в течение 1 ч при комнатной температуре. Избыток несвязанного HER3-BI удаляли путем 3-кратного отмывания частиц с использованием магнитного сепаратора. После этого частицы, покрытые антигеном, инкубировали с 250 мкл образца, содержащего комплексы биспецифического анти-C-MET/HER3 антитела и с-МЕТ. Образцы инкубировали при комнатной температуре при перемешивании приблизительно в течение 1 ч. После инкубации частицы удаляли из образца при помощи магнитного сепаратора. Надосадочную жидкость использовали для анализа "свободного" с-МЕТ методом ИФА (см. Пример 2).

Пример 2

ИФА для определения с-МЕТ

На первом этапе на поверхность планшетов для микротитрования, покрытую стрептавидином, наносили биотинилированное моноклональное антитело, направленное против с-МЕТ. Образец надосадочной жидкости, полученной на этапе элиминации (см. Пример 1), разводили в 10 раз и добавляли в лунки планшетов, покрытых анти-с-МЕТ антителом. Свободный с-МЕТ в образце связывался с анти-с-МЕТ антителом, нанесенным на поверхность лунок планшетов для микротитрования. После инкубации в течение 1 ч при при комнатной температуре образец удаляли путем 3-кратного отмывания планшета. Затем в лунки добавляли моноклональное меченое DIG анти-с-МЕТ антитело, связывающееся с детерминантой, т.е. эпитопом, отличной от детерминанты, распознающейся анителом, которым были покрыты планшеты, и инкубировали еще в течение часа при комнатной температуре. После следующего этапа отмывки в планшет добавляли поликлональное меченое HRP анти-DIG антитело и инкубировали еще в течение часа. Для развития цветной реакции использовали раствор субстрата ABTS (см. Фиг. 3).

Пример 3

Элиминация с-МЕТ. связанного с молекулой лекарственного средства, из человеческой сыворотки и буфера

Согласно Примеру 1 биспецифическое анти-с-МЕТ/HER3 антитело разводили до концентрации 20/10/5/1/0,5/0,1 и 0 мкг/мл, соответственно, и инкубировали с с-МЕТ в постоянной концентрации 100 нг/мл. Разведения готовили в двух различных средах:

- буфере PBS/BSA

- пулированой человеческой сыворотке (Trina, NHS Base matrix)

Образцы инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем образцы обедняли, как описано в Примере 1.

HER3-BI использовали для захвата комплексов с-МЕТ с биспецифическим анти-c-MET/HER3 антителом.

После элиминации (обеднения) в супернатанте определяли с-МЕТ методом ИФА, как описано в Примере 2.

Как показано на Фиг. 4а, с-МЕТ, связанный с биспецифическим анти-с-MET/HER3 антителом, удаляли путем иммуно-опосредованной элиминации. В присутствии биспецифического антитела в концентрации 5 мкг/мл или выше, уровень сигнала, обусловленного с-МЕТ, после элиминации был близким к уровню фона.

Схожая картина наблюдалась в образцах сыворотки, как показано на Фиг. 4b.

Пример 4

ИФА для определения антигена биспецифического антитела с использованием другого антигена

а) Определение концентрации (общего) с-МЕТ в образце

На первом этапе осуществляли связывание биотинилированного HER3 с поверхностью покрытого стрептавидином планшета для микротитрования. Параллельно проводили предварительную инкубацию биспецифического анти-с-MET/HER3 антитела с образцом/стандартом в течение 1 часа. Во время предварительной инкубации с-МЕТ в образце связывался с бифункциональным анти-с-МЕТ/HER3 антителом. После отмывки покрытых стрептавидином планшетов добавляли смесь с-МЕТ и анти-с-МЕТ/HER3 антитела, прошедших предварительную инкубацию, и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. После следующего этапа отмывки для удаления несвязанных компонентов образца, добавляли меченое дигоксигенином анти-с-МЕТ антитело (связывающееся с другим эпитопом с-МЕТ в отличие от бифункционального анти-с-MET/HER3 антитела) и инкубировали в течение часа. После следующего этапа отмывки в планшеты добавляли поликлональное меченое пероксидазой хрена (HRP) анти-DIG антитело и инкубировали в течение часа. Для развития цветной реакции использовали раствор субстрата ABTS (см. Фиг. 5а).

b) Определение в образце (предсуществующих) комплексов биспецифического анти-c-MET/HER3 антитела и с-МЕТ

На первом этапе осуществляли связывание биотинилированного HER3 с поверхностью покрытого стрептавидином планшета для микротитрования. После отмывки планшета добавляли образцы и стандарты и инкубировали в течение часа при комнатной температуре. Комплексы биспецифического анти-c-MET/HER3 антитела с с-МЕТ связывались с иммобилизованным HER3-BI. После следующего этапа отмывки добавляли меченое дигоксигенином анти-с-МЕТ антитело, специфически связывающееся с другим эпитопом с-МЕТ в отличие от бифункционального анти-c-MET/HER3 антитела, и инкубировали в течение часа. После следующего этапа отмывки в планшеты добавляли поликлональное меченое HRP анти-DIG антитело и инкубировали в течение часа. Для развития цветной реакции использовали раствор субстрата ABTS (см. Фиг. 5(A)).

Пример 5

ИФА для определения первого антигена биспецифического антитела с использованием антиидиотипического антитела, направленного против второй связывающей детерминанты этого биспецифического антитела

а) Определение концентрации (общего) с-МЕТ в образце

На первом этапе осуществляли связывание биотинилированного антиидиотипического антитела, направленного против связывающей детерминанты, специфически связывающейся с HER3 (антиидиотипическое анти-HER3 антитело-BI), с поверхностью планшетов для микротитрования, покрытых стрептавидином. Параллельно проводили предварительную инкубацию биспецифического анти-с-MET/HER3 антитела с образцом или стандартом в течение 1 часа. На этапе предварительной инкубации с-МЕТ в образце специфически связывался с биспецифическим анти-c-MET/HER3 антителом. После отмывания планшетов, покрытых стрептавидином, в планшеты добавляли смесь с-МЕТ и биспецифического анти-c-MET/HER3 антитела, прошедших предварительную инкубацию, и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. После следующего этапа отмывки для удаления несвязанных компонентов, добавляли меченое дигоксигенином анти-с-МЕТ антитело (которое специфически связывается с другим эпитопом с-МЕТ в отличие от биспецифического анти-c-MET/HER3 антитела) и инкубировали в течение 1 часа. После следующего этапа отмывки в планшеты добавляли поликлональное меченое HRP анти-DIG антитело и инкубировали еще в течение 1 часа. Для развития цветной реакции использовали раствор субстрата ABTS (см. Фиг. 5(B)).

b) Определение в образце (предсуществующих) комплексов анти-с-MET/HER3 антитела и с-МЕТ

На первом этапе осуществляли связывание биотинилированного антиидиотипического антитела, направленного против связывающей детерминанты, специфически связывающейся с HER3 (антиидиотипическое анти-HER3 антитело-BI), с поверхностью планшетов для микротитрования, покрытых стрептавидином. После отмывания планшетов в планшеты добавляли образцы и стандарты и инкубировали 1 час при комнатной температуре. Комплексы анти-c-MET/HER3 антитела и с-МЕТ захватывались иммобилизованным антиидиотипическим антителом. После следующего этапа отмывки добавляли меченое дигоксигенином анти-с-МЕТ антитело, которое специфически связывается с другим эпитопом с-МЕТ в отличие от биспецифического анти-c-MET/HER3 антитела, и инкубировали в течение 1 часа. После следующего этапа отмывки в планшеты добавляли поликлональное меченое HRP анти-DIG антитело и инкубировали в течение 1 часа. Для развития цветной реакции использовали раствор субстрата ABTS (см. Фиг. 5(B)).

Пример 6

ИФА для определения комплексов VEGF с биспецифическим анти-ANG2/VEGF антителом

Биотинилированное моноклональное антиидиотипическое анти-ANG2 антитело, которое специфически связывается со связывающей детерминантой анти-ANG2/VEGF антитела для ANG2, наносили на покрытые стрептавидином планшеты для микротитрования (МТП). Образец с неизвестным содержанием комплекса VEGF с анти-ANG2/VEGF антителом разводили в 10 раз и добавляли в лунки МТП, покрытого антиидиотипическим анти-ANG2 антителом. Биспецифическое антитело, специфически связывающееся с ANG2 и VEGF, образовывало комплекс с иммобилизованным антиидиотипическим антителом, направленным против CDR связывающей детерминаны биспецифического антитела для ANG2. Также связывались комплексы биспецифического антитела и VEGF. После инкубации в течение 1 часа при комнатной температуре образцы/супернатант удаляли, планшет 3-кратно промывали. Затем в лунки добавляли моноклональное меченое дигоксигенином анти-VEGF антитело (которое связывается с другим эпитопом VEGF в отличие от биспецифического анти-ANG2/VEGF антитела, подлежащего определению) и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. После этапа отмывки в планшет добавляли поликлональное меченое пероксидазой хрена (HRP) антитело, направленное против дигоксигенина (анти-DIG антитело) и инкубировали в течение 1 часа. После удаления супернатанта и отмывки для развития цветной реакции добавляли раствор субстрата ABTS (см. Фиг. 7).

Пример 7

ИФА для определения комплексов ANG2 с биспецифическим анти-ANG2/VEGF антителом

Биотинилированное моноклональное антиидиотипическое антитело, которое специфически связывается со связывающей детерминантой анти-ANG2A/EGF антитела для VEGF, наносили на покрытые стрептавидином планшеты для микротитрования (МТП). Образец с неизвестным содержанием комплексов ANG2 с анти-ANG2/VEGF антителом разводили в 10 раз и добавляли в лунки МПТ, покрытого антиидиотипическим анти-VEGF антителом. Биспецифическое антитело, специфически связывающееся с ANG2 и VEGF, образовывало комплексы с иммобилизованным антиидиотипическим антителом, направленным против CDR связывающей детерминанты биспецифического анти-ANG2/VEGF антитела для VEGF. Также связывались комплексы биспецифического антитела и ANG2. После инкубации в течение 1 часа при комнатной температуре образцы/супернатант удаляли, планшет 3-кратно промывали. Затем в лунки добавляли моноклональное меченое дигоксигенином анти-ANG2 антитело (которое специфически связывается с другим эпитопом, в отличие от связывающей детерминанты биспецифического анти-ANG2/VEGF антитела для ANG2) и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. После этапа отмывки в планшет добавляли поликлональное меченое HRP антитело, направленное против дигоксигенина и инкубировали в течение 1 часа. После удаления супернатанта и отмывки для развития цветной реакции добавляли раствор субстрата ABTS (см. Фиг. 9).

Пример 8

ИФА для определения комплексов VEGF с биспецифическим анти-ANG2/VEGF антителом

Биотинилированное моноклональное антитело, направленное против VEGF, наносили на покрытые стрептавидином планшеты для микротитрования (МТП). После отмывки образец с неизвестным содержанием комплексов VEGF с анти-ANG2/VEGF антителом, разводили в 10 раз и добавляли в лунки МТП, покрытых анти-VEGF антителом. Иммобилизованное антитело, направленное против VEGF, связывает VEGF по другому сайту связывания по сравнению с биспецифическим анти-ANG2/VEGF антителом. Комплексы VEGF с анти-ANG2/VEGF антителом, связывались с иммобилизованным анти-VEGF антителом. После инкубации в течение 1 часа при комнатной температуре образцы/супернатант удаляли, планшет 3-кратно промывали. Затем в лунки добавляли моноклональное меченое дигоксигенином антиидиотипическое антитело, которое специфически связывается со связывающей детерминантой анти-ANG2/VEGF антитела для ANG2, и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. После этапа отмывки в планшет добавляли поликлональное меченое HRP антитело, направленное против дигоксигенина, и инкубировали в течение 1 часа. После удаления супернатанта и отмывки для развития цветной реакции добавляли раствор субстрата ABTS (см. Фиг. 11). Соответствующая калибровочная кривая приведена на Фиг. 12.

Пример 9

ИФА для определения общего ANG2 при переводе свободного ANG2 в связанный с антителом ANG2 и инкубации с биспецифическим анти-ANG2/VEGF антителом

Биотинилированное моноклональное антиидиотипическое антитело, которое специфически связывается со связывающей детерминантой анти-ANG2/VEGF антитела для VEGF, связывали с поверхностью планшетов для микротитрования (МТП), покрытой стрептавидином. Первую аликвоту образца с неизвестным количеством ANG2 инкубировали в течение 1 часа с биспецифическим анти-ANG2/VEGF антителом в концентрации 1,5 мкг/мл для перевода свободного ANG2 в связанный с анти-ANG2/VEGF антителом ANG2. Вторую (т.е. не подвергавшуюся инкубации) аликвоту образца и инкубировавшуюся с антителом аликвоту образца разводили в 10 раз и добавляли в лунки МТП, покрытых антиидиотипическим антителом, которое специфически связывается со связывающей детерминантой биспецифического антитела для VEGF. Биспецифическое антитело связывалось с иммобилизованным антиидиотипическим антителом. Аналогично, находящийся в составе комплекса ANG2 связывался с биспецифическим антителом. После инкубации в течение 1 часа при комнатной температуре супернатант (= образец) удаляли, планшет 3-кратно промывали. Затем в лунки добавляли моноклональное меченое дигоксигенином анти-ANG2 антитело (которое специфически связывается с другим эпитопом в отличие от связывающей детерминанты анти-ANG2/VEGF антитела для ANG2) и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. После этапа отмывки в планшет добавляли поликлональное меченое HRP антитело, направленное против дигоксигенина, и инкубировали в течение 1 часа. После удаления супернатанта и отмывки, для развития цветной реакции добавляли раствор субстрата ABTS (см. Фиг. 13). По разнице между результатом, полученным для первой аликвоты, и результатом, полученным для второй аликвоты, рассчитывали концентрацию свободного ANG2. Таким образом, в ходе данного анализа определяли концентрацию связанного с антителом ANG2 и свободного ANG2.

Группа изобретений относится к области химии и представляет собой способ иммуноферментного анализа. Предложен способ детекции свободного антигена биоспецифического антитела в образце, в котором антиген, подлежащий определению, может быть специфически связан с первым сайтом связывания биоспецифического антитела, включающий этап инкубации образца, содержащего свободный антиген и биоспецифическое антитело, с антиидиотипическим антителом, которое специфически связывается со второй связывающей детерминантой биспецифического антитела, отличной от первой связывающей детерминанты, при этом антиидиотипическое антитело связано с твердой фазой. Заявленная группа изобретений позволяет эффективно определить наличие/концентрацию свободного антигена биоспецифического антитела в образце. 2 н. и 7 з.п. ф-лы, 13 ил., 9 пр.

1. Способ определения наличия и/или концентрации антигена биспецифического антитела в образце, в котором антиген, подлежащий определению, может быть специфически связан с первой связывающей детерминантой биспецифического антитела и в котором антиген находится в комплексе с биспецифическим антителом (комплекс антиген-биспецифическое антитело), включающий этап:

- инкубации образца, содержащего антиген и биспецифическое антитело, с антиидиотипическим антителом, которое специфически связывается со второй связывающей детерминантой биспецифического антитела, отличной от первой связывающей детерминанты, при этом антиидиотипическое антитело связано с твердой фазой, и

- детекции комплекса антиген-биспецифическое антитело-антиидиотипическое антитело и таким образом определения наличия и/или концентрации антигена биспецифического антитела.

2. Способ по п. 1, где детекция указанного комплекса проводится посредством инкубации комплекса, образованного на первом этапе, с меченным антителом, которое специфически связывается с эпитопом антигена, отличным от эпитопа, связанного с биспецифическим антителом, и таким образом определения наличия и/или концентрации антигена биспецифического антитела в образце.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что способ предназначен для определения наличия и/или концентрации антигена биспецифического антитела, который находится в комплексе с биспецифическим антителом.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что способ включает следующие этапы:

- получение образца, содержащего антиген и биспецифическое антитело, в котором по меньшей мере 90% антигена находится в комплексе с биспецифическим антителом,

- инкубацию образца, содержащего антиген и биспецифическое антитело, с антиидиотипическим антителом, которое специфически связывается со второй связывающей детерминантой биспецифического антитела, отличной от первой связывающей детерминанты, при этом антиидиотипическое антитело связано с твердой фазой, и

- детекцию указанного комплекса посредством инкубации комплекса, образованного на первом этапе, с меченным антителом, которое специфически связывается с эпитопом антигена, отличным от эпитопа, связанного с биспецифическим антителом, и таким образом определения наличия и/или концентрации антигена биспецифического антитела в образце.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что способ включает следующие этапы:

- инкубацию образца, содержащего антиген и биспецифическое антитело, с биспецифическим антителом в таком количестве, чтобы в образце по меньшей мере 90% антигена находилось в составе комплекса с биспецифическим антителом,

- инкубацию образца, содержащего антиген, находящийся в комплексе с биспецифическим антителом, с антиидиотипическим антителом, которое специфически связывается со второй связывающей детерминантой биспецифического антитела, отличной от первой связывающей детерминанты, при этом антиидиотипическое антитело связано с твердой фазой, и

- детекцию указанного комплекса посредством инкубации комплекса, образованного на предыдущем этапе, с меченным антителом, которое специфически связывается с эпитопом антигена, отличным от эпитопа, связанного с биспецифическим антителом, и таким образом определения наличия и/или концентрации антигена биспецифического антитела в образце.

6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что концентрация биспецифического антитела в образце составляет от 1 мкг/мл до 10 мкг/мл.

7. Способ по любому из пп. 5-6, отличающийся тем, что по меньшей мере 95% антигена находится в составе комплекса с биспецифическим антителом.

8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что по меньшей мере 98% антигена находится в составе комплекса с биспецифическим антителом.

9. Способ определения в образце концентрации антигена биспецифического антитела, находящегося в составе комплекса с биспецифическим антителом, включающий этапы:

- инкубации образца, содержащего антиген и биспецифическое антитело, с антиидиотипическим антителом, которое специфически связывается со связывающей детерминантой биспецифического антитела, отличной от связывающей детерминанты, с которой связан антиген, при этом антиидиотипическое антитело связано с твердой фазой, и

- детекции указанного комплекса посредством инкубации комплекса, образованного на первом этапе, с меченным антителом, которое специфически связывается с эпитопом антигена, отличным от эпитопа, связанного с биспецифическим антителом, и таким образом определения в образце концентрации антигена биспецифического антитела, находящегося в комплексе с биспецифическим антителом.