Способ диагностики пролиферативной активности клеток лейомиомы матки Российский патент 2019 года по МПК G01N33/577 

Изобретение относится к медицине, а именно, к гинекологии, и может быть использовано в качестве дооперационной диагностики уровня пролиферации в лейомиоме матки у пациенток репродуктивного возраста.

Актуальность предлагаемого способа определяется тем, что лейомиома матки является одним из самых распространенных гинекологических заболеваний и занимает 2-е место после воспалительных заболеваний органов малого таза в структуре гинекологической патологии. У пациенток с лейомиомой матки формируется сложный комплекс симптомов, существенно снижающих качество жизни больных, таких как выраженный болевой синдром, дизурические явления, а также бесплодие и невынашивание [Иммунные механизмы быстрого роста миомы матки / А.И. Малышкина, Н.Ю. Сотникова, Ю.С. Анциферова, А.К. Красильникова. - Иваново, 2010. - 272 с.].

Наиболее распространенным методом лечения лейомиомы матки является хирургический, но он всегда связан с возможностью развития послеоперационных осложнений. Кроме того, проведение тотальной гистероэктомии, нежелательно для молодых пациенток с нереализованной репродуктивной функцией, так как им требуется проведение органосохраняющего лечения. В таких случаях врачу важно оценить особенности роста лейомиомы матки и интенсивность пролиферативной активности в опухоли. Известно, что женщин с высоким уровнем пролиферации в миоматозных узлах относят к группе риска по развитию гиперпластических процессов в эндометрии и молочных железах, а также по развитию кистозных доброкачественных и злокачественных образований в яичниках [Миома матки / под ред. И.С. Сидоровой. - М.: МИА, 2003. - 256 с.].

В настоящее время существует несколько подходов к классификации и оценке особенностей роста лейомиомы матки, основанных на числе миоматозных узлов, их локализации и размера [Juhasz-Boss I., Jungmann P., Radosa J., von Heesen A., Stroder R., Juhasz-Boss S., Meyberg-Solomayer G., Solomayer E2. Two novel classification systems for uterine fibroids and subsequent uterine reconstructionn after myomectomy // Arch Gynecol Obstet. - 2017. - 295(3). - P. 675-680].

В литературе есть данные о том, что миомы малых размеров, являясь более клеточными по составу, обладают меньшей способностью к пролиферации, чем опухоли больших размеров, но высокой диагностической значимостью эти данные не обладают [Holdsworth-Carson S.J., Zhao D., Cann L., Bittinger S., Nowell C.J., Rogers P.A. Differences in the cellular composition of small versus large uterine fibroids // Reproduction. - 2016. - Vol. 152(5). - Р. 467-480]. Таким образом, в настоящее время проблематично диагностировать уровень пролиферативной активности в лейомиоме матки на дооперационном этапе, основываясь на данных инструментального и клинического исследования. Для определения эффективной тактики лечения пациенток с целью предотвращения быстрого роста опухоли необходимо разрабатывать малоинвазивные лабораторные способы, позволяющие еще до операции диагностировать высокий и низкий уровень пролиферации в опухоли.

Ранее был предложен способ дифференциальной диагностики типа роста лейомиомы матки у женщин репродуктивного возраста. Авторы предлагали диагностировать «истинный» тип быстрого роста лейомиомы матки, т.е. те случаи, когда увеличение размера опухоли сопровождалось морфологическими признаками пролиферации, и «ложный» тип роста лейомиомы за счет отека, некроза и гиалиноза. Для этой цели в периферической крови женщин с быстрорастущей лейомиомой матки определяют относительное количество лимфоцитов с фенотипом CD4+IL-10+ и при значении этого показателя равного 5,8% или более диагностируют «истинный» рост лейомиомы матки, а при значении менее 5,8% - «ложный» рост [Патент №2361216. Российская Федерация. Способ дифференциальной диагностики типа роста лейомиомы матки / Н.Ю. Сотникова, Л.В. Посисеева, О.М. Бойко и др. // Изобретения. Полезные модели. - 2009. - №19].

К недостаткам предложенного способа относятся:

- уровень данного пула Т-хелперов повышен и у больных с рядом заболеваний, таких как дисплазия соединительной ткани [Regulatoy Т cells in peripheral blood of patients with mixed connective tissue disease / S. Barath, S. SipKa, M. AleKsza et al. // Scand. J. Rheumatol. - 2006. - Vol. 35, №4. - P. 300-304], аутоимунными заболеваниями, такими как системная красная волчанка [Monocytes and T-lymphocytes contribute to a predominance of interleukin-6 and interleukin-10 in systemic lupus erythematosus / S. Mel-lor-Pita, M.J. Citores, R. Castejon et al. // Cytometry В Clin. Cytom. - 2009. - Vol. 76, №4. - P. 261-270], антифосфолипидный синдромом [Immunological features of primary anti-phospholipid syndrome in connection with endothelial dysfunction / P. Soltesz, H. Der, K. Veres et al. // Rheumatology (Oxford). - 2008. - Vol. 47, №11. - P. 1628-1634], инфицирование вирусом простого герпеса [Dysregulated expression of IFN-gamma and IL-10 and impaired IFN-gamma-mediated responses at different disease stages in patients with genital herpes simplex virus-2 infection / R. Singh, A. Kumar, W. D.];

- изменение этого показателя при заболеваниях, не связанных с лейомиомой матки, свидетельствует о низкой специфичности данного способа. Точность метода составляет 79,1%.

Известен способ дифференциальной диагностики типов роста лейомиомы матки. В периферической крови женщин с быстрорастущей лейомиомой матки определяют относительное количество лимфоцитов с фенотипом CD3+CD56+CD158i и при значении этого показателя более 0,8% диагностируют «ложный» рост лейомиомы матки, а при значении равном или менее 0,8% - «истинный» рост с точностью 88,2%, чувствительностью 85,0%, специфичностью 92,9%. [Патент №2542468. Российская Федерация. Способ дифференциальной диагностики типов роста лейомиомы матки / Малышкина А.И., Сотникова Н.Ю., Перетятко Л.П и др.// Изобретения. Полезные модели. - 2015. - №5]. Однако этот способ имеет ряд недостатков:

- разработанный способ предлагается применять только у женщин с быстрорастущей лейомиомой матки, следовательно, контингент женщин с нерастущей миомой матки не подлежит обследованию на данный диагностический параметр;

- диагностика темпа роста миоматозного узла требует повторного обследования с интервалом 6-12 месяцев после впервые выявленной лейомиомы матки;

- иммунные показатели периферической крови не всегда соответствуют процессам, идущим на локальном уровне (например, в эндометрии).

Указанные недостатки предлагается устранить в заявляемом способе.

Технический результат заявляемого способа заключается в дооперационной диагностике пролиферативной активности клеток лейомиомы матки у женщин репродуктивного возраста, позволяющей получить более информативные данные, лучше отражающие патогенетические изменения в лейомиоме, связанные с пролиферацией.

Заявляемый технический результат достигается тем, что в эндометрии женщин, взятом в первую фазу менструального цикла, определяют относительное содержание популяции лимфоцитов с фенотипом CD335+CD336+ в гейте CD56+ и при значении этого показателя 5,4% или менее диагностируют высокий уровень пролиферации в миоматозных узлах, а при значении более 5,4% - низкий уровень пролиферации в опухоли.

Новизна заявляемого способа заключается в том, что впервые предлагается дифференцировать высокий и низкий уровень пролиферативной активности в миоматозных узлах по определению одновременной экспрессии рецепторов естественной цитотоксичности NKp44(CD336) и NKp46(CD335) в гейте эндометриальных CD56+ естественных киллеров (ЕК).

Известно, что NKp46 молекулы могут экспрессироваться как на отдыхающих, так и на активированных ЕК, тогда как NKp44 экспрессируются только на активированных ЕК [Takahashi Н., Yamamoto Т., Yamazaki М., Murase Т., Matsuno Т., Chishima F. Natural Cytotoxicity Receptors in Decidua Natural Killer Cells of Term Normal Pregnancy. J Pregnancy. 2018; 2018: 4382084.]. Лиганды этих рецепторов до конца не установлены. Есть данные, что оба рецептора распознают терминальные остатки сиаловой кислоты нейраминидазы вируса сендай и гемагглютинина вируса гриппа. Кроме того, NKp44 детектирует внеклеточную микобактерию и HIVgp41 [там же].

Рецепторы естественной цитотоксичности (NCR), к которым относятся NKp44 и NKp46, классически определяются как рецепторы, активирующие ЕК и запускающие цитотоксичность и цитокиновый ответ в ЕК в результате ингейджмента лигандов опухолевых клеток [Pazina Т., Shemesh A., Brusilovsky М., Porgador A., Campbell K.S. Regulation of the Functions of Natural Cytotoxicity Receptors by Interactions with Diverse Ligands and Alterations in Splice Variant Expression // Front Immunol. - 2017. - 30 (8). - P. 369.]. Есть также данные о том, что через NKp46 происходит элиминация клеток-мишеней, инфицированных вирусом инфлюэнцы [там же]. Показано снижение дабл-позитивной популяции CD56+CD336+CD335+ лимфоцитов у больных целиакией, энтеропатией, обусловленной глютеном [Marafini I., Monteleone I., Di Fusco D., Sedda S., Cupi M.L., Fina D., Paoluzi A. O., Pallone F., Monteleone G. Celiac Disease-Related Inflammation Is Marked by Reduction of Nkp44/Nkp46-Double Positive Natural Killer Cells // PLoS One. 2016, 11(5): е0155103]. Уровень NKp46+ЕК был значительно снижен у пациенток с привычным невынашиванием в анамнезе, а также у беременных с привычным невынашиванем [Fukui A., Funamizu A., Fukuhara R., Shibahara Н. Expression of natural cytotoxicity receptors and cytokine production on endometrial natural killer cells in women with recurrent pregnancy loss or implantation failure, and the expression of natural cytotoxicity receptors on peripheral blood natural killer cells in pregnant women with a history of recurrent pregnancy loss // J Obstet Gynaecol Res. -2017. - Vol. 43(11). - Р. 1678-1686]. При изучении этих рецепторов при эндометриозе было установлено, что уровень CD56+NKp46+ЕК у пациенток с распространенным эндометриозом был существенно снижен по сравнению с контролем [Funamizu A., Fukui A., Kamoi М., Fuchinoue К., Yokota М., Fukuhara R., Mizunuma Н. Expression of natural cytotoxicity receptors on peritoneal fluid natural killer cell and cytokine production by peritoneal fluid natural killer cell in women with endometriosis // Am J Reprod Immunol. - 2014. - Vol. 71(4). - Р. 359-367]. Для диагностики уровня пролиферации в клетках лейомиомы матки эти рецепторы ранее не использовали.

Учитывая выраженную способность NKp44 и NKp46 рецепторов к индукции реакций цитотоксичности у CD56+ЕК можно предположить, что сниженный уровень эндометриальных ЕК, одновременно экспрессирующих оба рецептора, приводит к срыву локальных цитотоксических реакций, способствуя таким образом угнетению противоопухолевого надзора в матке. В результате недостаточной цитотоксической активности эндометриальных ЕК в ткани лейомиомы матки, непосредственно прилегающей к эндометрию, увеличивается пролиферативная активность опухолевых клеток.

Способ осуществляется следующим образом.

1. Из биоптатов эндометрия, полученных в первую фазу менструального цикла выделяют клеточную суспензию путем механического измельчения ткани в физрастворе, фильтруют ее через стальное сито для удаления крупных неизмельченных фрагментов, дважды отмывают в фосфатно-солевом буфере и ресуспендируют в 5 мл культуральной среды RPMI 1640.

2. К 5 мл полученной клеточной суспензии добавляют 2 мл Фиколл-Урографина и выделяют обогащенную популяцию мононуклеарных клеток эндометрия стандартным методом скоростного центрифугирования (Bourn A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood and bone marrow // Scand. J. Clin. Invest. - 1968. - Vol. 21, №97. - P. 77).

3. Выделенную суспензию мононуклеарных клеток эндометрия дважды отмывают физиологическим раствором, доводят концентрацию клеток до 1×10⁶кл/мл. К 0,1 мл полученной суспензии одновременно добавляют по 5 мкл моноклональных антител анти- CD56, меченных РЕ, aHTH-CD335, меченных PerCP и анти-CD336, меченных АРС (Beckman Coulter, USA). Клетки инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте, отмывают в 1 мл физраствора.

4. На проточном цитометре определяют относительное (процентное) количество двойных позитивных CD336+CD335+ лимфоцитов в CD56+ гейте.

Использование предлагаемого способа позволяет с высокой точностью (81,3%) и чувствительностью (94,4%) оценить высокую и низкую пролиферативную активность клеток миоматозных узлов.

Отличительные признаки заявляемого способа заключаются в том, что в первую фазу менструального цикла в мононуклеарных клетках эндометрия, локализованного в проекции узла, определяют относительное содержание CD336+CD335+ лимфоцитов в CD56+ гейте и при значении этого показателя 5,4% или менее диагностируют высокий уровень пролиферативной активности клеток лейомиомы матки, а при значении более 5,4% - низкий уровень.

Сущность заявляемого способа поясняется следующими примерами:

Пример 1.

Больная К., 38 лет, наблюдалась в женской консультации по поводу миомы матки малых размеров (6 недель). В течение последнего года отмечает появление дизурии. В анамнезе внематочная беременность справа (лапароскопия, тубэктомия). Метод контрацепции - прерванный половой акт. Пациентка планирует беременность.

При влагалищном исследовании: шейка матки без дефектов слизистой, матка увеличена до 12 недель беременности за счет узла преимущественно по правой боковой стенке. Матка плотная, подвижная, безболезненная. Придатки не пальпируются, своды свободны.

По данным УЗС: тело матки 110×90×103 мм неоднородной структуры. По правой боковой стенке визуализируется интрамурально-субсерозный узел 85×72×80 мм. Полость матки не деформирована. М-ЭХО 11 мм. Яичники: правый 33×20 мм, левый 31×24 мм, обычной структуры.

Анализ крови: гемоглобин - 114 г/л, эритроциты - 4,4 Т/л, лейкоциты - 6,4 Г/л, тромбоциты - 264 Г/л, СОЭ -11 мм/ч.

Клинический диагноз: интрамурально-субсерозная лейомиома матки. Быстрый рост. Осложненный акушерско-гинекологический анамнез (ОАГА). Планирование беременности.

По данным иммунологического обследования по заявляемому способу установлено, что содержание в эндометрии, локализованном в проекции узла, CD336+CD335+ в CD56+ гейте - 5,4%.

Заключение: диагностирован высокий уровень пролиферативной активности клеток лейомиомы матки.

Произведена операция: лапароскопия, миомэктомия, гистероскопия.

При гистологическом исследовании операционного материала получены результаты: лейомиома матки, простая гиперплазия эндометрия без атипии клеток с секреторной трансформацией эпителиальных желез.

При полимеразной цепной реакции (ПНР) исследовании ткани миоматозного узла установлено: мРНК ki67 - 36,6 копий пар нормализованных по уровню экспрессии мРНК АСТВ (бета актин). Таким образом, диагноз «высокий уровень пролиферативной активности клеток лейомиомы матки» подтвердился.

Пример 2.

Больная И., 39 лет, наблюдалась в женской консультации по поводу миомы матки малых размеров (5 недель). В течение последнего года отмечает появление дизурии, тянущих болей внизу живота. Метод контрацепции - презерватив.

При влагалищном исследовании: шейка матки без дефектов слизистой, матка увеличена до 12 недель беременности за счет узла по левой боковой стенке. Матка плотная, подвижная, безболезненная. Придатки не пальпируются, своды свободны.

По данным УЗС: тело матки 100×102×113 мм неоднородной структуры. По левой боковой стенке интрамурально-субсерозный узел 68×70×64 мм. Полость матки несколько деформирована. М-ЭХО 12 мм. Яичники: правый 34×24 мм, левый 32×22 мм, обычной структуры.

Анализ крови: гемоглобин - 120 г/л, эритроциты - 4,7 Т/л, лейкоциты - 6,8 Г/л, тромбоциты - 274 Г/л, СОЭ - 14 мм/ч.

Клинический диагноз: интрамурально-субсерозная лейомиома матки. Быстрый рост.

По данным иммунологического обследования по заявляемому способу установлено, что содержание в эндометрии, локализованном в проекции узла, CD336+CD335+ в CD56+ гейте - 4,1%.

Заключение: диагностирован высокий уровень пролиферативной активности клеток лейомиомы матки.

Произведена операция: лапароскопия, миомэктомия, гистероскопия.

При гистологическом исследовании операционного материала получены результаты: лейомиома матки с гиалинозом стромы, локальная простая гиперплазия эндометрия без атипии клеток железистого эпителия, эндометрий пролиферативного типа.

При ПНР исследовании ткани миоматозного узла установлено: мРНК ki67 - 1098,4 копий пар нормализованных по уровню экспрессии мРНК АСТВ. Таким образом, диагноз «высокий уровень пролиферативной активности клеток лейомиомы матки» подтвердился.

Пример 3.

Больная Ш., 31 год, регулярно наблюдалась в женской консультации. В течение последнего года отметила, что менструации стали обильнее, появилась слабость. Консультирована гинекологом, выявлена миома матки. Беременностей не было. Метод контрацепции - презерватив.

При влагалищном исследовании: шейка матки без дефектов слизистой, матка увеличена до 9 недель беременности за счет узла по передней стенке. Матка плотная, подвижная, безболезненная. Придатки не пальпируются, своды свободны.

По данным УЗС: тело матки 86×73×80 мм неоднородной структуры. По передней стенке интрамурально-субсерозный узел 52×60×62 мм. Полость матки не деформирована. М-ЭХО 11 мм. Яичники: правый 33×25 мм, левый 30×24 мм, обычной структуры.

Анализ крови: гемоглобин - 99 г/л, эритроциты - 3,9 Т/л, лейкоциты - 7,8 Г/л, тромбоциты - 250 Г/л, СОЭ - 16 мм/ч.

Клинический диагноз: интрамурально-субсерозная лейомиома матки (впервые выявленная). Нарушения менструальной функции (НМФ) по типу гиперменореи, приводящей к анемии.

По данным иммунологического обследования по заявляемому способу установлено, что содержание в эндометрии, локализованном в проекции узла, CD336+CD335+ в CD56+ гейте - 29,2%.

Заключение: диагностирован низкий уровень пролиферативной активности клеток лейомиомы матки.

Произведена операция: лапароскопия, миомэктомия, гистероскопия.

При гистологическом исследовании операционного материала получены результаты: лейомиома матки, эндометрий пролиферативного типа, хронический эндометрит.

При ПНР исследовании ткани миоматозного узла установлено: мРНК ki67 - не выявлен. Таким образом, диагноз «низкий уровень пролиферативной активности клеток лейомиомы матки» подтвердился.

Пример 4.

Больная А., 32 лет, регулярно наблюдалась в женской консультации. В анамнезе 1 своевременные роды, 1 медикаментозный аборт, миома матки. В течение трех лет динамического наблюдения размеры узла стабильны. На данный момент планирует беременность. Гинекологом рекомендована миомэктомия.

При влагалищном исследовании: шейка матки без дефектов слизистой, матка увеличена до 8 недель беременности за счет узла по задней стенке. Матка плотная, подвижная, безболезненная. Придатки не пальпируются, своды свободны.

По данным УЗС: тело матки 79×55×58 мм неоднородной структуры. По задней стенке интрамурально-субсерозный узел 52×46×40 мм. Полость матки незначительно деформирована. М-ЭХО 11 мм. Яичники: правый 34×26 мм, левый 32×25 мм, обычной структуры.

Анализ крови: гемоглобин - 121 г/л, эритроциты - 4,0 Т/л, лейкоциты - 6,8 Г/л, тромбоциты - 248 Г/л, СОЭ - 16 мм/ч.

Клинический диагноз: интрамурально-субсерозная лейомиома матки.

По данным иммунологического обследования по заявляемому способу установлено, что содержание в эндометрии, локализованном в проекции узла, CD336+CD335+ в CD56+ гейте - 1,6%

Заключение: диагностирован высокий уровень пролиферативной активности клеток лейомиомы матки.

Произведена операция: лапароскопия, миомэктомия, гистероскопия.

При гистологическом исследовании операционного материала получены результаты: лейомиома матки, эндометрий пролиферативного типа, хронический эндометрит;

При ПЦР исследовании ткани миоматозного узла установлено: мРНК ki67 - 486,3 копий пар нормализованных по уровню экспрессии мРНК АСТВ. Таким образом, диагноз «высокий уровень пролиферативной активности клеток лейомиомы матки» подтвердился.

Указанным способом обследовано 32 женщины репродуктивного возраста с симптоматической лейомиомой матки. Данные исследований приведены в таблице 1.

Преимущества заявляемого способа:

1. Способ применим для всех пациенток репродуктивного возраста, нуждающихся в дооперационной диагностике уровня пролиферативной активности в миоматозных узлах, а не только для женщин с быстрорастущей лейомиомой матки.

2. В предлагаемом способе материалом для исследования является эндометрий, но его взятие не связано с дополнительными вмешательствами, т.к. происходит во время плановой гистероскопии у всех пациенток и предусмотрено стандартом обследования женщин с лейомиомой матки.

3. Исследование эндометрия, непосредственно прилегающего к миометрию, в котором развивается сама опухоль, позволяет получить более информативные данные, лучше отражающие патогенетические изменения в лейомиоме, связанные с пролиферацией, чем периферическая кровь.

4. Данные по пролиферативной активности лейомиомы матки позволяют обосновать показания для таргетной терапии.

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, и может быть использовано в качестве дооперационной диагностики уровня пролиферации в лейомиоме матки у пациенток репродуктивного возраста. Для осуществления способа в первую фазу менструального цикла в мононуклеарных клетках эндометрия, локализованного в проекции узла, определяют относительное содержание CD336+CD335+ лимфоцитов в CD56+ гейте. При значении этого показателя 5,4% или менее диагностируют высокий уровень пролиферативной активности клеток лейомиомы матки. При значении более 5,4% - низкий уровень пролиферативной активности клеток лейомиомы матки. Технический результат - дооперационная диагностика пролиферативной активности клеток лейомиомы матки у женщин репродуктивного возраста, позволяющая получить более информативные данные, лучше отражающие патогенетические изменения в лейомиоме, связанные с пролиферацией. 1 табл., 4 пр.

Способ диагностики пролиферативной активности клеток лейомиомы матки путем иммунологического исследования биологического материала женщин репродуктивного возраста, отличающийся тем, что в первую фазу менструального цикла в мононуклеарных клетках эндометрия, локализованного в проекции узла, определяют относительное содержание CD336+CD335+ лимфоцитов в CD56+ гейте и при значении этого показателя 5,4% или менее диагностируют высокий уровень пролиферативной активности клеток лейомиомы матки, а при значении более 5,4% - низкий уровень пролиферативной активности клеток лейомиомы матки.