СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ТЕМПОВ РОСТА ЛЕЙОМИОМЫ МАТКИ У ЖЕНЩИН РЕПРОДУКТИВНОГО ВОЗРАСТА Российский патент 2019 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к области медицины, а именно гинекологии, и может быть использовано для прогнозирования темпов роста лейомиомы матки у женщин репродуктивного возраста.

Проблема лейомиомы матки (особенно у женщин репродуктивного возраста) является чрезвычайно важной в связи с широкой распространенностью и ее «омоложением», а также отрицательным влиянием на состояние здоровья и репродуктивную функцию женщин, приводя к бесплодию, невышиванию беременности, пери - и неонатальной патологии, что имеет не только медицинское, но и социальное значение (Стрижаков А.Н., Давыдов А.И., Пашков В.М., Лебедев В.А. Доброкачественные заболевания матки. М.: ГЭОТАР-Медиа. 2011. 288 с.; Кондратович Л.М. Современный взгляд на этиологию, патогенез и способы лечения миомы матки // Российский медицинский журнал. 2014. №5. С. 36-40; Iashvili T.I., Kherodinashvili S.S., Dzhorbenadze T.G., Shermadini T.I. Clinico-morpho-ulrasonographical characteristics of large uterine leiomyoma in females during late reproductive and premenopausal period // Georgian. Med. News. 2006. Vol. 139. P. 40-43). Миома матки занимает ведущее место среди доброкачественных опухолей половых органов и наблюдается у 20-40% женщин репродуктивного возраста, причем пик заболеваемости приходится на социально активный возраст (Айламазян Э.К. Гинекология: Учебник для медицинских вузов. СПб: СпецЛит, 2008. - 132 с; Bulun S.E. Uterine Fibroids // New England Journal of Medicine. 2013. Vol. 369. P. 1344-1355.).

Вопросы изучения этиопатогенеза миомы матки, несмотря на большое число исследований, продолжают оставаться в центре внимания отечественных и зарубежных авторов (Сидорова И.С. Миома матки. М.: МИА. 2003. 256 с.; Савицкий Г.А., Савицкий А.Г. Миома матки. СПб.: «ЭЛБИ-СГ16». 2003. 236 с.; Ligon А.Н., Morton С.С. Leiomyomata: heritability and cytogenetic studies // Hum. Reprod. Update. 2001. №7. P. 8-14; Vilos G.A., Allaire C., Laberge P.Y., Leyland N.; The management of uterine leiomyomas // J. Obstet. Gynaecol. Can. 2015. Vol. 37, №2. P. 157-178). До настоящего времени остаются дискуссионными различные гипотезы и научные положения, объясняющие возникновение и течение миомы матки, что затрудняет выбор наиболее оптимальных методов лечения данной патологии (Гриценко Я.В., Константинова О.Д., Черкасов С.В. Миома матки в современном мире: актуальные вопросы патогенеза, диагностики и лечения // Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН. 2012. №3. С. 7; Кондратович Л.М. Современный взгляд на этиологию, патогенез и способы лечения миомы матки // Российский медицинский журнал. 2014. №5. С. 36-40.). Кроме изучения причин, приводящих к возникновению миомы матки, несомненно, важным представляется выяснение темпов ее роста. Это является задачей, решение которой позволит своевременно определять стратегию и тактику терапии в каждом конкретном случае.

Среди известных в патентной и научно-медицинской литературе методов прогнозирования и диагностики роста лейомиомы матки можно отметить следующие.

В патенте РФ №2258222 (25.08.2003) предложен способ дифференциальной диагностики быстрорастущей лейомиомы матки путем исследования биологического материала, отличающийся тем, что в биоптате эндометрия определяют содержание эпидермального фактора роста и при его значении 6 нг/мл и менее диагностируют «ложный» рост миомы, а при значении более 6 нг/мл - «истинный» рост миомы.

Недостатками данного способа являются: инвазивность (взятие ЦУГа эндометрия); необходимость госпитализации пациентки для проведения гистероскопии; трудоемкость (выделение из эндометрия обогащенной популяции мононуклеарных клеток); необходимость дорогостоящего оборудования и тест-систем для выполнения ИФА; недостаточная специфичность (60%), изменение этого фактора роста имеет место и при других гинекологических заболеваниях (Киселев В.И., Сидорова И.С., Унанян А.Л., Муйжнек Е.Л. Гиперпластические процессы органов женской репродуктивной системы: теория и практика. М.: ИД «МЕДПРАКТИКА-М». 2010. 468 с.).

Известен способ прогнозирования роста лейомиомы матки (патент РФ №2340897, 16.07.2007) путем иммунологического исследования периферической венозной крови, отличающийся тем, что определяют относительное содержание IL-8+моноцитов и при его значениях равных 63% или больших прогнозируют быстрый рост лейомиомы матки в течение года.

Недостатками данного способа являются его трудоемкость: предварительное выделение обогащенной популяции мононуклеарных клеток, последующее специфическое внутриклеточное окрашивание и измерение относительного количества на проточном цитометре; использование дорогостоящих реактивов и аппаратуры, недоступной для учреждений практического здравоохранения.

Также не лишен недостатков способ прогнозирования быстрого роста миомы матки (патент РФ 2350259, 04.06.2007), заключающийся в том, что определяют количество медицинских абортов в анамнезе, наличие артериальной гипертензии во время предшествующих беременностей, угрозы невынашивания беременности, продолжительность родов, наличие аномалий родовой деятельности в предшествующих родах, воспалительных послеродовых заболеваний, а также хронических заболеваний желудочно-кишечного тракта и рассчитывают показатель прогноза скорости роста миомы матки и при его значении больше 1,70 прогнозируют быстрый рост опухоли. Способ имеет ряд недостатков: для прогноза предлагается оценить большой комплекс клинических факторов, что значительно затрудняет интерпретацию результатов; отсутствуют данные о специфичности и чувствительности способа, невысокая точность - 73,1%.

Известен способ дифференциальной диагностики типа роста лейомиомы матки (патент РФ 2361216, 07.04.2008) путем иммунологического исследования периферической венозной крови, отличающийся тем, что определяют относительное количество СД-4+IL-10+лимфоцитов и при значении этого показателя равном 5,8% или более диагностируют «истинный» рост лейомиомы матки, а при значении менее 5,8%-«ложный» рост лейомиомы матки у женщин репродуктивного возраста. К недостаткам способа относятся: чрезвычайная трудоемкость; необходимость наличия дорогостоящих питательных сред, реактивов и импортной аппаратуры; невысокая точность (26% ложноположительных и ложноотрицательных результатов).

В патенте РФ №2542468 (07.10.2013) предложен способ дифференциальной диагностики типов быстрого роста матки путем иммунологического исследования периферической венозной крови у женщин репродуктивного возраста, отличающийся тем, что определяют относительное количество CD3+CD56+CD158i лимфоцитов, и при значении этого показателя, равном 0,8% или менее, диагностируют «истинный» рост лейомиомы матки, а при значении более 0,8%-«ложный» рост лейомиомы.

Для данного способа характерны недостатки, присущие предыдущему способу: трудоемкость, дорогостоящее оборудование, возможность использования только в стационарах, оснащенных специальной аппаратурой.

Прототипом заявляемого изобретения выбран способ прогнозирования роста лейомиомы матки (патент РФ №2236684, 17.07.2002) путем исследования периферической крови, отличающийся тем, что определяют относительное содержание СД38+ лимфоцитов и при их значениях, равных или больших 23%, прогнозируют быстрый рост миомы матки в течение года. Данный способ, как и предыдущие, имеет ряд недостатков:

- недостаточная точность: 24,0% составляют ложно-положительные и ложноотрицательные результаты;

- недостаточная чувствительность: измерение прогностического показателя в относительных, а не абсолютных величинах;

- недостаточная специфичность, поскольку количество СД38+ лимфоцитов значительно варьируют в периферической крови при различных видах инфекционной и неинфекционной патологии, эндотелиальной дисфункции органов, структурно-функциональных изменениях бронхолегочной системы, в том числе гладкомышечных клеток бронхов (Шломина И.А., Вязьмина Е.С., Новиков В.В., Крыжанова М.А., Мартынова Т.Г. Определение уровня растворимых CD38, CD50, CD95 антигенов и растворимого гетеродимера «β2-микроглобулин-HLA антигены I класса» при цитомегаловирусной инфекции и гриппе // Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. Серия: Биология. 2001. №1. С. 225-231; Соловьева И.А., Собко Е.А., А.Ю. Крапошина, Демко И.В., Салмина А.Б. Современные представления о роли CD38 в патогенезе бронхиальной астмы // Пульмонология. 2013. №5. С. 81-84; Janeway Ch. A., Travers P. Immunobiology: The immune system in health and disease. 6th ed. New York; London. 2004. 848 p.);

- трудоемкость способа (предварительное получение клеточной фракции лимфоцитов);

- использование дорогостоящей аппаратуры (проточный цитометр), что ограничивает возможности его практического использования.

Указанные недостатки предлагается устранить в заявляемом способе.

Задача изобретения состоит в разработке высокоинформативного способа, позволяющего с высокой точностью прогнозировать темпы роста лейомиомы матки.

Поставленная задача решается следующим образом: в сыворотке крови женщин репродуктивного возраста с лейомиомой матки определяют активность нейтральных и кислых протеиназ и при значении активности нейтральных протеиназ выше 4,6 мкмоль/л и активности кислых протеиназ выше 3,3 мкмоль/л прогнозируют быстрый рост лейомиомы.

Технический результат, получаемый в ходе использования изобретения, состоит в повышении точности и специфичности способа прогнозирования темпов роста лейомиомы матки, что позволит своевременно выбрать и назначить соответствующую адекватную терапию.

Новизна заявляемого способа заключается в том, что впервые предлагается прогнозировать темпы роста лейомиомы матки у женщин репродуктивного возраста по однократному определению в сыворотке крови активности нейтральных и кислых протеиназ.

В сложной цепи нарушений, приводящих к возникновению миомы матки, важное значение имеет изменение интенсивности белкового обмена, нарушение протеомного спектра в миоматозной ткани, дисбаланс катаболизма и анаболизма белков, играющих ключевую роль во всех регуляторных клеточных реакциях (Lin С.Р., Chen Y.W., Liu W.H., Chou Н.С., Chang Y.P., Lin S.T., Li J.M., Jian S.F., Lee Y.R., Chan H.L. Proteomic identification of plasma biomarkers in uterine leiomyoma // Mol. Biosyst. 2012. Vol. 8, №4. P. 1136-1145; Lemeer, S.; Gholami, A.M.; Wu, Z.; Kuster, B. Quantitative Proteome Profiling of human Myoma and Myometrium tissue reveals kinase expression signatures with potential for therapeutic intervention. Proteomics. 2015. Vol. 15. P. 356-364; Ura В., Scrimin F., Arrigoni G., Franchin C., Monasta L., Ricci G. A Proteomic Approach for the Identification of Up-Regulated Proteins Involved in the Metabolic Process of the Leiomyoma // Int. J. Mol. Sci. 2016. Vol. 17, №4. P. 540.). Существенное место в указанных процессах занимают протеиназы, которым принадлежит центральная роль в биологическом распаде и обновлении белковых молекул. Изменение активности протеиназ также не остается без существенных последствий для их структуры и биологической активности, приводя к посттрансляционной модификации. Причем только сочетанное действие нейтральных и кислых эндо- и экзопротеиназ, функционирующих во всех субклеточных фракциях, полноценно регулирует обмен белков (Дин Р. Процессы распада в клетке. М.: Мир. 1981. 120 с.; С., Bond J.S. Proteases: multifunctional enzymes in life and disease // J. Biol. Chem. 2008. Vol. 283, №45. P. 30433-30437). Поэтому одновременное определение обоих типов протеиназ позволяет более объективно оценить нарушение обмена белков и прогнозировать темпы роста миомы матки.

Нейтральные протеиназы, активные при физиологических рН имеют особое значение в изменении структуры и, как следствие, функции белков, связанных с пластическими, иммунологическими процессами, реакциями апоптоза и ангиогенеза. В то же время, кислые протеиназы в большей степени участвуют в деструктивных процессах, причем деструкция белков плазматических мембран может способствовать выходу в межклеточный матрикс лейомиомы цитокинов, факторов роста и других реактивных молекул клеточной поверхности, повышающих пролиферативную активность миоцитов, что облегчает протеазо-зависимый рост миомы (Nagase Н. A personal journey with matrix metalloproteinases // Biological Chemistry. 2016. Vol. 397, №9. P. 805-813). Кроме того, определенное влияние протеиназ на возникновение и темпы роста миомы, очевидно, обусловлено также их активным действием на уровень и структуру коллагена (в частности характер внутримолекулярных перекрестных связей), важного компонента соединительной ткани в большом количестве, представленной в псевдокапсуле (Malvasi A., Cavallotti С., Morroni М., Lorenzi Т., Dell'Edera D., Nicolardi G., Tinelli A. Uterine fibroid pseudocapsule studied by transmission electron microscopy // Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 2012. Vol. 162, №2. P. 187-191; Kamel M., Wagih M., Kilic G.S., Diaz-Arrastia C.R., Baraka M.A., Salama S.A. Overhydroxylation of lysine of collagen increases uterine fibroids proliferation: roles of lysyl hydroxylases, lysyl oxidases, and matrix metalloproteinases // BioMed Research International. 2017. Vol. 2017. [5316845]. DOI: 10.1155/2017/5316845).

Определение в сыворотке крови активности нейтральных и кислых протеиназ позволяет судить о создании условий для развития дисбаланса в обмене регуляторных белков, играющего важную роль в развитии лейомиомы матки.

Нами установлены прогностические параметры прогноза темпов роста лейомиомы матки по определению в сыворотке крови женщин репродуктивного возраста активности нейтральных и кислых протеиназ и при значении нейтральных протеиназ выше 4,6 мкмоль/л и активности кислых протеиназ выше 3,3 мкмоль/л прогнозируют быстрый рост лейомиомы.

Подробное описание способа и примеры его клинического использования.

Способ осуществляется следующим образом.

У женщины репродуктивного возраста с лейомиомой матки утром натощак производят забор крови из локтевой вены. Для определения активности нейтральных протеиназ к 0,2 мл сыворотки крови добавляют в качестве белка-субстрата 0,2 мл 1% альбумина в 0,1 М трис-HCl буфере (рН 7,8) и инкубируют 30 минут при 37°С. Реакцию останавливают добавлением 0,2 мл 5% раствора трихлоруксусной кислоты, после чего пробы центрифугируют при 3000 об/мин. В контрольные пробы раствор трихлоруксусной кислоты прибавляли сразу после внесения белка-субстрата без инкубации. В центрифугатах определяют количество образовавшегося при протеолизе тирозина с использованием реактива Фолина. Пробы колориметрируют в видимой области спектра при 750 нм. Активность нейтральных протеиназ определяют как разность оптической плотности между опытными и контрольными пробами и выражают в мкмоль/л. Определение кислых протеиназ и расчет их активности выполняют аналогичным способом, используя в качестве субстрата реакции 1% раствор гемоглобина в натрий-ацетатном буфере (рН 3,5). Расчет содержания тирозина проводят по калибровочному графику, составленному с использованием растворов стандартной аминокислоты. Время исследования 60 минут.

Работоспособность заявляемого способа подтверждается следующими клиническими примерами.

Пример. 1 Больная Е., 34 г.Обратилась в женскую консультацию с жалобами на обильные менструации. В анамнезе беременностей не было. Пациентка вне брака. ВМС в полости матки не стояла. Контрацепция барьерным методом. При влагалищном исследовании - шейка матки без дефектов слизистой, тело матки увеличено до 7 недель беременности, плотное, подвижное, безболезненное. Придатки не определяются. По данным УЗИ: тело матки неоднородной структуры 70×55×67 мм, на задней стенке узел 40 мм, правый яичник 37×17 мм, левый яичник 34×11 мм, оба яичника обычной структуры.

Общий анализ крови: Гемоглобин - 110 г/л, гематокрит - 33,1%, эритроциты - 3,16×10¹²/л, лейкоциты - 5,0×10⁹/л, нейтрофилы - 52%, лимфоциты - 35%, моноциты - 6%, эозинофилы - 6%, базофилы - 1%, тромбоциты - 287×10⁹/л.

Клинический диагноз: субсерозная лейомиома матки, дисменорея.

По данным биохимического анализа активность нейтральных протеиназ в сыворотке крови 4,7 мкмоль/л, активность кислых протеиназ 3,4 мкмоль/л, что выше заявляемых параметров.

Заключение: прогнозируется быстрый рост лейомиомы матки в течение года.

При обращении через 1 год больная предъявляет жалобы на слабость, обильные менструации, головокружение, боли внизу живота. При осмотре: шейка матки без дефектов слизистой, тело матки до 12 недель беременности, подвижное, плотное, безболезненное, структура бугристая за счет субсерозных узлов. Придатки не пальпируются. Данные УЗИ: тело матки 120×85×90 мм с несколькими субсерозными узлами, наибольшие - в области дна - 65 мм, на задней стенке - 40 мм, правый яичник 33×25 мм, левый яичник 36×19 мм. Оба яичника нормальной структуры. Анализ крови: НЬ - 99 г/л. Клинический диагноз: субсерозная лейомиома матки больших размеров, быстрый рост опухоли (быстрый рост диагностируется при увеличении размеров лейомиомы за год на срок 5 недель беременности и выше), анемия 1 степени.

Больная направлена в стационар на обследование и оперативное лечение. То есть прогноз быстрого роста лейомиомы по заявляемому способу подтвердился.

Пример 2. Больная Н., 32 лет. Наблюдается в клинике НИИАП по поводу миомы матки (7-8 недель) в течение 2х лет. Предъявляет жалобы на тянущие боли внизу живота в течение 1 года. Миома матки с сентября 2015 г, когда при плановом УЗИ впервые выявили миому матки. В анамнезе 1 роды путем кесарева сечения в сроке 39-40 недель, без осложнений. Пациентка вне брака. ВМС в полости матки не стояла. Контрацепция барьерным методом.

При влагалищном исследовании: наружные половые органы развиты правильно. Шейка матки конической формы. Слизистая не изменена. При бимануальном исследовании: тело матки увеличено как при 7-8 недель условной беременности, за счет миоматозных узлов, подвижное, безболезненное при пальпации. Придатки с обеих сторон не определяются, область их безболезненна. Своды свободные. Выделения светлые, умеренные.

Общий анализ крови: Гемоглобин - 116 г/л, гематокрит - 35,5%, эритроциты - 3,96×10¹²/л, лейкоциты - 5,0×10⁹/л, нейтрофилы - 63,2%, лимфоциты - 25,6%, моноциты - 7,2%, эозинофилы - 3,4%, базофилы - 0,6%, тромбоциты - 205×10⁹/л.

УЗИ: Тело матки 72×50×60 мм, неоднородной структуры. Эндометрий 5,4 мм. Миометрий неоднородный. По передней стенке матки лоцируется субсерозный узел диаметром 32 мм. Правый яичник 35×29 мм. Левый яичник 31×24 мм.

Клинический диагноз: субсерозная лейомиома матки.

По данным биохимического анализа активность нейтральных протеиназ в сыворотке крови 4,6 мкмоль/л, активность кислых протеиназ 3,3 мкмоль/л, что соответствует показателям отсутствия быстрого роста лейомиомы.

Заключение: прогнозируется отсутствие роста лейомиомы матки в течение года.

При повторном осмотре через 1 год гинекологический статус больной тот же (подтвержден данными УЗИ). Прогноз по заявляемому способу подтвердился.

По заявляемому способу нами обследовано 60 женщин с лейомиомой матки, у которых в сыворотке крови была определена активность нейтральных и кислых протеиназ. Из обследованных пациенток у 48 активность нейтральных протеиназ была выше 4,6 мкмоль/л, активность кислых протеиназ - выше 3,3 мкмоль/л, что позволяло прогнозировать у них в дальнейшем быстрый рост лейомиомы. У 47 из 48 женщин с указанными величинами активности протеиназ через 12 месяцев наблюдения по данным влагалищного исследования и УЗИ был выявлен быстрый рост лейомиомы матки (истинно положительный результат) и лишь у одной женщины быстрый рост лейомиомы не был подтвержден (ложноположительный результат). Ложноотрицательные результаты отсутствовали. У 12 женщин с лейомиомой матки активность нейтральных протеиназ была 4,6 мкмоль/л и ниже, активность кислых протеиназ -3,3 мкмоль/л и ниже. Через год при осмотре и УЗИ быстрого роста миомы матки у них не наблюдалось.

Из приведенных данных следует, что точность и специфичность способа 98%.

Вышеизложенное подтверждает прогностическую ценность заявляемого метода. Таким образом, заявляемый способ более эффективен по сравнению с известными и обладает рядом преимуществ:

1. Высокая точность - 98%, специфичность - 98%.

2. Доступность применения способа в широкой клинической практике.

3. Возможность раннего прогнозирования темпов роста лейомиомы матки.

Заявляемый способ позволяет прогнозировать быстрый рост лейомиомы матки и может быть рекомендован к использованию в гинекологической практике для своевременного выбора стратегии и тактики терапии этой патологии.

Изобретение относится к области медицины, а именно гинекологии, и может быть использовано для прогнозирования темпов роста лейомиомы матки у женщин репродуктивного возраста. Сущность способа заключается в том, что в сыворотке крови женщин определяют активность нейтральных и кислых протеиназ и при значении активности нейтральных протеиназ выше 4,6 мкмоль/л и активности кислых протеиназ выше 3,3 мкмоль/л прогнозируют быстрый рост лейомиомы матки. Способ позволяет повысить точность и специфичность прогнозирования темпов роста лейомиомы матки у женщин репродуктивного возраста. 2 пр.

Способ прогнозирования темпов роста лейомиомы матки у женщин репродуктивного возраста, путем исследования периферической крови, отличающийся тем, что в сыворотке крови женщин определяют активность нейтральных и кислых протеиназ и при значении активности нейтральных протеиназ выше 4,6 мкмоль/л и активности кислых протеиназ выше 3,3 мкмоль/л прогнозируют быстрый рост лейомиомы матки.