СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ТИПОВ РОСТА ЛЕЙОМИОМЫ МАТКИ Российский патент 2015 года по МПК G01N33/577 

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, и может быть использовано в качестве дифференциальной дооперационной диагностики типов быстрого роста лейомиомы матки у женщин репродуктивного возраста.

Актуальность предлагаемого способа определяется тем, что миома матки является одним из наиболее распространенных гинекологических заболеваний. Развиваясь у женщин репродуктивного возраста, миома матки нарушает их репродуктивную функцию, приводит к бесплодию, невынашиванию беременности, перинатальным потерям, что отрицательно влияет на демографическую ситуацию в стране (Иммунные механизмы быстрого роста миомы матки / А.И. Малышкина, Н.Ю. Сотникова, Ю.С. Анциферова, А.К. Красильникова. - Иваново, 2010. - 272 с.).

Существует понятие быстрого роста миомы, под которым понимается увеличение размеров матки за последний год наблюдения на величину, соответствующую 4-5 неделям беременности. При изучении морфологических критериев быстрого роста миом различают «истинный» тип роста опухоли, обусловленный пролиферацией миоцитов, и «ложный», когда узел увеличивается за счет вторичных изменений (отек, гиалиноз, склероз, петрификация), связанных с нарушением кровоснабжения (Иммунные механизмы быстрого роста миомы матки / А.И. Малышкина, Н.Ю. Сотникова, Ю.С. Анциферова, А.К. Красильникова. - Иваново, 2010. - 272 с.). Известно, что пролиферирующая миома матки имеет менее благоприятное течение. У пациенток с данным типом роста опухоли часто возникает озлокачествление опухоли и ее рецидив. Женщин с пролиферирующим типом роста миомы относят к группе риска по развитию гиперпластических процессов в эндометрии и молочных железах, а также по развитию кистозных доброкачественных и злокачественных образований в яичниках (Миома матки / под ред. И.С. Сидоровой. - М.: МИА, 2003. - 256 с.).

При выборе тактики ведения и лечения больных важным моментом является определение типов роста опухоли. В связи с этим необходим поиск новых критериев, позволяющих максимально точно дифференцировать «истинный» и «ложный» типы роста лейомиомы матки.

Известен способ дифференциальной диагностики быстрого роста лейомиомы матки по содержанию эпидермального фактора роста в эндометрии. При его значении, равном 6 нг/мл и менее, диагностируют «ложный» рост миомы, а при значении более 6 нг/мл - «истинный» рост миомы (патент №2258222. Российская Федерация. Способ дифференциальной диагностики быстрорастущей лейомиомы матки / Л.В. Посисеева, А.И. Малышкина, А.К. Красильникова и др. // Изобретения. Полезные модели. - 2005. - №22). Однако этот способ имеет ряд недостатков.

1. Способ является инвазивным.

2. Взятие эндометрия на исследование осуществляется при проведении гистероскопии в стационарных условиях, что связано с госпитализацией пациентки и использованием дорогостоящего оборудования.

3. Способ чрезвычайно трудоемок, поскольку для его осуществления требуется выделение из ткани эндометрия обогащенной популяции мононуклеарных клеток с последующим их культивированием в течение 24 часов. Для проведения культуральных исследований необходимы дорогостоящие питательные среды и СO2-инкубатор.

Предложен способ дифференциальной диагностики быстрорастущей лейомиомы матки у женщин репродуктивного возраста по определению в крови содержания TNF-α, абсолютного содержания CD4+ лимфоцитов, относительного содержания T-цитотоксических лимфоцитов CD8+, результатов спонтанного НСТ-теста, а в сыворотке крови общей комплементарной активности и вычислению индекса Y по формуле. При значении Y меньше 4,6 прогнозируют непролиферирующий вариант роста миомы матки; при Y больше 6,8 прогнозируют пролиферирующий вариант роста миомы матки; при Y от 4,6 до 6,8 - неопределенный прогноз, требующий применения метода описательной статистики, с использованием качественных анамнестических и клинических критериев (патент №2400757. Российская Федерация. Способ диагностики морфологических типов лейомиомы матки / Т.Е. Бызова, О.Ю. Севостьянова, И.А. Газиева и др. // Изобретения. Полезные модели. - 2010. - №27). Однако этот способ имеет ряд недостатков.

1. Способ чрезвычайно трудоемок, поскольку включает в себя проведение большого количества методик и, соответственно, имеет более высокую себестоимость.

2. Существует интервал значений от 4,6 до 6,8, который расценивается как неопределенный прогноз, требующий применения дополнительных методов исследования, что оказывает влияние на точность полученных результатов. Согласно математической формуле данного исследования достоверность результатов составляет 70%. Наиболее близким по техническому решению к заявляемому способу является способ дифференциальной диагностики типа роста лейомиомы матки у женщин репродуктивного возраста. В периферической крови женщин с быстрорастущей лейомиомой матки определяют относительное количество лимфоцитов с фенотипом CD4+IL-10+ и при значении этого показателя, равного 5,8% или более, диагностируют «истинный» рост лейомиомы матки, а при значении менее 5,8% - «ложный» рост (патент №2361216. Российская Федерация. Способ дифференциальной диагностики типа роста лейомиомы матки / Н.Ю. Сотникова, Л.В. Посисеева, О.М. Бойко и др. // Изобретения. Полезные модели. - 2009. - №19).

Однако было показано, что уровень данного пула T-хелперов повышен и у больных с рядом заболеваний. Установлено, что содержание CD4+IL-10+ увеличено у больных с дисплазиями соединительной ткани (Regulatory T cells in peripheral blood of patients with mixed connective tissue disease / S. Barath, S. SipKa, M. AleKsza et al. // Scand. J. Rheumatol. - 2006. - Vol.35, №4. - P.300-304), с аутоимунными заболеваниями, такими как системная красная волчанка (Monocytes and T lymphocytes contribute to a predominance of interieukin 6 and interleukin 10 in systemic lupus erythematosus / S. Mellor-Pita, M.J. Citores, R. Castejon et al. // Cytometry В Clin. Cytom. - 2009. - Vol.76, №4. - P.261-270), и с антифосфолипидным синдромом (Immunological features of primary anti-phospholipid syndrome in connection with endothelial dysfunction / P. Soltesz, H. Der, K. Veres et al. // Rheumatology (Oxford). - 2008. - Vol.47, №11. - P.1628-1634). Кроме этого существует ряд исследований, Bourn А., подтверждающих изменение данного показателя при инфицировании вирусом простого герпеса (Dysregulated expression of IFN-gamma and IL-10 and impaired IFN-gamma-mediated responses at different disease stages in patients with genital herpes simplex virus-2 infection / R. Singh, A. Kumar, W.D. Creery et al. // Clin. Exp.Immunol. - 2003. - Vol.133, №1. - P.97-107). Кроме того, отмечается увеличение этого пула T-хелперов в крови пациентов с аллергией после проведения им курса аллерген-специфической иммунотерапии (Induction of T regulatory cells by standardized house dust mite immunotherapie: an increase in CD4+CD25+ interieukin-10+ T cells expressing peripheral tissue trafficking / L.M. Gardner, F.C. Thien, J.A. Douglass et al. // Clin. Exp. Allergy. - 2004. - Vol.34, №8. - P.1209-1219). Таким образом, данный показатель изменяется при широком спектре заболеваний, в связи с чем специфичность метода снижается. Точность метода составляет 79,1%. Указанные недостатки предлагается устранить в заявляемом способе.

Техническим решением заявляемого способа является повышение точности дооперационной дифференциальной диагностики типов роста лейомиомы матки у женщин репродуктивного возраста до 88,2%, чувствительности до 85,0%, специфичности до 92,9%. Заявляемый технический результат достигается тем, что в периферической крови женщин с быстрорастущей лейомиомой матки определяют относительное количество лимфоцитов с фенотипом CD3+CD56+CD158i и при значении этого показателя более 0,8% диагностируют «ложный» рост лейомиомы матки, а при значении, равном или менее 0,8%, - «истинный» рост.

Новизна заявляемого способа заключается в том, что впервые предлагается дифференцировать «истинный» и «ложный» типы быстрого роста лейомиомы матки по определению в периферической крови экспрессии рецептора CD158i на естественных киллерных T-лимфоцитах (ЕК-Т), маркерами которых являются CD3+CD56+. Ранее было показано, что уровень данного показателя снижается в эндометриальной ткани у женщин с быстрорастущей миомой матки (Характер экспрессии KIR рецепторов естественными киллерными T-лимфоцитами в эндометрии при миоме матки различных темпов роста / А.И. Малышкина, Н.Ю. Сотникова, Д.Н. Воронин и др. // Проблемы репродукции. - 2012. - Спец. выпуск. - С.186). В других работах изучали рецепторы (CD1581) на естественных киллерах (CD56+). Выявлено увеличение CD56+CD158i лимфоцитов при ВИЧ-инфекции (Perturbation of the natural killer cell compartment during primary human immunodeficiency virus 1 infection primarily involving the CD56 bright subset / P. Mantegani, G. Tambussi, L. Galli et al. / Immunology. - 2010. - Vol.129, №2. - P.220-233) и хроническом гепатите В (High frequency of polyfunctional natural killer cells with high expression of NKG2D is linked to HBV-specific T-helper type 1 immune control / I. Carey, A. Mendes, S. Bansal et al. // Journal of Hepatology. - 2010. - Vol.52. - P.176). Кроме того, отмечено увеличение CD56+CD158i лимфоцитов при онкологическом заболевании системы крови - лейкемии (T-cell large granular lymphocyte leukemias have multiple phenotypic abnormalities involving pan-T-cell antigens and receptors for MHC molecules / R. Lundell, L. Hartung, S. Hill et al. // Am J. Clin. Pathol. - 2005. - Vol.124, №6. - P.937-946). Для дифференциальной диагностики типов быстрого роста лейомиомы матки содержание CD3+CD56+CD158i лимфоцитов ранее не использовали.

Популяцию лимфоцитов с фенотипом CD3+CD56+ относят к естественным киллерным T-лимфоцитам (ЕК-Т). Установлено, что мишенями для этих клеток служат трансформированные (инфицированные) и быстро пролиферирующие клетки (Ярилин А.А. Иммунология. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. - 752 с.). Цитотоксическая активность ЕК-Т регулируется посредством активирующих и ингибирующих KIR рецепторов, взаимодействующих с лигандами на клетках мишенях (Activating and inhibitory receptors of natural killer cells / J. Pegram Hollie, Daniel М. Andrews, Mark J. Smyth et al. // Immunology and Cell Biology. - 2011. - Vol.89. - P.216-224). Рецепторы CD158i являются активаторами цитотоксических лимфоцитов, направленных против клеток-мишеней, что объясняется их участием в противоопухолевом иммунитете (Activating and inhibitory receptors of natural killer cells CD158 Receptor Controls Cytotoxic T-Lymphocyte Susceptibility to Tumor-Mediated Activation-Induced Cell Death by Interfering with Fas Signaling / A. Gati, N. Guerra, C. Gaudin et al. //Cancer Research. - 2003. - Vol.63, №1. - P.7475). Изменения в экспрессии активирующих CD158i рецепторов, лигандами которых являются молекулы HLA-Cw на поверхности трансформированных клеток миометрия, отражают состояние противоопухолевого надзора со стороны иммунной системы. Таким образом, ЕК-Т, экспрессирующие активирующие KIR рецепторы, участвуют в механизмах быстрого роста миомы матки.

Способ осуществляется по стандартной методике следующим образом.

1) К 3 мл гепаринизированной венозной крови, полученной из кубитальной вены, добавляют 3 мл среды 199 и выделяют обогащенную популяцию мононуклеарных клеток стандартным методом скоростного центрифугирования (Bourn A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood and bone marrow // Scand. J. Clin. Invest. - 1968. - Vol.21, №97. - P.77).

2) Суспензию мононуклеарных клеток дважды отмывают физиологическим раствором, доводят концентрацию клеток до 1×10⁶ кл/мн. К 0,1 мл полученной суспензии одновременно добавляют 20 мкл моноклональных антител анти-СD3, меченных PC 5, анти-CD56, меченных РЕ, анти-СВ158i, меченных FICE (ООО «Сорбент», Москва). Клетки инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте, отмывают в 1 мл физраствора.

3) Определяют относительное (процентное) количество тройных позитивных CD3+CD56+CD158i лимфоцитов в лимфоцитарном гейте на проточном цитометре.

Использование предлагаемого способа позволяет с высокой точностью 88,2% дифференцировать «истинный» и «ложный» типы быстрого роста лейомиомы матки.

Отличительными признаками способа являются: установление дифференциально-диагностического параметра относительного содержания CD3+CD56+CD158i лимфоцитов, при значении которого 0,8% или менее диагностируют «истинный» рост лейомиомы матки, а при значении более 0,8% - «ложный» рост лейомиомы матки.

Сущность заявляемого способа поясняется следующими примерами.

Пример 1. Больная З., 39 лет, поступила на плановое оперативное лечение. Наблюдалась в женской консультации с миомой матки малых размеров (6 недель). При очередном осмотре через год после первого обращения обнаружен быстрый рост миомы матки. У больной появились боли внизу живота и пояснице, обильные менструации, сопровождающиеся снижением гемоглобина. В анамнезе 1 самопроизвольный выкидыш, 3 медицинских аборта. Метод контрацепции - барьерный. Пациентка планирует беременность.

При осмотре: шейка матки без дефектов слизистой, тело матки увеличено до 18 недель беременности за счет миоматозного узла, расположенного на задней стенке матки. Тело матки плотное, подвижное, безболезненное. Придатки при пальпации без особенностей.

По данным УЗС: тело матки неоднородной структуры, размеры вместе с узлом - 142×130×122 мм. В задней стенке матки расположен интрамурально-субсерозный узел 132×123×107 мм. Полость матки не деформирована. Толщина эндометрия 13 мм. Правый яичник 30×18 мм. Левый яичник 38×30 мм. Оба яичника обычной структуры.

Анализ крови: гемоглобин - 94 г/л, эритроциты 4,0 т/л, цветной показатель 0,6, лейкоциты - 5,2 г/л, палочкоядерные нейтрофилы - 2, сегментоядерные нейтрофилы - 59, моноциты - 8, лимфоциты - 28, СОЭ - 15 мм/ч.

Клинический диагноз: интрамурально-субсерозная лейомиома матки. Быстрый рост. Гиперменорея, приводящая к анемии. Болевой синдром.

По данным иммунологического обследования по заявляемому способу установлено, что содержание в периферической крови CD3+CD56+CD158i лимфоцитов составило 0,55%, что ниже заявляемого параметра (0,8%).

Заключение: диагностирован «истинный» тип быстрого роста лейомиомы матки.

Учитывая возраст женщины и нереализованную репродуктивную функцию, запланирован органосохраняющий объем оперативного вмешательства. В связи с полученными результатами типа роста миомы матки, а поскольку данный тип опухоли обладает менее благоприятным течением, пациентке в качестве предоперационной подготовки назначен агонист Гн-РГ - бусерелин 3,75 мг. Препарат вводился один раз в 28 дней внутримышечно в течение 2 месяцев. На втором этапе, через 3 недели после последней инъекции, женщина поступила на оперативное лечение.

По данным УЗС после лечения: тело матки неоднородной структуры, размеры вместе с узлом - 125×122×102 мм. На задней стенки матки расположен интрамурально-субсерозный узел 120×108×87 мм. Полость матки не деформирована. Толщина эндометрия 8 мм. Правый яичник 30×18 мм. Левый яичник 38×30 мм. Оба яичника обычной структуры.

Анализ крови (после лечения): гемоглобин - 120 г/л, эритроциты 4,2 т/л, лейкоциты - 5,3 г/л, палочкоядерные нейтрофилы - 1, сегментоядерные нейтрофилы - 63, моноциты - 8, лимфоциты - 26, СОЭ -18 мм/ч.

Произведена операция - лапаротомия, миомэктомия.

При гистологическом исследовании операционного материала получен ответ: «пролиферирующая лейомиома матки». Таким образом, диагноз «истинного» типа роста лейомиомы матки подтвердился.

Пример 2. Больная Б., 38 лет. В течение года наблюдалась в женской консультации по поводу миомы матки малых размеров (6-7 недель). За указанный период менструации стали более обильными, появилась слабость после менструации. В анамнезе 1 медицинский аборт, 1 своевременные роды без осложнений. Метод контрацепции - барьерный.

При влагалищном исследовании: шейка цилиндрическая, без дефектов слизистой. Матка увеличена до 12-13 недель беременности, за счет множества узлов, мягковатая при пальпации, подвижная, безболезненная. Придатки не пальпируются, своды свободные.

По данным ультразвукового сканирования (УЗС): тело матки размерами 120×80×115 мм, неоднородное по структуре. В передней стенке матки расположен интрамурально-субсерозный узел диаметром 48 мм, в правой боковой стенке диаметром 38 мм, в левом углу узел диаметром 48 мм, в задней стенке узел диаметром 57 мм. Все узлы неоднородной структуры. Полость матки не деформирована. Толщина эндометрия 10 мм. Правый яичник 38×26 мм, левый яичник 37×20 мм. Оба яичника обычной структуры.

Анализ крови: гемоглобин - 63 г/л, эритроциты - 2,78 т/л, цветной показатель 0,7, лейкоциты - 3,9 г/л, палочкоядерные нейтрофилы - 5, сегментоядерные нейтрофилы - 50, моноциты - 9, лимфоциты - 31, СОЭ - 20 мм/ч.

Клинический диагноз: множественная интрамурально-субсерозная лейомиома матки больших размеров. Быстрый рост. Гиперменорея, приводящая к анемии.

По данным иммунологического обследования по заявляемому способу установлено, что содержание в периферической крови CD3+CD56+CD158i лимфоцитов составило 1,35%, что выше заявляемого параметра (0,8%).

Заключение: диагностирован «ложный» тип быстрого роста лейомиомы матки.

Произведена операция: субтотальная гистерэктомия без придатков.

При гистологическом исследовании операционного материала был установлен диагноз: «лейомиома матки с выраженным отеком и очаговым гиалинозом стромы». Таким образом, диагноз «ложного» типа роста лейомиомы матки подтвердился.

Пример 3. Больная Б., 41 год. Наблюдалась в женской консультации в течение 4 лет с миомой матки небольших размеров (5-6 недель). В течение последнего года появились обильные менструации, сопровождающиеся снижением гемоглобина. В анамнезе 1 своевременные роды без осложнений, 3 медицинских аборта. Метод контрацепции - барьерный.

При влагалищном исследовании: шейка матки без дефектов слизистой, матка увеличена до 15 недель беременности, за счет узла, расположенного в передней стенке матки. Матка плотная, подвижная, безболезненная. Придатки не пальпируются, своды свободные.

По данным УЗС: тело матки размерами 120×75×100 мм, неоднородной структуры. На передней стенке визуализируется интрамурально-субсерозный узел 95×65×80 мм с явлением отека. Полость матки не деформирована. Толщина эндометрия 12 мм. Правый яичник размерами 38×25 мм, левый яичник размерами 37×20 мм, обычной структуры.

Анализ крови: гемоглобин - 121 г/л, эритроциты - 4,55 т/л, цветной показатель 0,8, лейкоциты - 4,0 г/л, сегментоядерные нейтрофилы - 62, моноциты - 6, лимфоциты - 26, СОЭ - 19 мм/ч.

Клинический диагноз: интрамурально-субсерозная лейомиома матки. Быстрый рост. Гиперменорея. Болевой синдром.

По данным иммунологического обследования по заявляемому способу установлено, что содержание в периферической крови CD3+CD56+CD158i лимфоцитов составило 0,8%, что соответствует пограничному значению заявляемого параметра.

Заключение: диагностируется «истинный» тип быстрого роста лейомиомы матки.

Произведена операция: субтотальная гистерэктомия без придатков.

При гистологическом исследовании операционного материала получен результат: «пролиферирующая лейомиома с умеренным количеством сосудов и отеком стромы». Таким образом, диагноз «истинного» типа роста подтвердился.

Указанным способом обследовано 34 женщины репродуктивного возраста с быстрорастущей лейомиомой матки. Данные исследований приведены в таблице 1.

Таблица 1 Показатель Количество обследованных Всего женщин 34 истинно-положительный результат 17 ложно-положительный результат 1 истинно-отрицательный результат 13 ложно-отрицательный результат 3 Итого: точность заявляемого способа - 88,2%, чувствительность заявляемого способа - 85,0%, специфичность заявляемого способа - 92,9%

Преимущества заявляемого способа.

1. Способ повышает точность, чувствительность, специфичность дифференциальной диагностики типов роста лейомиомы матки.

2. Способ расширяет арсенал средств для дифференциальной диагностики типов роста лейомиомы матки.

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии и может быть использовано в качестве дифференциальной дооперационной диагностики типов быстрого роста лейомиомы матки. Для этого в периферической венозной крови женщины с быстрорастущей лейомиомой матки определяют показатель относительного содержания CD3+CD56+CD158i лимфоцитов. При его значении, равном 0,8% или менее, диагностируют «истинный» рост лейомиомы матки, а при значении более 0,8% - «ложный» рост миомы. Использование данного способа дает возможность проводить дооперационную диагностику типов быстрого роста лейомиомы матки у женщин репродуктивного возраста, что позволит своевременно разработать оптимальную тактику ведения больной и сделать выбор между консервативным и оперативным методами лечения. 1 табл., 3 пр.

Способ дифференциальной диагностики типов быстрого роста лейомиомы матки путем иммунологического исследования периферической венозной крови у женщин репродуктивного возраста, отличающийся тем, что определяют относительное количество CD3+CD56+CD158i лимфоцитов, и при значении этого показателя, равного 0,8% или менее, диагностируют «истинный» рост лейомиомы матки, а при значении более 0,8% - «ложный» рост лейомиомы матки.