ОФТАЛЬМОЛОГИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ЦИКЛОСПОРИН И ТРЕГАЛОЗУ Российский патент 2019 года по МПК A61K31/7016 A61K38/13 A61P27/02 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к офтальмологической композиции, способу ее изготовления и способу профилактики или лечения глазных болезней.

Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно заявке на патент Республики Корея № 10-2014-0141089, поданной в Республике Корея 17 октября 2014 г., раскрытие которой включено в настоящую заявку посредством ссылки.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Слезная пленка состоит из трех слоев: масляного, водного и слизистого, таким образом, слезная пленка имеет трехслойную структуру. Синдром сухого глаза, или заболевания сухого глаза (далее именуемые "сухой глаз"), очень вариативен, и во многих случаях его причина неизвестна, и, таким образом, сухой глаз определяется не как болезнь, а как аномальное состояние глаз, вызванное нестабильностью слезной пленки, обусловленной уменьшением или изменением количества или качества слезы и более быстрым, чем в норме, разрушением слезной пленки.

Согласно определению, к категории сухого глаза относят такие заболевания, как сухой кератоконъюнктивит, патология роговичного эпителия, сниженная выработка слезной жидкости, синдром Стивенса-Джонсона, синдром сухого глаза, синдром Шегрена, недостаточность выработки слезы, гиперемия глаза, нестабильность слезной пленки или отек глаз. Кроме того, к категории сухого глаза относятся аллергический конъюнктивит, вирусный конъюнктивит или сухой глаз после хирургического лечения катаракты. Кроме того, в последнее время в связи с увеличением числа лиц, носящих контактные линзы, с провождением времени в искусственной кондиционируемой среде, и с возможностью контакта с терминалами визуального отображения (ТВО) ввиду широкого использования телевизоров и компьютеров, число факторов, способствующих развитию сухого глаза, резко возросло, и в результате этого к категории сухого глаза относят также сухой глаз, связанный с ношением контакных линз или с использованием ТВО.

Кроме того, лица с сухим глазом во многих случаях страдают сухим кератоконъюнктивитом. В частности, в случае недостаточности выработки слизистого слоя слезной пленки наблюдается серьезное повреждение роговицы, что приводит к патологиям эпителия роговицы и конъюнктивы, и к категории патологий эпителия роговицы и конъюнктивы относят сухой глаз, дефект эпителия роговицы, дефект эпителия конъюнктивы, эрозию эпителия роговицы, уменьшение толщины роговицы, инфильтрат роговицы, прободение роговицы или отслоение роговичного эпителия, и патологии эпителия роговицы и конъюнктивы приводят к язве роговицы, кератиту, конъюнктивиту, поверхностному точечному кератиту, сухому кератоконъюнктивиту, верхнему лимбальному кератоконъюнктивиту, нитчатому кератиту и инфекционным глазным заболеваниям эпителия роговицы и конъюнктивы. Патология эпителия роговицы и конъюнктивы может быть вызвана травмой глаза, микрохирургическим вмешательством или ношением жестких контактных линз.

Лечение сухих глаз направлено на то, чтобы обеспечить сохранение, по меньшей мере, заранее определенного объема слез консервативным способом, таким как восполнение жидкости с помощью искусственной слезы в виде глазных капель, или временная или постоянная окклюзия слезных каналов, но в последнее время, с расширением терапевтических концепций, в лечении сухого глаза наблюдается тенденция в сторону активной терапии с использованием лекарств, способствующих выработке слезной жидкости даже в случае сухого глаза легкой степени, как альтернативы пассивному лечению, имеющего целью смягчение симптомов. В соответствии с этой тенденцией для лечения сухого глаза все чаще используются иммуносупрессивные препараты. Иммуносупрессивные препараты включают циклоспорин, сиролимус, такролимус и их производные. Среди них одно из имеющихся в продаже лекарств - циклоспорин А 0,05%, глазные капли в форме эмульсии (Restasis ^®). Оно показало свою эффективность при лечении синдрома сухого глаза и связанной с ним патологии эпителия роговицы и конъюнктивы, но в то же время известны его многочисленные побочные эффекты, из них наиболее распространено жжение в глазах, а также у некоторых пациентов наблюдались гиперемия конъюнктивы, выделения из глаз, эпифора, боль в глазах, ощущение инородного тела, зуд, острая стреляющая боль, расстройство зрения (часто нечеткое зрение). В соответствии с работой Ji Eun Lee et al., при контакте с 0,05% циклоспорина в течение 10 минут наблюдается увеличение апоптоза и уменьшение жизнеспособности клеток, и для того, чтобы избежать токсичного воздействия на эпителиальные клетки роговицы, продолжительность воздействия 0,05% циклоспорина должна быть меньше 10 минут (J Korean Ophthalmol Soc 48(10):1399-1409, 2007), а жизнеспособность клеток значительно снижена при концентрации циклоспорина 0,05% (5 мкг/мл) и более (Graefe's Arch Clin Exp Ophthalmol (2006) 244: 382-389).

В дополнение к циклоспорину, использование избыточного количества иммуносупрессивных препаратов вызывает побочные эффекты, такие как анемия, лейкопения, тромбоцитопения и потеря волос. Однако в соответствии с современной тенденцией для лечения тяжелых случаев сухого глаза, а также клинических симптомов дискомфорта даже в легких случаях, для лечения сухого глаза активно используются иммуносуппрессивные препараты. Кроме того, как правило, пациентам, страдающим сухим глазом, назначают много типов лекарств и частые дозы, однако известно, что эти факторы усложняют схему приема лекарств и снижают лечебный эффект.

С другой стороны, трегалоза представляет собой дисахарид, в котором две молекулы глюкозы связаны своими восстанавливающими группами, и имеет три оптических изомера: α,α-трегалоза, α,β-трегалоза и β,β-трегалоза. В природе трегалоза часто встречается в бактериях, растениях и животных, а в пищевой промышленности трегалоза имеет широкий спектр применений, ввиду своих уникальных характеристик, таких как относительно низкая сладость, способность замедлять старение крахмала и предотвращать деградацию белка во время замораживания/сушки. Кроме того, Корейская патентная заявка № 10-2002-0021320 (опубликованная 20 марта 2002 года) содержит информацию о том, что композиция, содержащая трегалозу в качестве единственного активного ингредиента, оказывает влияние на лечение синдрома Шегрена.

Однако до настоящего времени не имелось свидетельств о влиянии офтальмологической композиции, содержащей два ингредиента, циклоспорин и трегалозу, особенно в отношении профилактики, облегчения и дальнейшего лечения широкого спектра заболеваний сухого глаза и, кроме того, не существует обзора синергических эффектов комбинации этих двух ингредиентов и весового отношения либо интервала весовых процентных долей, в котором наблюдается синергический эффект.

Сущность изобретения

Техническая проблема

Проблема, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в создании офтальмологической композиции, оказывающей эквивалентное или превосходящее действие с меньшим количеством циклоспорина, и оказывающего превосходящий комбинированный эффект в лечении сухого глаза, который может быть обусловлен различными причинами и под которым понимается не единственная болезнь, а различные состояния и симптомы.

Техническое решение

Для достижения цели настоящее изобретение представляет собой офтальмологическую композицию, содержащую циклоспорин и трегалозу, в котором два ингредиента смешиваются в заранее установленном соотношении или с заданными весовыми процентными долями. Изобретатели обнаружили, что эта офтальмологическая композиция оказывает эквивалентный или превосходящий эффект с меньшим количеством циклоспорина, который не может быть вызван композицией, содержащей только циклоспорин или только трегалозу в качестве активного ингредиента, например, превосходящий комбинированный эффект на сухой глаз, который может быть обусловлен различными причинами, таким как сухой воздух, воспаление глаз или консерванты, и выражаться в различных состояниях и симптомах, и создали изобретение, приготовив его как циклоспорин-трегалозную комплексную композицию.

Таким образом, настоящее изобретение представляет собой офтальмологическую композицию, включающую циклоспорин и трегалозу в качестве активных ингредиентов, способ его приготовления, и способ профилактики, облегчения или лечения глазных заболеваний (предпочтительно, сухого глаза) с использованием указанной офтальмологической композиции.

В частности, настоящее изобретение представляет собой офтальмологическую композицию, включающую циклоспорин и трегалозу в качестве активных ингредиентов, и предпочтительно офтальмологическую композицию для профилактики, облегчения или лечения сухого глаза.

Дополнительно, настоящее изобретение представляет собой метод профилактики, облегчения симптомов или лечения глазных болезней (предпочтительно, сухого глаза) путем применения офтальмологической композиции, включающей фармацевтически эффективное количество циклоспорина и трегалозы, для млекопитающих (предпочтительно, человека).

Дополнительно, настоящее изобретение предлагает применение циклоспорина и трегалозы для приготовления офтальмологической композиции (предпочтительно, офтальмологической композиции для профилактики, облегчения или лечения сухого глаза).

В офтальмологической композиции в соответствии с настоящим изобретением, смешивание двух активных ингредиентов в заранее определенном соотношении приводит к синергическому эффекту и, дополнительно, он максимизируется, причем весовое соотношение циклоспорина к трегалозе составляет предпочтительно 1: 20-200, 1: 20-190, 1: 20-180, 1: 20-170, 1: 20-160, 1: 20-150, 1: 20-140, 1: 20-130, 1: 20-120, 1: 20-110, 1: 20-100, 1: 20-90, 1: 20-80, 1: 20-70, 1: 20-60, 1: 20-50, 1: 20-40, 1: 20-30, 1: 20, 1: 30-200, 1: 30-190, 1: 30-180, 1: 30-170, 1: 30-160, 1: 30-150, 1: 30-140, 1: 30-130, 1: 30-120, 1: 30-110, 1: 30-100, 1: 30-90, 1: 30-80, 1: 30-70, 1: 30-60, 1: 30-50, 1: 30-40, 1: 30, 1: 40-200, 1: 40-190, 1: 40-180, 1: 40-170, 1: 40-160, 1: 40-150, 1: 40-140, 1: 40-130, 1: 40-120, 1: 40-110, 1: 40-100, 1: 40-90, 1: 40-80, 1: 40-70, 1: 40-60, 1: 40-50, 1: 40, 1: 50-200, 1: 50-190, 1: 50-180, 1: 50-170, 1: 50-160, 1: 50-150. Если весовое соотношение составляет менее 1: 20, то нельзя ожидать комбинированного воздействия на сухой глаз, который может выражаться в различных состояниях и симптомах, а если весовое соотношение превышает 1: 200, то невозможно поддерживать эффективное осмотическое давление в глазных каплях (около 230-320 мОсмоль/кг) и сохранять состояние прозрачой нано-эмульсии.

Кроме того, когда два активных ингредиента смешиваются в пределах определенного интервала весовых процентных соотношений, возникает синергический эффект, и, дополнительно, он максимизирован, причем весовая доля циклоспорина в процентах составляет более чем 0,01% в расчете на общий вес офтальмологической композиции. Однако предпочтительная весовая доля циклоспорина составляет менее 0,1%, и если весовая доля циклоспорина составляет более чем 0,1%, возникают побочные эффекты, такие как ощущение жжения и нечеткое зрение. Предпочтительно, весовая доля циклоспорина составляет более 0,01 весовых % и менее или ровно 0,05 весовых %, более 0,01 весовых % и менее 0,05 весовых %, более или ровно 0,02 весовых % и менее или ровно 0,05 весовых %, более или ровно 0,02 весовых % и менее 0,05 весовых %, более или ровно 0,02 весовых % и менее или ровно 0,05 весовых %, более 0,01 весовых % и менее или ровно 0,04 весовых %, более или ровно 0,02 весовых % и менее или ровно 0,04 весовых %, более 0,01 весовых % и менее или ровно 0,03 весовых %, более или ровно 0,02 весовых % и менее или ровно 0,03 весовых %, или 0,02 весовых %, в расчете на общий вес офтальмологической композиции.

Кроме того, весовая доля трегалозаы может больше или равна 0,5 весовых % в расчете на общий вес офтальмологической композиции. Например, весовая доля трегалозы может составлять 0,5 весовых % или более, 0,6 весовых % или более, 0,7 весовых % или более, 0,8 весовых % или более, 0,9 весовых % или более, 1 весовой процент или более, 1,1 весовых % или более, 1,2 весовых % или более, 1,3 весовых % или более, 1,4 весовых % или более, 1,5 весовых % или более, 1,6 весовых % или более, 1,7 весовых % или более, 1,8 весовых % или более, 1,9 весовых % или более, 2 весовых % или более, 2,1 весовых % или более, 2,2 весовых % или более, 2,3 весовых % или более, 2,4 весовых % или более, 2,5 весовых % или более, 2,6 весовых % или более, 2,7 весовых % или более, 2,8 весовых % или более, 2,9 весовых % или более, 3 весовых % или более, 3,1 весовых % или более, 3,2 весовых % или более, 3,3 весовых % или более, 3,4 весовых % или более, 3,5 весовых % или более, 3,6 весовых % или более, 3,7 весовых % или более, 3.8 весовых % или более, 3,9 весовых % или более, 4 весовых % или более, 4,1 весовых % или более, 4,2 весовых % или более, 4,3 весовых % или более, 4,4 весовых % или более, 4,5 весовых % или более, 4,6 весовых % или более, 4,7 весовых % или более, 4,8 весовых % или более, 4,9 весовых % или более, 5 весовых % или более, 7,5 весовых % или менее, 0,5-7,5 весовых %, 0,5-7 весовых %, 0,5-6,5 весовых %, 0,5-5,5 весовых %, 0,5-5 весовых %, 0,5-4,5 весовых %, 0,5-4 весовых %, 0,5-3,5 весовых %, 0,5-3 весовых %, 0,6-7,5 весовых %, 0,6-7 весовых %, 0,6-6,5 весовых %, 0,6-5,5 весовых %, 0,6-5 весовых %, 0,6-4,5 весовых %, 0,6-4 весовых %, 0,6-3,5 весовых %, 0,6-3 весовых %, 0,6-0,3, 0,7-7,5 весовых %, 0,7-7 весовых %, 0,7-6,5 весовых %, 0,7-5,5 весовых %, 0,7-5 весовых %, 0,7-4,5 весовых %, 0,7-4 весовых %, 0,7-3,5 весовых %, 0,7-3 весовых %, 0,8-7,5 весовых %, 0,8-7 весовых %, 0,8-6,5 весовых %, 0,8-5,5 весовых %, 0,8-5 весовых %, 0,8-4,5 весовых %, 0,8-4 весовых %, 0,8-3,5 весовых %, 0,8-3 весовых %, 0,9-7,5 весовых %, 0,9-7 весовых %, 0,9-6,5 весовых %, 0,9-5,5 весовых %, 0,9-5 весовых %, 0,9-4,5 весовых %, 0,9-4 весовых %, 0,9-3,5 весовых %, 0,9-3 весовых %, 1-7,5 весовых %, 1-7 весовых %, 1-6,5 весовых %, 1-5,5 весовых %, 1-5 весовых %, 1-4,5 весовых %, 1-4 весовых %, 1-3,5 весовых %, 1-3 весовых %, в расчете на общий вес офтальмологической композиции. Если весовая доля трегалозы составляет менее 0,5%, то нельзя ожидать комбинированного воздействия на сухой глаз, который может выражаться в различных состояниях и симптомах, а если весовая доля трегалозы составляет менее 0,5%, то невозможно поддерживать эффективное осмотическое давление в глазных каплях (около 230~320 мОсмоль/кг) и сохранять состояние прозрачной нано-эмульсии.

Например, офтальмологическая композиция может включать более 0,01 весовых % и менее 0,1 весовых % циклоспорина и 0,5-7,5 весовых % трегалозы, от более 0,01 весовых % до менее 0,05 весовых % циклоспорина и от 0,5-5 весовых % трегалозы, от более 0,01 весовых % до менее 0,05 весовых % циклоспорина и 0,5-3,5 весовых % трегалозы, от 0,02 или более весовых % до менее 0,05 весовых % циклоспорина и 0,5-5 весовых % трегалозы, от 0,02 или более весовых % до менее 0,05 весовых % циклоспорина и 0,5-3,5 весовых % трегалозы, от 0,02 или более весовых % до менее 0,05 весовых % циклоспорина и 1-3 весовых % трегалозы, 0,02 весовых % циклоспорина и 1-3 весовых % трегалозы.

Предпочтительно, для синергического действия циклоспорина и трегалозы, в соответствии с настоящим изобретением, офтальмологическая композиция предпочтительно включает циклоспорин и трегалозу в пределах вышеуказанных весовых соотношений или/и весовой процентной доли.

В настоящем документе, в предположении, что активный ингредиент содержится в офтальмологической композиции в той же пропорции, рассчитываемой от общего веса в процентах, по сравнению с офтальмологической композицией, содержащей только лишь циклоспорин или только лишь трегалозу в качестве активного ингредиента, термин «синергическое действие» может включать усиление или повышение эффективности воздействия на ту же самую болезнь, оказываемого офтальмологической композицией, содержащей только лишь циклоспорин или только лишь трегалозу в качестве активного ингредиента, воздействие на болезнь, которого не оказывает офтальмологическая композиция, содержащая только лишь циклоспорин или только лишь трегалозу в качестве активного ингредиента, или ослабленный побочный эффект или недостаток офтальмологической композиции, содержащей только лишь циклоспорин или только лишь трегалозу в качестве активного ингредиента. Например, синергическое действие может заключаться в значительно усиленном эффекте лечения по сравнению с применением только лишь циклоспорина или только лишь трегалозы, уменьшении уровня повреждения роговицы, восстановлении объема выработки слезы, снижении уровня воспаления глаз, повышении качества слезы, облегчении раздражения глаз (включая эритему, отек и усиленные конъюнктивальные выделения), поддержании, смазке и увлажнении слезной пленки, а также усилении секреции муцина ввиду увеличения активности бокаловидных клеток, отвечающих за секрецию муцина, во всех моделях сухого глаза, вызываемых сухим воздухом, воспалением и консервантами.

В описании изобретения термины "циклоспорин" или "трегалоза" могут использоваться независимо от способа приготовления и происхождения, если это не противоречит цели настоящего изобретения.

Кроме того, циклоспорин может подразумевать в качестве активного вещества циклоспорин А, производные циклоспорина А, циклоспорин B, циклоспорин C, циклоспорин D и их комбинации, но предпочтительно подразумевает циклоспорин А. Трегалоза может включать в качестве активного вещества три оптических изомера, а именно, α,α-трегалозу, α,β-трегалозу, β,β-трегалозу и их комбинации.

Кроме того, в настоящем описании изобретения термины "циклоспорин" или "трегалоза" охватывают их фармацевтически приемлемые производные, а под фармацевтически приемлемыми производными будут пониматься вещества, имеющие или выполняющие ту же биологическую функцию и/или активность, что и циклоспорин или трегалоза, которые могут включать в себя предшественники циклоспорина или трегалозы, их сольваты и их сокристаллы, если это не противоречит цели настоящего изобретения.

Термин "предшественник" относится к препарату циклоспорина или трегалозы, содержащему количество вещества, которое может быть экспериментально обнаружено в обмене веществ через заранее определенный промежуток времени после приема.

Термин "сольват" относится к химическому соединению, включающему стехиометрическое или нестехиометрическое число молекул растворителя, удерживаемых нековалентными молекулярными силами. В случае, если растворитель представляет собой воду, сольват является гидратом.

Термин "сокристалл" относится к кристалической форме, включающей по меньшей мере один компонент в кристаллической решетке. Coкристалл включает кристаллический молекулярный комплекс, состоящий из по меньшей мере двух нелетучих соединений, удерживаемых вместе в кристаллической решетке неионными взаимодействиями. В настоящем описании изобретения понятие сокристалла включает в себя фармацевтический сокристалл, который является кристаллическим молекулярным комплексом, содержащим циклоспорин или трегалозу, и по меньшей мере одно дополнительное нелетучее соединение (далее именуемое "контрмолекула"). В фармацевтическом сокристалле контрмолекула может быть нетоксичной фармацевтически приемлемой молекулой, например, пищевой добавкой, консервантом, вспомогательным веществом или другим активным фармацевтическим ингредиентом (АФИ). В некоторых вариантах осуществления фармацевтический сокристалл улучшает некоторые физические свойства лекарственных препаратов (например, растворимость, скорость растворения, биологическая доступность/стабильность), не нарушая при этом целостности химической структуры АФИ.

Циклоспорин, включая его фармацевтически приемлемые производные, и трегалоза, включая ее фармацевтически приемлемые производные, могут быть приготовлены различными химическими или ферментативными способами в пределах уровня техники, или могут быть получены из коммерческих продуктов.

Офтальмологическая композиция в соответствии с настоящим изобретением может быть приготовлена путем смешивания активных ингредиентов, а именно, циклоспорина и трегалозы.

Офтальмологическая композиция в соответствии с настоящим изобретением может быть приготовлена как фармацевтическая композиция, препарат общего воздействия и продукт лечебного питания.

Офтальмологическая композиция в соответствии с настоящим изобретением может включать такие добавки, как фармацевтически (или диетологически) приемлемый носитель, вспомогательное вещество или разбавитель, причем характеристики, которым должно удовлетворять добавочное вещество, включают, не ограничиваясь нижеперечисленным, совместимость с циклоспорином и трегалозой, биосовместимость и соответствующую температуру обработки.

Офтальмологическая композиция в соответствии с настоящим изобретением может быть приготовлена в виде препарата, принимаемого не орально, например, в виде офтальмологического раствора, глазной мази, инъекции и примочки для глаз, или в виде препарата, принимаемого орально, например, в виде таблетки, капсулы и гранулы, причем предпочтительным способом применения является офтальмологический раствор, и наиболее предпочтительным способом применения являются глазные капли.

В случае если препарат приготовлен в виде офтальмологического раствора, офтальмологический раствор может применяться любым способом, используемым для офтальмологического раствора, например, в виде водного офтальмологического раствора, такого как водный офтальмологический раствор, водно-эмульсионный офтальмологический раствор, вязкий офтальмологический раствор и разбавленный офтальмологический раствор; либо в виде неводного офтальмологического раствора, такого как неводный офтальмологический раствор и неводно-эмульсионный офтальмологический раствор.

В случае если препарат приготовлен в виде водно-эмульсионного офтальмологического раствора, офтальмологический раствор может включать различные добавки в пределах уровня техники, например, регулятор тоничности, буферное вещество, стабилизатор, регулятор pH, загуститель, консервант, хелатирующее вещество, солюбилизатор и растворитель, если это не противоречит цели настоящего изобретения. Буферное вещество может быть выбрано из группы веществ, состоящей из фосфатного буфера, боратного буфера, цитратного буфера, тартратного буфера, ацетатного буфера (например, ацетата натрия), трометамина и аминокислот, но не ограничивающейся вышеперечисленным. Предпочтительно использование фосфатного буфера. Регулятор тоничности может быть выбран из группы веществ, состоящей из сахаров, таких как сорбитол, глюкоза, эритритол и маннитол, альдитолов, таких как глицерин, полиэтиленгликоль и полипропиленгликоль, а также солей, таких как хлорид натрия, но не ограничивающейся вышеперечисленным. Консервант может быть выбран из группы веществ, состоящей из бензалкония хлорида, бензетония хлорида, алкилпараоксибензоатов, таких как метилпараоксибензоат и этилпараоксибензоат, бензилового спирта, фенилэтилового спирта, сорбиновой кислоты и ее солей, тимерозала, поликватерниума, бензододециния бромида, оксихлорного комплекса и хлоробутанола, но не ограничивающейся вышеперечисленным. Стабилизирующий агент может быть выбран из циклодекстрина и его производных, растворимых в воде полимеров, таких как поли(винилпирролидон), и поверхностно-активных веществ, таких как полисорбат 80 (tween 80 ^®), полисорбат 20 и тилоксапол, но не ограничиваясь вышеперечиленным. Регулятор pH может быть выбран из группы веществ, состоящей из соляной кислоты, уксусной кислоты, фосфорной кислоты, серной кислоты, гидроксида натрия, гидроксида калия, моноэтаноламина, водного раствора аммиака и гидроксида аммония, но не ограничивающейся вышеперечисленным. Загуститель может быть выбран из группы веществ, состоящей из гидроксиэтилцеллюлозы, гидроксипропилцеллюлозы, метилцеллюлозы, гидроксипропилметилцеллюлозы и карбоксиметилцеллюлозы, поливинилового спирта, карбомера, повидона, полоксамера, поликарбофила и его соли, но не ограничивающейся вышеперечисленным. Хелатирующее вещество может быть выбрано из группы веществ, состоящей из натриевой соли ЭДТА, цитрата натрия и конденсированного фосфата натрия, но не ограничивающейся вышеперечисленным. Солюбилизатор или растворитель могут быть представлять собой глицерин, ДМСО, диметилацетамид, n-метилпирролидон, этанол, бензиловый спирт, изопропиловый спирт, различной молекулярной массы полиэтиленгликоль или пропиленгликоль, но не ограничиваясь вышеперечисленным. Спектры веществ, которые могут использоваться в качестве растворителей или солюбилизаторов, могут перекрываться, и любое вещество может быть использовано как в качестве растворителя, так и в качестве солюбилизатора, и в таком случае, если вещество действует в качестве растворителя в процессе приготовления, оно считается растворителем, а если вещество не действует в качестве растворителя, оно считается солюбилизатором. Альтернативно, в некоторых вариантах осуществления солюбилизатор может представлять собой поверхностно-активное вещество. Могут быть использованы комбинации поверхностно-активных веществ, включающие различные типы поверхностно-активных веществ. Например, могут использоваться неионные, анионные (например, мыло, сульфонат), катионные (например, цетилтриметиламмония бромид), цвиттерионные, полимерные, амфотерные поверхностно-активные вещества. Например, доступные поверхностно-активные вещества включают соединения с ГЛБ 10, 11, 12, 13 или 14 или более, но не ограничиваются ими. Примеры поверхностно-активных веществ включают полиоксиэтиленовый продукт гидрогенизированного растительного масла, полиэтоксилированное касторовое масло или гидрогенизированное касторовое масло, полиоксиловое касторовое масло или его производные, эфир жирных кислот и полиоксиэтилен-сорбитана и полиоксиэтиленовое касторовое масло, но не ограничиваются ими. Согласно конкретному варианту осуществления, офтальмологическая композиция, соответствующая настоящему изобретению, может включать более 0,01 весовых % и менее 0,1 весовых % циклоспорина, 0,5-7,5 весовых % трегалозы, 1-10 весовых % солюбилизатора, 0,01-2 весовых % растворителя, а оставшуюся часть составляют буферное вещество и регулятор тоничности, в расчете на общий вес композиции.

Водно-эмульсионный офтальмологический раствор может быть предпочтительно приготовлен в виде нано-эмульсии, и в этом случае может включать различные добавки в пределах уровня техники, например, масло и поверхностно-активное вещество, если это не противоречит цели настоящего изобретения. Масло может являться, по меньшей мере, одним из группы соединений, состоящей из пропиленгликоля монокаприлата, пропиленгликоля лаурата, триглицеридов средней длины цепи (C8-С10), глицерина 1,3-диолеата, глицерина моноолеата и глицерина линолеата. Поверхностно-активные вещества включают по крайней мере одно вещество из группы, состоящей из олеоил полиэтиленгликоль глицеридов, линолеоил полиэтиленгликоль глицеридов, каприлокапроил полиоксилглицеридов, полиоксил 35 касторового масла, полиоксил 35 гидрогенизированного касторового масла, полиоксил 40 гидрогенизированного касторового масла, продукта конденсации оксиси этилена с 12-гидроксистеариновой кислотой и полисорбата 80 (Croda, Соединенное Королевство).

Наиболее предпочтительно, чтобы водно-эмульсионный офтальмологический раствор мог быть приготовлен в виде прозрачной нано-эмульсии, причем при приготовлении можно ссылаться, не ограничиваясь нижеуказанным, на патент № 10-0938500 Республики Корея.

Офтальмологическая композиция в соответствии с настоящим изобретением может использоваться для облегчения, профилактики или лечения глазных заболеваний, и предпочтительно для облегчения, профилактики или лечения расстройств, вызванных сухим глазом.

"Расстройства, вызванные сухим глазом", могут включать в себя сухой кератоконъюнктивит, патологию эпителия роговицы и конъюнктивы, уменьшение выработки слезной жидкости, синдром Стивенса-Джонсона, синдром сухого глаза, синдром Шегрена, недостаточность выработки слезы, гиперемию конъюнктивы глаза, нестабильность слезной пленки или отек глаз; аллергический конъюнктивит, вирусный конъюнктивит или сухой глаз после хирургического лечения катаракты; и сухой глаз, связанный с ношением контактных линз, либо связанный с работой с ТВО.

Кроме того, "патология эпителия роговицы и конъюнктивы" может включать в себя сухой глаз, дефект эпителия роговицы, дефект эпителия конъюнктивы, эрозию эпителия роговицы, уменьшение толщины роговицы, инфильтрат роговицы, прободение роговицы или отслоение роговичного эпителия; язву роговицы, кератит, конъюнктивит, поверхностный точечный кератит, сухой кератоконъюнктивит, верхний лимбальный кератоконъюнктивит, нитчатый кератит и инфекционные глазные заболевания эпителия роговицы и конъюнктивы; патологии эпителия роговицы и конъюнктивы, связанные с травмой глаз, микрохирургией или ношением жестких контактных линз.

При лечении и/или профилактики заболеваний у млекопитающих, в частности, человека, дозировка офтальмологической композиции в соответствии с настоящим изобретением может, в основном, определяться специалистами в медицинской промышленности, или специалистами в данной области техники. Например, когда композиция в соответствии с настоящим изобретением используется в качестве глазных капель для взрослого пациента с сухим глазом, предпочтительная доза офтальмологической композиции, включающей циклоспорин и трегалозу в качестве активных ингредиентов, может составлять, не ограничиваясь нижеуказанным, 1-4 капли (около 0,025-0,1 мл) глазных капель, содержащих 0,02 весовых % циклоспорина и 1-3 весовых % трегалозы 1-10 раз в день, и специалисты, работающие в медицинской промышленности, или специалисты в данной области техники могут определять наиболее оптимальную реальную дозировку, исходя не только из данных о возрасте, весе, поле и реакции пациента на лечение, но и из состояния, ожидаемого при этом способе лечения.

Офтальмологическая композиция в соответствии с настоящим изобретением может содержаться и предоставляться в стерильном контейнере, и в комплекте могут быть даны указания относительно ее применения, а инструкции могут быть механически прикреплены к контейнеру, наполненному офтальмологической композицией, или ко второму контейнеру, в который упакован первый контейнер, или могут быть упакованы вместе во втором контейнере.

Полезный эффект

Офтальмологическая композиция в соответствии с настоящим изобретением, содержащая циклоспорин и трегалозу, в которой два ингредиента смешиваются в предопределенном соотношении и/или предустановленном количестве, имеет превосходящее комбинированное воздействие на сухой глаз, который может быть обусловлен различными причинами, таким как сухой воздух, воспаление глаз или консерванты, и выражаться в различных состояниях и симптомах. Более конкретно, офтальмологическая композиция с меньшим содержанием циклоспорина оказывает эквивалентное или превосходящее воздействие. Кроме того, по сравнению с одним лишь циклоспорином или одной лишь трегалозой, применение офтальмологической композиции обеспечивает намного превосходящее синергическое действие, и оказывает влияние на уменьшение уровня повреждения роговицы, восстановление объема выработки слезы, снижение уровня воспаления глаз, повышение качества слезы, облегчение раздражения глаз (включая эритему, отек и усиленные конъюнктивальные выделения), поддержание, смазку и увлажнение слезной пленки, а также усиление секреции муцина ввиду увеличения активности бокаловидных клеток, отвечающих за секрецию муцина.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На Фиг.1 показано уменьшение степени повреждений роговицы в модели сухого глаза, вызванной воздействием сухого воздуха, вследствие обработки комплексной композицией.

На Фиг.2 показано влияние обработки комплексной композицией на уменьшение выработки слезы в модели сухого глаза, вызванной конканавалином А.

На Фиг.3 показано ослабление воспаления роговицы в модели сухого глаза, вызванной конканавалином А, вследствие обработки комплексной композицией.

На Фиг.4 показаны изменения результатов теста Ширмера (вверху) и изменения времени разрыва слезной пленки (ВРСП, внизу) в модели сухого глаза, вызванной бензалкония хлоридом, вследствие обработки комплексной композицией.

На Фиг.5 показано количество бокаловидных клеток в модели сухого глаза, вызванной бензалкония хлоридом, вследствие обработки комплексной композицией.

На Фиг.6 показаны изменения воспаления (вверху) и степени раздражения глаз (внизу) в модели сухого глаза, вызванной бензалкония хлоридом, вследствие обработки комплексной композицией.

На Фиг.7 показана жизнеспособность клеток в модели сухого глаза, после обработки комплексной композицией.

ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Ниже приводится более подробное описание настоящего изобретения с помощью примеров. Эти примеры предназначены для более подробного описания настоящего изобретения, и, как очевидно специалисту в данной области техники, область применения настоящего изобретения не ограничивается этими примерами.

Пример 1. Приготовление пробной субстанции

Согласно каждой пропорции ингредиентов A-J в Таблице 1 (композиция, включающая циклоспорин А и трегалозу в различной концентрации), циклоспорин был солюбилизирован в результате смешивания с солюбилизатором полиоксил 35 касторового масла. Глицерин смешали с фосфатным буферным раствором, pH которого был приведен к значению 7,2 в соответствии с каждым соотношением, а солюбилизированный раствор циклоспорина был диспергирован для приготовления эмульсии. Осмотическое давление было приведено примерно к 300 мОсмоль/кг добавлением трегалозы и регулятора тоничности к готовому эмульсионному раствору циклоспорина.

[Таблица 1]

Компоненты A B C D E F G H I J Циклоспорин А 0 0,01% 0,02% 0,05% 0 0 0,01% 0,02% 0,01% 0,02% Трегалоза 0 0 0 0 1% 3% 1% 1% 3% 3% Полиоксил 35 касторового масла 3% 3% 3% 3% 3% 3% 3% 3% 3% 3% Этанол 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% Глицерин 0,8% 0,8% 0,8% 0,8% 0,8% 0,8% 0,8% 0,8% 0,8% 0,8% Фосфатный буферный раствор Оптимум Оптимум Оптимум Оптимум Оптимум Оптимум Оптимум Оптимум Оптимум Оптимум Регулятор тоничности Оптимум Оптимум Оптимум Оптимум Оптимум Оптимум Оптимум Оптимум Оптимум Оптимум

Тестовый пример 1. Эффект лечения в модели сухого глаза, вызванной воздействием сухого воздуха

Тестируемая субстанция

Композиции A, C, D, E, F, I, J, подготовленные согласно приведенному выше примеру 1, использовались в качестве тестируемой субстанции в эксперименте.

Экспериментальные животные

Экспериментальные животные, шестинедельные самцы крыс линии Sprague-Dawley (SD), Dae Han Bio Link Co. Ltd. (Ымсон, Чхунбук) были размещены в клетках для крыс по четыре крысы в каждой клетке. Животные использовались в эксперименте после акклиматизации, длившейся примерно 1 неделю. Параметры лабораторной среды для животных контролировались, температуру поддерживали на уровне 23 ± 2°C, относительную влажность на уровне 55 ± 10%, частоту вентиляции 12 раз/час, цикл освещения 12 часов, освещенность 150-300 люкс. Экспериментальным животным был предоставлен твердый гранулированный корм для Purina Rat Chow ^® Biopia Co., Ltd. (Кунпхо, Кенгидо), а также неограниченный доступ к стерильной очищенной воде.

Индукция сухого глаза и лечение с помощью тестируемой субстанции

20 мкл тестируемой субстанции было применено к каждому из двух глаз экспериментального животного за 30 минут до воздействия ветра, создаваемого нагнетательным вентилятором. Через 30 минут после нанесения тестируемой субстанции на глаза в брюшную полость вводили 20 мг/кг атропина (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США), чтобы ингибировать выработку слезы, и животное было анестезировано путем инъекции Золетила ^® (Virbac Korea, Сеул, Корея) в мускулы для поддержания единообразной позы и контроля мигания. Анестезированное животное фиксировали перед нагнетательным вентилятором, так чтобы ветер воздействовал непосредственно на глаза, и расстояние контролировали таким образом, чтобы обеспечить воздействие на глаза воздуха 25-35% относительной влажности при скорости ветра 2 м/сек. Тестируемую субстанцию многократно наносили в общей сложности 10 раз в течение 3 часов с интервалом 20 минут с момента воздействия сухого воздуха (нулевая минута), причем после нанесения субстанции на глаза веки закрывали на время порядка 10 секунд, чтобы распространить материал по поверхности глаз, и после этого глаза были подвержены воздействию воздуха. В течение эксперимента следили, чтобы экспериментальное животное не изменяло позы и не закрывало глаз, и его позу часто поправляли.

Измерение степени повреждения роговицы

Степень повреждения роговицы была оценена методом, описанным в работе Kim et al., (2010) Comparative effectiveness of distilled water and isotonic saline in a rat model of dry eyes. Journal of Biomedical Research 11(4):211-218. 5 мкл 1% флуоресцеина (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США), в сбалансированном солевом растворе (сбалансированный раствор натрия), вводили в конъюнктивальный мешок животного, у которого был вызван сухой глаз, и к которому была применена тестируемая субстанция, и глаза животного фиксировали в закрытом состоянии в течение 1 часа с помощью повязки. Невпитавшиеся остатки красителя смывали раствором, и глаз энуклеировали. Зеленую флуоресценцию участка (области) роговицы энуклеированного глаза, в пределах которой имело место проникновение флуоресцеина, наблюдали с помощью лампы накаливания, и изображение фотографировали. Область проникновения флуоресцеина определяли количественным анализом фотографии с помощью программы J 1,38x. Для количественной оценки флуоресцеина, проникшего в роговицу, резецированную роговицу помещали в соляной раствор калия (1 мл) и промывали в течение 24 часов, а затем уровень (интенсивность) испускания зеленой флуоресценции оценивали путем измерения флуоресценции при длине волны возбуждения 485 Нм и испускания 538 Нм с помощью флуорофотометра. Высокая степень проникновения в роговицу и высокое испускание флуоресцеина означают, что роговица не выполняет барьерной функции, и таким образом, чем меньше степень проникновения и испускание, тем выше, по определению, воздействие тестируемой субстанции.

Тест на патологию

После завершения эксперимента все экспериментальные животные были убиты удушающим воздействием углекислого газа. Энуклеированный глаз фиксировали в растворе Дэвидсона в течение 7-24 часов, а затем фиксировали в 10%-ном нейтральном формалине в течение по крайней мере 24 часов для приготовления среза ткани, после чего окрашивали гематоксилин-эозином, и повреждение эпителия роговицы, а также толщину роговицы измеряли под оптическим микроскопом с увеличением x100. Ткань конъюнктивы, резецированная при аутопсии, фиксировали в 10%-ном нейтральном растворе формалина для подготовки среза ткани, после чего окрашивали с помощью реакции с иодной кислотой и реактивом Шиффа (далее ШИК-реакция), и количество бокаловидных клеток, содержащих или выделяющих муцин-подобные гликопротеины, подсчитывали под оптическим микроскопом с увеличением x100.

Результаты

В соответствии с экспериментальными условиями, сухой глаз вызван аналогично развитию сухого глаза, обусловленного воздействием кондиционирования воздуха или сухого воздуха в помещении. В качестве контрольной использовали группу, к которой применили композицию А, приготовленную в соответствии с примером 1. Область проникновения (площадь) (%) и уровень испускания (интенсивность) (%) флуоресцентно-окрашенной роговицы рассчитывались как относительные величины, причем область проникновения (площадь) (%) и уровень испускания (интенсивность) (%) флуоресцентно-окрашенной роговицы в контрольной группе принимались за 100%:

Область проникновения (площадь) (%) или уровень испускания (интенсивность) (%)=[1-(контрольная группа-тестируемая группа)/контрольная группа] * 100.

Ингибирование повреждения роговицы (%) рассчитывали с помощью следующего уравнения из суммы средних значений области проникновения в роговицу (площадь) (%) и уровня испускания (интенсивности) (%):

Ингибирование повреждения роговицы (%)=[(контрольная группа-тестируемая группа)/контрольная группа] * 100.

Сухой глаз, вызванный воздействием сухого воздуха в течение 3 часов, значительно увеличил интенсивность флуоресценции на поверхности роговицы, и было обнаружено глубокое проникновение флуоресцентного вещества. Результаты показаны на Фиг.1, и можно заметить, что ингибирование повреждения роговицы (%) вследствие воздействия композиции J, соответствующей комплексной композиции в соответствии с настоящим изобретением, составляет около 40%. В противоположность этому можно заметить, что композиции (композиции C и D), содержащие в качестве активного ингредиента только лишь циклоспорин А, практически не оказывают лечебного воздействия на повреждение роговицы, а композиция D усугубляет повреждение роговицы. Кроме того, композиции (композиции E, F) содержащие в качестве активного ингредиента только лишь трегалозу, показали эффективное воздействие на повреждение роговицы, но продемонстрировали меньшее профилактическое воздействие на повреждение роговицы, чем композиция J, соответствующая комплексной композиции в соответствии с настоящим изобретением. Кроме того, в случае композиции I, содержащей как циклоспорин А, так и трегалозу при весовом соотношении циклоспорин А: трегалоза 1:300, превентивное воздействие на повреждение роговицы было меньше, чем в композиции, содержащей только лишь трегалозу. Кроме того, можно заметить, что в результате обработки сухого глаза, вызванного воздействием сухого воздуха, тестируемой субстанцией согласно примеру 1, в группе животных, к которым применялась комплексная композиция (композиция J) соответственно настоящему изобретению, численность бокаловидных клеток, содержащих либо выделяющих муцин-подобные гликопротеины, существенно увеличивалась.

Тестовый пример 2. Эффект лечения в модели сухого глаза, вызванного конканавалином А

Тестируемая субстанция

Композиции A, B, C, D, E, F, G, H, J, подготовленные в соответствии с примером 1, описанным выше, использовались в эксперименте в качестве тестируемой субстанции.

Экспериментальные животные

Экспериментальные животные, самки белого новозеландского кролика (НЗБ), весом 1,8-2,0 кг, Samtako Bio Korea (Осан, Кенгидо), были размещены в клетках для кроликов по одному кролику в клетке. Животные использовались в эксперименте после акклиматизации, длившейся примерно 1 неделю.

Лабораторная среда для животных контролировалась, температуру поддерживали на уровне 23 ± 2°C, относительную влажность на уровне 55 ± 10%, частоту вентиляции 12 раз/час, цикл освещения 12 часов, освещенность 150-300 люкс. Кроликам был предоставлен твердый гранулированный корм NIH#32M (Samtako Bio Korea), а также неограниченный доступ к стерильной очищенной воде. Оба глаза у кроликов были осмотрены за 24 часа до начала испытания, и были использованы только те животные, которые не имели повреждений глаз, например, повреждений роговицы.

Конканавалин А и лечение с помощью тестируемого вещества

После анестезирования экспериментального животного путем инъекции 50 мг/кг Золетила ^® и 6 мг/кг ксилазина в мышцы, 50 мкл конканавалина А (далее Кон А), приготовленного в концентрации 10 мг/мл в физиологическом солевом растворе, вводили в каждую из главных слезных желез и добавочных слезных желез верхних век обоих глаз с использованием инсулинового шприца (игла 31 калибра). Через 24 часа после введения Кон А каждую тестируемую субстанцию наносили на глаза в течение 3 дней по 4 раза в день, причем после нанесения на глаза веки закрывали примерно на 10 секунд, с тем чтобы вещество равномерно распространилось по поверхности глаз. Наблюдение общих симптомов и микроскопическое обследование глаз проводились один раз в сутки.

Измерение количества выработки слезы (проба Ширмера)

Для оценки сокращения выработки слезы один из боковых концов бумажной полоски с хлоридом кобальта (бумажная проба Ширмера) помещали в латеральный угол нижнего века на 30 секунд, что вызывало слезоотделение и смачивание полоски. Уменьшение выработки слезы способствует развитию сухого глаза, поэтому воздействие тестируемой субстанции считалось повышенным, если оно приводило к увеличению объема выработки слезы. В качестве контрольной использовали группу, к которой применили композицию А, приготовленную в соответствии с примером 1.

Ингибирование выработки слезы (%)=[1-(тестируемая группа-контрольная группа)/контрольная группа] * 100

Определение степени окрашивания и воспаления роговицы

Степень окрашивания и воспаления роговицы определялась способом, описанным в работе ʺPauly et al., (2007) New tools for the evaluation of toxic ocular surface changes in the rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science.ʺ

Поврежденная часть роговицы была окрашена флуоресцеином на 4-й день после нанесения тестируемой субстанции на глаз, и степень окраски флуоресцеином в верхней, средней и нижней частях роговицы была выражена в баллах в соответствии с нижеописанными критериями, и для каждого участка была рассчитана средняя сумма.

(Критерии определения)

0: не окрашена.

1: редкое окрашивание, с большим расстоянием между окрашенными пятнами.

2: окрашивание промежуточной плотности, некоторые окрашенные пятна расположены близко друг к другу.

3: плотное окрашивание, все окрашенные пятна располагаются близко друг к другу.

В качестве контрольной использовали группу, к которой применили композицию А, приготовленную в соответствии с примером 1. Уменьшение воспаления роговицы (%) рассчитывали путем подстановки среднего значения суммы по каждому из участков (верхней, средней и нижней частей роговицы), полученной в соответствии с критериями определения, в следующее уравнение:

Уменьшение воспаления роговицы (%)=(Контрольная группа-тестируемая группа)/контрольная группа*100.

Тест на патологию

На 10-й день после применения тестируемой субстанции оценили развитие синдрома сухого глаза и раздражение глаз, и кролики были убиты удушающим воздействием углекислого газа. Ткани роговицы и конъюнктивы, резецированные при аутопсии, фиксировали в 10%-ном нейтральной растворе формалина для подготовки среза ткани, после чего окрашивали с помощью ШИК-реакции, и количество бокаловидных клеток, содержащих или выделяющих муцин-подобные гликопротеины, подсчитывали под оптическим микроскопом с увеличением x100.

Результаты

Кон А, вызывающий воспаление, вводили в слезные железы кролика, что привело к снижению выработки слезы и повреждений роговицы в результате воспаления, а также к воспалению глаз, например, воспалению слезных желез. Результаты лечения сухого глаза, вызванного Кон А, с помощью тестируемой субстанции, приготовленной в соответствии с примером 1, а именно, уменьшение выработки слезы (%) и уменьшение воспаления роговицы (%), соответственно, отображены на Фиг.2 и 3.

По сравнению с группами, к которым был применен только лишь циклоспорин, и группами, к которым была применена только лишь трегалоза, (композиции B, C, D, E, F), группы, к которым была применена комплексная композиция (композиции G, H, J), показали значительно более обильную выработку слезы. В отличие от модели сухого глаза, вызванной сухим воздухом, группы, к которым была применена только лишь трегалоза (композиции E, F), не показывали снижения количества вырабатываемой слезы вследствие воспаления глаз, и не демонстрировали облегчения воспаления роговицы. Кроме того, группы, к которым был применен только лишь циклоспорин (композиции B, C, D), демонстрировали уменьшение воспаления роговицы, но не демонстрировали снижения количества вырабатываемой слезы. В отличие от этого, в результате воздействия комплекса (композиции G, H, J) в соответствии с настоящим изобретением, в облегчении воспалений наблюдается синергический эффект.

Кроме того, можно отметить, что в результате лечения воспаления глаз, вызванного Кон А, с помощью тестируемой субстанции, приготовленной в соответствии с примером 1, количество бокаловидных клеток, содержащих или секретирующих муцин-подобные гликопротеины, значительно возросло в группах, которые подвергались воздействию комплексной композиции в соответствии с изобретением (композиции G, H, J).

Тестовый пример 3. Лечение сухого глаза, вызванного воздействием бензалкония хлорида

Тестируемая субстанция

Композиции A, D, J, подготовленные в соответствии с примером 1, описанным выше, использовались в качестве испытательного вещества в эксперименте.

Экспериментальные животные

Экспериментальные животные, самки белого новозеландского кролика (НЗБ), весом 1,8-2,0 кг, Samtako Bio Korea (Осан, Кенгидо), были размещены в клетках для кроликов по одному кролику в клетке. Животные использовались в эксперименте после акклиматизации, длившейся примерно 1 неделю.

Лабораторная среда для животных контролировалась, температуру поддерживали на уровне 23 ± 2°C, относительную влажность на уровне 55 ± 10%, частоту вентиляции 12 раз/час, цикл освещения 12 часов, освещенность 150-300 люкс. Кроликам был предоставлен твердый гранулированный корм NIH#32M (Samtako Bio Korea), а также неограниченный доступ к стерильной очищенной воде. Оба глаза у кроликов были осмотрены за 24 часа до начала испытания, и были использованы только те животные, которые не имели повреждений глаз, например, повреждений роговицы.

Бензалкония хлорид и воздействие тестируемой субстанции

Для того, чтобы вызвать сухой глаз, 100 мкл 0,1% бензалкония хлорида (далее, БХ) вводили в конъюнктивальный мешок дважды в сутки (в 9:00 и в 21:00) в течение 15 дней.

На 5-й день после введения БХ развитие сухого глаза оценивали путем определения времени разрыва слезной пленки (далее ВРСП), количества вырабатываемой слезы, флуоресцентного окрашивания и степени раздражения, и затем кролики с индуцированным сухим глазом были сгруппированы случайным образом. Тестируемую субстанцию вводили дважды в сутки (в 9:00 и в 21:00) в течение 10 дней, начиная с 5-го дня после введения БХ.

Наблюдение общих симптомов и аномальных реакций глаз проводилось один раз в сутки.

Диагностика сухого глаза

Диагностику сухого глаза (ВРСП, количество вырабатываемой слезы, флуоресцентная окраска) проводили до введения тестируемой субстанции (5-й день после введения БХ) и по прошествии 5 дней (что соответствует 10-му дню после введения БХ) и 10 дней (что соответствует 15-му дню после введения БХ) после введения тестируемой субстанции.

В пробе ВРСП момент начала разрыва флуоресцентного слоя после введения 5 мкл флуоресцеина с концентрацией 0,1% в конъюнктивальный мешок фиксировали под микроскопом с щелевой лампой. Среднюю величину ВРСП получали в результате трех измерений.

Для оценки количества вырабатываемой слезы один из концов бумажной полоски с хлоридом кобальта (бумажная проба Ширмера) помещали в латеральный угол нижнего века на 30 секунд, что вызывало слезоотделение и смачивание полоски, и измеряли длину увлажненной области.

В методе флуоресцентного окрашивания степень повреждения роговицы была определена путем выражения в баллах степени окрашивания флуоресцеином в соответствии с нижеописанными критериями в верхней, средней и нижней частях роговицы, и степень повреждения роговицы рассчитывали из среднего значения суммарных баллов для каждого участка.

(Критерии определения)

0: не окрашена.

1: редкое окрашивание, с большим расстоянием между окрашенными пятнами.

2: окрашивание промежуточной плотности, некоторые окрашенные пятна расположены близко друг к другу.

3: плотное окрашивание, все окрашенные пятна располагаются близко друг к другу.

Оценка раздражения глаз

Оценку повреждений глаз воздействием тестируемой субстанции проводили до введения тестируемой субстанции (5-й день введения БХ), а также по прошествии 5 и 10 дней после введения тестируемой субстанции путем измерения эритемы, отека и количества конъюнктивальных выделений следующим образом. Согласно нижеуказанным критериям определения, результатам оценки раздражения глаз (эритема, конъюктивальные выделения и отек) присваивали баллы, и из их среднего значения рассчитывали раздражение глаз (%). При расчете раздражения глаз (%) принимали, что средний уровень раздражения глаз, вызванного композицией А, составляет 100%.

Раздражение глаз (%)=(раздражение, вызванное композицией А - раздражение, вызванное тестируемой субстанцией)/раздражение, вызванное композицией А * 100.

- Эритема (только конъюнктивы век и глазного яблока)

0: нормальное состояние кровеносных сосудов

1: некоторые кровеносные сосуды имеют явные признаки гиперемии конъюнктивы глаза

2: малиновый оттенок, соответствующие кровеносные сосуды наблюдаются с трудом

3: бледно-багряный оттенок

- отек конъюнктивы

0: припухлости нет

1: припухлость немного больше обычной (с учетом мигательной перепонки)

2: заметная припухлость, сопровождаемая частичным отгибанием века

3: припухлость века создает впечатление полузакрытого глаза

4: припухлость века создает впечатление глаза, закрытого более чем на половину

- Выделения из глаз

0: нет выделений

1: небольшое количество выделений (за исключением небольшого количества, наблюдаемого на внутреннем углу глаза)

2: количество выделений достаточно для увлажнения ресниц и век

3: количество выделений достаточное для увлажнения значительной области вокруг глаз, а также ресниц и век.

Тест на патологию

На 10-й день после введения тестируемой субстанции оценили развитие синдрома сухого глаза и раздражение глаз, после чего кролики были убиты удушающим воздействием углекислого газа. Ткани роговицы и конъюнктивы, резецированные при аутопсии, фиксировали в 10%-ном нейтральной растворе формалина для подготовки среза ткани, после чего окрашивали с помощью ШИК-реакции, и количество бокаловидных клеток, содержащих или выделяющих муцин-подобные гликопротеины, подсчитывали под оптическим микроскопом с увеличением x100.

Результаты

БХ является веществом, широко используемым в качестве консерванта, и также используется в качестве консерванта жидких глазных капель, однако известно, что при воздействии на глаза в чрезмерных количествах он вызывает сухой глаз. Механизм развития сухого глаза, обусловленный воздействием БХ, отличается от механизма развития сухого глаза, вызванного воздействием Кон А и сухого воздуха, а повреждения в этом случае наблюдаются в течение сравнительно долгого времени. В отличие от других моделей, по мере развития симптомов нестабильность и преждевременный разрыв слезной пленки возникает ввиду повышенного количества слезы или сниженного уровня выработки муцин-подобных гликопротеинов, а потенциальное повреждение поверхности роговицы сопровождается комбинацией факторов, действующих на глазное яблоко и способствующих развитию сухого глаза. Можно заметить, что группа, к которой применялась комплексная композиция (композиция J), демонстрировала подавление чрезмерной выработки слезы, вызванной БХ, по сравнению с группой, к которой применялся только лишь циклоспорин (композиция D) (Фиг.4, вверху), и увеличение времени разрыва слезной пленки. Хорошо известно, что укороченное ВРСП является результатом уменьшения количества слизистого вещества слезы и количества вырабатываемой слезы (Фиг.4, внизу). Таким образом, по результатам данного эксперимента ожидается, что воздействие комплексной композиции позволит поддержать осмотическое давление слезы путем подавления чрезмерного выделения слезы и повысить интенсивность выделения слизистого компонента (Фиг.5), что будет приводить к удлинению ВРСП (Фиг.4, внизу), и, как следствие, к повышению качества слезы.

Кроме того, определение степени повреждения роговицы с помощью флуоресцентного окрашивания позволяет видеть, что группа, к которой была применена комплексная композиция (композиция J), показала существенно более эффективное заживление повреждений роговицы по сравнению с группой, к которой применялся только лишь циклоспорин (композиция D) (Фиг.6, вверху).

Кроме того, комплексная композиция уменьшала воспаление, вызванное воздействием БХ, в также уменьшала раздражение глаз (конъюнктивальная пост-инъекционная реакция и отек, увеличение выделений), вызываемое БХ (Фиг.6, внизу).

Пример 2 и тестовый пример 4. Воздействие на клетки роговичного эпителия при сухом глазе

Тестируемая субстанция

В качестве тестируемых субстанций в эксперименте использовались композиции A, D, E, F, G, H, I, J, приготовленные согласно приведенному выше примеру 1. Кроме того, композиция, содержащая 0,05% циклоспорин и 1% или 3% трегалозу, была приготовлена в соответствии с примером 1 и использована в эксперименте.

Культура клеток и лечебное воздействие

Клетки роговичного эпителия инкубировали в среде культивирования при 37°С, причем среду культивирования, содержащую 10% фетальной бычьей сыворотки, эпидермальный фактор роста и антибиотики, добавляемые к среде Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, GibcoBRL, USA), заменяли каждые 2-3 дня, а когда клетки демонстрировали сплошной рост, среду культивирования полностью удаляли, и клетки однократно промывали фосфатно-солевым буферным раствором (ФСБ), а затем обрабатывали 0,25% трипсин-ЭДТА для разделения клеток, которые использовались в эксперименте.

Измерение жизнеспособности клеток

Для оценки жизнеспособности клеток роговичного эпителия в сухой среде клетки роговичного эпителия однократно промывали ФСБ, после чего приводили в контакт с тестируемой субстанцией в течение 10 минут, и затем клетки роговичного эпителия были оставлены в сухой среде на 15 минут. После контакта с субстанцией клетки культивировали в течение 18-24 часов, и жизнеспособность клеток была определена с помощью МТТ-теста. Расчет по формуле Жизнеспособность клеток (%)=поглощение в каждой лунке/поглощение в лунке с контрольной группой×100 проводился три раза для каждой концентрации.

Результаты теста

Все тестируемые субстанции контактировали с клетками роговичного эпителия в течение 10 минут, а затем экспонировались в сухой среде в течение 15 минут.

В результате теста комплексная обработка циклоспорином и трегалозой показала превосходящие результаты с точки зрения жизнеспособности кератоцитов по сравнению с группой, к которой применялась только лишь трегалоза, и с группой, к которой применялся только лишь циклоспорин, и продемонстрировала явную растущую тенденцию в зависимости от концентрации циклоспорина (p<0,05).

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и представляет собой офтальмологическую композицию для облегчения, лечения или профилактики расстройства, вызванного сухим глазом, содержащую циклоспорин и трегалозу в качестве активных ингредиентов, причем весовое соотношение циклоспорин : трегалоза равно 1:20-200 и циклоспорин присутствует в количестве от более чем 0,01 весовых % до менее чем 1 весового %, а трегалоза присутствует в количестве от более чем 1 весового % до 7,5 весовых % из расчета на общий вес композиции. Изобретение обеспечивает синергетический эффект в отношении профилактики, облегчения и лечения сухости глаза. 3 н. и 6 з.п. ф-лы, 7 ил., 1 табл., 4 пр.

1. Офтальмологическая композиция для облегчения, лечения или профилактики расстройства, вызванного сухим глазом, содержащая циклоспорин и трегалозу в качестве активных ингредиентов, причем весовое соотношение циклоспорин : трегалоза равно 1:20-200 и циклоспорин присутствует в количестве от более чем 0,01 весовых % до менее чем 1 весового %, а трегалоза присутствует в количестве от более чем 1 весового % до 7,5 весовых % из расчета на общий вес композиции.

2. Офтальмологическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что циклоспорин присутствует в количестве 0,02-0,05 весовых %, а трегалоза присутствует в количестве от более чем 1 весового % до 3 весовых %.

3. Офтальмологическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что весовое соотношение циклоспорин : трегалоза составляет 1:50-150.

4. Офтальмологическая композиция по п. 1, где расстройство, вызванное сухим глазом, выбирают из группы, состоящей из сухого кератоконъюнктивита, расстройства эпителия роговицы и конъюнктивы, сниженной выработки слезной жидкости, синдрома Стивенс-Джонсона, синдрома сухого глаза, синдрома Шегрена, недостаточности выработки слезы, гиперемии глаза, нестабильности слезной пленки или отека глаз; аллергического конъюнктивита, вирусного конъюнктивита или сухого глаза после хирургического лечения катаракты; а также сухого глаза, связанного с ношением контактных линз либо связанного с работой с ТВО.

5. Офтальмологическая композиция по п. 4, где расстройство эпителия роговицы и конъюнктивы выбирают из группы, состоящей из сухого глаза, дефекта эпителия роговицы, дефекта эпителия конъюнктивы, эрозии эпителия роговицы, уменьшения толщины роговицы, инфильтрата роговицы, прободения роговицы или отслоения роговичного эпителия; язвы роговицы, кератита, конъюнктивита, поверхностного точечного кератита, сухого кератоконъюнктивита, верхнего лимбального кератоконъюнктивита, нитчатого кератита и инфекционных глазных заболеваний эпителия роговицы и конъюнктивы; расстройства эпителия роговицы и конъюнктивы, связанного с травмой глаза, микрохирургией или ношением жестких контактных линз.

6. Офтальмологическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что офтальмологическая композиция сформулирована в виде глазных капель.

7. Офтальмологическая композиция по п. 6, отличающаяся тем, что офтальмологическая композиция представляет собой глазные капли в виде прозрачной наноэмульсии.

8. Способ профилактики, облегчения или лечения расстройства, вызванного сухим глазом, включающий введение млекопитающему офтальмологической композиции по п. 1.

9. Применение циклоспорина и трегалозы для изготовления офтальмологической композиции по п. 1 для профилактики, облегчения или лечения расстройства, вызванного сухим глазом.