Способ получения диагностикума для определения токсина холерного вибриона, выделенного из объектов окружающей среды Российский патент 2019 года по МПК A61K39/106 

Предполагаемое изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано в лабораторной клинической диагностике особо-опасных инфекций для количественного определения токсинопродукции холерного вибриона при его выделении из объектов окружающей среды в процессе мониторинга с последующей оценкой его эпидемического потенциала.

В настоящее время остается актуальной проблема исследований холерного токсина. Центр по контролю и профиактике заболеваний США дает перечень методов дя исследований холерного токсина. Это иммуноферментный анализ, иммунофлюоресцентный метод с использованием ганглиозид-GM1-содержащей ДАSS-системы, реакция коагглютинации с коагглютинирующими диагности-кумами, латекс агглютинация с анти-ХТ-сывороткой, полимеразная цепная реакция, ДНК-секвенирование.(1) Учеными из Тайваня разработан иммуносен-сор, основанный на комбинированном использовании GM1-липосом и антител к XT в проточной системе с регистрацией сигнала специфической фюоресцен-ции.

Известен биологический микрочип для выявления и многопараметрического анализа противохолерных антител, в том числе и к холерному токсину.(2).

Согласно принятой схеме лабораторной диагностики холеры для определения эпидемической значимости холерных вибрионов используется ряд методических подходов: определение гемолитической активности в пробе Грейга, чувствительности к холерным диагностическим бактериофагам ctx- и ctx+, выявление холерогенного эффекта на биологической модели (крольчата-сосунки), обнаружение ctxAB и tcpA генов методом полимеразной цепной реакции [3,].

Однако постановка биологической пробы трудоемка и продолжительна по времени, применение бактериофагов затруднительно вследствие увеличения в последние годы количества штаммов вибрионов резистентных к ним. Определение генов, кодирующих синтез энтеротоксина, не всегда указывает на наличие экспрессии самого токсина. Поэтому разработка и совершенствование методов выявления холерного токсина in vitro до сих пор остается актуальной.

В микробиологической практике чаще всего используют для оценки токси-генности холерных вибрионов иммуноферментный анализ, полимеразную цепную реакцию или биологическую пробу на модели кроликов. Использование биопробных животных дает неоднозначные результаты, так как некоторые не-токсигенные штаммы могут давать картину токсической реакции.

Полимеразная цепная реакция является дорогостоящим исследованием, требует специального оборудования, зачастую импортного и специалистов с подготовкой по молекулярной биологии.

Иммуноферментный анализ для определения холерного токсина, включает в себя несколько стадий проведения исследования, требует специальных реагентов, оборудования и подготовленного персонала. Кроме того этот метод также требует существенных затрат, что ограничивает его использование при массовых эпидемических обследованиях.

Лабораториями ВОЗ и CDC предложена методика определения холерного токсина в иммуноферментном анализе, где в качестве связывающего лиганда выступают GM1-ганглиозиды [4].

Суть метода заключается в использовании «сэндвич»-варианта иммуно-ферментного анализа, где специфическими компонентами системы являются сывороточные или моноклональные антитела к холерному токсину, моносиало-гангиозид, а также вторые моноклональные антивидовые антитела, меченные пероксидазой хрена для выявления компекса антиген-антитело.

Другой вариант иммуноферментного анализа для выявления холерного токсина предложен Михеевой Е.А.(5)

Недостатками этих способов является их многостадийность, на результатах исследования сказывается качество адсорбирования МКА или моносиалоган-гиозидов в лунках планшета, качество многоразовых отмывок, а также потребность в приборном обеспечении которое зачастую является импортным, в подготовленном персонале и финансовом обеспечении. В комплект тест-системы иммуноферментной входит 12 компонентов.

В то же время существуют диагностические препараты для определения биологических агентов (антигенов или антител) на основе полимерных окрашенных носителей в простой одностадийной и весьма экономичной реакции агломерации объемной. Иммуносуспензионная реакция агломерации объемная (РАО), проводимая при использовании латексных диагностикумов по сути, является аналогом РНГА, доступным и простым в техническом отношении методом, т.к. не требует наличия специального оборудования, высокой квалификации персонала и может быть использована при проведении исследований в полевых условиях.

Наиболее близким по технической сущности является способ выявления атоксигенных гемолитических штаммов холерного вибриона (6), заключающийся в том, что проводят поэтапную иммунизацию кроликов липазой Pseudomonas spp.и получают антилипазные антитела, которые затем иммобилизуют на полмерных микросферах, а затем в реакции агломерации объемной исследуемые гемолитичные штаммы холерных вибрионов обнруживают свойство продуцировать липазу при взаимодействии с антилипазными антителами иммобилизованными на полимерном носителе и дают при этом положительную реакцию, подтверждая атоксигенность исследуемых штаммов.

Однако известный способ не позволяет выявлять токсигенные штаммы холерного вибриона, выделенные из объектов окружающей среды, определять концентрацию продуцируемого ими холерного токсина для оценки эпидемической опасности, так как используемые антитела и антигены напрямую не связаны со способностью холерного вибриона продуцировать токсин.

Технической задачей предлагаемого изобретения является создание пре-парата-диагностикума, способного выявлять и определять количество токсина холерного вибриона в процессе его выделения из объектов окружающей среды и оценивать его эпидемическую опасность.

Поставленная задача достигается тем, что способ получения диагностикума для количественного определения холерного токсина из объектов окружающей среды включает следующие стадии:

а) получают экспериментальные антитоксические иммунные кроличьи сыворотки путем иммунизации кроликов весом 2,5 - 3,0 кг с помощью введения препарата чистого холерного токсина в дозе 100 мкг белка подкожно в паховый лимфатический узел и внутривенно в краевую ушную вену в количестве Зх инъекций с интервалом в 14 дней, затем через 14 дней после последней инъекции осуществляют обескровливание кроликов, а из крови готовят сыворотки с последующим определением титра антител;

б) выделяют иммуноглобулины из кроличьих сывороток, для этого предварительно готовят физиологический раствор, забуференный двузамещенным фосфатом натрия и однозамещенным фосфатом калия при рН 7,2 (ЗФР), затем готовят водный раствор метанола, смешивая 6 мл метанола с 8 мл дистиллированной воды, смесь охлаждают, после чего полученную сыворотку в количестве 4 мл соединяют с 2 мл забуференного физиологического раствора (ЗФР)перемешивают, помещают в центрифужные стаканы ставят на лед добавляют метанольную воду 14 мл понижая при этом температуру до -5°С, после чего стакан со смесью ставят в холодильник на 30-40 минут, а затем центрифугируют при 2000 об./мин в течение 20 минут при нулевой температуре, полученную надосадочную жидкость сливают, а осадок суспендируют в ЗФР от исходного объема сыворотки, определяют количество белка по методу Лоури, получая в результате сенситин;

в) готовят полимерный носитель, используя метод анионной полимеризации мономера-акрилового альдегида в водно-щелочной среде с получением монодисперсных частиц сферической формы диаметром 1,0 ±0,1 микрон, которые окрашивают тианином и отмывают дистиллированной водой;

г) сенсибилизируют полимерный носитель иммуноглобулинами к холерному токсину, для этого осадок отмытого носителя суспендируют в боратном буфере (рН8,4), добавляют к нему иммуноглобулины и оставляют для контакта при перемешивании в течение 2 часов при 20°С, в результате альдегидные реакционные группы на поверхности частиц специфически взаимодействуют с аминогруппами белковых молекул иммуноглобулинов. После этого суспензию охлаждают до 4-5°С.и выдерживают при этой температуре 16-18 часов.

д) блокируют свободные альдегидные группы путем введения в суспензию 0,5%-ного раствора желатозы на забуференном физиологическом растворе (рН 7,0-7,1) и инкубацией в течение 2-х часов при комнатной температуре при постоянном перемешивании на электромагнитрой мешалке;

е) суспензию диагностикума центрифугируют в течение 10 минут при 6000 об/мин. и трижды отмывают забуференным физиологическим раствором (рН 7,0-7,1) от избытка желатозы, а конечный осадок суспендируют в 0,1%-ном растворе желатозы в забуференном физиологическом растворе (рН 7,0-7,1).

ж) определяют чувствительность препарата используя препарат чистого холерного токсина, для этого в лунки планшета вносят по 50 мкл нормальной кроличьей сыворотки, затем в первую лунку первого ряда вносят 50 мкл раствора холерного токсина с содержанием белка 100 мкг/мл и двукратно титруют до 12 лунки включительно, причем из последней 12 лунки удаляют 50 мкл жидкости, 13 и 14 лунки, в которые вносят только 50 мкл нормальной кроличьей сыворотки для контроля на спонтанную агглютинацию диагностикума, потом во все лунки рядов вносят по 25 мкл взвеси диагностикума, через 2,5 часа инкубации при комнатной температуре проводят учет результатов реакции проводят визуально, при этом последняя лунка, а именно 10-я, дающая положительный результат - голубой агломерат выстилающий все дно лунки, разведение которой содержит 100 нг белка /мл, что соответствует чувствительности диагностического препарата, а специфичность препарата определяют в реакции агломерации объемной (РАО);

з) лиофилизацию диагностикума осуществляют путем суспендирования препарата в 20 мл 3% желатозо-сахарозной среды, затем суспензию разливают в ампулы по 1 мл, замораживают в жидком азоте, с последующим вакуумным высушиванием, постепенно поднимая температуру до 22-23 С в течение суток.

При этом реакцию агломерации объемную осуществляют в планшетах путем внесения в лунки 50 мкл 1% нормальной кроличьей сыворотки, затем в первую лунку каждого ряда вносят 50 мкл исследуемого и двукратно титруют до конца ряда, из последней лунки 50 мкл удаляют, в две любые лунки вносят только нормальную кроличью сыворотку для контроля спонтанной агглютинации диагностикума, затем во все лунки вносят по 25 мкл диагностикума и оставляют при комнатной температуре, учет результатов РАО осуществляют через 2-2,5 часа, при положительном результате фиксируется равномерный цветной агломерат выстилающий все дно лунки, с четко очерченными краями, а в отрицательном случае и в отрицательном контроле образуется компактное колечко или точка в центре лунки.

Кроме того определяют концентрацию холерного токсина в жидкой питательной среде для культивирования холерного вибриона, в которую продуцируется токсин, для этого реакцию ставят по методике РАО, но в лунках планшета с разводящей жидкостью НКС двукратно титруют жидкую питательную среду после культивирования в ней возбудитея холеры, затем вносят по 25 мкл иммуноглобулинового диагностикума, при этом последняя лунка с положительной реакцией фиксирует величину последнего разведения культуральной жидкости, поэтому концентрацию холерного токсина рассчитывают по формуле:

С=Р×Ч

где С - искомая концентрация холерного токсина;

Р - последнее разведение исследуемой жидкости, в котором фиксировался положительный результат;

Ч - чувствительность диагностикума в нг/мл.

Способ осуществляется следующим образом.

На первом этапе готовят диагностический препарат по следующей технологии:

а) Получают экспериментальные гипериммунные кроличьи сыворотки, используя чистый препарат холерного токсина, полученный авторами из токсигенного штамма V.cholerae 569В O1 серогруппы из коллекции музея живых культур с центром патогенных для человека вибрионов Ростовского-на-Дону противочумного института.

Для подбора иммунизирующих доз определяют концентрацию белка по Лоури. Затем для иммунизации отбирают самцов кроликов калифорнийской породы весом от 2,5 до 3,0 кг. Иммунизацию осуществляют путем введения препарата холерного токсина в дозе 100 мкг белка подкожно в паховый лимфатический узел и внутривенно в краевую ушную вену в количестве 3х инъекций с интервалом в 14 дней. Через 14 дней после последней инъекции осуществляют обескровливание кроликов, а из крови готовят сыворотки с последующим определением титра антител. Полученную гипериммунную сыворотку фасуют и хранят в замороженном состоянии при -30°С.

б) Выделяют иммуноглобулины из кроличьих гипериммунных сывороток с помощью метанольного метода.

Для этого предварительно готовят 0,9% раствор NaCl добавляют двузаме-щенный фосфат натрия и однозамещенный фосфат калия при рН 7,2 (ЗФР), затем готовят водный раствор метанола, смешивая 6 мл метанола с 8 мл дистиллированной воды, смесь охлаждают. После этого на лед помещают центрифужные стаканы, в них наливают 4 мл полученной сыворотки, добавляют 2 мл ЗФР, перемешивают и вливают метанольную воду 14 мл понижая при этом температуру до - 5°С.Стакан со смесью ставят в холодильник на 30-40 минут, а затем центрифугируют при 2 ООО об./мин в течение 20 минут при нулевой температуре. Полученную надосадочную жидкость сливают, а осадок суспендируют в ЗФР от исходного объема сыворотки, определяют количество белка по методу Лоури, получая в результате сенситин;

в) Готовят полимерный носитель, используя метод анионной полимеризации мономера - акрилового альдегида - в водно-щелочной среде с получением монодисперсных частиц сферической формы диаметром 1,0 ±0,1 микрон, которые окрашивают тианином и отмывают дистиллированной водой;

г) Проводят иммобилизацию сенситина на носитель.

Для иммобилизации сенситина осадок полиакролеинового окрашенного носителя суспендируют в боратном буфере (рН8,4), добавляют к нему холерные иммуноглобулины и оставляют для контакта при перемешивании в течение 2 часов при 20°С. В результате альдегидные реакционные группы на поверхности частиц специфически взаимодействуют с аминогруппами белковых молекул иммуноглобулинов. После этого суспензию охлаждают до 4-5°С. и выдерживают при этой температуре 16-18 часов.

д) Блокируют свободные альдегидные группы путем введения в суспензию 0,5%-ного раствора желатозы на забуференном физиологическом растворе (рН 7,0-7,1) и инкубацией в течение 2-х часов при комнатной температуре при постоянном перемешивании. В результате стабилизации желатоза позволяет блокировать не связавшиеся в процессе сенсибилизации с иммуноглобулинами реакционные группы на поверхности частиц.

е) Суспензию диагностикума центрифугируют в течение 10 минут при 6000 об/мин. и трижды отмывают забуференным физиологическим раствором (рН 7,0-7,1) от избытка желатозы, а конечный осадок суспендируют в 0,1%-ном растворе желатозы в забуференном физиологическом растворе (рН 7,0-7,1).

ж) Определяют чувствительность препарата используя препарат чистого холерного токсина, для этого в лунки планшета вносят по 50 мкл нормальной кроличьей сыворотки, затем в первую лунку первого ряда вносят 50 мкл раствора холерного токсина с содержанием белка 100 мкг/мл и двукратно титруют до 12 лунки включительно, причем из последней 12 лунки удаляют 50 мкл жидкости, 13 и 14 лунки, в которые вносят только 50 мкл нормальной кроличьей сыворотки для контроля на спонтанную агглютинацию диагностикума. После этого во все лунки рядов вносят по 25 мкл взвеси диагностикума, через 2,5 часа инкубации при комнатной температуре и проводят учет результатов реакции визуально, при этом последняя лунка, а именно 10-я, дающая положительный результат - голубой агломерат, выстилающий все дно лунки, разведение которой соответствует 100 нг белка /мл, определяет чувствительность диагностического препарата, т.е. ту минимальную концентрацию холерного токсина, которую способен выявить диагностический препарат, что позволяет, используя количественное выражение чувствительности (Ч), определять концентрацию холерного токсина в исследуемых объектах после выделения токсигенного холерного вибриона.

Специфичность препарата определяют подобным образом в реакции агломерации объемной (РАО) используя нетоксигенные штаммы холерного вибриона и гетерологичные штаммы возбудителей кишечных инфекций.

з) Лиофилизацию диагностикума осуществляют путем суспендирования препарата в 20 мл 3% желатозо-сахарозной среды, затем суспензию разливают в ампулы по 1 мл, замораживают в жидком азоте, с последующим вакуумным высушиванием, постепенно поднимая температуру до 22-23°С в течение суток.

Методика постановки реакции.

Реакцию агломерации объемную осуществляют в планшетах путем внесения в лунки 50 мкл 1% нормальной кроличьей сыворотки, затем в первую лунку каждого ряда вносят 50 мкл исследуемого вещества и двукратно титруют до конца ряда, из последней лунки 50 мкл удаляют. В две любые лунки вносят только нормальную кроличью сыворотку для контроля спонтанной агглютинации диагностикума. Затем во все лунки вносят по 25 мкл диагностикума и оставляют при комнатной температуре, учет результатов РАО осуществляют через 2-2,5 часа, при положительном результате фиксируется равномерный цветной агломерат, выстилающий все дно лунки, с четко очерченными краями, а в отрицательном случае и в отрицательном контроле образуется компактное колечко или точка в центре лунки.

1) Определение специфической чувствительности иммуноглобулино-вого антитоксического диагностикума в реакции агломерации объемной (РАО) по вышеприведенной технологии.

Для исследования готовят раствор холерного токсина с концентрацией белка 100 мкг/ мл, в лунки 96-луночного планшета для иммунологических реакций в ряд А вносят по 50 мкл 1%-ной нормальной кроличьей сыворотки. Затем в первую лунку ряда А вносят микропипеткой-дозатором 50 мкл раствора холерного токсина и титруют, т.е. делают двукратные последовательные разведения, по 12 лунку. В две другие лунки 1 и 2 ряда В вносят только по 50 мкл нормальной кроличьей сыворотки. Во все 14 лунок рядов А и В вносят по 25 мкл диагностикума в рабочем разведении (1 мл диагностикума+6 мл ЗФР). Две лунки ряда В содержат только НКС и диагностикум и служат отрицательным контролем на отсутствие спонтанной агломерации. Содержимое лунок перемешивают покачиванием и оставляют при комнатной температуре на 2,5 часа.

Учет результатов реакции осуществляют визуально по образованию голубого агломерата. За положительный результат принимают цветной голубой агломерат, равномерно выстилающий все дно лунки. В отрицательном случае и контроле диагностикума образуется компактное колечко или «точка» в центре лунки. Последняя лунка, в которой фиксируется положительный результат, соответствует уровню специфической чувствительности (Ч) исследуемого диагностикума концентрация белка в которой составляет 100нг/мл и является чувствительностью диагностикума, т.е. той минимальной концентрации холерного токсина, которую способен выявить диагностический препарат, что позволяет используя количественное выражение чувствительности определять концентрацию холерного токсина в исследуемых объектах после выделения токсигенного холерного вибриона.

2) Определяют концентрацию холерного токсина в жидкой питательной среде для культивирования холерного вибриона, в которую продуцируется токсин, для этого реакцию ставят по методике РАО, но в лунках планшета с разводящей жидкостью НКС двукратно титруют жидкую питательную среду после культивирования в ней возбудителя холеры, затем вносят по 25 мкл иммуноглобулинового диагностического препарата, при этом последняя лунка с положительной реакцией фиксирует величину последнего разведения культуральной жидкости, поэтому концентрацию холерного токсина рассчитывают по формуле:

С=Р×Ч,

где С - искомая концентрация холерного токсина;

Р - последнее разведение исследуемой жидкости, в котором фиксировался положительный результат;

Ч - чувствительность диагностикума в нг/мл.

Пример 1. Определяют количества токсина в исследуемом материале музейных бульонных культур токсигенных штаммов холерного вибриона, взятых из колекции музея живых культур с центром патогенных для человека вибрионов Ростовского-на-Дону противочумного института.

Ряд С - раститровывается в НКС V.cholerae 12214;

Ряд D - раститровывается в НКС V.cholerae 1310;

Результаты определения токсинопродукции с помощью диагностического полимерного антитоксического холерного иммуноглобулинового диагностикума в РАО.

Учет результатов реакции через 2,5 часа.

V.cholerae 12214 - положительная реакция фиксируется в разведении 1:512 и количество токсина - по формуле:

С=Р×Ч - 512×100 нг=51,2 мкг/мл

V.cholerae 1310 - положительная реакция фиксируется в разведении 1:32 и количество токсина по формуле

С=Р×Ч составит 32×100нг=3,2 мкг/мл

Вывод: так как штамм V.cholerae 12214 продуцирует 51,2 мкг/мл токсина, а штамм V.cholerae 1310 - 3,2 мкг/мл токсина, то штамм V.cholerae 12214 является более токсигенным и эпидемически значимым, чем штамм V.cholerae 1310.

Пример 2. Отличается от примера 1 тем, что исследуемым материалом являются бульонные культуры нетоксигенных штаммов холерного вибриона из колекции музея живых культур с центром патогенных для человека вибрионов Ростовского-на-Дону противочумного института

Ряд L- раститровывается в НКС V.cholerae 18963;

Ряд F- раститровывается в НКС V.cholerae 15031;

Результаты определения токсинопродукции с помощью диагностического полимерного антитоксического холерного иммуноглобулинового диагностикума в РАО.

Учет результатов реакции через 2,5 часа.

В этих рядах фиксировали отсутствие реакции, т.е. в центре лунки формировалась «пуговка», что говорит об отсутствии токсинопродукции этими холерными штаммами.

Вывод: исследованные культуры V.cholerae 18963 и V.cholerae l5031 являются нетоксигенными, т.е. не продуцирующими холерный токсин и не представляющими эпидемической угрозы.

Пример 3.

Определяют токсинопродукцию и количество продуцируемого токсина культурами холерного вибриона с неизвестной токсигенностью выделенными из водной среды.

Отличается от примера 2 тем, что исследуемым материалом являются культуры холерного вибриона выделенные из водных источников в процессе мониторинга после бактериологической идентификации.

Ряд G-раститровывется в НКС бульонная культура холерного вибриона №1 из водного источника;

Ряд Н- раститровывется в НКС бульонная культура холерного вибриона №2 из водного источника;

Результаты определения токсинопродукции холерных вибрионов с помощью диагностического полимерного антитоксического холерного иммуноглобулинового диагностикума в РАО.

Учет результатов реакции через 2,5 часа.

В ряду G фиксируется отрицательная реакция, что говорит о том, что выделенная холерная культура не является токсигенной.

. В ряду Н фиксируется положительная реакция в разведении 1:8, что говорит о невысоком уровне токсигенности данной культуры и количество токсина составит:

С=Р×Ч 8×100нг=0,800 мкг/м

Вывод: таким образом культура холерного вибриона выделенная из водного источника №1 является нетоксигенной, безопасной в эпидемическом отношении.

Холерный вибрион выделенный из водоисточника №2 обладает слабой токси-нопродукцией, однако за этим источником необходимо продолжить наблюдение.

Таким образом приведенные примеры исследования токсинопродукции различных культур холерного вибриона, показывают эффективность использования предлагаемого метода.

Использование предлагаемого способа позволяет определелять токсино-продукцию холерного вибриона в простой одностадийной реакции агломерации объемной путем разработанного авторами полимерного иммуноглобулинового диагностикума и дает возможность решать задачи не только в научных исследованиях, но и при эпидемиологическом мониторинге объектов окружающей среды, с целью выявления эпидемически опасных токсигенных штаммов холерного вибриона, значительно упрощая и сокращая сроки бактериологического анализа.

Источники информации

1. Detection of Cholera Toxin: Laboratory Methods for the Diagnosis of Vibrio cholerae Centers for Disease Control and Prevention Laboratory Methods for the Diagnosis of Vibrio cholerae Centers for Disease Control and Prevention. - Atlanta, JA, 1994. -P. 62-88.

2. Патент №2528099, кл. GO1N 33/53, 27.10.2013 г., «Биологический микрочип для выявления и многопараметрического анализа противохолерных антител»,

// Определение генных детерминант холерного энтеротоксина методом поли-меразной цепной реакции./ / СВ. Балахонов, B.C. Ганин, Л.Я. Урбанович, Журнал инфекционной патологии. - 1998. - N 4. - С. 52-54.

4. //Практическое руководство по лаб. диагн. опасных инф. болезней. // Под ред. акад. РАМН Г.Г. Онищенко, акад. РАМН В.В. Кутырева. - Изд. 2-е. -М.:30 «Шико», 2013. -560 с.

5. Михеева Е. А

Конструирование диагностической иммуноферментной тест-системы для идентификации токсигенных штаммов холерного вибриона. Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук, РосНИПЧИ « Микроб» Г. Саратов, 2017 г.

6. Патент №2261444, кл.G01N 35/50 от 22.03.2004 г., «Способ выявления атоксигенных гемолитичных штаммов холерных вибрионов»

1.11 Холера: оценка эпидемиологической обстановки в мире и России в 2006-2015 гг.прогноз на 2016 г. / / СВ. Титова, Э.А. Москвитина, В.Д. Кругликов, А.В. Самородова.Г. Тюленева, Е.В. Монахова, Р.В. Писанов, А.С Водопьянов, нов, И.В. Архангельская, СМ. Иванова, Т.В. Ковалева, СО. Водопьянов, Пробл. особоопасн. инфекций. - 2016. - Вып. 1. - С. 20-27.

8. // Конструирование псевдотуберкулезного видоспецифического полимерного диагностикума / Г.Л. Карбышев, Д.И. Симакова, Л.В. Ларионова и др. // По матер, науч.-практ. конф. «Современные аспекты эпиднадзора и профилактики особо опасных и природно-очаговых болезней», посвященной 75-летнему юбилею ФГУЗ НИПЧИ Сибири и Дальнего Востока. - Иркутск, 2009. - с. 122- 123, а также патент №),

9. Ларионова Л.В., Черникова А.А., Архангельская И.В., Симакова Д.И., Наркевич А.Н., Карбышев Г.Л., Терентьев А.Н. //Разработка препаратов для комплексной серологической диагностики холеры у людей // Обмен веществ при адаптации повреждений. Материалы X межвузовской конференции с международным участием. - Ростов-на-Дону. - 2011 - С 101 - 103.),

10. Наркевич А.Н., Карбышев Г.Л., Терентьев А.Н., Ларионова Л.В., Кочеткова А.П., Шелохович А.И., Наталич А.Н., Симакова Д.И., Сокиркина О.Г. // Конструирование набора полимерных иммуноглобулиновых диагностикумов для серологической идентификации L. pneumophila // Акт. пробл. болезней, общих для человека и животных: Матер, Всеросс. науч-практ конф. с междунар. участием. (Ставрополь, 2012. - Стр. 138-139.).

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии, и может быть использовано для получения диагностикума для количественного определения токсина холерного вибриона, выделенного из объектов окружающей среды. Для этого получают экспериментальные антитоксические иммунные кроличьи сыворотки путем иммунизации кроликов весом 2,5-3,0 кг с помощью введения препарата чистого холерного токсина в дозе 100 мкг белка подкожно в паховый лимфатический узел и внутривенно в краевую ушную вену в количестве 3 инъекций с интервалом в 14 дней, затем через 14 дней после последней инъекции осуществляют обескровливание кроликов, а из крови готовят сыворотки с последующим определением титра антител. Далее выделяют иммуноглобулины из кроличьих сывороток, для этого предварительно готовят физиологический раствор, забуференный двузамещенным фосфатом натрия и однозамещенным фосфатом калия при рН 7,2 (ЗФР), затем готовят водный раствор метанола, смешивая 6 мл метанола с 8 мл дистиллированной воды, смесь охлаждают, после чего полученную сыворотку в количестве 4 мл соединяют с 2 мл забуференного физиологического раствора (ЗФР), помещают в центрифужные стаканы, ставят на лед и выливают в них сыворотку при температуре 0°С, затем добавляют забуференный физиологический раствор, перемешивают, вливают метанольную воду 14 мл, понижая при этом температуру до - 5°С, после чего стакан со смесью ставят в холодильник на 30-40 минут, а затем центрифугируют при 2000 об/мин в течение 20 минут при нулевой температуре, полученную надосадочную жидкость сливают, а осадок суспендируют в ЗФР от исходного объема сыворотки, определяют количество белка по методу Лоури, получая в результате сенситин. Готовят полимерный носитель, используя метод анионной полимеризации мономера - акрилового альдегида - в водно-щелочной среде с получением монодисперсных частиц сферической формы диаметром 1,0 ±0,1 микрон, которые окрашивают тианином и отмывают дистиллированной водой. Затем сенсибилизируют полимерный носитель иммуноглобулинами к холерному токсину, для этого осадок отмытого носителя суспендируют в боратном буфере (рН8,4), добавляют к нему иммуноглобулины и оставляют для контакта при перемешивании в течение 2 часов при 20°С, в результате альдегидные реакционные группы на поверхности частиц специфически взаимодействуют с аминогруппами белковых молекул иммуноглобулинов. После этого суспензию охлаждают до 4-5°С и выдерживают при этой температуре 16-18 часов. Блокируют свободные альдегидные группы путем введения в суспензию 0,5%-ного раствора желатозы на забуференном физиологическом растворе (рН 7,0-7,1) и инкубацией в течение 2 часов при комнатной температуре. Суспензию диагностикума центрифугируют в течение 10 минут при 6000 об/мин. и трижды отмывают забуференным физиологическим раствором (рН 7,0-7,1) от избытка желатозы, а конечный осадок суспендируют в 0,1%-ном растворе желатозы в забуференном физиологическом растворе (рН 7,0-7,1). Лиофилизацию диагностикума осуществляют путем суспендирования препарата в 20 мл 3% желатозо-сахарозной среды, затем суспензию разливают в ампулы по 1 мл, замораживают в жидком азоте с последующим вакуумным высушиванием, постепенно поднимая температуру до 22-23°С в течение суток. Использование данного способа позволяет получить диагностикум для количественного определения токсина холерного вибриона, выделенного из объектов окружающей среды, с целью выявления эпидемически опасных токсигенных штаммов холерного вибриона. 2 з.п. ф-лы, 3 табл., 2 пр.

1. Способ получения диагностикума для определения токсина холерного вибриона, выделенного из объектов окружающей среды, включающий следующие стадии:

а) получают экспериментальные антитоксические иммунные кроличьи сыворотки путем иммунизации кроликов весом 2,5-3,0 кг с помощью введения препарата чистого холерного токсина в дозе 100 мкг белка подкожно в паховый лимфатический узел и внутривенно в краевую ушную вену в количестве 3 инъекций с интервалом в 14 дней, затем через 14 дней после последней инъекции осуществляют обескровливание кроликов, а из крови готовят сыворотки с последующим определением титра антител;

б) выделяют иммуноглобулины из кроличьих сывороток, для этого предварительно готовят физиологический раствор, забуференный двузамещенным фосфатом натрия и однозамещенным фосфатом калия при рН 7,2 (ЗФР), затем готовят водный раствор метанола, смешивая 6 мл метанола с 8 мл дистиллированной воды, смесь охлаждают, после чего полученную сыворотку в количестве 4 мл соединяют с 2 мл забуференного физиологического раствора (ЗФР), перемешивают, помещают в центрифужные стаканы, ставят на лед, добавляют метанольную воду 14 мл, понижая при этом температуру до -5°С, после чего стакан со смесью ставят в холодильник на 30-40 минут, а затем центрифугируют при 2000 об/мин в течение 20 минут при нулевой температуре, полученную надосадочную жидкость сливают, а осадок суспендируют в ЗФР от исходного обьема сыворотки, определяют количество белка по методу Лоури, получая в результате сенситин;

в) готовят полимерный носитель, используя метод анионной полимеризации мономера - акрилового альдегида - в водно-щелочной среде с получением монодисперсных частиц сферической формы диаметром 1,0 +0,1 микрон, которые окрашивают тианином и отмывают дистиллированной водой;

г) сенсибилизируют полимерный носитель иммуноглобулинами к холерному токсину, для этого осадок отмытого носителя суспендируют в боратном буфере (рН8,4), добавляют к нему иммуноглобулины и оставляют для контакта при перемешивании в течение 2 часов при 20°С, в результате альдегидные реакционные группы на поверхности частиц специфически взаимодействуют с аминогруппами белковых молекул иммуноглобулинов, после этого суспензию охлаждают до 4-5°С и выдерживают при этой температуре 16-18 часов;

д) блокируют свободные альдегидные группы путем введения в суспензию 0,5%-ного раствора желатозы на забуференном физиологическом растворе (рН 7,0-7,1) и инкубацией в течение 2 часов при комнатной температуре при постоянном перемешивании на электромагнитрой мешалке;

е) суспензию диагностикума центрифугируют в течение 10 минут при 6000 об/мин и трижды отмывают забуференным физиологическим раствором (рН 7,0-7,1) от избытка желатозы, а конечный осадок суспендируют в 0,1%-ном растворе желатозы в забуференном физиологическом растворе (рН 7,0-7,1);

ж) определяют чувствительность препарата, используя препарат чистого холерного токсина, для этого в лунки планшета вносят по 50 мкл нормальной кроличьей сыворотки, затем в первую лунку первого ряда вносят 50 мкл раствора холерного токсина с содержанием белка 100 мкг/мл и двукратно титруют до 12 лунки включительно, причем из последней 12 лунки удаляют 50 мкл жидкости, 13 и 14 лунки, в которые вносят только 50 мкл нормальной кроличьей сыворотки для контроля на спонтанную агглютинацию диагностикума, потом во все лунки рядов вносят по 25 мкл взвеси диагностикума, через 2,5 часа инкубации при комнатной температуре проводят учет результатов реакции визуально, при этом последняя лунка, а именно 10-я, дающая положительный результат, - голубой агломерат, выстилающий все дно лунки, разведение которой содержит 100 нг белка/мл, что соответствует чувствительности диагностического препарата, а специфичность препарата определяют в реакции агломерации объемной (РАО);

з) лиофилизацию диагностикума осуществляют путем суспендирования препарата в 20 мл 3% желатозо-сахарозной среды, затем суспензию разливают в ампулы по 1 мл, замораживают в жидком азоте, с последующим вакуумным высушиванием, постепенно поднимая температуру до 22-23°С в течение суток.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что реакцию агломерации объемную осуществляют в планшетах путем внесения в лунки 50 мкл 1% нормальной кроличьей сыворотки, затем в первую лунку каждого ряда вносят 50 мкл исследуемого вещества и двукратно титруют до конца ряда, из последней лунки 50 мкл удаляют, в две любые лунки вносят только нормальную кроличью сыворотку для контроля спонтанной агглютинации диагностикума, затем во все лунки вносят по 25 мкл диагностикума и оставляют при комнатной температуре, учет результатов РАО осуществляют через 2-2,5 часа, при положительном результате фиксируется равномерный цветной агломерат, выстилающий все дно лунки, с четко очерченными краями, а в отрицательном случае и в отрицательном контроле образуется компактное колечко или точка в центре лунки.

3. Способ по п. 2 отличающийся тем, что определяют концентрацию холерного токсина в жидкой питательной среде для культивирования холерного вибриона, в которую продуцируется токсин, для этого реакцию ставят по методике РАО, но в лунках планшета с разводящей жидкостью НКС двукратно титруют жидкую питательную среду после культивирования в ней возбудителя холеры, затем вносят по 25 мкл иммуноглобулинового диагностикума, при этом последняя лунка с положительной реакцией фиксирует величину последнего разведения культуральной жидкости, поэтому концентрацию холерного токсина рассчитывают по формуле:

С=Р×Ч,

где С - искомая концентрация холерного токсина;

Р - последнее разведение исследуемой жидкости, в котором фиксировался положительный результат;

Ч - чувствительность диагностикума в нг/мл.