ШТАММ БАКТЕРИЙ VIBRIO CHOLERAE - ПРОДУЦЕНТ ХОЛЕРНОГО ТОКСИНА II ТИПА Российский патент 2008 года по МПК C12N1/20 C12R1/63 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к конструированию штамма с повышенной продукцией холерного токсина II типа, и может быть использовано при создании химических вакцин нового поколения, а также при конструировании иммуноферментных диагностических тест-систем. Кроме того, данное изобретение может использоваться в молекулярно-генетических исследованиях, направленных на изучение нового механизма регуляции экспрессии генов вирулентности и иммуногенности у патогенных бактерий.

Холерный токсин II типа, продуцируемый холерными вибрионами биовара эльтор и отличающийся по антигенным свойствам от холерного токсина I типа, который синтезируют V. cholerae классического биовара, является необходимым компонентом поливалентных химических холерных вакцин, формирующим антитоксический иммунитет при холере. Этот иммуногенный белок входит также в состав иммунодиагностических тест-систем, предназначенных для дифференциации токсигенных и нетоксигенных штаммов холерного вибриона биовара эльтор.

Известен штамм Vibrio cholerae 2414 классического биовара серовара Огава - продуцент холерного токсина и токсин-корегулируемых пилей адгезии (патент РФ №2169187, С12N 1/20), эффективно продуцирующий в среду выращивания холерный токсин I и II типов - 48-60 мкг/мл, по данным иммуноферментного анализа GM₁ ELISA.

Природные штаммы V.cholerae биовара эльтор, используемые в производстве холерных вакцин, в условиях in vitro образуют незначительное количество холерного токсина II типа - менее 0,1 мкг/мл (Mekalanos J.J., Duplikation and amplifikation of toxin genes in Vibrio cholerae // Cell. - 1983. - V. - 253-263), ввиду чего их использование в промышленных условиях является маловероятным.

Среди экспериментально полученных штаммов известен штамм V.cholerae биовара эльтор серовара Огава КМ1446/рСО107-2, описанный в авторском свидетельстве СССР №1412306, С12N 15/00 и синтезирующий 5 мкг/мл холерного токсина. Довольно высокий уровень продукции этого белка обусловлен присутствием в клетках рекомбинантной плазмиды рСО107-2, несущей клонированные гены холерного токсина (ctxAB) и ген резистентности к канамицину (kan). В то же время при отсутствии селективного давления (канамицина в среде выращивания) стабильность наследования рекомбинантной плазмиды составляет 70-80%, что ведет к снижению продукции XT. Необходимость добавления в среду выращивания антибиотика затрудняет технологию культивирования штамма в производственных условиях.

Наиболее близким к заявленному штамму является штамм V.cholerae KM195 - продуцент холерного токсина II типа (патент РФ №2172776, МКИ: С12N 1/20, 1/21, А61К 39/106). Штамм получен экспериментальным путем, при инфицировании клеток V.cholerae биовара эльтор умеренным холерным фагом 139. Полученные лизогенные клетки продуцировали в среду выращивания 7,0 мкг/мл (по данным GM₁ ELISA). Однако указанный штамм содержит в хромосоме умеренный фаг 139, способный индуцировать вторичные генетические перестройки в геноме, которые могут привести к возникновению нетоксигенных вариантов.

Сущность изобретения состоит в конструировании штамма холерного вибриона биовара эльтор с высокой и стабильной продукцией холерного токсина II типа.

Для создания штамма с заданными свойствами был использован транспозонный мутагенез профага СТХϕ, содержащего гены асе, zot и ctxAB, в результате которого повысилась экспрессия структурных генов холерного токсина (ctxAB). Штамм сконструирован путем введения в клетки природного штамма V.cholerae MAK757 биовара эльтор конъюгативной плазмиды pSUP5011 (Ap^RCm^R), несущей транспозон Tn5-Mob (Km^R). При последующем культивировании плазмидного штамма при 4°С в бульоне с добавлением канамицина отбирают трансконъюганты Km^RAp^SCm^S, утратившие плазмиду, но сохранившие транспозон, внедренный в ген zot профага СТХϕ. В результате реорганизации генома профага в полученном штамме MAK757 zot::TnMob (Km^RTox⁺) происходит значительное усиление экспрессии генов холерного токсина.

Штамм депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» в Российском научно-исследовательском противочумном институте «Микроб» (г.Саратов) под номером КМ234.

Заявленный штамм характеризуется следующими признаками:

- имеет высокий уровень продукции холерного токсина II типа - 45,0 мкг/мл (по данным иммуноферментного анализа GM₁ELISA);

- генетически маркирован за счет внедрения транспозона Tn5-mob в ген zot;

- стабилен - сохраняет указанные свойства при хранении и культивировании на питательных средах.

Культурально-морфологические признаки.

Слабоподвижные, слегка изогнутые палочки, не образующие капсул и спор. На твердых питательных средах через 18-24 часа роста при 37°С формируют круглые серовато-голубые полупрозрачные колонии с ровными краями; в бульоне образуют равномерное помутнение. Штамм растет на простых питательных средах и на средах с добавлением канамицина (50 мг/мл). Прототроф.

Физиологические свойства.

Не лизирует эритроциты барана, агглютинирует куриные эритроциты, растет на щелочном агаре с добавлением 50 мкг/мл полимиксина. Не ферментирует лактозу и арабинозу, ферментирует маннозу, сахарозу, маннит, мальтозу до кислоты без газа. Агглютинируется до титра специфическими диагностическими сыворотками О и Огава. Чувствителен к холерному диагностическому фагу «Эльтор». Штамм хранят в лиофильно высушенном состоянии не менее одного года.

Пример 1, свидетельствующий о высокой продуктивности штамма.

Определение продукции холерного токсина. Продукцию холерного токсина определяют с помощью радиального пассивного гемолиза (РПИГ) на плотной среде и иммуноферментным методом GM₁ ELISA.

РПИГ, чувствительность которого составляет 0,2 мкг/мл, ставят по методу Bramucei M.G., Holmes R.K. (1978), модифицированному Шагиняном И.А., Маракушей Б.М. (Шагинян И.А., Маракуша Б.М. // Журн. Микробиол. - 1983. - №7. - С.92-96). Колонии изучаемых штаммов методом реплик переносят на чашки с 1,0% синказным агаром, содержащим 1,0% отмытых в синказном бульоне эритроцитов барана. Посевы инкубируют 18 ч при 30°С, заливают слоем 0,5% синказного агара, содержащего азид натрия, комплемент морской свинки и монорецепторную антитоксическую сыворотку (АТС) и помещают в термостат на 1-2 ч при 37°С. По истечении указанного срока вокруг макроколоний созданного штамма КМ234 формируется четкая зона иммунного гемолиза размером в 2-2,5 мм, тогда как вокруг макроколоний исходного штамма МАК757 эта зона отсутствует.

Для количественного определения холерного токсина применяют иммуноферментный метод GM₁ ELISA (Svennerholm A.-M., Wikland G., 1983). В качестве контроля и для определения чувствительности метода используют очищенный препарат холерного токсина. Исходную культуру штамма КМ234 выращивают в казаминовом бульоне (казаминовые кислоты - 30 г/л, дрожжевой экстракт - 5 г/л, рН 7,6) в течение 16-18 часов в условиях интенсивной аэрации. Клетки осаждают центрифугированием при 4000 g в течение 15 минут и в супернатанте определяют содержание холерного токсина следующим образом. Пробы инкубируют в течение двух часов при 37°С в лунках микроплат, предварительно заблокировав неспецифическую сорбцию инертным белком (бычий сывороточный альбумин). Инкубацию с кроличьей антитоксической противохолерной сывороткой, разведенной 1:200, проводят в течение 1 ч при 37°С. После промывания лунок 0,05 М фосфатным буфером рН 7,2-7,4 добавляют рабочее разведение иммуноферментных конъюгатов, которые представляют собой меченные пероксидазой козьи диагностические антитела против иммуноглобулинов кролика. Реакцию учитывают через 15 минут после добавления субстрата - 0,03% перекиси водорода в цитратном буфере рН 4,0 с 0,1% ABTS (2.2 azino-di-(3-ethylbenzthiazoline sulphonate). Чуствительность метода ELISA составляет в данной серии опытов 1 нг/мл. Количество продуцируемого холерного токсина у исследуемого штамма КМ234 рассчитывают в соответствии с установленной чувствительностью и подсчетом числа выросших микробных клеток.

Согласно данным иммуноферментного метода GM₁ ELISA, заявленный штамм продуцирует в 2250 раз больше холерного токсина (45 мкг/мл) по сравнению с исходным (0,02 мкг/мл). По сравнению с известным штаммом продуцентом холерного токсина II типа V.cholerae eitor KM195 по патенту РФ №2172776 (7 мкг/мл) уровень продукции холерного токсина у заявленного штамма в 6,4 раза выше.

Пример 2, указывающий на присутствие в геноме профага СТХϕ транспозона Тп5-mob.

Используют полимеразную цепную реакцию (ПЦР) со специфическими с праймерами на гены ctxA, ctxB, асе, zot, входящие в состав профага СТХϕ. Клетки 18-часовой культуры, выращенные на LB агаре, ресуспензируют в 1 мл физиологического раствора до концентрации 10⁹ клеток в 1 мл, затем титрованием в дистиллированной воде доводят до конечной концентрации 10⁷ клеток в 1 мл. Далее клетки лизируют путем кипячения в течение 30 минут и после центрифугирования при 12000 g в течение 5 мин супернатант в количестве 10 мкл используют для исследования в ПЦР. К образцу добавляют растворы олигонуклеотидных праймеров, синтезированных на основе нуклеотидных последовательностей генов ctxA, ctxB, асе, zot - по 0,4 мкл каждого, 2,5 мкл 10-кратного ПЦР-буфера, 2,5 мкл раствора дНТФ, 1 мкл 50 мМ раствора хлорида магния, 0,25 мкл Tag-полимеразы и 7,95 мкл деионизированной воды.

В качестве положительного контроля используют ДНК из типичного токсигенного штамма 0139-серогруппы V. cholerae PI 6064, а также исходного штамма V. cholerae МАК757. В отрицательный контроль вносили 10 мкл деионизированной воды.

ПЦР проводят при следующих температурных режимах: 1-й цикл - 95°С - 5 мин; 2-35-й циклы, включающие: денатурацию при 95°С - 30 сек, отжиг при 60°С - 30 сек и синтез при 72°С - 30 сек; 36-й цикл - синтез в течение 7 минут при 72°С.

Результаты ПЦР учитывают с помощью электрофореза при 80 В в течении 35 минут в 1,5% агарозном геле, содержащем 0,5 мкл/мл бромида этидия, с последующим просмотром геля в УФ-свете. По данным ПЦР-анализа в геноме исходного штамма МАК757 присутствуют все тестируемые гены профага асе, zot, ctxA и ctxB. В созданном штамме КМ234 при наличии генов ctxA, ctxB, асе специфический амплификат гена zot отсутствует, что свидетельствует о внедрении в него транспозона Tn5-mob.

Пример 3, свидетельствующий о стабильности продукции холерного токсина.

Штамм V. cholerae KM234 культивируют 18 часов в бульоне без антибиотиков, а затем рассевают на плотные среды до получения изолированных колоний. Последующая проверка 700 колоний на продукцию токсина методом РПИГ показывает, что все изученные клоны были Кm^R и синтезировали этот белок в значительном количестве - зона иммунного гемолиза вокруг макроколоний составляла 2-2,5 мм. Эти данные подтверждают стабильность продукции токсина и стабильность наследования транспозона Tn5-mob штамма KM234. Иммуноферментный анализ 100 произвольно выбранных клонов подтвердил высокий уровень продукции XT (45-48 мкг/мл). В процессе производственных испытаний созданный штамм также характеризовался стабильной продукцией токсина и стабильным наследованием генетического маркера Кm^R.

Таким образом, заявленный штамм Vibrio cholerae KM234 обладает высоким и стабильным уровнем продукции холерного токсина II типа. Штамм может быть использован в производстве для получения химических вакцин нового поколения, содержащих более полный набор протективных антигенов и применяемых для профилактики холеры, вызванной холерным вибрионом как классического, так и эльтор вибрионов. Кроме того, штамм может быть использован для выделения очищенного холерного токсина II типа, используемого для получения антитоксических сывороток, входящих в состав иммунодиагностических тест-систем, которые предназначены для выявления природных токсигенных штаммов Vibrio cholerae биовара эльтор. Более того, штамм рекомендуется использовать при проведении генетических исследований для изучения нового механизма регуляции экспрессии генов вирулентности и иммуногенности холерных вибрионов.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения холерных химических вакцин, применяемых для профилактики холеры, вызванной холерным вибрионом как классического, так и эльтор биовара, а также для создания иммунодиагностической тест-системы, позволяющей выявлять токсигенные клоны Vibrio cholerae. Штамм бактерий Vibrio cholerae, депонированный в Государственной коллекции патогенных бактерий ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» под номером КМ234, продуцирует холерный токсин II типа. Штамм V.cholerae обладает высокой продукцией холерного токсина II типа, формирующего антитоксический иммунитет при холере.

Штамм бактерий Vibrio cholerae, депонированный в Государственной коллекции патогенных бактерий ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» под номером КМ234 - продуцент холерного токсина II типа.