Способ получения токсинопродуцирующих субкультур холерных вибрионов Советский патент 1989 года по МПК C12N1/20 C12N1/20 C12R1/63 

Изобретение относится к медипин- ской микробиологии и касается способа активизащ|и токсинопродуцйрующих культур холерных вибрионов

Цель изобретения - упрощение способа,;

Способ осуществляется следукицим образом.

Культуру исследуемого штамма холерного вибриона выращивают при 37 С в течение 4-5 ч в жидкой среде, состоящей из 3%-ной пептонной воды, 0,5% хлористого натрия и 0,05-0,2% инозина (рН 7,8-8,0). Для получения изолированных колоний выращенную бульонную культуру высевают на 2%-ную агаровую

среду того же состава и инкубируют 18-20 ч при , Токсигенные свойства холерных вибрионов, составляющих отдельную колонию, определяют известным способом.

Пример 1. Культуру Vibrio cholerae 569В в течение 4 ч выращивают при 37 С в 4 МП среды следукяцего состава, г/100 im: пептон (мясной для бектериологических целей) 3; хлористый натрий 0,5; инозин 0,05; вода дистиплированнгш остальное, рН 8,0.

После окончания вьгращивания бульонную культуру пересевают на плотную (2%-ную агаровую) среду такого же состава с целью получения изолированел ю

sl

ч

ньгх колоний и инкубируют при 37 С 18-20 ч.

Субкзшьтуры, полученные из изолированных колоний, исследуют на способность продуцировать холерный токсин, для чего часть материала каждой из отобранных колоний засевают на 3%- ную пептонную воду с 0,5% NaCl (рН 7,8-8,0), разлитую по 2 мл в 100-мил- лшштровые стерильные флаконы с ват- но-марлевой пробкой. Выращивание проводят при 37°С в течение 20 ч. После окончания срока выращивания культуры обеззараживают мертиолатом (1:5000), центрифугируют при 6000 об/мин 30 мин и надосадочную жидкость исследуют на наличие фактора кожной проницаемости в цельных и разведенных препа- .ратах на модели кролика (внутрикож- ная проба Крейга).

Из 20 субкультур штамма 569В все 20 продущфуют в среду культивирования фактор кожной проницаемости,оказывающий действие на кожу кролика при разведении надосадочной жидкости 1:20 При разведении 1:40 такую активность проявляют 6 субкультур, 1:80 - 13, 1:160-1.

Пример 2. Проводят аналогично примеру 1, но в состав среды вводят О,1% .инозина. Используют 2 штамма - V.cholerae 569В и V.eltor Р5879.

В результате исследования 20 субкультур штамма 569В все культуры продуцируют в среду культивирования фактор кожной проницаемости, оказьшаю- ttptfl действие на кожу кролика при разведении надосадочной жидкости 1: :20. При разведении 1:40 такую активность проявляют 8 субкультур, 1:80 - 9, 1:160 - 3.

Из 125 субкультур штамма Р5879 фактор кожной проницаемости обнаружен у 17 при введении цельных и разведенных 1:2 препаратов надосадочной лсидкости. В более высоких разведения при постановке кожной пробы он не проявлялся,

Пример 3. Проводят аналогично примеру 1, В среду вводят 0,2% инозина, В результате среди 20 субкультур штамма 569В все.20 продуцируют фактор кожной проницаемости в титре 1;20, 18 - 1:40, 2 - 1:80 и не продуцируют токсин при разведении надосадочной жидкости бульонных культур 1:160.

Результат влияния пассажей через кишечник кролика-сосунка и среду с инозином на количество вьщеляемых клоновых субкультур штамма V.cholerae 569В Пакистан приведены в таблице .

Исходные 100 20 20

Пассир ованные

через кишечник 50 36 72

среду с

инозином 25 17 68

Таким образом, предлагаемый способ значительно проще способа-прототипа при сохранении его эффективности, так как не требует использования лабораторных животных, создания специальных условий для их вскрытия.

Способ позволяет также в дальнейшем получить количественную характеристику культур по изучаемому приз- нэку. При его использовании можно выделить гиперпродуценты среди субкультур производственных штаммов холерного вибриона, создать коллекцию штаммов холерных и эльтор вибрионов с различной способностью продуцировать холерный токсин, что необходимо для проведе1шя генетических исследований.

Способ дает возможность с помощью изучения токсинпродукции клоновых культур провести анализ популяции в довольно большом объеме (до 100 одномоментно) с сохранением этого генетического материала для дальнейшего получения необходимых характеристик.

Формула изобретения

Способ получения токсинопродуци- рующих субкультур холерных вибрионов путем активации исходной культуры с последующим пересевом на плотную щелочную питательную среду и определения токсинообразующей активности изолированных колоний, о т л и ч а ю - щ и и с я тем, что, с целью упроще51521770А

ния способа, активацию осуществляютние на плотной питательной среде вев жидкой питательной среде в присут- дут в присутствии инозина в той же ствии 0,05-0,2% инозина и выращива-концентрации.

Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к способам получения культур холерных вибрионов, продуцирующих холерный токсин. Цель изобретения - упрощение способа. Культуру исследуемого штамма холерного вибриона выращивают в течение 4-5 ч в жидкой щелочной среде с 0,05-0,2% инозина (PH 7,8-8,0). Для получения изолированных колоний выращенную бульонную культуру высевают на 2%-ную агаровую среду того же состава и инкубируют 18-20 ч при 37°С. Токсигенные свойства холерных вибрионов, составляющих отдельную колонию, определяют известным способом. 1 табл.