ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, ПРЕДНАЗНАЧЕННАЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ОЖОГОВЫХ ПОРАЖЕНИЙ КОЖИ Российский патент 2019 года по МПК A61K38/08 A61K47/32 A61K9/06 A61P17/02 

Изобретение относится к медицине, а именно к разработке и применению нового фармацевтического средства, предназначенного для лечения ожоговых поражений кожи. Применение гидрогеля, содержащего регуляторный пептид Thr-Gly-Glu-Asn-His-Arg-NH₂, является перспективным методом оптимизации течения процессов репаративной регенерации при ожогах кожи.

Актуальность разработки препарата определяется тем, что ожоги являются одной из основных причин инвалидности взрослого и детского населения развитых стран, однако, проблема лечения таких пострадавших остается во многом не решенной [1]. По данным Росстата в 2017 г. в нашей стране зарегистрировано 278,2 тысяч пациентов с диагнозом термический и химический ожог, при этом среди них 68,7 тысяч дети [2].

Современная тактика лечения ожоговых поражений является мультидисциплинарой и проводится с учетом особенностей патогенеза ожоговой болезни и ее осложнений [3]. Благодаря прогрессу медицинской науки внедрены патогенетически обоснованные методы антибактериальной терапии, иммунокоррекции местного лечения ран [4]. Перспективным представляется разработка новых методов лечения поверхностных и глубоких ожоговых поражений биотехнологическими, в том числе клеточными продуктами, биополимерными раневыми покрытиями с живыми клетками - скаффолдами [5, 6].

Один из перспективных путей повышения эффективности лечения ожоговых поражений предусматривает использование ростовых стимуляторов и факторов регенерации, в частности, эпидермального, фибробластического, тромбоцитарных факторов роста: тромбоцитарный фактор роста (PDGFA+B), инсулиноподобные факторы роста (IGFI, II). Однако, в настоящий момент этот подход еще не привел к созданию лечебного средства для эффективной терапии ожоговых поражений.

Новым направлением в области создания эффективных и безопасных лекарственных средств регуляторного, протекторного, нормализующего, противоопухолевого и противовоспалительного действия является создание фармацевтических средств на основе эндогенных регуляторных пептидов, высокоэффективных и обладающих низкой токсичностью. Примером такого регуляторного пептида является пептид общей формулы Thr-Gly-Glu-Asn-His-Arg, обладающий противоопухолевой, протекторной и нормализующей активностью. Регуляторная активность пептида, согласно патенту РФ № 2213747, показана при индуцировании дифференциации и ингибировании пролиферации клеток раковых образований [7]. Патент РФ № 2557003 на амидную форму этого регуляторного пептида Thr-Gly-Glu-Asn-His-Arg-NH₂ предлагает его в качестве нейропротекторного и ноотропного средства, направленного на профилактику и лечение болезни Альцгеймера и ишемического инсульта [8]. Известен также патент на использование регуляторного пептида Thr-Gly-Glu-Asn-His-Arg-NH₂ в качестве анксиолитического средства, направленного на профилактику и лечение тревожных расстройств [9].

Однако возможность использования регуляторного пептида Thr-Gly-Glu-Asn-His-Arg-NH₂ в качестве лекарственного препарата противоожогового действия неизвестно. Техническим результатом, достигаемым при реализации изобретения, является обнаружение у известного регуляторного пептида Thr-Gly-Glu-Asn-His-Arg-NH₂, обладающего противоопухолевой, нейропротекторной, ноотропной и анксиолитической активностью, противоожоговой активности, что определяет возможность его использования в низких дозах в качестве средства, в виде удобной для применения лекарственной формы без нежелательных побочных эффектов с хорошей переносимостью.

Выраженность противоожогового действия этого нового лекарственного препарата, которая происходит на фоне традиционной терапии тяжелых ожоговых повреждений, реализуется в виде ускорения процессов эпителизации ран к 28 суткам на 71,11% (p<0,01) и снижению частоты развития гнойных осложнений на 62,5% (p<0,05). При этом, применение фармацевтической композиции, содержащей регуляторный пептид Thr-Gly-Glu-Asn-His-Arg-NH₂ не приводит к возникновению нежелательных побочных эффектов.

Вышеописанный технический результат достигается тем, что известный регуляторный пептид общей формулы: Thr-Gly-Glu-Asn-His-Arg-NH₂ применяется в качестве средства для терапии ожоговых поражений кожи в виде раствора в гидрогеле на основе Carbopol ETD 2020 [10].

В лекарственном составе противоожоговой фармацевтической композиции, содержащего активное вещество, растворенное в гидрогеле, в качестве активного компонента содержится регуляторный пептид Thr-Gly-Glu-Asn-His-Arg-NH₂, а в качестве редкосшитого акрилового полимера, - Carbopol ETD 2020, и при следующем соотношении компонентов:

Регуляторный пептид Thr-Gly-Glu-Asn-His-Arg-NH₂ - 0,1-100 мг/л

Редкосшитый акриловый полимер, Carbopol ETD 2020, - 4,5 г/л

Вода дистиллированная - остальное

Лекарственной форме присвоено название - Хеалинггель.

Предложенный в качестве фармацевтической композиции для терапии ожогов регуляторный пептид Thr-Gly-Glu-Asn-His-Arg-NH₂, строение которого соответствует фрагменту 41TGENHR46 фактора дифференциации, присутствует в крови и ЦНС млекопитающих [11]. Известно, что регуляторный пептид Thr-Gly-Glu-Asn-His-Arg-NH₂ оказывает протекторное действие на клетки гиппокампа мозга, защищая их от деградации вызванной токсическим действием амилоидного пептида [12]. Ранее, при исследовании механизма фармакологического действия регуляторного пептида было показано что, NMDA-рецепторы являются функциональной мишенью специфического фармакологического эффекта регуляторного пептида Thr-Gly-Glu-Asn-His-Arg-NH₂ [13]. Специфическая нейропрогекторная активность регуляторного пептида также связана со стимуляцией нейростероидогенеза, подавлением экспрессии 5-альфа редуктазы и восстановлением уровней стероидов при патологии практически до нормы [14]. Протекторное и ноотропное действие регуляторного пептида на модели болезни Альцгеймера выражается в практически полном восстановлении памяти в результате его хронического применения [15]. Особенностью действия регуляторного пептида Thr-Gly-Glu-Asn-His-Arg-NH₂ является то, что он оказывает нормализующее действие при патологии, в то время как на контрольных животных не оказывает отрицательного воздействия даже в дозе в сотни раз превышающей терапевтическую [16].

Установлено, что регуляторный пептид Thr-Gly-Glu-Asn-His-Arg полностью сохраняет дифференцирующую активность полноразмерного фактора индуцировать дифференцировку и ингибировать пролиферацию клеток, в том числе HL-60 [17]. Кроме этого, регуляторный пептид обладает способностью взаимодействовать с липидами клеточных мембран, что сказывается на активности цитокинов, задействованных в пролиферации и дифференцировке клеток по гранулоцитарному пути [18]. Было показано, что регуляторный пептид Thr-Gly-Glu-Asn-His-Arg усиливает окислительно-восстановительные процессы в клетках и повышает метаболическую активность макрофагов [19].

Пример 1. Изучение влияния раствора регуляторного пептида Thr-Gly-Glu-Asn-His-Arg-NH₂ в гидрогеле на основе Carbopol ETD 2020, на эффективность местного лечения ожогов кожи.

В эксперименте участвовало 48 самцов крыс линии Wistar-Kyoto массой 230-250 гр. Все манипуляции выполнялись под общим ингаляционным наркозом в асептических условиях. Ожог воспроизводили по собственной оригинальной методике (рационализаторское предложение ВМедА им. С.М. Кирова №14287/1 от 19.01.2016). После подготовки операционного поля животное фиксировали к лабораторному столу. Площадь ожога 16 см² (около 10% от площади тела). На депилированную кожу спины животного помещали датчик электротермопары мультиметра Electroline (Китай), которым определяли температуру кожи и металлической нагревательной пластины. Время экспозиции 10 с при температуре на поверхности кожи 95-97°С.

Фармацевтическую композицию для нанесения на раневую поверхность готовили растворением регуляторного пептида Thr-Gly-Glu-Asn-His-Arg-NH₂ в различных разведениях в гидрогеле на основе Carbopol ETD 2020 (0,45%). Гидрогель, содержащий регуляторный пептид Thr-Gly-Glu-Asn-His-Arg-NH₂, ежедневно наносили на поверхность раны в течение 7 суток. Всем животным спустя 60 минут после ожога выполнялась некрэктомия до собственной фасции, края раны фиксировались к подлежащим тканям узловыми швами.

Животные были разделены на 6 групп по 8 животных в каждой с учетом концентрации пептида Thr-Gly-Glu-Asn-His-Arg-NH₂ в геле. Концентрация составляла: 100 мг/л, 10 мг/л, 1 мг/л, 0,1 мг/л и 0 мг/л в группах №1, №2, №3, №4, №5, соответственно. В группе активного контроля №6 выполнялась только ранняя хирургическая некрэктомия, без последующего лечения.

Оценку эффективности лечения выполняли ежедневно, осуществляли осмотр ран, отмечали характер отделяемого, а также оценку осложнений и летальные исходы. Планиметрическим методом Л.Н. Поповой определяли площадь ожога и вычисляли индекс заживления по следующей формуле:

где S - площадь ожога при предыдущем измерении, мм²; Sn - площадь ожога при данном измерении, мм2, Т - интервал между измерениями, сутки.

Установлено, что выполнение ранней хирургической некрэктомии в зоне глубокого ожога кожи, с последующим нанесением гидрогеля с регуляторным пептидом Thr-Gly-Glu-Asn-His-Arg-NH₂ (HLDF-6), сопровождалось достоверным сокращением площади раны, при этом величина показателей определялась концентрацией регуляторного пептида в гидрогеле (Таблица). В частности, на 28 сутки в группе №6 в которой выполнялась только некрэктомия на площадь раны 90,38% (до 1,54 см²), при этом нагноения ран наблюдались у 5 животных из 8. На это же время в группе №5, в которой рана после некрэктомии обрабатывалась только гидрогелем, обработка привела к уменьшению площади раны на 27% (до 1,13 см²) по сравнению с группой №6 и нагноения ран наблюдались у 2 животных из 8. Наилучшие результаты были получены в группе №4, в которой рана после некрэктомии обрабатывалась гидрогелем, содержащим 0,1 мг/л регуляторного пептида Thr-Gly-Glu-Asn-His-Arg-NH₂. Обработка фармацевтическим средством, содержащим регуляторный пептид привела к уменьшению площади раны на 42% (до 0,90 см²) по сравнению с группой №6 и нагноения ран у животных удалось полностью избежать. Близкие результаты были получены в группе №1, в которой рана после некрэктомии обрабатывалась гидрогелем, содержащим 100 мг/л регуляторного пептида Thr-Gly-Glu-Asn-His-Arg-NH₂. Обработка фармацевтическим средством, содержащим регуляторный пептид в этой концентрации привела к уменьшению площади раны на 41% (до 0,91 см²) по сравнению с группой №6 и нагноения ран наблюдалось у 1 животного из 8.

Пример 2. Изучение влияния раствора регуляторного пептида Thr-Gly-Glu-Asn-His-Arg-NH₂ в гидрогеле на основе Carbopol ETD 2020 при гистологическом исследовании биоптатов ран.

Отбор биоптатов для гистологического исследования осуществляли на 14 и 28 сутки, их фиксировали в 10% растворе формалина с последующей проводкой через спирты восходящей концентрации (30-96%) и заливкой в парафин. Гистологические срезы окрашивали гематоксиллином и эозином, исследовали методами световой микроскопии.

При гистологическом исследовании биоптатов ран установлено, что на 14 сутки наблюдения морфологическая картина в зоне ожога имела ряд особенностей с учетом выбора метода лечения. Послеоперационная рана в различных группах животных была различной площади, покрыта массами фибрина, густо инфильтрированного нейтрофильными лейкоцитами (Фиг. 1).

Дно раневого дефекта представлено грануляционной тканью, распространяющейся вплоть до мышечной фасции. Макрофаги и нейтрофилы располагаются диффузно, наиболее густо инфильтрированы поверхностные слои. В прилежащих к фасции отделах отмечаются небольшие очаги инфильтрации лимфоцитами. В группе №4 (HLDF-6 0,1 мг/л) смешанно-клеточная инфильтрация незначительно распространялась на окружающие ткани, в то время как в группах №1 (HLDF-6 100 мг/л), №2 (HLDF-6 10 мг/л) и №3 (HLDF-6 1 мг/л) констатированы достаточно крупные очаги субэпидермальной лейкоцитарной инфильтрации. В группе №5 (гидрогель без HLDF-6) нейтрофильные лейкоциты располагаются не только в дерме, но и самом эпидермисе, формируя немногочисленные микроабсцессы. Кроме того, в грануляционной ткани определяются многочисленные, пролиферирующие, полнокровные сосуды капиллярного типа. Количество микрососудов в грануляционной ткани в группах существенно различалось (Фиг. 2).

На 28 сутки дно дефекта было представлено грубоволокнистой соединительной тканью с большим количеством крупных фибробластов (Фиг. 3). В соединительной ткани сохраняется очаговая инфильтрация лимфоцитами и макрофагами. В группах №1 (HLDF-6 100 мг/л) и №4 (HLDF-6 0,1 мг/л) с незначительным числом нейтрофильных лейкоцитов, в то время как в группах №2 (HLDF-6 10 мг/л) и 3 (HLDF-6 1 мг/л) их количество умеренное. В группе №5 число нейтрофильных лейкоцитов так же умеренное, но в ряде наблюдений выявлены мелкие внутридермальные абсцессы. В группе №5 (гидрогель без HLDF-6) лимфо-гистиоцитарная инфильтрация более выражена, очаги несколько крупнее, сливаются друг с другом. Кроме того, в группе №5 лейкоцитарные инфильтраты распространяются на эпидермис по краям дефекта. Сосуды соединительной ткани представлены капиллярами и мелкими венулами. Эндотелиоциты этих сосудов крупные, пролиферирующие, с округлыми гиперхромными ядрами и скудной эозинофильной цитоплазмой.

В этот же срок в биоптатах отобранных у животных группы №6, перенесших раннюю хирургическую некрэктомию без местного лечения, в отличии от других групп, на дне дефекта располагался слой грануляционной ткани с крупноочаговой инфильтрацией, преимущественно нейтрофильными лейкоцитами (Фиг. 4). Очаги локализовались непосредственно под фибринозным экссудатом, на поверхности дефекта. В отдельных участках отмечается формирование грубоволокнистой соединительной ткани с многочисленными достаточно крупными фибробластами. Сосуды в ткани на дне дефекта полнокровные, представлены множественными капиллярами и немногочисленными, мелкими венулами, с пролиферирующим эндотелием. Эпидермис по краям дефекта с выраженным акантозом, гиперкератозом и мелкоочаговой лейкоцитарной инфильтрацией.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что применение регуляторного пептида Thr-Gly-Glu-Asn-His-Arg-NH₂, растворенного в гидрогеле на основе Carbopol ETD 2020, может являться перспективным методом оптимизации течения процессов репаративной регенерации при ожогах кожи. Недельное применение регуляторного пептида, растворенного в гидрогеле в концентрации 0,1 мг/л для терапии ожоговых повреждений, возникших при термическом ожоге кожи III степени, позволило к 28 дню достичь сокращения исходной площади ран на 94,38%. Обработка этим фармацевтическим средством, привела к уменьшению площади раны на 42% (до 0,90 см²), по сравнению с группой, в которой после ранней некрэктомии такой обработки не делали. Важным преимуществом этой фармацевтической композиции для лечения ожоговых повреждений кожи является то, что его применение позволяет полностью избежать нагноения ран, которое возникает у большинства животных после ранней некрэктомии ожоговых повреждений. При гистологическом исследовании биоптатов ран также установлено, что применение регуляторного пептида приводит к существенному улучшению характера ожоговых ран.

Публикации

1. Информационный бюллетень ВОЗ.-2018. (http://www.who.int/ru/news-room/fact-sheets/detail/burns).

2. Оксенойт Г.К. Здравоохранение в России. 2017 / Г.К. Оксенойт, С.Ю. Никитина [и др.] // Здравоохранение в России. 2017: Стат.сб. / Росстат. - М., 2017. - С. 49.

3. Алексеев А.А. Современные технологии местного консервативного лечения пострадавших от ожогов / А.А. Алексеев, А.Э. Бобровников // Анналы хирургии - 2002. - №2. - С. 32-38.

4. Алексеев, А.А. Современные методы лечения ожогов и ожоговой болезни / А.А. Алексеев // Мир без ожогов. - 1999. - №1.

5. Зиновьев Е.В. Экспериментальная оценка эффективности применения адипогенных мезенхимальных стволовых клеток для лечения ожогов кожи III степени / Е.В. Зиновьев, В.Н. Цыган, М.С. Асадулаев, В.Е. Юдин, Р.Г. Стояновский, Н.В. Смирнова, А.С. Шабунин, С.А. Лукьянов, Т.А. Шалоня, Д.В. Костяков. Вестник российской военно-медицинской академии - 2017. - №1. - С. 137-141.

6. Алексеев А.А. Комплексное лечение глубоких ожогов на основе применения хирургической некрэктомии и современных биотехнологических методов / А.А. Алексеев, К.З. Салахиддинов, Б.К. Гаврилюк, Ю.И. Тюрников // Анналы хирургии - 2012. - №6 - С. 41-45.

7. Патент Российской Федерации «Пептид, обладающий противоопухолевой, протекторной и нормализующей активностью, и фармацевтическая композиция», №2213747, 10.10.2003 г.

8. Патент Российской Федерации «Пептид, обладающий нейропротекторной и ноотропной активностью, и фармацевтическая композиция на его основе», №2557003, 22 июня 2015 г.

9. Патент Российской Федерации «Анксиолитическое средство и фармацевтическая композиция анксиолитического действия», №2580311, 14 марта 2016.

10. Technical Data Sheet. TDS - 187. Labrizol Advanced Materials Inc. 2007.

11. Sewell R.D., Gruden M.A., Pache D.M., Storozheva Z.I., Kostanyan I.A., Proshin A.T., Yurashev V.V., Sherstnev V.V. Does the human leukaemia differentiation factor fragment HLDF6 improve memory via brain DNA and protein synthesis? // J. Psychopharmacol. 2005. V. 19. №6. P. 602-608.

12. Костанян И.А., Жохов С.С., Сторожева З.И., Прошин А.Т., Сурина Е.А., Бабиченко И.И., Шерстнев В.В., Липкин В.М. Нейропротекторное действие гексапептида HLDF-6 на нейроны гиппокампа крыс на модели болезни Альцгеймера in vitro и in vivo. // Биоорган. химия. 2006. Т. 32. №4. С. 399-407.

13. Yu.A. Zolotarev, G.I. Kovalev, N.V. Kost, M.E. Voevodina, O.Y. Sokolov, A.K. Dadayan, E.A. Kondrakhin, E.V. Vasileva, A.P. Bogachuk, V.N. Azev, V.M. Lipkin and N.F. Myasoedov Anxiolytic activity of the neuroprotective peptide HLDF-6 and its effects on brain neurotransmitter systems in BALB/c and C57BL/6 mice J. Psychopharmacol., 2016, 30 (9), 922-935.

14. Rzhevsky DI, Zhokhov SS, Babichenko II, et al. (2005) HLDF-6 peptide affects behavioural reactions and organism functions dependent on androgen hormones in normal and castrated male mice. Regul Peptides 127: 111-121.

15. Bogachouk A.P., Storozheva Z.I., Solovjeva O.A., Sherstnev V.V., Zolotarev Yu.A., Azev V.N., Rodionov I.L., Surina E.A. and Lipkin V.M. Comparative study of the neuroprotective and nootropic activities of the carboxylate and amide forms of the HLDF-6 peptide in animal models of Alzheimer's disease. J. Psychopharmacol., 2016, 30 (1), 78-92.

16. Липкин B.M., Золотарев Ю.А., Азев B.H., Ржевский Д.И., Телегин Г.Б., Сторожева З.И., Ковалев Г.И., Мурашев А.Н., Богачук А.П. Разработка нового нейропротектора на основе пептида HLDF-6. «Информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии»: Материалы Международной конференции IT + M&Ec` 2016 (Гурзуф, с 02 по 12 июня 2016 г.). 2016. С. 89-99.

17. Костанян И.А. Биологически активный фрагмент фактора дифференцировки клеток линии HL-60. Идентификация и свойства / И.А. Костанян, М.В. Астапова, Е.В. Новолотская, Т.Н. Лепихова, С.М. Драницына, Г.В. Телегин, И.Л. Родионов, Л.К. Байдакова, Ю.А. Золотарев, И.М. Молотковская, В.М. Липкин // Биоорган, хим. - 2000. - Т. 26. - №7. - С. 505-511.

18. Сысоева Г.М. Влияние пептида HLDF-6 на пролиферативную активность спленоцитов в культуре клеток на фоне введения агонистов опиатных рецепторов / Г.М. Сысоева, Е.Д. Даниленко, В.И. Масычева, В.В. Самуков, И.А. Костанян // Сибирский медицинский журнал (Томск) - 2009. - №4 - С. 55-59.

19. Даниленко Е.Д. Модуляция пептидом HLDF-6 функциональной активности макрофагов на фоне введения агонистов опиатных рецепторов / Е.Д. Даниленко, В.А. Фадина, В.И. Масычева, В.В. Самуков, И.А. Костанян // Медицинская иммунология - 2005. - №1. - С. 77-84.

Таблица. Результаты планиметрической оценки эффективности ранозаживляющего действия фармацевтического средства, содержащего раствор регуляторного пептида Thr-Gly-Glu-Asn-His-Arg-NH₂ (HLDF-6) в гидрогеле на основе Carbopol ETD 2020 после проведения некрэктомии.

Группы сравнения Площадь раны в сроки (сутки), см² 7 14 21 28 1 HLDF-6 100 мг/л 8,78±1,34 *, ** 3,78±1,49 *, ** 1,80±0,82 *, ** 0,91±1,02 *, ** 2 HLDF-6 10 мг/л 12,20±1,32 *, ** 10,29±1,46 *, ** 7,88±0,83 *, ** 4,09±1,02 *, ** 3 HLDF-6 1 мг/л 11,08±1,30 *, ** 9,13±1,46 *, ** 2,93±0,83 *, ** 1,39±1,03 *, ** 4 HLDF-6 0,1 мг/л 11,68±1,31 *, ** 6,24±1,47 *, ** 0,94±0,81 *, ** 0,90±1,00 *, ** 5 Гидрогель без HLDF-6 9,02±1,31 4,63±1,47 1,42±0,84 1,13±1,01 6 Некрэктомия 12,68±1,79 8,49±2,45 3,00±0,14 1,54±0,18 Примечание: * - достоверно p<0,05 по сравнению с гидрогелем без HLDF-6; ** - достоверно p<0,2 по сравнению с группой, в которой выполнялась ранняя хирургическая некрэктомия

Изобретение относится к медицине, в частности к разработке и применению нового фармацевтического средства, предназначенного для оптимизации течения процессов репаративной регенерации при ожогах кожи. Предложено применение пептида Thr-Gly-Glu-Asn-His-Arg-NH₂ в качестве регуляторного, протекторного, нормализующего и противовоспалительного средства для лечения ожоговых поражений кожи. Предложен новый состав противоожогового средства, содержащий активное вещество в виде указанного регуляторного пептида 0,1-100 мг/л, гидрогель на основе Carbopol ETD 2020 4,5 г/л, и вода дистиллированная - остальное. Состав высокоэффективен в низких дозах пептида Thr-Gly-Glu-Asn-His-Arg-NH₂, удобен и прост в применении. 2 н.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл., 2 пр.

1. Применение регуляторного пептида Thr-Gly-Glu-Asn-His-Arg-NH₂ в качестве средства для лечения ожоговых повреждений кожи.

2. Фармацевтическая композиция для лечения ожоговых повреждений кожи, содержащая активное вещество, гидрогель и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что в качестве активного вещества содержит регуляторный пептид формулы Thr-Gly-Glu-Asn-His-Arg-NH₂, а в качестве носителя - гидрогель на основе Carbopol ETD 2020 при следующих соотношениях компонентов:

Регуляторный пептид Thr-Gly-Glu-Asn-His-Arg-NH₂ 0,1-100 мг/л Гидрогель на основе Carbopol ETD 2020 4,5 г/л Вода дистиллированная Остальное