СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ СУСТAВОВ Российский патент 2019 года по МПК A61K31/196 A61K31/7048 A61K31/7056 A61K47/24 A61K9/06 A61P19/02 A61P29/00 

Изобретение относится к области медицины, в частности, к лекарственным средствам и может быть использовано при изготовлении геля с антиревматическим действием для местного лечения суставов.

Формула изобретения: Средство для местного лечения артритов, содержащее диклофенак натрия, отличающееся наличием основы в виде кремнийорганического глицерогидрогеля состава Si(C₃H₇O₃)₄ · 6C₃H₈O₃ · 24H₂O, представляющего собой прозрачный или полупрозрачный бесцветный гель, без запаха, устойчивый при хранении, а так же линкомицина и нистатина при следующем соотношении компонентов, масс. %: диклофенак натрия – 0,8÷1,5; линкомицин – 1,5÷2,5; нистатин – 1,5÷2,5; кремнийорганический глицерогидрогель – остальное до 100.

Артриты – воспалительные заболевания суставов различной этиологии, являются ведущим клиническим симптомом целого ряда ревматических заболеваний (ревматоидный артрит, анкилозирующий спондилит, серонегативные спондилоартриты, включающие реактивный артрит, инфекционные артриты и т.д.), а также частым симптомом, сопровождающим соматическую патологию. Высокая распространённость артритов среди детского и взрослого населения, недостаточная эффективность лечения, склонность к хронизации и инвалидизации свидетельствуют об актуальности данной проблемы.

Особое беспокойство у больных артритом вызывает болевой синдром, являющийся одним из основных клинических проявлений артрита. Суставные боли приводят к ограничению двигательной активности больных, инвалидизации, ухудшению качества жизни [Багирова Г.Г. Избранные лекции по ревматологии, М., Медицина, 2008, 253 с.].

Снятие боли и воспалительного процесса в суставах традиционно обеспечивается назначением системных гормональных средств (кортикостероидов), противовоспалительных нестероидных препаратов (НПВП), однако известно большое количество серьёзных побочных эффектов при их системном использовании. В этой связи высока популярность местного лечения артрита с помощью мазей, гелей и кремов, содержащих вышеуказанные лекарственные средства и другие ингредиенты.

Известно большое количество симптоматических средств для купирования болевого синдрома при артритах. В настоящее время в действующей фармацевтической классификации (предложенной ВОЗ и принятой в России) представлены 4 подгруппы средств наружного применения при заболеваниях опорно-двигательного аппарата:

• Средства на основе НПВП: диклофенака, кетопрофена и др. Примеры таких мазей: Найз, Кетонал, Индометоциновая, Финалгель и другие.

• Препараты перца на основе капсаицина (вещества, содержащегося в перце и отвечающего за «жгучий» эффект) и его производных: Капсин, Никофлекс, бальзам «Золотая звезда» (она же «Звездочка»), Эспол, Капсикам, Финалгон и др.

• Препараты на основе салициловой кислоты и ее производных: Бом-Бенге, Бен-Гей, Випросал, Эфкамон, Нижвисал и др.

• Другие средства, к которым отнесен такой известный препарат как Димексид, а также ряд комбинированных и гомеопатических средств, хондропротекторы.

При артрите для уменьшения воспалительной реакции, болевого синдрома, отечности на протяжении длительного периода широко применяются производные пиразолона (бутадион) и индолуксусной кислоты (индометацин), обладающие анальгетическим, противовоспалительным, антикоагулянтным действием, как перорально, так и местно виде мази [Насонова В.А., Астапенко М.Г. Клиническая ревматология, М., 1989, 420 с.].

Однако, среди побочных эффектов этих препаратов следует отметить зудящие кожные сыпи, задержку жидкости, цитопении. Основными противопоказаниями к их использованию являются нарушения функции печени и почек, недостаточность кровообращения и цитопении.

Наиболее часто в последние годы для лечения местного воспалительного процесса при ревматоидных артритах применяют диметилсульфоксид (ДМСО). Основанием для его применения является анальгетическое, противовоспалительное, умеренно асептическое и фибринолитическое действие [Шаламберидзе К.Ш. Диметилсульфоксид в комплексной терапии ювенильного ревматоидного артрита, Труды Львовского медицинского института, 1991, т. 13, с. 92–93]. В фармакотерапии артритов используют аппликации 50% водного раствора ДМСО как в чистом виде, так и в сочетании с другими лекарствами (гепарином, анальгином, салициловым натрием, гидрокортизоном, никотиновой кислотой), а также в виде 40% ДМСО-индометацинового геля, 40% ДМСО-бутадионового геля, 30% ДМСО-вольтаренового геля. Применение ДМСО в терапии артритов является симптоматическим и, по-видимому, не оказывает воздействия на патогенез артрита.

Наиболее существенными недостатками применения ДМСО являются невысокая эффективность, а также наличие побочного действия в виде зудящего дерматита, непереносимости запаха, бронхоспазма. ДМСО противопоказан при нарушении функции печени, катаракте, беременности.

В 2006 году предложено средство наружного лечения артритов, которое может быть использовано при лечении различных воспалительных суставных синдромов. Предложенное средство содержит противовоспалительные препараты из группы нестероидных противовоспалительных средств и глюкокортикостероиды, роль носителя выполняют заряженные фосфолипидные везикулы [Табенова А.А., Саменов Н.А., Сейсенбаев А.Ш., Гильманов М.К. Средство для наружного лечения артритов, Патент № 17186 (Казахстан), 2006].

Однако, используемые в качестве действующего вещества глюкокортикоиды, являются симптоматическими препаратами, но не являются патогенетическими средствами терапии артрита, с одной стороны; с другой – обладают рядом множественных негативных побочных эффектов (стероидные угри, пурпура, телеангиэктазии, жжение и зуд кожи, раздражение и сухость кожи). При длительном применении и/или при нанесении на большие поверхности возможно развитие гиперкортицизма вследствие резорбтивного действия.

Наиболее близким по техническому решению прототипом являются гели, содержащие НПВС и, в первую очередь, диклофенак натрия, который наиболее широко используется в настоящее время в практической ревматологии для лечения заболеваний суставов.

Однако, мази и гели на основе диклофенака натрия обладают недостаточно выраженным противовоспалительным эффектом из-за низкой транскутанной способности, что не обеспечивает в полной мере терапевтический эффект препарата [Патент РФ № 2255939, С 07 F 7/ 04. Глицераты кремния, обладающие транскутанной проводимостью медикаментозных средств, и глицерогидрогели на их основе / Т.Г. Хонина, Л.П. Ларионов, Г.Л. Русинов, А.Л. Суворов, О.Н. Чупахин. Опубл. 10.07.2005].

Учитывая, что содержащие диклофенак натрия средства не являются высокоэффективными и применение их ограничено во времени (2-3 недели) в связи с выраженными побочными эффектами, актуален поиск новых эффективных и безопасных способов лечения артритов.

Таким образом, перед авторами стояла задача разработать лекарственное средство для лечения заболеваний суставов в виде геля, обладающего не только симптоматическим (болеутоляющим) эффектом, но и патогенетическим противовоспалительным (антиревматическим) действием, т.е. способного уменьшать размеры и деформации суставов, вовлеченных в воспалительный процесс, нормализовать их функциональную способность.

Для решения указанной задачи авторы провели аналитический обзор научно-исследовательской литературы, посвященной вопросам этиопатогенеза, роли микробного фактора и иммунных нарушений в развитии различных вариантов артрита.

В последние годы активно изучается этиология и патогенез реактивных, инфекционных, деструктивных артритов, в том числе, ревматоидного артрита. Установлена роль инфекционного фактора в развитии большей части артритов. В 2010 году Sekirov I. et al. провели экспериментальные исследования, демонстрирующие участие кишечного микробиома в развитии патологии опорно-двигательного аппарата (ОДА) воспалительного генеза [Sekirov I., Russell S.L., Antunes L.C.M., Finlay B.B. Gut microbiota in Health and Disease. Physiol. Rev. 90: 859–904, 2010].

На важную роль кишечного микробиома в развитии воспалительных ревматических заболеваний указывают данные Yeoh N. et al. (2013), из которых следует, что состояние эубиоза кишечника поддерживает полноценное морфо-функциональное состояние суставов. Напротив, состояние кишечного дисбиоза является центральным патогенетическим звеном, ведущим к формированию артрита [Yeoh N., Burton J.P., Suppiah P., Reid G., Stebbings S. The role of the Microbiome in Rheumatic Diseases. Curr. Rheumatol. Rep. (2013),15: 314].

Проведенные исследования показали, что ведущим инициирующим фактором в развитии артритов является, наряду с видовой принадлежностью условно-патогенных микроорганизмов, их гиперколонизация в микробиоме, обеспечивающая поддержание воспалительного процесса. Работы Бухарина О.В. с соавторами свидетельствуют о связи дисбиоза кишечника с гиперколонизацией грибов рода Candida и патологией опорно-двигательного аппарата у детей, имеющих симптомы дисплазии соединительной ткани [Бухарин О.В., Лобакова Е.С., Перунова Н.Б. и др. Симбиоз и его роль в инфекции. Екатеринбург: УрО РАН, 2011, 301 с.; Бухарин О.В., Перунова Н.Б. Микросимбиоценоз. Екатеринбург: УрО РАН, 2014, 260 с.].

Микробиоценоз кишечника человека представляет собой значительный антигенный резервуар, непосредственно контактирующий с иммунной системой человека на всех эпителиальных структурах и играет важную роль в поддержании гомеостаза (здоровья человека) [Ley R., Lozupone C.A., Hamady M. et al. Worlds within worlds: evolution of the vertebrate gut microbiota. Nat. Rev. Microbiol. 2008; 6: 776–788.]. Неоспорим факт участия иммунной системы человека в формировании артрита. Доказано, что дисбиоз кишечника ведёт к дисбалансу Th17/Treg, инвазии фибробластов синовиальной оболочки сустава Th17, способствуя развитию артрита [Sanchez B., Hevia A., Gonzalez S., Margolles A. Interaction of intestinal microorganisms with the human host in the framework of autoimmune diseases. doi: 10.3389/fimmu.2015.00594]. Связующим звеном взаимодействия между бактериальными антигенами и иммунными являются TLR-рецепторы, антимикробные пептиды, цитокины. Установлено, что каждый вид микроорганизмов кишечной микробиоты оказывает специфическое воздействие на иммунную систему хозяина, баланс про- и противовоспалительных цитокинов, антимикробных факторов локальной защиты кишечного биотопа [Asquith M., Elewaut D., Lin P., Rosenbaum J.T. The role of gut and microbes in the pathogenesis of spondyloarthritis. Best Pract Res Clin Rheumatol. 2014; 28(5): 687–702. doi:10.1016/J.berh.2014.10.018].

Таким образом, современная гипотетическая модель артрита предполагает непосредственное участие микроорганизмов кишечной микробиоты, как одного из центральных патогенетических звеньев, в формировании артрита, наряду с иммунными и наследственными факторами. Исходя из представленных данных о роли микробного фактора, прежде всего, бактерий и грибов рода Candida, в совокупности с иммунными нарушениями, авторами решена поставленная задача создания эффективного средства для лечения заболеваний суставов. В предлагаемом составе геля включены: нестероидный противовоспалительный препарат – диклофенак натрия, антигрибковый компонент – нистатин, антибактериальный компонент – линкомицина гидрохлорид, а в качестве основы, обеспечивающей необходимый транскутанный эффект (проникновение во внутрисуставные ткани) содержит кремнийорганический глицерогидрогель «Силативит».

Диклофенак натрия – производное фенилуксусной кислоты, НПВП. Диклофенак натрия обладает противовоспалительным, обезболивающим, антиагрегантным и жаропонижающим действием. Не избирательно угнетая циклооксигеназу 1 и 2 (ЦОГ1 и ЦОГ2), нарушает метаболизм арахидоновой кислоты, уменьшает количество простагландинов в очаге воспаления. Наиболее эффективен при болях воспалительного характера. При ревматических заболеваниях противовоспалительное и анальгезирующее действие диклофенака способствует значительному уменьшению выраженности боли, утренней скованности, припухлости суставов, что улучшает их функциональное состояние. При травмах, в послеоперационном периоде диклофенак натрия уменьшает болевые ощущения и воспалительный отек. Показания к применению: симптоматическое лечение заболеваний опорно-двигательного аппарата (ревматоидный артрит, псориатический артрит, ювенильный хронический артрит, анкилозирующий спондилит (болезнь Бехтерева); подагрический артрит, ревматическое поражение мягких тканей, остеоартроз периферических суставов и позвоночника, в том числе с радикулярным синдромом, тендовагинит, бурсит). Препарат снимает или уменьшает боль и воспаление в период лечения, при этом не влияет на прогрессирование заболевания.

Нистатин – полиеновый антибиотик, продуцируемый актиномицетом Streptomyces noursei. Светло-желтый порошок со специфическим запахом. Горький на вкус. Практически не растворим в воде, очень мало – в спирте. Гигроскопичен. Разлагается под действием света, высокой температуры, кислорода воздуха. Легко разрушается в кислой и щелочной среде и под действием окислителей. Фармакологическое действие – противогрибковое, фунгистатическое. Имеет в структуре большое количество двойных связей, обусловливающих высокую тропность препарата к стеролам клеточной мембраны грибов. Вследствие этого молекула встраивается в мембрану клетки с образованием множества каналов, способствующих неконтролируемому транспорту воды, электролитов и неэлектролитов. Клетка теряет устойчивость к воздействию внешних осмотических сил, что приводит к лизису. Оказывает in vitro фунгистатическое и фунгицидное действие в отношении дрожжей и дрожжеподобных грибов, особенно Candida spp. (в т.ч. Candida albicans), а также Aspergillus spp. При местном применении действует преимущественно на Candida spp. Толерантность к нистатину чувствительных грибов развивается очень медленно. Используется для лечения и профилактики развития системного кандидоза, а также кандидоза слизистых и кожи.

Линкомицина гидрохлорид – антибиотик из группы линкозаминов. В терапевтических дозах действует бактериостатически. При более высоких концентрациях оказывает бактерицидное действие. Подавляет синтез белка в микробной клетке. Активен преимущественно в отношении грамположительных бактерий: аэробных – Staphylococcus spp. (в т.ч. продуцирующих пенициллиназу); Streptococcus spp., в т.ч. Streptococcus pneumoniae (за исключением Enterococcus faecalis), Corynebacterium diphtheriae; анаэробных спорообразующих бактерий Clostridium spp. Линкомицина гидрохлорид активен также в отношении грамотрицательных анаэробных бактерий: Bacteroides spp., Mycoplasma spp. Устойчивость вырабатывается медленно. После парентерального введения препарат быстро распределяется в тканях и жидкостях организма, высокие концентрации достигаются в костной ткани. Применяют линкомицина гидрохлорид при лечении септических состояний, вызванных стафилококками и стрептококками, при острых и хронических остеомиелитах, пневмониях, гнойных инфекциях кожи и мягких тканей, рожистом воспалении, отитах и других инфекциях, вызванных чувствительными к этому антибиотику микроорганизмами, особенно при инфекциях, вызванных микроорганизмами, устойчивыми к пенициллинам и другим антибиотикам, а также при аллергии к пенициллинам. Вследствие того, что линкомицина гидрохлорид накапливается в костной ткани, он является одним из наиболее эффективных препаратов при лечении острых и хронических остеомиелитов и других инфекционных поражений костей, а также суставов.

Кремнийорганический глицерогидрогель («Силативит») – вещество с химической формулой Si(C₃H₇O₃)₄ · 6С₃Н₈О₃ · 24Н₂О (Патент РФ № 2255939, МКИ C07F 7/04, 2005 г., патентообладатель – Институт органического синтеза им. И.Я. Постовского Уральского отделения РАН, г. Екатеринбург), представляющее собой гелеобразную полупрозрачную бесцветную массу, без запаха. Обладает противовоспалительной, противоотечной и антиоксидантной активностью, высокой транскутанной проводимостью различных лекарственных веществ, способностью предохранять ткани от высыхания и отеков, повышать их оксигенацию, структурной совместимостью с липидной составляющей клеточных мембран. При этом не оказывает какого-либо побочного отрицательного действия, стабильный, удобный при хранении и хорошо смывается, хорошо растворяется в 95% спирте и воде и легко передает тканям включенные в него лекарственные вещества.

Кроме того, кремний относится к биогенным микроэлементам, которые необходимы для обеспечения нормальной жизнедеятельности человеческого организма. Особенно велико содержания кремния в соединительной и эпителиальной тканях, поскольку кремний входит в состав гликозаминогликанов и их белковых комплексов – структурообразующих компонентов суставных тканей. Следовательно, при использовании глицеролатов кремния в качестве одной из составляющих предлагаемого средства будет осуществляться дополнительное положительное воздействие на организм – восполнение дефицита кремния.

Предлагаемое средство для лечения заболеваний суставов готовят следующим образом. Берут кремнийорганический глицерогидрогель состава Si(C₃H₇O₃)₄ · 6C₃H₈O₃ · 24H₂O, представляющий собой прозрачный или полупрозрачный бесцветный гель, без запаха, устойчивый при хранении. Добавляют порошки диклофенака натрия, линкомицина и нистатина при следующем соотношении компонентов, масс. %: диклофенак натрия – 0,8÷1,5; линкомицин – 1,5÷2,5; нистатин – 1,5÷2,5; кремнийорганический глицерогидрогель – остальное до 100. Смесь тщательно перемешивают при комнатной температуре в течение 10-15 мин в смесителе роторного типа. Получают готовую к употреблению мазь для местного применения светло-желтого цвета.

Предлагаемое техническое решение иллюстрируется следующими примерами его получения.

Пример 1. Берут 96,2 г (96,2 масс.%) кремнийорганического глицерогидрогеля состава Si(C₃H₇O₃)₄ · 6C₃H₈O₃ · 24H₂O, добавляют 0,8 г (0,8 масс.%) диклофенака, 1,5 г (1,5 масс.%) линкомицина и 1,5 г (1,5 масс.%) нистатина. Компоненты смеси тщательно перемешивают при комнатной температуре в течение 10-15 мин в смесителе роторного типа. Получают готовую к употреблению мазь для местного применения светло-желтого цвета.

Пример 2. Берут 95,0 г (95,0 масс.%) кремнийорганического глицерогидрогеля состава Si(C₃H₇O₃)₄ · 6C₃H₈O₃ · 24H₂O, добавляют 1,0 г (1,0 масс.%) диклофенака, 2,0 г (2,0 масс.%) линкомицина и 2,0 г (2,0 масс.%) нистатина. Компоненты смеси тщательно перемешивают при комнатной температуре в течение 10-15 мин в смесителе роторного типа. Получают готовую к употреблению мазь для местного применения светло-желтого цвета.

Пример 3. Берут 93,5 г (93,5 масс.%) кремнийорганического глицерогидрогеля состава Si(C₃H₇O₃)₄ · 6C₃H₈O₃ · 24H₂O, добавляют 1,5 г (1,5 масс.%) диклофенака, 2,5 г (2,5 масс.%) линкомицина и 2,5 г (2,5 масс.%) нистатина. Компоненты смеси тщательно перемешивают при комнатной температуре в течение 10-15 мин в смесителе роторного типа. Получают готовую к употреблению мазь для местного применения светло-желтого цвета.

Средству для лечения заболеваний суставов присвоено условное название «Линисдик-гидрогель».

Токсикологические исследования заявляемого средства.

Исследования предлагаемого средства «Линисдик-гидрогель» проводили на кафедре фармакологии и клинической фармакологии ГБОУ ВПО «Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России (г. Екатеринбург) согласно Руководству по проведению доклинических исследований лекарственных средств (под ред. А.Н. Миронова, ч. 1, М.: Гриф и К, 2012 г, 944 с.) с соблюдением требований Европейской конвенции по защите лабораторных животных.

Исследование острой токсичности проводили на белых беспородных мышах массой 19-29 г обоего пола и на белых крысах популяции Wistar массой 180-250 г обоего пола. Было сформировано 4 группы экспериментальных животных по 20 особей в каждой группе: две группы мышей и две группы крыс. Исследуемый гель вводили в желудок через зонд и внутрибрюшинно однократно в виде 50%-й водной суспензии, дозирование осуществляли индивидуально в зависимости от массы животных в расчете 0,5 мл/10 г особи (мыши) и 2,5 мл/100 г особи (крысы). Наблюдения за животными осуществляли в первые сутки после введения через каждый час, а в последующие 13 суток – один раз в сутки. В течение всего срока наблюдения никаких признаков интоксикации у животных опытных групп не было выявлено; так при внутрижелудочном, так и при внутрибрюшинном введении «Линисдик-гидрогеля» экспериментальные животные оставались живыми, LD₅₀ определить не удалось.

Изучение местного раздражающего действия «Линисдик-гидрогеля» на кожу и слизистые проводили на 9-и кроликах породы Шиншилла массой 2,9-3,6 кг обоего пола. Сначала для исследования раздражающего действия на слизистые за веко одного глаза кролика вносили одну каплю 10%-й суспензии исследуемого средства, при этом за веко другого глаза (контроль) для сравнения вносили одну каплю воды для инъекций. Наблюдение за состоянием слизистой осуществляли в первый день через 5, 10, 20, 30, 60, 90 и 120 минут после закапывания, в последующие 30 дней – один раз в сутки. За весь срок наблюдения раздражающего эффекта на склерах обоих глаз зафиксировано не было, что свидетельствует об отсутствии местного отрицательного воздействия «Линисдик-гидрогеля».

На следующем этапе для изучения местного раздражающего действия на выбритый участок кожи (4×4 см) одного бока кролика наносили 50%-ю суспензию «Линисдик-гидрогеля» в объёме 1 мл, при этом на аналогичный участок кожи другого бока этого же кролика (контроль) для сравнения наносили 1 мл воды для инъекций. Аппликации проводили ежедневно в течение 28 дней. За указанный период эксперимента ни в одном случае не наблюдали возникновения эритемы и отёка, что свидетельствует об отсутствии местного раздражающего эффекта у изучаемой суспензии.

Далее исследовали сенсибилизирующее действие 50%-й суспензии «Линисдик-гидрогеля». Для этого на выбритый участок правого бока кролика (4×4 см) ежедневно в течение 3-х дней наносили 1 мл 50%-й суспензии исследуемого средства, после чего эту же суспензию наносили на левый бок – с целью выявления аллергии. Поскольку аллергической реакции не было обнаружено, эксперимент продолжили до 7-, 14-, 21- и 28-и суток; на заключительные сутки эксперимента никаких видимых изменений на коже кролика отмечено не было.

На основании данного эксперимента можно сделать заключение, что предлагаемое средство для лечения заболеваний суставов «Линисдик-гидрогель» не оказывает местного раздражающего действия на слизистые глаз, кожные покровы и не вызывает аллергических реакций.

Таким образом, полученные результаты позволяют отнести «Линисдик-гидрогель» согласно ГОСТ 12.1.007-76 к практически нетоксичным лекарственным веществам (IV класс опасности).

Экспериментальная оценка in vivo эффективности

«Линисдик-гидрогеля»

Для оценки эффективности антиревматического действия предлагаемого средства были проведены экспериментальные исследования in vivo путем воспроизведения моделей классического адъювантного и бактериально-грибкового артритов.

Адъювантный артрит был смоделирован у 19 особей крыс линии Wistar массой 300-400 г.

Для эксперимента крысы были разделены на 5 групп:

1-я группа (контрольная, n = 2) – у животных был сформирован артрит, но лечение не проводилось;

2-я группа (n = 5) – крысы с артритом, пролеченные «Силативитом»;

3-я группа (n = 5) – крысы с артритом, пролеченные «Линисдик-гидрогелем»;

4-я группа (n = 2) – интактные здоровые животные без артирита и лечения;

5-я группа (n = 5) – крысы с артритом, пролеченные НПВС «Вольтарен-эмульгелем».

Животным 1-й, 2-й, 3-й и 5-й групп был смоделирован адъювантный артрит путем введения субплантарно в правую заднюю лапу 0,1 мл полного адъюванта Фрейнда (ПАФ) (Sigma, Германия). Адъювантный артрит (АА), характеризующийся комплексом воспалительных изменений, локализующихся в суставах, окружающих тканях, в коже и в лимфоидной ткани, с преобладанием пролиферативного компонента, является признанной экспериментальной моделью для изучения эффективности средств, применяемых для лечения ревматоидного артрита [Water-soluble fullerene (C60) inhibits the development of arthritis in the rat model of arthritis. Yudoh K. et al. Int. J. Nanomedicine. 2009; № 4: 217-225].

Длительность эксперимента составила 30 дней. Эксперимент проводился согласно «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных» в соответствии с «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985), правилами лабораторной практики в РФ (Приказ МЗ РФ от 19.06.2003 № 267) и законом «О защите животных от жестокого обращения» (гл. V, ст. 10, 4679-ГД от 01.12.1999 г). Проведение исследования одобрено локальным этическим комитетом Оренбургского государственного медицинского университета (протокол № 151 от 19.10.2016 г).

На 14-й день эксперимента после возникновения вторичного воспаления суставов крысам 2-й, 3-й и 5-й групп было начато лечение «Силативитом», «Линисдик-гидрогелем» и «Вольтарен-эмульгелем», соответственно. Животные контрольной группы лечение не получали.

Курс лечения наружными средствами составил 15 дней, средства наносились на предварительно выбритую кожу в области пораженного сустава (в зависимости от площади болезненного участка) 3 раза в сутки в дозе 2-3 мг. Для предотвращения слизывания средства крысам на шейную область были надеты пластиковые воротники, которые ограничивали возможные повороты головы животного (использовалась модель воротника, представленная на сайте http://fancyrat.ru/forum/viewtopic.php?f=47&t=634).

На 30-й день эксперимента для гистологического исследования были взяты отсепарированные голеностопные (скакательные) суставы с максимальным сохранением топографии. Фиксацию проводили 10 %-м раствором формалина, декальцинацию кусочков тканей 10% азотистой кислотой, заливали в целлоидин-парафин для изготовления срезов толщиной 6-8 мкм, окрашивали гемотоксилином Майера и эозином.

Морфологические изменения в суставах экспериментальных животных с развившимся адъювантным артритом в своей совокупности сводились к образованию серозно-фибринозного выпота в полости сустава, выраженному отеку тканевых структур суставной сумки и полнокровию синовиальной оболочки. В последней отмечались отек ворсин, полиморфно-клеточная инфильтрация (рис. 1) с преобладанием лимфоцитов и множественного васкулита.

Существенные дистрофические процессы отмечались в коллагеновом комплексе. Коллагеновые волокна набухшие, гомогенные, с неравномерной пикринофилией. В межклеточном матриксе соединительной ткани синовиальной оболочки нарастали структуры, содержащие металлопротеиназу 9. В ряде случаев отмечен зернистый распад коллагеновых фибрилл. Характерным было поражение кровеносных сосудов (в основном микроциркуляторного русла) не только в суставе, но и в прилежащих структурах кожи – дерме (рис. 2, 3).

Изменения заключались в набухании интимы артериол и венул, локальном фибриноидном набухании и некрозе сосудистой стенки, лимфоидно-гистиоцитарных инфильтратах. Все это свидетельствовало о развитии васкулитов в области суставов экспериментальных животных.

Гистологические исследования позволили установить две основные стадии развития суставных поражений. Первая касается изменений соединительнотканных структур, сосудов и синовиоцитов. Во второй стадии на фоне продолжающегося мукоидного и фибриноидного набухания суставной сумки присоединяются процессы разрастания обильных грануляций с резорбцией хряща (рис. 4).

У экспериментальных животных контрольной группы (не получавших лечение) и получавших лечение «Силативитом» без включения других лекарственных компонентов существенных изменений при гистологическом исследовании не выявлено: сохранялись отек ворсин синовиальной оболочки, пузырчатые хондроциты в области суставного хряща, мукоидное и фибриноидное набухание суставной сумки, разрастание обильных грануляций с резорбцией хрящевой ткани, образование на суставной поверхности грануляционной ткани в виде паннуса.

Сравнительная характеристика эффективности изучаемых антиревматических средств на модели адъювантного артрита («Линисдик-гидрогель» и «Вольтарен-эмульгель») представлена в таблице 1.

При использования в качестве лечебного средства «Линисдик-гидрогеля» получен эффект, гистологически проявляющийся новообразованной хрящевой тканью суставных поверхностей (рис. 5), что свидетельствует о купировании артрита.

Однако большая эффективность данного средства выявлена на ранних этапах воспалительного процесса в суставах (в фазу инфильтрации и отека) и менее выражена в стадии деструктивных изменений хрящевой и костной ткани.

Одновременно следует отметить, что «Линисдик-гидрогель» существенно оказывает иммуносупрессивное действие в отношении морфофункциональных изменений органов иммуногенеза (тимус, селезенка, лимфатические узлы), возникающих в условиях коллаген индуцированного артрита (рис. 6, 7).

В этот же день эксперимента у крыс, которым проводилось лечение артрита «Вольтарен-эмульгелем», при гистологическом исследовании сохранялась зона полиморфно-клеточного инфильтрата на участке кожи в околосуставной области (рис. 3) и множественные кистовидные образования хрящевой ткани (пузырчатые хондроциты).

Наряду с классической моделью адъювантного артрита, нами была воспроизведена модель бактериально-грибкового артрита на лабораторных животных для дополнительного подтверждения эффективности антибактериального и антигрибкового компонентов, входящих в состав предлагаемого средства для местного лечения артрита.

В эксперименте in vivo использовали крыс-взрослых самцов линии Wistar массой 330-370 г.

Так же как и в первом эксперименте, животные были разделены на 4 группы:

1-я группа (контрольная, n = 2) – животные со сформированным артритом, которым лечение не проводилось;

2-я группа (n = 5) – крысы с артритом, которым лечение «Линисдик-гидрогелем» проводилось после развития симптомокомплекса артрита;

3-я группа (n = 5) – крысы с артритом, пролеченные «Линисдик-гидрогелем» с 1-го дня после заражения, до развития артрита;

4-я группа (n = 5) – крысы с артритом, пролеченные НПВС «Вольтарен-эмульгелем», лечение проводилось после развития симптомов артрита.

Длительность эксперимента составляла 15 суток. Исследование было одобрено локальным этическим комитетом Оренбургского государственного медицинского университета, протокол № 151 от 19.10.2016 г., и проводилось согласно правилам и приказам, перечисленным при описании первого эксперимента.

В 1-й день эксперимента животным 1-й, 2-й ,3-й и 4-й групп был смоделирован инфекционный артрит. Перед проведением пункции сустава животным проводили премедикацию путем внутримышечного введения ксилазина в дозе 0,05 мл/кг массы тела (в соответствии с патентом РФ № 2466753 «Способ проведения наркоза у крыс при многоэтапном эксперименте при моделировании эндометриоза»), затем через 10 мин вводили «Zoletil 50» в дозе 0,5мг/кг массы тела крысы. Способ обеспечивает адекватную анестезию при одновременном сокращении времени выхода крысы из наркоза. Подопытным животным в суставную полость скакательного сустава правой задней конечности вводили по 0,125 мл бактериально-грибковой взвеси под контролем рентгеновского аппарата FireCR+ в клинике МИП «Научно-производственный центр» «Инновационная ветеринария» с участием доктора Волкова А.С.

Для получения взвеси использовали музейные штаммы Klebsiella pneumoniae ICIS – 278 в разведении 1×10⁹ КОЕ/мл и Candida albicans из коллекции АТСС 24433 в разведении 1×10⁹ КОЕ/мл.

Культуры K. pneumoniae и C. albicans выращивали на плотной питательной среде Schaedler-агар (BBL, США) при 37°С в течение 24 ч. Далее из выросших агаровых культур готовили бактериальную взвесь с концентрацией микроорганизмов 10⁹ КОЕ/мл (3 McF).

Лечение животных проводилось на предварительно выбритую кожу в области сустава пораженного артритом 3 раза в сутки, в дозе 2-3 мг. Для предотвращения слизывания препарата крысам на шейную область были надеты пластиковые воротники, которые ограничивали возможные повороты головы животного. Зараженных животных наблюдали ежедневно, до 15-го дня окончания эксперимента.

Критериями оценки артрита служили: изменения поведения крыс, воспалительные явления и болезненные проявления в зараженных суставах, определяемые при осмотре, нарушения движения в инфицированных суставах, патоморфологические изменения в суставах. Сравнительный анализ эффективности исследуемых антиревматических препаратов на модели инфекционного артрита представлены в таблице 2.

Крыс умерщвляли на 15-е сутки эксперимента. Сустав обрабатывали спиртом, вскрывали стерильными скальпелем и ножницами. Раскрывали суставную полость и проводили посев с суставной поверхности бактериологической петлей на чашки Петри со средами: Эндо, кровяной агар и Бигги-агар.

Бактериологическое исследование суставной поверхности пораженных суставов выявило у 75-и % крыс культуры Klebsiella pneumoniae, которые по данным ПЦР-анализа идентичны исходному вирулентному штамму Klebsiella pneumoniae, использованному для заражения животных в данном эксперименте. При этом необходимо отметить, что грибы рода Candida, так же используемые в эксперименте при заражении животных, не высевались из пораженных суставов крыс.

Для гистологического исследования были взяты отсепарированные голеностопные (скакательные) суставы с максимальным сохранением топографии. Фиксацию проводили 10 %-м раствором формалина, декальцинацию кусочков тканей 10 %-й азотистой кислотой, заливали в целлоидин-парафин для изготовления срезов толщиной 6-8 мкм, окрашивали гемотоксилином Майера и эозином.

Морфологические изменения в суставах экспериментальных животных при инфекционном артрите были идентичны таковым при адъювантном артрите и проявлялись наличием серозно-фиброзного выпота в полость сустава, выраженным отеком тканевых структур суставной сумки и полнокровием синовиальной оболочки, а также полиморфно-клеточной инфильтрацией с преобладанием лимфоцитов и множественными васкулитами.

Необходимо ответить, что при инфекционной форме артрита наблюдается более выраженная (по сравнению с адьювантной формой) дезорганизация соединительнотканных структур суставной сумки. При инфекционном артрите синовиальная оболочка резко утолщается, отечна, гиперемирована. Ворсины ее подвергнуты гиперплазии, покрыты фибриноидным экссудатом, пропитаны нейтрофильными гранулоцитами, лимфоцитами и макрофагами.

Воспалительные и дистрофические изменения в стенке сосудов приводят к развитию васкулита, пан- и периартрита в синовиальной оболочке.

Разрушение суставных хрящей в данной серии опытов более значительное. Кроме формирования очагов некроза в области суставной поверхности имеет место разрушение эпифизарной костной ткани. При этом формируются «узуры», фиброзные спайки, аномальные очаги хондро- и остеогенеза, что в совокупности создает условия для развития анкилоза.

Отличительной особенностью инфекционного артрита является развитие мелкоочаговых гнойно-некротических процессов в гиподерме и дерме околосуставной области, вплоть до развития микроабсцессов.

При инфекционном артрите гистологическая картина суставов отличалась наличием признаков остеомиелита в костных структурах диафиза (рис. 8)

Описанные выше изменения позволяют сделать вывод о наличии в суставе экспериментальных животных продуктивного и прогрессивно текущего воспаления с образованием на суставной поверхности грануляционной ткани в виде паннуса. Последний разрушает хрящ, что может привести к развитию фиброзного анкилоза (рис. 9).

Следует особенно подчеркнуть, что процессы дезорганизации соединительнотканных структур затрагивают и околосуставные области (кожа). При этом наиболее яркими морфологическими признаками были полиморфно-клеточные инфильтраты, включающие в свой состав фибриноидно-некротические элементы, а также макрофаги, гранулоциты, лимфоциты, плазмоциты, клетки фибробластического дифферона.

В условиях раннего начала (с первого дня заражения животных) лечебных мероприятий следует отметить, что на стадии ранних патологических изменений суставов (стадия воспалительных и деструктивных изменений сосудов и мягких тканей суставов) был достигнут положительный результат по их купированию: отмечается новообразованная хрящевая ткань, выстилающая суставные поверхности.

Нормализовалась структура сосудов микроциркуляции, улучшалась гистологическая организация соединительной ткани суставной сумки, отмечены явления репаративной регенерации синовиоцитов и суставной поверхности за счет пролиферации хондробластов. Ликвидировались процессы воспаления в околосуставных тканях и красном костном мозге диафизов кости (рис. 10).

Таким образом, сравнительный анализ эффективности заявленного препарата для местного лечения артрита («Линисдик-гидрогель») в отличие от ближайшего прототипа ( «Вольтарен-эмульгель») как при адъювантном, так и при бактериально-грибковом артритах показал, что при использовании «Линисдик-гидрогеля» в более ранние сроки отмечается купирование болевого синдрома, а так же вторичных воспалительных изменений суставов (уменьшение отечности и нормализация конфигурации сустава). Важным аспектом являются морфологические различия гистологических изменений: при лечении «Линисдик-гидрогелем» нормализовалась структура сосудов микроциркуляции, улучшалась гистологическая организация соединительной ткани суставной сумки, отмечены явления репаративной регенерации синовиоцитов суставной поверхности за счет пролиферации хондробластов. Ликвидировались процессы воспаления в околосуставных тканях и красном костном мозге диафизов кости. В то же время, у животных, получавших лечение «Вольтарен эмульгелем», сохранялись воспалительные изменения в виде отека тканевых структур суставной сумки и полнокровия синовиальной оболочки с отеком ворсин, полиморфно-клеточной инфильтрацией с преобладанием лимфоцитов, отмечалось набухание интимы артериол и венул, локальное фибриноидное набухание и некроз сосудистой стенки, что свидетельствует о развитии васкулита в области суставов.

Примеры использования средства для лечения

заболеваний суставов в эксперименте in vivo

Пример № 1. Лабораторное животное, получавшее лечение «Линисдик-гидрогелем». В 1-й день эксперимента белой крысе линии Wistar был спровоцирован адъювантный артрит путем введения субплантарно в правую заднюю лапу 0,1 мл полного адъюванта Фрейнда (ПАФ) (Sigma). Начиная с первого дня эксперимента, у крысы определяли выраженность воспалительной реакции путем измерения окружности пораженного сустава с помощью штангенциркуля ежедневно, до 30-го дня эксперимента. Исходный показатель окружности исследуемого сустава составлял 9,4 мм. На третий день крыса стала менее активная, малоподвижная. При движении щадила зараженную лапу, наступала на нее с осторожностью. При проведении пальпации отдергивала лапу, пищала. Отмечалось увеличение окружности правого скакательного сустава задней лапы на 1,8 мм, на 7-й день на 4,4 мм, в сравнении с исходным показателем, что в целом свидетельствует о развитии адъювантного артрита у экспериментального животного. С 7-го до 15-го дня эксперимента окружность сустава оставалась увеличенной в тех же пределах.

С 15-ого дня от начала эксперимента крысе проводилось местное лечение артрита гелем «Линисдик-гидрогель». Гель наносили на предварительно выбритую кожную поверхность воспаленного сустава в дозе 2-3 мг 3 раза в сутки в течение 15-ти дней. Для предотвращения слизывания геля крысе на шейную область надевали пластиковый воротник, который ограничивал повороты головы животного.

На 3-и сутки от начала лечения (17 день эксперимента) у исследуемого животного отмечалось достоверное улучшение: болевой синдром купировался, крыса стала наступать на больную конечность, дальнейшее проведение терапии привело к снижению выраженности вторичного воспаления пораженного сустава, нормализации местной температуры, уменьшению окружности пораженного сустава: на 3-й день от начала лечения окружность сустава уменьшилась до 12,3 мм, к 15-му дню лечения – 9,4 мм, т.е. отмечалось полное купирование клинических признаков воспаления.

На 30-й день эксперимента проведено патологоанатомическое вскрытие животного для морфологического исследования тканей суставов. Проведенный гистологический анализ показал, что на фоне лечения «Линисдик-гидрогелем» получен эффект, гистологически проявляющийся восстановлением структуры синовиальной оболочки сустава, регенерацией хрящевой ткани суставных поверхностей.

Пример 2. Лабораторное животное, получавшее лечение «Вольтарен эмульгелем». В 1-й день эксперимента белой крысе линии Wistar был спровоцирован адъювантный артрит путем введения субплантарно в правую заднюю лапу 0,1 мл полного адъюванта Фрейнда (ПАФ) (Sigma). Начиная с первого дня эксперимента, у крысы определяли выраженность воспалительной реакции путем измерения окружности пораженного сустава с помощью штангенциркуля ежедневно, до 30-го дня эксперимента. Исходный показатель окружности исследуемого сустава составлял 9,1 мм. На третий день крыса стала менее активная, малоподвижная. При движении щадила зараженную лапу, наступала на нее с осторожностью. При проведении пальпации отдергивала лапу, пищала. Отмечалось увеличение окружности правого скакательного сустава задней лапы на 1,2 мм, на 7-й день на 4,9 мм, в сравнении с исходным показателем, что в целом свидетельствует о развитии адьювантного артрита у экспериментального животного. С 7-го до 15-го дня эксперимента окружность сустава оставалась увеличенной в тех же пределах.

С 15-ого дня от начала эксперимента крысе проводилось местное лечение артрита гелем «Вольтарен-эмульгель». Гель наносили на предварительно выбритую кожную поверхность воспаленного сустава в дозе 2-3 мг 3 раза в сутки в течение 15-ти дней. Для предотвращения слизывания геля крысе на шейную область надевали пластиковый воротник, который ограничивал повороты головы животного.

На протяжении первых семи дней лечения у животного сохранялся болевой синдром (крыса щадила пораженный сустав). К 15-му дню лечения боль в пораженном суставе купировалась, однако окружность пораженного сустава оставалась увеличенной. За 15 дней терапии окружность сустава уменьшилась с 14,0 мм до 13,0 мм, т.е. на 1,0 мм.

На 30-й день эксперимента проведено патологоанатомическое вскрытие животного для проведения морфологического исследования тканей. Проведенный гистологический анализ показал, что на фоне лечения «Вольтарен-эмульгелем» сохранялась полиморфно-клеточная инфильтрация кожи и синовиальной оболочки суставных поверхностей, отек ворсин синовиальной оболочки, множественные кистовидные образования хрящевой ткани.

Таким образом, авторами предлагается фармацевтическое средство для лечения заболеваний суставов, выполненное в виде геля, обеспечивающего значительный противовоспалительный и обезболивающий эффекты. Предлагаемое средство в эксперименте позволяет ускорить процесс купирования артрита, способствует нормализации структуры тканей суставов, вовлеченных в воспалительный процесс. Применение заявляемого геля для лечения заболеваний суставов «Линисдик-гидрогель» расширяет арсенал эффективных и безопасных средств, применяемых при лечении артритов.

Изобретение относится к области медицины, в частности к лекарственным средствам, и может быть использовано при изготовлении геля с антиревматическим действием для местного лечения суставов. Средство местного лечения суставов содержит диклофенак натрия, линкомицин, нистатин и в качестве основы кремнийорганический глицерогидрогель состава Si(C₃H₇O₃)₄ · 6C₃H₈O₃ · 24H₂O, в указанных в формуле изобретения количествах. Фармацевтическое средство по изобретению, выполненное в виде геля, обеспечивает противовоспалительный и обезболивающий эффекты, позволяет ускорить процесс купирования артрита, способствует нормализации структуры тканей суставов. 10 ил., 2 табл., 3 пр.

Средство для местного лечения артритов, содержащее диклофенак натрия, отличающееся наличием основы в виде кремнийорганического глицерогидрогеля состава Si(C₃H₇O₃)₄ · 6C₃H₈O₃ · 24H₂O, а также линкомицина и нистатина при следующем соотношении компонентов, масс. %: диклофенак натрия – 0,8÷1,5; линкомицин – 1,5÷2,5; нистатин – 1,5÷2,5; кремнийорганический глицерогидрогель – остальное до 100.