Способ повышения безопасности и эффективности хранения и транспортировки трансплантируемого органа под давлением консервирующей газовой смеси и устройство на его основе Российский патент 2019 года по МПК A01N1/02 

Изобретение относится к области трансплантологии и медицинской техники и может быть использовано при хранении и транспортировке трансплантируемого органа для поддержания его жизнеспособности в целях последующей трансплантации.

Пересадка органов, в том числе сердца, является одной из сложных и актуальных медико-биологических проблем. Ежегодно в мире выполняется около 100 тысяч трансплантаций органов и более 3800 трансплантаций сердца (по данным регистра Международного общества трансплантации сердца и легких, ISHLT). Дальнейшее расширение применения трансплантации органов в медицине сдерживает ряд причин, одна из которых - проблема обеспечения длительного хранения органа. Рекомендованные сроки хранения почечного, печеночного и сердечного трансплантата составляют соответственно 16-24, 12 и 4 часа. Среди органов, для которых разработаны способы трансплантации, в период отключения от кровотока наиболее остро и быстро повреждается сердце. В отдельных ситуациях для сердечных трансплантатов этот срок может быть пролонгирован, но не более, чем до 6 часов («Трансплантация сердца» Национальные клинические рекомендации»). При таких сроках хранения не может осуществляться эффективная логистика. В последнее десятилетие различными исследователями были получены данные о возможности пролонгировать длительность хранения органов под воздействием монооксида углерода (угарного газа). Монооксид углерода - токсичный газ, который обладает высокой афинностью к гемоглобину, благодаря чему в высоких концентрациях блокирует доставку кислорода кровью к тканям организма. Одновременно с этим монооксид углерода является важнейшей эндогенной молекулой, относящейся к тканевым газовым мессенджерам. Монооксид углерода в небольших концентрациях продуцируется в организме гемоксигеназой при расщеплении протогема IX. Данная молекула обладает высокой реакционной способностью и играет важную роль в регуляции различных физиологических и патологических реакций. Показано, что насыщение организма доноров и/или реципиентов малыми дозами экзогенного монооксида углерода с помощью ингаляции снижает негативный эффект ишемии-реперфузии трансплантатов при пересадке органов (Nakao A, Choi AM, Murase N. Protective effect of carbon monoxide in transplantation. J Cell Mol Med. 2006 Jul-Sep; 10(3):650-71). Ряд авторов показал, что монооксид углерода способствует сохранению жизнеспособности и качеству трансплантатов при применении ex vivo. Для этого при хранении трансплантатов осуществляют хранение органов в газовой атмосфере, содержащей монооксид углерода в разных концентрациях (Zhou PY, Zhang Z, Guo YL, Xiao ZZ, Zhu P, Mai MJ, Zheng SY. Protective Effect of Antiapoptosis Potency of Prolonged Preservation by Desiccation Using High-Pressure Carbon Monoxide on Isolated Rabbit Hearts. Transplant Proc. 2015 Nov; 47(9):2746-51. doi: 10.1016/j.transproceed.2015.09.040.).

Сохранение жизнеспособности и функциональной состоятельности донорских органов является крайне актуальной задачей. Известно много устройств для транспортировки донорских органов. В последнее время наиболее активно стали применяться системы и устройства для поддержания органа в работоспособном состоянии до имплантации с использованием аппаратов для перфузии органов с применением реагентов насыщенных газами (US 9756849 В2, 12.09.2017), перфузионных устройств для транспортировки с каналами для циркуляции жидкости и/или газа через контейнер (US 8993225 В2, 31.03.2015), устройств для перфузии органа с точной настройкой давления перфузионных реагентов (US 8962303 В2, 24.02.2015). Для повышения эффективности трансплантации используют подачу в камеру перфузионного устройства с транспортируемым органом разных типов газов или их комбинаций, например, комбинации кислорода и углекислого газа (US 20150017627 А1, 15.01.2015 и US 2010330547 А1, 30.12.2010). Во всех упомянутых исследованиях авторы свидетельствуют о повышении жизнеспособности органов после хранения. Одним из эффективных способов для пролонгации хранения почки и сердца оказался способ хранения трансплантатов в атмосфере смеси монооксида углерода с кислородом под повышенным давлением (Hatayama N. et al. Preservation by desiccation of isolated rat hearts for 48 hours using carbon monoxide and oxygen, Cell Transplant, 2012, 21(2-3):609-15, doi: 10.3727/096368911X605547; Abe T. et al. High-pressure carbon monoxide preserves rat kidney grafts from apoptosis and inflammation, Lab Invest., 2017 Apr, 97(4):468-477, doi: 10.1038/labinvest.2016.157).

Наиболее близким аналогом заявленного способа хранения и транспортировки трансплантируемого органа является способ хранения трансплантатов в атмосфере смеси монооксида углерода с кислородом под повышенным давлением, известный из WO 2010049996 А1, 06.05.2010, согласно которому орган изолируют стандартным способом, для удаления крови из сосудов проводят перфузию органа физиологическим раствором Кребса-Хенселяйта, раствором Университета Висконсин или аналогами с добавлением антитромботических препаратов, одновременно охлаждая орган до температуры 2-10°С. В случае применения простого физиологического раствора на последнем этапе перфузии меняют его на кардиоплегический раствор для торможения сердечных сокращений. Затем прекращают перфузию, не осушая сосудов органа, и помещают орган в камеру, в которой поддерживаются следующие условия: температура 2-10°С, влажность 50-95%, атмосфера газообразных кислорода и монооксида углерода с давлением кислорода от 1,3 до 5,0 атм и монооксида углерода от 0,3 до 5,0 атм. После хранения орган погружают в физиологический раствор, дополненный антитромбическими препаратами и затем имплантируют в соответствии с общепринятым способом. Такой способ позволяет сохранить сердце крысы в течение 24 часов без потери физиологических функций. В отдельных случаях сердечная деятельность восстанавливалась после 48 часов хранения органа.

Однако, в практике трансплантации органы, как правило, нужно не только хранить, но и транспортировать, зачастую на большое расстояние. Между тем, монооксид углерода (СО) является чрезвычайно токсичным газом. При концентрации монооксида углерода в атмофере 0,01% у людей проявляются симптомы отравления, концентрация 0,08-0,12% СО во вдыхаемом воздухе приводит сначала к респираторной недостаточности, затем к сердечной недостаточности и впадению в кому. Концентрация в воздухе более 0,1% приводит к смерти в течение одного часа. Способ, описанный в WO 2010049996 А1, 06.05.2010 предполагает необходимость использования дополнительных баллонов с токсичным газом СО и кислородом О₂ под высоким давлением для создания необходимой атмосферы в камере хранения органа. При транспортировке такой системы в рабочем состоянии может происходить утечка газов, что, в случае монооксида углерода, приведет к отравлению окружающей среды. Кроме того, несмотря на то, что описанный способ обладает высокой эффективностью, он не учитывает все факторы, приводящие к снижению жизнеспособности органа во время хранения. При хранении органов при температуре 2-4°С в присутствии монооксида углерода метаболизм клеток и тканей кардинально замедляется, но не останавливается. При описанном способе хранения в органах постепенно накапливаются метаболиты, в т.ч. такие как молочная кислота, мочевая кислота, арахидоновая кислота, другие жирные кислоты. Перечисленные метаболиты оказывают негативное влияние на восстановление функциональной активности сердца.

Недостатком применения известного изобретения является то, что его конструкция не позволяет безопасную транспортировку органов при применении токсичного газа, например, монооксида углерода при высоком давлении газа. Таким образом, имеется потребность усовершенствования способа хранения и транспортировки трансплантируемого охлажденного органа под давлением газовой среды и устройства на его основе с целью гарантированной безопасности, а также поддержания и восстановления функционирования трансплантатов течение возможно более длительного времени.

Изобретение направлено на решение задачи повышения безопасности и эффективности при хранении и транспортировке трансплантируемого органа при длительном поддержании его жизнеспособности.

Технический результат заключается в повышении безопасности и эффективности длительного хранения и транспортировки трансплантируемого охлажденного донорского органа в условиях использования консервирующей газовой среды, содержащей токсичный газ, при высоком давлении, а также в дистанционном оповещении обслуживающего персонала о возникновении нештатных и опасных ситуаций.

Технический результат достигается благодаря новому способу подачи газовой среды под высоким давлением к трансплантируемому органу и устройству, содержащему камеру с изменяемым объемом, которую предварительно заполняют газовой средой.

Одним аспектом настоящего изобретения является способ безопасного и эффективного хранения и транспортировки трансплантируемого охлажденного органа под давлением консервирующей газовой среды, содержащей токсичный газ. При реализации способа осуществляют подготовку органа для трансплантации к хранению путем перфузии указанного органа раствором хранения с последующим размещением трансплантата в контейнере, находящемся в корпусе устройства для перфузии, хранения и транспортировки трансплантата, при этом проводят замещение воздуха в контейнере с трансплантатом консервирующим газом или смесью консервирующих газов, содержащих токсичный газ, предварительно размещенных в камере с изменяемым объемом. Давление газов на трансплантат обеспечивают за счет вытеснения консервирующей газовой смеси из внутреннего объема камеры с изменяемым объемом посредством формирования давления на внешнюю часть указанной камеры, которая выполнена в форме камеры с эластичной оболочкой или в форме цилиндра с подвижным поршнем.

Для удаления излишков образовавшихся метаболитов возможно проведение прерывистой перфузии свежим раствором хранения через каждые 5-12 часов хранения. После размещения трансплантируемого органа в камере и создания в ней давления консервирующих газов возможно проведение одного или нескольких циклов прерывистой перфузии при температуре 2-10°С для замены раствора хранения в сосудах и полостях трансплантата.

Подготовку трансплантата к хранению проводят путем перфузии органа раствором, входящим в группу, включающую: Евро-Коллинз, раствор Кребса-Хензеляйта, Тироде, раствор университета Висконсин, Кустодиол, а также указанные растворы с добавлением антибактериальных средств, противовоспалительных средств, веществ повышающих текучесть мембран. Противовоспалительные средства вводят в раствор хранения для предотвращения накопления противовоспалительных простагландинов, цитокинов и др. факторов. Вещества, повышающие текучесть клеточной и митохондриальной мембран, вводят в раствор хранения для снижения нарушения метаболических цепей в условиях низкой температуры. Антитромботическое средство выбирают из группы, состоящей из: гепарина, варфарина. Антибактериальное средство выбирают из группы, состоящей из: цефалозина, цефтриаксона, гентомицина, пенициллина G. Противовоспалительное средство выбирают из группы, состоящей из: дексаметазона, миноциклина, индометацина, ибупрофена. Компоненты, повышающие текучесть мембран, выбирают из группы, состоящей из: диметилсульфоксида (ДМСО), этиленгликоля, пропиленгликоля, глицерина. При этом указанные дополнительные средства выбирают из ДМСО 0,5 об. %, дексаметазон 16 мкг/мл и цефалозин 0,1 мг/мл.

Консервирующие газы, подаваемые во внутренний объем контейнера с органом, выбраны из группы, состоящей из: кислорода, монооксида углерода, инертного газа, сероводорода, а также их комбинаций. Давление консервирующей газовой смеси находится в пределах от 1 до 10 атм, предпочтительно от 2 до 7 атм.

Соотношение в составе смеси консервирующих газов монооксида углерода и кислорода лежит в диапазоне от 10/1 до 1/10, предпочтительно 4/3.

Давление на внешнюю часть камеры с изменяемым объемом создают за счет давления воздуха внутри корпуса, в котором расположены контейнер с органом и камера с изменяемым объемом, которое создают с помощью внешнего компрессора, использующего окружающий воздух.

В процессе хранения органа для трансплантации обеспечивают возможность смены растворов для перфузии указанного органа. При этом смену растворов для перфузии органа осуществляют за счет подачи давления воздуха мини-компрессором во внутренний объем выбранного резервуара с раствором для перфузии.

Температура хранения составляет 2-10°С, предпочтительно 2-4°С.

Другим аспектом изобретения является мобильное устройство для перфузии, хранения и транспортировки трансплантата в консервирующей газовой среде, содержащей токсичный газ, с возможностью защиты окружающей среды от утечек токсичного газа, содержащее термостат, корпус с контейнером, в котором размещен трансплантируемый орган, датчики давления и температуры. В корпусе устройства также размещена система перфузии, включающая N резервуаров, содержащих растворы для перфузии или хранения органа, при этом входы резервуаров через воздушные краны и воздушный разветвитель подключены к выходу миникомпрессора с возможностью вытеснения выбранного раствора из объема резервуара, а выходы резервуаров подключены ко входам жидкостного разветвителя, выход которого подключен к пружинному клапану с возможностью подачи выбранного раствора на трансплантируемый орган. Устройство дополнительно содержит камеру с изменяемым объемом, выполненную с возможностью предварительного размещения в ней консервирующей газовой среды, содержащей токсичный газ. Воздушный выход камеры с изменяемым объемом через воздушный кран подключен к воздушному входу контейнера с трансплантатом, причем давление газов на трансплантат обеспечивают за счет формирования внешнего давления на внешнюю оболочку камеры с изменяемым объемом. Устройство также содержит тележку, на которой размещены термостат, в котором установлен корпус с контейнером, блок управления, аккумулятор, а также внешний компрессор, выход которого подключен к внутреннему объему корпуса с возможностью создания давления внутри корпуса. На вход блока управления поступают сигналы от датчика температуры и датчика давления, размещенных внутри корпуса, причем блок управления контролирует переключение кранов, работу мини-компрессора, обрабатывает сигналы от датчиков по программе, размещенной в запоминающем устройстве блока, с возможностью подачи аварийных сигналов.

Любой узел устройства, контактирующий с растворами для промывок или перфузии и контактирующий с частями трансплантируемого органа, выполнен из биологически совместимых материалов. Коммуникации между резервуарами 6, жидкостным разветвителем 10 и кранами 9 предпочтительно выполнять из гибкого материала, например, силиконовых шлангов.

Для сохранения транспортируемого органа используют консервирующие газы, выбранные из группы, состоящей из: кислорода, двуокиси углерода, монооксида углерода, сероводорода, инертного газа, а также их комбинаций. Предпочтительно используют комбинацию монооксида углерода и кислорода.

Камера с изменяемым объемом выполнена в форме камеры с эластичной оболочкой, или в форме цилиндра с подвижным поршнем. Материал, из которого выполнена камера с изменяемым объемом, выбран из резины, пластмассы, силиконовых полимеров, таких как полидиметилсилоксан (PDMS), полиметилметакрилат (РММА), поливинилхлорид (PVC), а также Tygon®. Соотношение объема камеры с изменяемым объемом и объема контейнера для трансплантата составляет от 6/1 до 10/1, в зависимости от рабочего давления. Материал, из которого выполнен контейнер для трансплантата, выбран из группы, состоящей из полиэтилена, полипропилена, поликарбоната.

Количество резервуаров, содержащих растворы для промывки или перфузии органа, составляет от 1 до 10, предпочтительно от 1 до 6.

Блок управления дополнительно включает узел передачи сигналов для бесконтактной передачи данных о параметрах температуры, давления, уровня питающего напряжения, сигнала об аварийной ситуации или прекращения работы. При этом данные от блока управления передаются, по меньшей мере, через один протокол передачи данных, входящий в группу, состоящую из: мобильного (GSM), беспроводного, инфракрасного, оптического, радиочастотного.

В процессе разработки мобильного устройства для транспортировки трансплантируемого органа основное внимание было уделено защите окружающей среды и операторов от воздействия токсичных газов, которые могут входить в состав консервирующей газовой смеси, размещенной в контейнере с транспортируемым органом. Было обнаружено, что применение в составе устройства камеры с изменяемым объемом, предварительно заполненной смесью консервирующих газов, в которую входит и токсичный газ, дает возможность обеспечения защиты. При этом выход для газовой смеси из камеры с изменяемым объемом подключен через воздушный кран на вход контейнера, в котором размещен орган. Это дает возможность исключить попадание токсичного газа в окружающую среду и позволяет транспортировать устройство для перфузии и хранения органа в воздушных и наземных транспортных средствах.

На фиг. 1 изображена структурная схема предложенного устройства для перфузии, хранения и транспортировки трансплантата в консервирующей газовой среде, содержащей токсичный газ.

На фиг. 2 изображена структурная схема системы для перфузии органа.

Устройство состоит из следующих основных узлов: блока управления 1, термостата 2, корпуса 3 с крышкой, контейнера 4, в котором размещен трансплантируемый орган 5, по меньшей мере, одного жидкостного резервуара 6 входящего в систему подготовки растворов для перфузии и хранения 7, воздушного разветвителя 8, воздушных кранов 9, выпускных воздушных кранов 19, 20, жидкостного разветвителя 10, пружинного клапана 11, мини-компрессора 12, жидкостного сборника 13, камеры с изменяемым объемом 14, воздушного разъема 15 и воздушного крана 16. В состав устройства дополнительно входят: тележка 21, на которой размещают термостат 2, аккумулятор 17, внешний компрессор 18.

Устройство работает следующим образом. На блоке управления 1, который закреплен на внешней части термостата 2, оператор устанавливает параметры температуры внутри объема корпуса 3 в диапазоне от +2 до +6°С и величину давления, которое система управления будет формировать в объеме контейнера 4, в котором размещен трансплантируемый орган 5. После установки температуры хранения транспортируемого органа открывается кран 19, выход камеры с изменяемым объемом 14 через разъем 15 и воздушный кран 16 присоединяется к воздушному входу контейнера 4 и осуществляется продувка контейнера 4 путем замещения воздуха в контейнере газом или смесью газов, выходящих из камеры с изменяемым объемом 14. После продувки воздушный кран 19 закрывается, и осуществляется установка выбранного уровня давления смесью газов внутри контейнера 4 с органом 5 за счет формирования внешнего давления на внешнюю оболочку камеры с изменяемым объемом 14. При этом давление на внешнюю оболочку камеры создается за счет нагнетания внешнего воздуха с помощью внешнего компрессора 18 внутри корпуса 3, в котором расположены контейнер 4 с органом 5 и камера с изменяемым объемом 14.

Над контейнером 4 размещена система 7 для перфузии органа 5. Система включает N резервуаров 6 содержащих растворы для промывки и последующей перфузии органа 5. Ко входам резервуаров 6 подключены трехходовые краны 9, вход которых подключен к выходам воздушного разветвителя 8. Вход разветвителя 8 присоединен к мини-компрессору 12, создающему воздушное давление внутри выбранного объема резервуара 6. С выходов резервуаров 6 через жидкостной разветвитель 10, выход которого снабжен пружинным клапаном 11, растворы, размещенные в резервуарах 6, через жидкостные коммуникации попадают на орган 5. Капли раствора с нижней части органа падают в сборник 13.

Термостат 2 размещен на тележке 21, на которой дополнительно размещены аккумулятор 17, внешний компрессор 18, выход которого подключен к внутреннему объему корпуса 3. Блок управления 1 управляет переключением кранов и работой мини-компрессора 12 по программе, размещенной в запоминающем устройстве блока управления. На вход блока поступают сигналы от датчика температуры 22 и датчика давления 23, размещенных внутри корпуса 3.

В случае внезапной остановки работы компрессора или превышения температуры в корпусе термостата программа управления работой устройства вырабатывает сигнал оповещения 24, который выводится на дисплей 25 блока управления 1 и в случае выбора режима работы формируется звуковой сигнал оповещения об аварийной ситуации или о прекращении нормального режима работы.

В процессе хранения органа возможна смена растворов для перфузии органа. При этом по программе переключаются воздушные краны 9 и через жидкостной разветвитель 10 под давлением мини-компрессора 12 из выбранного по программе резервуара поступает очередной раствор для перфузии органа 5.

После доставки органа на операцию осуществляется декомпрессия. При этом давление сбрасывается при срабатывании воздушного крана 20, переключении кранов 9 на открытие выходов 26. Далее осуществляют последующую промывку органа 5 тем раствором, который улучшает приживаемость органа.

При открывании крана 20 и декомпрессии давления внутри корпуса 3 большая часть газа содержащегося в объеме контейнера 4 возвращается в объем камеры с изменяемым объемом 14. Тем самым снижается выход токсичного газа, например, смеси оксида углерода и кислорода в окружающую среду. Предпочтительно обеспечивать работу термостата в диапазоне от +2 до +6°С. Предпочтительно чтобы соотношение объема камеры с изменяемым объемом 14 и объема контейнера 4 составляло от 6/1 до 10/1, в зависимости от рабочего давления.

В некоторых вариантах выполнения блока управления устройством оно может быть остановлено и/или запущено вручную пользователем. Пользователь может активировать автоматическую работу устройства после устранения аварийной ситуации. Датчики температуры 22 и давления 23 соединены с процессором, размещенным в блоке управления 1. Передача данных о контролируемых параметрах устройства не ограничивается выводом на дисплей 25 блока управления. Данные могут быть переданы по системам беспроводной связи на удаленные системы контроля процесса транспортировки с использованием, например, включая, но не ограничиваясь, мобильным телефоном или подобными внешними устройствами.

Примеры.

Пример 1. Хранение сердца под давлением смеси газов (Р_СО=4 атм, Р_О2=3 атм) в течение 24 часов в безопасной камере по изобретению с определением жизнеспособности сердца in vitro.

В эксперименте использовали группу из четырех крыс, самцов линии Вистар, весом 210-230 гр.

Для обездвиживания и анестезии крысам подкожно вводили 0,8 мл раствора ксилазина (20 мг/мл) и спустя 10 минут 0,2 мл раствора золазепама гидрохлорида (100 мг/мл). По достижении состояния полного наркоза крысу помещали на рабочую поверхность под микроскоп Leika EZ4D. На первом этапе производили продольный разрез кожных покровов и передней стенки живота. Кишечник отводили в сторону и обнажали нижнюю полую вену. Инсулиновым шприцом в вену вводили 1 мл раствора гепарина (5000 МЕ/мл). Спустя одну минуту проводили разрез грудной клетки (стернотомия), края грудины разводили с помощью ранорасширителя с кремальерой. С сердца пинцетами удаляли перикард и накладывали лигатуры на нижнюю и верхнюю полые вены. На восходящую аорту накладывали микрохирургическую клипсу, затем прокачивали через сердце 20-30 мл охлажденного до 2°С раствора Тироде с добавлением гепарина (2 Ед/мл), одновременно поливая сердце охлажденным раствором для достижения холодовой кардиоплегии, после достижения кардиоплегии дополнительно прокачивали 5 мл раствора хранения. В данном эксперименте в качестве раствора хранения использовали раствор Тироде с добавлением 0,1 мг/мл цефтриаксона. Затем пересекали, дистально от наложенных лигатур, нижнюю и верхнюю полые вены. Пересекали восходящую аорту и легочный ствол. Далее пинцетом сердце оттягивали вентрально и подводили лигатуру под легочные вены, после ее затягивания сердце выделяли и помещали в чашку Петри, наполненную раствором хранения с температурой 4°С на салфетку, смоченную кустодиолом. Для облегчения последующей оценки жизнеспособности сердца in vitro, сразу вводили канулю в аорту и накладывали лигатуру для фиксации.

В таком виде сердце вынимали из раствора (сосуды остаются заполненными раствором хранения) и помещали сердце в контейнер 4 (фиг. 1), предварительно охлажденный до 4°С. Контейнер заполняли газовой смесью СО и О₂ в соотношении 4:3 и создавали рабочее давление 7 атм. В контейнере поддерживали влажность 95-100%. Температура хранения составляла 4°С.

После хранения в течение 24 часов постепенно, в течение 8 минут, снижали рабочее давление в контейнере до атмосферного. Затем сердце вынимали из контейнера и помещали на установку для ретроградной перфузии для оценки жизнеспособности. Давление перфузии поддерживали на уровне 60 мм. рт. столба. Сердце перфузировали раствором Тироде физиологической температуры (37°С).

В ходе эксперимента наблюдали возобновление сердечных сокращений в течение 2-4 минут после разогрева. Через 1-6 минут после начала сердечных сокращений устанавливался регулярный сердечный ритм, наблюдались только редкие нарушения сердечного ритма с последующим восстановлением. Сократительную активность проявляли как предсердия, так и желудочек. Частота сердечных сокращений в среднем составила 99±6 сокращений/мин. Для сравнения нативное сердце крысы в идентичных условиях (перфузия под давлением 60 мм. рт. столба раствором Тироде) составила 98±5 сокращений/мин. Жизнеспособность сердец в данном эксперименте не отличалась от жизнеспособности сердец, сохраняемых в аналогичных условиях в традиционной установке для создания газовой атмосферы, представленной в примере 3.

Пример 2. Хранение сердца под давлением смеси газов (Р_СО=4 атм, Р_О2=3 атм) в течение 24 часов в безопасной камере с определением жизнеспособности сердца in vivo.

В эксперименте использовали четырех крыс самцов линии Вистар весом 210-230 грамм (2 крысы в качестве доноров, 2 крысы в качестве реципиентов). Сердце выделяли и хранили аналогично примеру 1. Жизнеспособность сердец определяли способом гетеротопической трансплантации.

Для проведения гетеротопической трансплантации животных обездвиживали. Для обездвиживания и анестезии крысам подкожно вводили 0,8 мл раствора ксилазина (20 мг/мл) и спустя 10 минут 0,2 мл раствора золазепама гидрохлорида (100 мг/мл). По достижении состояния полного наркоза крысу помещали на рабочую поверхность под микроскоп Leika EZ4D. Производили разрез кожных покровов и передней стенки живота (продольная лапаротомия). Кишечник выводили на салфетку, смоченную раствором 0.9% NaCl, в верхний правый (от оператора) угол живота, в рану вводили ранорасширитель с кремальерой. В процессе операции кишечник смачивали раствором NaCl. Далее микрохирургическими пинцетами мобилизовали нижнюю полую вену и брюшную аорту, накладывали лигатуры на поясничные вены в области пересадки. Инсулиновым шприцом в вену вводили 1 мл раствора гепарина (5000 Ед./мл). Затем накладывали два сосудистых зажима (клипсы) на полую вену и брюшную аорту, ограничивая участок для трансплантации.

Инсулиновой иглой производили прокол аорты реципиента, далее микрохирургическими ножницами делали продольный разрез сосудов. Сосуды промывали раствором гепарина. После помещения сердца в брюшную полость первым накладывали анастомоз (конец в бок), между брюшной аортой (реципиент) и восходящей аортой (сердце), вторым между нижней полой веной (реципиент) и легочным стволом (сердце). Во время операции сердце смачивали раствором Кустодиол с температурой 4°С. По завершении наложения анастомозов, убирали зажимы с сосудов. При наличии кровопотери проводили дополнительную процедуру по локализации и устранению дефектов сосудов. На последнем этапе операции после успешного запуска сердца в брюшную полость возвращали кишечник. После зашивания брюшной раны животное помещали в теплое место, для выхода из наркоза. При необходимости, для лучшего выхода из наркоза животным вводили препарат адреналина и кордиамина.

Работу трансплантированного сердца прослеживали в течение 7 дней после пересадки. Наличие сердцебиений определяли пальпацией сквозь брюшную стенку.

В результате эксперимента два трансплантированных сердца возобновили сокращения через 2-5 минут после возобновления кровотока. Наличие сердцебиений в области гетеротопической трансплантации отмечали весь срок наблюдения за животными (7 дней).

Пример 3. Хранение сердца под давлением смеси газов (Р_СО=4 атм, Р_О2=3 атм) в течение 24 часов с определением жизнеспособности сердца in vitro.

В эксперименте использовали 4 сердца. Хранение сердца под давлением смеси газов проводят аналогично примеру 1, за исключением того, что хранение сердца в газовой атмосфере осуществляли в камере, конструкция которой описана в международной заявке WO 2010049996 А1, 06.05.2010. Конструкция камеры представляет собой запирающуюся герметичную емкость, выполненную из нержавеющей стали и снабженную вентилями и кронштейном для крепления сердца крысы в подвешенном состоянии. Необходимое давление газов создается подачей газов под давлением из газовых баллонов через редуктор. Давление контролируется встроенным в камеру манометром. Для создания влажной атмосферы, предохраняющей сердце от высыхания во время хранения, на дно камеры наливают раствор Рингера.

В процессе эксперимента наблюдается возобновление сердечных сокращений в течение 2-4 минут после разогрева. Через 1-6 минут после начала сердечных сокращений устанавливался регулярный сердечный ритм, наблюдали только редкие нарушения сердечного ритма с последующим восстановлением. Сократительную активность проявляли как предсердия, так и желудочек. Частота сердечных сокращений в среднем составила 101±5 сокращений/мин. Для сравнения частота сокращений нативного сердца крысы в идентичных условиях (перфузия под давлением 60 мм. рт. столба раствором Тироде) составила 98±5 сокращений/мин.

Пример 4. Хранение сердца под давлением смеси газов (Р_СО=4 атм, Р_О2=3 атм) в течение 40 часов в растворе Евро-Коллинз.

Аналогично примеру 1, за исключением того, что в качестве раствора хранения использовали раствор Евро-Коллинз с добавлением антибиотика цефалозина (0,1 мг/мл). В эксперименте использовали 4 сердца.

В результате эксперимента из четырех сердец, использованных в эксперименте, у трех сердец восстановились сердечные сокращения в течение 10 минут после возвращения к физиологической температуре. При этом у одного сердца наблюдали только слабые не ритмичные сокращения. У двух сердец были зафиксированы средние сокращения с нарушением ритма сердечной деятельности, Частота сердечных сокращений в среднем составила 75±10 сокращений/мин. У одного из экспериментальных сердец не было зафиксировано восстановления сердечных сокращений.

Пример 5. Хранение сердца под давлением смеси газов (Р_CO=4 атм, Р_О2=3 атм) в течение 40 часов в растворе Евро-Коллинз с ДМСО, дексаметазоном и цефалозином.

Аналогично примеру 4, за исключением того, что в качестве раствора хранения использовали раствор Евро-Коллинз, с добавлением ДМСО (0,5 об. %), дексаметазона (16 мкг/мл) и цефалозина (0,1 мг/мл). В эксперименте использовали 5 сердец.

В эксперименте наблюдали возобновление сердечных сокращений в течение 3-9 минут после разогрева. Через 2-6 минут после начала сердечных сокращений устанавливался регулярный сердечный ритм, наблюдали только редкие нарушения сердечного ритма с последующим восстановлением. Сократительную активность проявляли как предсердия, так и желудочек. Частота сердечных сокращений в среднем составила 95±6 сокращений/мин.

При проведении сравнения результатов эксперимента с примером 4 видно, что добавление в раствор хранения ДМСО (0,5 об. %) и дексаметазона (16 мкг/мл) существенно улучшило сохранность сердец после хранения в атмосфере монооксида углерода и кислорода в течение 40 часов.

Пример 6. Хранение сердца под давлением смеси газов (Р_CO=4 атм, Р_О2=3 атм.) в течение 30 часов в безопасной камере по изобретению с проведением однократной прерывистой перфузии для замены раствора хранения.

Аналогично примеру 1 за исключением того, что орган хранили в течение 30 часов и в процессе хранения под давлением газовой смеси осуществляли замену раствора хранения методом прерывистой перфузии. Перфузию проводили через 15 часов хранения в течение 10 минут. В эксперименте использовали 2 сердца.

В эксперименте наблюдали возобновление сердечных сокращений у обоих сердец течение 4-9 минут после разогрева. Через 4-5 минут после начала сердечных сокращений устанавливался регулярный сердечный ритм, наблюдали только редкие нарушения сердечного ритма с последующим восстановлением. Сократительную активность проявляли как предсердия, так и желудочки. У желудочков несколько чаще наблюдали нарушения сердечного ритма, чем у предсердий. Частота сердечных сокращений в среднем составила 92±8 сокращений/мин.

Пример 7. Хранение сердца свиньи под давлением смеси газов (Р_CO=4 атм, Р_О2=3 атм) в течение 20 часов в безопасной камере по изобретению с определением жизнеспособности сердца in vitro.

В эксперименте использовали хряка породы вьетнамская вислоухая мини-свинья весом 30 кг (1 животное). Для обездвиживания и анестезии вводили 1,5 мл препарата Ксила (20 мг ксилазина на 1 мл раствора) внутримышечно в область бедра. Спустя 15-20 минут производили повторное введение препарата Ксила в дозировке 1,5 мл. Далее, в два этапа, в область бедра внутримышечно вводили 10 мл препарата Золетил (золазепама гидрохлорида 100 мг/мл) с временным промежутком 5 минут. В течение операции при необходимости проводили дополнительные инъекции Золетила.

После полного обездвиживания животное помещали на операционный стол, очищали и дезинфицировали операционное поле. Проводили правостороннюю боковую торакотомию в области V межреберья для лучшего доступа к полым венам. Скальпелем осуществляли послойное рассечение кожи, жировой клетчатки и широчайшей мышцы спины. После рассечения межреберных мышц, в грудную полость вводили реечный ранорасширитель для грудной полости. Диссектором проводили выделение основных сосудов сердца (верхней и нижней полых вен, аорты и легочного ствола). Под полые вены диссектором подводили хирургическую нить сквозь магистральную силиконовую трубку, концы нити выводятся из грудной полости. На нижнюю полую вену накладывали Z-образный шов и производили введение гепарина (300 ME на кг.) После удаления иглы шов затягивали. В аорту вводили кардиоплегическую канюлю, дистальнее сердца накладывали сосудистый зажим на аорту. После затягивания лигатур начинали подачу холодного +4°С раствора Тироде до полной остановки сердца. Одновременно сердце обкладывали льдом. После остановки сердца, накладывали сосудистый зажим на нижнюю полую вену дистальнее лигатуры, сердце выделяли из грудной полости, пересекали полые вены, аорту, легочный ствол и легочные вены. Сердце помещали в чашу с раствором Тироде, охлажденным до 4°С. Легочные и полые вены лигировали, на аорту накладывали кисет, легочный ствол и аорту перекрывали сосудистыми зажимами.

Камеру хранения предварительно охлаждали до +4°С, дно камеры заполнялась базовым раствором хранения, охлажденным до +4°С. Орган помещался на марлевый столик. Камеру плотно закрывали и продували двумя объемами смеси газов СО и О₂ в соотношении 4:3. После продувки, в течение 1,5 минут камеру наполняли той же смесью газов и подавали давление до достижения 7 атмосфер (абсолютное давление). Камеру помещали на хранение в холодильник +4°С, сроком на 20 часов.

Через 20 часов хранения камеру хранения извлекали из холодильника, производили снижение давления в камере постепенно, в течение 15 минут, газ сбрасывали в специальный мешок для газа. После разгерметизации камеры, сердце извлекали из камеры и подключали к перфузионному стенду. Перфузию осуществляли оксигенированным раствором Тироде (37°С) с добавлением 2,9 мМ глутатиона.

В ходе эксперимента наблюдали возобновление сердечных сокращений через 2 минуты после разогрева. Через 2-3 минуты после начала сердечных сокращений установился регулярный сердечный ритм. Сократительную активность проявляли как предсердия, так и желудочки. Частота сердечных сокращений составила 96 сокращений/мин (для сравнения частота сердечных сокращений нативного сердца составляла 112 сокращений/мин). В течение периода наблюдения (20 мин) нарушений сердечного ритма зафиксировано не было. После наблюдений сердце сняли с перфузионного стенда и исследовали путем иссечения. При исследовании органа обнаружена небольшая зона ишемического повреждения в области межжелудочковой перегородки, зон инфаркта не обнаружено.

Предлагаемый способ повышения безопасности и эффективности транспортировки трансплантатов и устройство для его осуществления могут быть использованы в работе центров органного донорства, отделениях реанимации и интенсивной терапии. Наиболее перспективным представляется использование данного устройства для транспортировки донорских органов для проведения трансплантации или для широкого использования в научно-исследовательских целях.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к безопасному хранению и транспортировке трансплантируемого охлажденного сердца животных под давлением консервирующей газовой среды и мобильному устройству для этого. Способ включает подготовку трансплантата к хранению посредством перфузии трансплантируемого органа, используя раствор хранения, входящий в группу: раствор Тироде с добавлением 0,1 мг/мл цефтриаксона, раствор Евро-Коллинз, с добавлением диметилсульфоксида 0,5 об.%, дексаметазона 16 мкг/мл и цефалозина 0,1 мг/мл, с последующим размещением трансплантата в контейнере, находящемся в корпусе устройства для перфузии, хранения и транспортировки трансплантата, при этом проводят замещение воздуха в контейнере с трансплантатом консервирующей газовой средой, состоящей из смеси газов СО и О₂ в соотношении 4:3, предварительно размещенной в камере с изменяемым объемом, где давление газов 7 атм на трансплантат обеспечивают за счет вытеснения консервирующей газовой среды из внутреннего объема камеры, которая выполнена в форме камеры с эластичной оболочкой или в форме цилиндра с подвижным поршнем, посредством формирования давления на внешнюю часть указанной камеры с помощью внешнего компрессора, использующего окружающий воздух. Мобильное устройство содержит корпус с контейнером, в котором размещены трансплантируемый орган, термостат, датчики давления и температуры, система перфузии, включающая N резервуаров, содержащих растворы для перфузии или хранения органа, при этом входы резервуаров через воздушные краны и воздушный разветвитель подключены к выходу мини-компрессора с возможностью вытеснения выбранного раствора из объема резервуара, а выходы резервуаров подключены ко входам жидкостного разветвителя, выход которого подключен к пружинному клапану с возможностью подачи выбранного раствора на трансплантируемый орган, причем устройство дополнительно содержит камеру с изменяемым объемом, выполненную с возможностью предварительного размещения в ней консервирующей газовой среды, воздушный выход которой через воздушный кран подключен к воздушному входу контейнера с трансплантатом, где давление газов на трансплантат обеспечивают за счет формирования внешнего давления на внешнюю оболочку камеры с изменяемым объемом, при этом устройство дополнительно содержит тележку, на которой размещены термостат, в котором установлен корпус с контейнером, блок управления, аккумулятор, внешний компрессор, выход которого подключен к внутреннему объему корпуса с возможностью создания давления внутри корпуса, где на вход блока управления поступают сигналы от датчика температуры и датчика давления, размещенных внутри корпуса, причем блок управления контролирует переключение кранов, работу мини-компрессора, обрабатывает сигналы от датчиков по программе, размещенной в запоминающем устройстве блока, с возможностью подачи аварийных сигналов. Изобретение позволяет повысить безопасность и эффективность длительного хранения и транспортировки донорского органа. 2 н. и 16 з.п. ф-лы, 2 ил., 7 пр.

1. Способ безопасного хранения и транспортировки трансплантируемого охлажденного сердца животных под давлением консервирующей газовой среды, состоящей из смеси газов СО и О₂ в соотношении 4:3, включает подготовку трансплантата к хранению посредством перфузии трансплантируемого органа, используя раствор хранения, входящий в группу: раствор Тироде с добавлением 0,1 мг/мл цефтриаксона, раствор Евро-Коллинз, с добавлением диметилсульфоксида 0,5 об.%, дексаметазона 16 мкг/мл и цефалозина 0,1 мг/мл, с последующим размещением трансплантата в контейнере, находящемся в корпусе устройства для перфузии, хранения и транспортировки трансплантата, при этом проводят замещение воздуха в контейнере с трансплантатом консервирующей газовой средой, предварительно размещенной в камере с изменяемым объемом, где давление газов 7 атм на трансплантат обеспечивают за счет вытеснения консервирующей газовой среды из внутреннего объема камеры, которая выполнена в форме камеры с эластичной оболочкой или в форме цилиндра с подвижным поршнем, посредством формирования давления на внешнюю часть указанной камеры с помощью внешнего компрессора, использующего окружающий воздух.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что после размещения трансплантируемого органа в камере и создания в ней давления газов проводят один или несколько циклов прерывистой перфузии при температуре 2-10°С для замены раствора хранения в сосудах и полостях трансплантата.

3. Способ по п. 1, где антитромботическое средство выбрано из группы, состоящей из: гепарина, варфарина.

4. Способ по п. 1, где антибактериальное средство выбрано из группы, состоящей из: цефалозина, цефтриаксона, гентомицина, пенициллина G.

5. Способ по п. 1, где противовоспалительное средство выбрано из группы, состоящей из: дексаметазона, миноциклина, индометацина, ибупрофена.

6. Способ по п. 1, где компоненты, повышающие текучесть мембран выбраны из группы, состоящей из: диметилсульфоксида, этиленгликоля, пропиленгликоля, глицерина.

7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в процессе хранения органа обеспечивают возможность смены растворов для перфузии органа.

8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что температура хранения составляет 2-10°С, предпочтительно 2-4°С.

9. Мобильное устройство для осуществления безопасного хранения и транспортировки трансплантируемого охлажденного сердца животных по способу п. 1, содержащее корпус с контейнером, в котором размещены трансплантируемый орган, термостат, датчики давления и температуры, система перфузии, включающая N резервуаров, содержащих растворы для перфузии или хранения органа, при этом входы резервуаров через воздушные краны и воздушный разветвитель подключены к выходу мини-компрессора с возможностью вытеснения выбранного раствора из объема резервуара, а выходы резервуаров подключены к входам жидкостного разветвителя, выход которого подключен к пружинному клапану с возможностью подачи выбранного раствора на трансплантируемый орган, причем устройство дополнительно содержит камеру с изменяемым объемом, выполненную с возможностью предварительного размещения в ней консервирующей газовой среды, воздушный выход которой через воздушный кран подключен к воздушному входу контейнера с трансплантатом, где давление газов на трансплантат обеспечивают за счет формирования внешнего давления на внешнюю оболочку камеры с изменяемым объемом, при этом устройство дополнительно содержит тележку, на которой размещены термостат, в котором установлен корпус с контейнером, блок управления, аккумулятор, внешний компрессор, выход которого подключен к внутреннему объему корпуса с возможностью создания давления внутри корпуса, где на вход блока управления поступают сигналы от датчика температуры и датчика давления, размещенных внутри корпуса, причем блок управления контролирует переключение кранов, работу мини-компрессора, обрабатывает сигналы от датчиков по программе, размещенной в запоминающем устройстве блока, с возможностью подачи аварийных сигналов.

10. Устройство по п. 9, отличающееся тем, что камера с изменяемым объемом выполнена в форме камеры с эластичной оболочкой, или в форме цилиндра с подвижным поршнем.

11. Устройство по п. 9, отличающееся тем, что соотношение объема камеры с изменяемым объемом и объема контейнера для трансплантата составляет от 6/1 до 10/1, в зависимости от рабочего давления.

12. Устройство по п. 9, отличающееся тем, что материал, из которого выполнен контейнер для трансплантата, выбран из группы, состоящей из полиэтилена, полипропилена, поликарбоната.

13. Устройство по п. 9, отличающееся тем, что материал, из которого выполнена камера с изменяемым объемом, выбран из резины, пластмассы, силиконовых полимеров, таких как полидиметилсилоксан (PDMS), полиметилметакрилат (РММА), поливинилхлорид (PVC), а также Tygon®.

14. Устройство по п. 9, отличающееся тем, что количество резервуаров, содержащих растворы для промывки или перфузии органа, составляет от 1 до 10.

15. Устройство по п. 14, отличающееся тем, что количество резервуаров предпочтительно составляет от 1 до 6.

16. Устройство по п. 9, отличающееся тем, что любой узел устройства, контактирующий с растворами для промывок или перфузии и контактирующий с частями трансплантируемого органа, выполнен из биологически совместимых материалов.

17. Устройство по п. 9, отличающееся тем, что блок управления дополнительно включает узел передачи сигналов для бесконтактной передачи данных о параметрах температуры, давления, уровня питающего напряжения, сигнала об аварийной ситуации или прекращения работы.

18. Устройство по п. 17, отличающееся тем, что данные от блока управления передаются по меньшей мере через один протокол передачи данных, входящий в группу, состоящую из: мобильного (GSM), беспроводного, инфракрасного, оптического, радиочастотного.