Настоящая заявка испрашивает приоритет предварительной заявки США №62/277,506, поданной 12 января 2016 г., которая включена посредством ссылки для всех целей как полностью изложенная в настоящем документе.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к антибактериальной композиции и к способу лечения стафилококковых инфекций антибактериальной композицией.
Обсуждение уровня техники
Стафилококки представляют собой род грамположительных бактерий и могут вызывать широкий ряд заболеваний у людей и животных либо посредством продукции токсина, либо посредством проникновения. Степень тяжести заболевания, обусловленного стафилококками, может находиться в диапазоне от легкой, не требующей лечения, до тяжелой и потенциально несовместимой с жизнью. Более 30 различных видов стафилококков могут вызывать инфекции у людей. Манифестации стафилококковых инфекций обычно зависят от типа инфекции, вызванной в организме. Часто встречающиеся типы инфекций включают следующие: кожные инфекции (например, фолликулит, фурункулы, импетиго, раневые инфекции, токсический эпидермальный некролиз), инфекции мягких тканей (например, пиомиозит, септический бурсит, септический артрит), синдром токсического шока, молниеносную пурпуру, эндокардит, остеомиелит, пневмонию, инфекции, связанные с протезными устройствами (например, протезами суставов и сердечных клапанов, шунтами, трансплантатами, катетерами) и инфекцию мочевыводящих путей. Лица с подавленной иммунной системой (принимающие подавляющие иммунитет лекарственные препараты или страдающие иммунодефицитами) подвержены повышенному риску развития более серьезных инфекций.
Стафилококковые инфекции обычно вызваны Staphylococcus aureus. Растут случаи возникновения инфекций, вызванные другими видами стафилококков. Например, Staphylococcus saprophyticus ответственен за вплоть до 10% неосложненных инфекций мочевыводящих путей у молодых женщин; Staphylococcus schleiferi, Staphylococcus lugdunensis и Staphylococcus haemolyticus связаны с эндокардитом нативного клапана. Коагулазоотрицательный стафилококк (CoNS) возник как клинически значимый патоген, обнаруживаемый у более 12% пациентов, госпитализированных в стационар, и являющийся подозреваемым возбудителем в составляющей вплоть до 30% доле случаев сепсиса, связанного с оказанием медицинской помощи. Кроме того, многие виды стафилококков резистентны к многим антибиотикам.
С учетом проблем, вызываемых стафилококками, существует неотложная потребность в разработке способа лечения стафилококковых инфекций, вызванных антибиотикочувствительными и антибиотикорезистентными видами стафилококков. Даже несмотря на то, что антибиотики до сих пор являются основными терапевтическими агентами для лечения таких стафилококковых инфекций, лечение, основанное на антибиотиках, характеризуется серьезными проблемами, такими как сниженный результат лечения. Поэтому для повышения эффективности лечения стафилококковых инфекций существует неотложная потребность в новом эффективном альтернативном терапевтическом агенте.
Недавно внимание авторов изобретения привлекло применение эндолизинов в качестве нового пути лечения бактериальных инфекций. Эндолизины фагов, также известные как фаговые лизины или лизины, представляют собой кодируемые бактериофагом ферменты, расщепляющие пептидогликан, которые быстро разрушают клеточную стенку бактерий и высвобождают потомство фага. В патенте США №8,232,370 описан антибактериальный белок, обладающий широким спектром бактерицидной активностьи, специфичной к Staphylococcus aureus.
Кроме того, широко описано, что эндолизины обладают видоспецифической бактерицидной активностью. Например, в публикации Future Microbiol. 2012 October; 7(10): 1147-1171, с. 1148, описано, что «важное преимущество эндолизинов перед классическими антибиотиками состоит в их высокой специфичности к определенным типам PG [пептидогликанов], что, как правило, ограничивает их антибактериальное действие представителями определенного рода, вида или даже серотипа бактерий». В публикации Applied and Environmental Microbiology, Mar. 2009, p. 1388-1394, на страницах 1388-1389 описано, что «[лизины бактериофагов] не только оказывают летальное действие в отсутствие бактериофага (вызывают лизис из ничего), но также проявляют специфичность к бактериальному хозяину, часто к конкретному роду, виду или даже подвиду в зависимости от лизина». В Applied and Evironmental Microbiology, Nov. 2002, p. 5311-5317, на странице 5311 описано, что «48 исследуемых штаммов С. perfringens были чувствительны к муреингидролазе [двойной системе лизиса бактериофага φ3626], при этом другие клостридии и бактерии, принадлежащие к другим родам, как правило, не подвергались воздействию».
Таким образом, существует потребность в разработке антибактериальных белков, обладающих антибактериальной активностью, специфичной для более одного вида стафилококков, и можно было, таким образом, лечить инфекции, вызванные множественными видами стафилококков.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящем изобретении предложен способ лечения стафилококковых инфекций. Этот способ включает введение субъекту эффективного количества антибактериальной композиции, обладающей широкой антибактериальной активностью против по меньшей мере одного или всех из следующих видов Staphylococcus: Staphylococcus arlettae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus auricularis, Staphylococcus carnosus, Staphylococcus carprae, Staphylococcus chromogenes, Staphylococcus cohnii, Staphylococcus delphini, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus equorum, Staphylococcus gallinarum, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus kloosii, Staphylococcus lentus, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus muscae, Staphylococcus pasteuri, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus warneri и Staphylococcus xylosus. Антибактериальная композиция включает в себя первый антибактериальный белок, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1, и/или второй антибактериальный белок, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2.
В одном аспекте изобретения антибактериальная композиция включает в себя 15-35 мол. % первого антибактериального белка и 55-85 мол. % второго антибактериального белка.
В другом аспекте изобретения антибактериальная композиция включает в себя 25 мол. % первого антибактериального белка и 75 мол. % второго антибактериального белка.
В другом аспекте изобретения стафилококковые инфекции представляют собой кожные инфекции, инфекции мягких тканей, синдром токсического шока, молниеносную пурпуру, эндокардит, остеомиелит, пневмонию, инфекции, связанные с протезными устройствами или инфекции мочевыводящих путей.
В другом аспекте изобретения кожные инфекции представляют собой фолликулит, фурункулы, импетиго, раневые инфекции или синдром токсического эпидермального некролиза.
В другом аспекте изобретения инфекции мягких тканей представляют собой пиомиозит, септический бурсит или септический артрит.
В другом аспекте изобретения протезные устройства представляют собой протезы суставов и сердечных клапанов, сосудистые шунты, трансплантаты или катетеры.
В настоящем изобретении предложен антибактериальный белок, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1. Антибактериальный белок обладающий широким спектром бактерицидной активности против по меньшей мере одного или всех из следующих видов Staphylococcus: Staphylococcus arlettae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus auricularis, Staphylococcus carnosus, Staphylococcus carprae, Staphylococcus chromogenes, Staphylococcus cohnii, Staphylococcus delphini, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus equorum, Staphylococcus gallinarum, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus kloosii, Staphylococcus lentus, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus muscae, Staphylococcus pasteuri, Staphylococcus saprophytics, Staphylococcus warneri и Staphylococcus xylosus.
В одном аспекте изобретения фармацевтическая композиция для лечения стафилококковых инфекций включает в себя антибактериальный белок в качестве активного ингредиента.
В настоящем изобретении предложен антибактериальный белок, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2. Этот антибактериальный белок обладающий широким спектром бактерицидной активности против по меньшей мере одного или всех из следующих видов Staphylococcus: Staphylococcus arlettae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus auricularis, Staphylococcus carnosus, Staphylococcus carprae, Staphylococcus chromogenes, Staphylococcus cohnii, Staphylococcus delphini, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus equorum, Staphylococcus gallinarum, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus kloosii, Staphylococcus lentus, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus muscae, Staphylococcus pasteuri, Staphylococcus saprophytics, Staphylococcus warneri и Staphylococcus xylosus.
В одном аспекте изобретения фармацевтическая композиция для лечения стафилококковых инфекций включает в себя антибактериальный белок в качестве активного ингредиента.
В настоящем изобретении предложена антибактериальная композиция, включающая в себя первый антибактериальный белок, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1, и второй антибактериальный белок, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2. Антибактериальная композиция обладает широким спектром бактерицидной активности против по меньшей мере одного или всех из следующих видов Staphylococcus: Staphylococcus arlettae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus auricularis, Staphylococcus carnosus, Staphylococcus carprae, Staphylococcus chromogenes, Staphylococcus cohnii, Staphylococcus delphini, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus equorum, Staphylococcus gallinarum, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus kloosii, Staphylococcus lentus, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus muscae, Staphylococcus pasteuri, Staphylococcus saprophytics, Staphylococcus warneri и Staphylococcus xylosus.
В одном аспекте изобретения антибактериальная композиция включает в себя 15-35 мол. % первого антибактериального белка и 55-85 мол. % второго антибактериального белка.
В другом аспекте изобретения антибактериальная композиция включает в себя 25 мол. % первого антибактериального белка и 75 мол. % второго антибактериального белка.
Следует понимать, что и приведенное выше общее описание, и последующее подробное описание носит иллюстративный и пояснительный характер и предназначено для обеспечения дополнительного пояснения заявленного изобретения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Сопроводительные графические материалы включены для обеспечения лучшего понимания изобретения, включены в данное описание и составляют его часть, иллюстрируют варианты осуществления изобретения и вместе с описанием служат для объяснения принципов изобретения.
В этих графических материалах:
На Фиг. 1 показан результат, демонстрирующий эффективную бактерицидную активность против Staphylococcus arlettae. (А) спот-тест на бактериальном газоне и (В) тест на снижение мутности.
На Фиг. 2 показан результат, демонстрирующий эффективную бактерицидную активность против Staphylococcus aureus. (А) спот-тест на бактериальном газоне и (В) тест на снижение мутности.
На Фиг. 3 показан результат, демонстрирующий эффективную бактерицидную активность против Staphylococcus auricularis. (А) спот-тест на бактериальном газоне и (В) тест на снижение мутности.
На Фиг. 4 показан результат, демонстрирующий эффективную бактерицидную активность против Staphylococcus carnosus. (А) спот-тест на бактериальном газоне и (В) тест на снижение мутности.
На Фиг. 5 показан результат, демонстрирующий эффективную бактерицидную активность против Staphylococcus carprae. (А) спот-тест на бактериальном газоне и (В) тест на снижение мутности.
На Фиг. 6 показан результат, демонстрирующий эффективную бактерицидную активность против Staphylococcus chromogenes. (А) спот-тест на бактериальном газоне и (В) тест на снижение мутности.
На Фиг. 7 показан результат, демонстрирующий эффективную бактерицидную активность против Staphylococcus cohnii. (А) спот-тест на бактериальном газоне и (В) тест на снижение мутности.
На Фиг. 8 показан результат, демонстрирующий эффективную бактерицидную активность против Staphylococcus delphini. (А) спот-тест на бактериальном газоне и (В) тест на снижение мутности.
На Фиг. 9 показан результат, демонстрирующий эффективную бактерицидную активность против Staphylococcus epidermidis. (А) спот-тест на бактериальном газоне и (В) тест на снижение мутности.
На Фиг. 10 показан результат, демонстрирующий эффективную бактерицидную активность против Staphylococcus equorum. (А) спот-тест на бактериальном газоне и (В) тест на снижение мутности.
На Фиг. 11 показан результат, демонстрирующий эффективную бактерицидную активность против Staphylococcus gallinarum. (А) спот-тест на бактериальном газоне и (В) тест на снижение мутности.
На Фиг. 12 показан результат, демонстрирующий эффективную бактерицидную активность против Staphylococcus haemolyticus. (А) спот-тест на бактериальном газоне и (В) тест на снижение мутности.
На Фиг. 13 показан результат, демонстрирующий эффективную бактерицидную активность против Staphylococcus hominis. (А) спот-тест на бактериальном газоне и (В) тест на снижение мутности.
На Фиг. 14 показан результат, демонстрирующий эффективную бактерицидную активность против Staphylococcus intermedius. (А) спот-тест на бактериальном газоне и (В) тест на снижение мутности.
На Фиг. 15 показан результат, демонстрирующий эффективную бактерицидную активность против Staphylococcus kloosii. (А) спот-тест на бактериальном газоне и (В) тест на снижение мутности.
На Фиг. 16 показан результат, демонстрирующий эффективную бактерицидную активность против Staphylococcus lentus. (А) спот-тест на бактериальном газоне и (В) тест на снижение мутности.
На Фиг. 17 показан результат, демонстрирующий эффективную бактерицидную активность против Staphylococcus lugdunensis. (А) спот-тест на бактериальном газоне и (В) тест на снижение мутности.
На Фиг. 18 показан результат, демонстрирующий эффективную бактерицидную активность против Staphylococcus muscae. (А) спот-тест на бактериальном газоне и (В) тест на снижение мутности.
На Фиг. 19 показан результат, демонстрирующий эффективную бактерицидную активность против Staphylococcus pasteuri. (А) спот-тест на бактериальном газоне и (В) тест на снижение мутности.
На Фиг. 20 показан результат, демонстрирующий эффективную бактерицидную активность против Staphylococcus saprophyticus. (А) спот-тест на бактериальном газоне и (В) тест на снижение мутности.
На Фиг. 21 показан результат, демонстрирующий эффективную бактерицидную активность против Staphylococcus warneri. (А) спот-тест на бактериальном газоне и (В) тест на снижение мутности.
На Фиг. 22 показан результат, демонстрирующий эффективную бактерицидную активность против Staphylococcus xylosus. (А) спот-тест на бактериальном газоне и (В) тест на снижение мутности.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЛЛЮСТРИРОВАННЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Далее приведено подробное описание вариантов осуществления изобретения со ссылкой на иллюстративные примеры и сопроводительные графические материалы.
При использовании в настоящем документе «эффективное количество» означает количество композиции (по мере применимости), достаточное для статистически значимой индукции положительного эффекта (например, улучшения состояния при кожных инфекциях, инфекциях мягких тканей и т.д.), но достаточно низкое, чтобы избежать серьезных побочных эффектов (например, неоправданной токсичности или аллергической реакции). «По меньшей мере один из следующих видов Staphylococcus» означает любой один, любые два, три, четыре, пять, шесть... вплоть до двадцати двух видов Staphylococcus, выбранных из группы, состоящей из Staphylococcus arlettae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus auricularis, Staphylococcus carnosus, Staphylococcus carprae, Staphylococcus chromogenes, Staphylococcus cohnii, Staphylococcus delphini, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus equorum, Staphylococcus gallinarum, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus kloosii, Staphylococcus lentus, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus muscae, Staphylococcus pasteuri, Staphylococcus saprophytics, Staphylococcus warneri и Staphylococcus xylosus.
Антибактериальная композиция обладает бактерицидной активностью против различных штаммов Staphylococcus и селективно индуцирует бактериолиз различных штаммов Staphylococcus и содержит в качестве активного ингредиента один или более антибактериальных белков, обладающих широким спектром бактерицидной активности (литической активности) против различных штаммов Staphylococcus.
Антибактериальные белки, обладающие широким спектром бактерицидной активности (литической активности) против различных штаммов Staphylococcus, имеют аминокислотные последовательности, представленные SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2. Антибактериальный белок, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, считают посттрансляционно модифицированной формой (т.е. с делетированным кодоном-инициатором метионина) антибактериального белка, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.
Считают, что трехмерная структура, биологическая активность и стабильность могут различаться между молекулами с метионином и без метионина на амино-конце, хотя эти молекулы, тем не менее, в остальном представляют собой один и тот же белок. Также считают, что присоединение метионина на амино-конце может вызывать повышение антигенности белка. Поэтому при промышленном применении важно установить относительно простой и эффективный способ селективного удаления такого амино-концевого метионина.
В способах решения этой проблемы на предшествующем уровне техники был предложен способ, посредством которого метионин можно было удалить путем расщепления цианогенбромидом (BrCN); однако удовлетворительного результата не получили, поскольку этот процесс не только предполагает отсутствие других остатков метионина в молекуле целевого зрелого белка, но также подвергает белок сильнодействующей химической реакции.
Преимущество антибактериальной композиции по настоящему изобретению состоит в том, что она имеет посттрансляционно модифицированную форму (т.е. с делетированным кодоном-инициатором метионина) антибактериального белка без необходимости в стадии расщепления. Не желая ограничиваться какой-либо конкретной теорией, объясняющей, почему антибактериальная композиция обладает широким спектром бактерицидной активности против определенных видов Staphylococcus, считают, что антибактериальный белок, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 (посттрансляционно модифицированная форма), вносит вклад в широкий спектр бактерицидной активности против определенных видов Staphylococcus.
Антибактериальные белки по настоящему изобретению также включают в себя их варианты, обладающие по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 99,5% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2. Идентичность аминокислотной последовательности определяют в настоящем документе как процентное содержание в последовательности-кандидате аминокислотных остатков, идентичных аминокислотным остаткам в последовательности антибактериального белка, после выравнивания последовательности в одной и той же рамке считывания и при необходимости введения гэпов для достижения максимальной идентичности последовательности в процентах, при этом какие-либо консервативные замены не рассматривают в составе идентичности последовательности.
Для определения идентичности двух аминокислотных последовательностей в процентах последовательности выравнивают в целях оптимального сравнения (например, в первую последовательность могут быть введены гэпы). Затем сравнивают аминокислоты в соответствующих положениях аминокислот. Если положение в первой последовательности занято той же аминокислотой в соответствующем положении во второй последовательности, молекулы являются идентичными в данной положении. Идентичность между двумя последовательностями в процентах зависит от числа идентичных положений, общих для этих последовательностей (т.е. % идентичности=N идентичных положений/общее N положений × 100).
Антибактериальные белки, обладающие широким спектром бактерицидной активности (литической активности) против различных штаммов Staphylococcus, характеризуются проявлением широкого спектра антибактериальной активности против одного или более штаммов Staphylococcus, включающих Staphylococcus arlettae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus auricularis, Staphylococcus carnosus, Staphylococcus carprae, Staphylococcus chromogenes, Staphylococcus cohnii, Staphylococcus delphini, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus equorum, Staphylococcus gallinarum, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus kloosii, Staphylococcus lentus, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus muscae, Staphylococcus pasteuri, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus warneri и Staphylococcus xylosus. Кроме того, эти штаммы Staphylococcus являются антибиотикочувствительными или антибиотикорезистентными штаммами Staphylococcus. Антибактериальная активность антибактериальных белков, обладающих широким спектром бактерицидной активности (литической активности) против различных штаммов Staphylococcus, не зависит от характера бактериальной антибиотикочувствительности.
Антибактериальная композиция, обладающая бактерицидной активностью против различных штаммов Staphylococcus и селективно индуцирующая бактериолиз различных штаммов Staphylococcus, включает в себя антибактериальный белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, антибактериальный белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 или их смесь. Смесь антибактериальных белков может включать в себя смесь 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 или 35 мол. % антибактериального белка, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, и 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84 или 85 мол. % антибактериального белка, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2. Предпочтительно смесь антибактериальных белков включает в себя около 25 мол. % антибактериального белка, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, и около 75 мол. % антибактериального белка, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2.
Антибактериальная композиция обладает бактерицидной активностью против различных штаммов Staphylococcus, селективно индуцирует бактериолиз различных штаммов Staphylococcus и проявляет широкий спектр антибактериальной активности против различных антибиотикочувствительных или антибиотикорезистентных штаммов Staphylococcus, включающих Staphylococcus arlettae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus auricularis, Staphylococcus carnosus, Staphylococcus carprae, Staphylococcus chromogenes, Staphylococcus cohnii, Staphylococcus delphini, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus equorum, Staphylococcus gallinarum, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus kloosii, Staphylococcus lentus, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus muscae, Staphylococcus pasteuri, Staphylococcus saprophytics, Staphylococcus warneri и Staphylococcus xylosus.
Таким образом, антибактериальная композиция эффективна в лечении инфекций, вызванных множественными штаммами Staphylococcus. Клиническая значимость композиции по настоящему изобретению состоит в том, что она сохраняет эффективность при комплексных стафилококковых инфекциях, вызванных множеством штаммов Staphylococcus.
Стафилококковые инфекции могут развиваться до заболеваний. Примерами стафилококковых инфекций и заболеваний, вызываемых Staphylococcus, являются следующие инфекции: кожные инфекции (например, фолликулит, фурункулы, импетиго, раневые инфекции, токсический эпидермальный некролиз), инфекции мягких тканей (например, пиомиозит, септический бурсит, септический артрит), синдром токсического шока, молниеносную пурпуру, эндокардит, остеомиелит, пневмонию, инфекции, связанные с протезными устройствами (например, протезами суставов и сердечных клапанов, сосудистые шунты, трансплантаты, катетеры) и инфекцию мочевыводящих путей.
Антибактериальная композиция по настоящему изобретению может дополнительно включать в себя фармацевтически приемлемое вещество, примерами которого являются без ограничений сахароза, сорбит, маннит и фосфат. Антибактериальная композиция по настоящему изобретению в дополнение к описанным выше ингредиентам может дополнительно включать в себя без ограничений эмульгаторы, суспендирующие агенты и стабилизатор.
Антибактериальную композицию по настоящему изобретению можно применять и вводить внутрь или парентерально (например, путем внутривенной, внутримышечной, подкожной, локальной или интраперитонеальной инъекции).
Эффективная дозировка фармацевтической композиции по настоящему изобретению изменяется в зависимости от лекарственной формы, пути введения, возраста, массы тела и пола животных или человека с инфекциями, вызванными Staphylococcus, от степени тяжести инфекции, рациона питания, периодичности и пути введения, выведения и чувствительности. Как правило, дозировка может быть определена опытным врачом с учетом целевого эффекта лечения.
Антибактериальную композицию по настоящему изобретению можно готовить в лекарственной форме любым способом, который может быть выполнен специалистами в данной области техники, путем использования фармацевтически приемлемого носителя и/или эксципиента в форме единичной дозы или в многодозовом контейнере. Лекарственная форма может иметь форму раствора, суспензии или эмульсии в жирорастворимой или водорастворимой среде, экстракта, порошка, гранулы, таблетки или капсулы. На этом этапе может быть дополнительно включен диспергирующий агент или стабилизатор.
В данном описании термин «лечение» или «лечить» указывает на (i) подавление инфекций, вызванных различными штаммами Staphylococcus; и (ii) ослабление инфекций, вызванных различными штаммами Staphylococcus.
Антибактериальные белки и антибактериальная композиция по настоящему изобретению отличаются от антибиотиков, являющихся стандартом лечения, по удельной активности, скорости действия, специфичности и активности против антибиотикорезистентных штаммов. В частности, быстрая и эффективная бактерицидная активность против как антибиотикочувствительных, так и против антибиотикорезистентных штаммов Staphylococcus является очень важным свойством с учетом обеспечиваемой ею клинической эффективности. В отличие от большинства антибиотиков, для проявления активности актибактериальных белков по настоящему изобретению и фармацевтической композиции, содержащей антибактериальный белок по настоящему изобретению, не требуется бактериальный метаболизм или рост, и бактериолитическая способность проявляется при контакте. Благодаря свойству быстрого бактерицидного действия антибактериальная композиция, содержащая антибактериальные белки по настоящему изобретению, хорошо приспособлена к быстрому снижению бактериальной нагрузки у инфицированных хозяев. Поэтому антибактериальные белки и антибактериальная композиция по настоящему изобретению позволяют решить проблему антибиотикорезистентности стафилококков. Кроме того, антибактериальные белки по настоящему изобретению и антибактериальная композиция по настоящему изобретению обладают высокой специфичностью к видам Staphylococcus и редко осуществляют лизис нецелевых бактерий, включая бактерии-комменсалы, что может уменьшить клинические осложнения. Как правило, при применении традиционных антибиотиков также повреждаются обычные резидентные бактерии, что вызывает различные побочные эффекты.
Практические и в настоящий момент предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения носят иллюстративный характер, как показано в приведенных ниже Примерах.
Однако при рассмотрении данного описания специалистам в данной области техники будет понятно, что в рамках сущности и объема настоящего изобретения возможны модификации и усовершенствования.
Пример 1: Приготовление антибактериальной композиции
Плазмиду, экспрессирующую антибактериальный белок по настоящему изобретению, конструировали путем традиционного субклонирования гена, кодирующего антибактериальный белок по настоящему изобретению, представленного SEQ ID NO: 3, в векторе pBAD-TOPO (Invitrogen). Клетки Escherichia coli BL21, трансформированные полученной в результате использования плазмиды в качестве хозяина-продуцента антибактериального белка по настоящему изобретению.
Экспрессию антибактериального белка по настоящему изобретению индуцировали 0,2% арабинозой при достижении клетками оптической плотности при 600 нм (OD600), равной 2,0, и впоследствии индуцированные бактериальные клетки инкубировали дополнительно в течение 10 часов при 19°С. Бактериальные клетки выделяли путем центрифугирования (6000 g в течение 20 минут), и полученный в результате остаток клеток после центрифугирования ресуспендировали в буферном растворе для лизиса [50 ммоль/л Na2HPO4 (рН 7,5), 10 ммоль/л этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), 1 ммоль/л дитиотрейтола (ДТТ)] и разрушали с помощью традиционной обработки ультразвуком в течение 5 минут (1-секундные импульсы с 3-секундными перерывами между импульсами). После центрифугирования (13000 g в течение 20 минут) супернатант извлекали и подвергали хроматографии в две стадии, содержащие ионообменную хроматографию (колонка SP с высокой скоростью потока; GE Healthcare) и гидрофобную хроматографию (колонка Toyopearl PPG-600M; Tosoh Bioscience).
В более подробном описании полученный хозяин-продуцент засевали в питательную среду ТСБ (триптиказо-соевый бульон) (гидролизат казеина, 17 г/л; гидролизат сои, 3 г/л; декстроза, 2,5 г/л; NaCl, 5 г/л; дикалийфосфат, 2,5 г/л) и проводили инкубацию при 37°С. При достижении концентрации клеток 2,0 OD600 добавляли L-арабинозу при конечной концентрации 0,2% для индукции экспрессии антибактериального белка. Клетки культивировали при 19°С в течение еще 10 часов с момента индукции. Культуральную жидкость центрифугировали при 6000 g в течение 20 минут с получением осадка клеток. Осадок суспендировали в буферном растворе 50 ммоль/л Na2HPO4 (рН 7,5), содержащем 10 ммоль/л ЭДТА и 1 ммоль/л ДТТ (10 мл буферного раствора на 1 г клеток). Клетки в суспензии разрушали с помощью традиционной обработки ультразвуком. Лизат клеток центрифугировали при 13000 g в течение 20 минут для удаления клеточного дебриса. Супернатант осадка подвергали хроматографии в две стадии, содержащие ионообменную хроматографию (буфер А: 25 ммоль/л Na2HPO4 (рН 7,5), 10 ммоль/л ЭДТА; буфер В: 25 ммоль/л Na2HPO4 (рН 7,5), 10 ммоль/л ЭДТА; 1 моль/л NaCl; буфер С: 25 ммоль/л Na2HPO4 (рН 7,5), 10 ммоль/л ЭДТА, 50 ммоль/л NaCl, 0,5% Triton Х-100; методика: нанесение пробы → 1,6 объема колонки (ОК) буфера А → 30 ОК буфера С → 20 ОК буфера А → 5 ОК 22% буфера В → элюция градиентом (20 ОК 22-100% буфера В)) и гидрофобную хроматографию (буфер А: 10 ммоль/л L-гистидина (рН 7,5), 1 моль/л NaCl; буфер В: 10 ммоль/л L-гистидина (рН 7,5), 1 моль/л мочевины; методика: нанесение пробы (проба очищена ионообменной хроматографией) → 10 ОК буфера А → элюция градиентом (10 ОК 0-100% буфера В)). Впоследствии раствор белка фильтровали через фильтр 0,2 мкм.
Для определения композиции антибактериальных белков, состоящих из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, проводили анализ в две стадии. Сначала проводили жидкостную хроматографию (ЖХ) с масс-спектрометрией (МС), используя обработанный протеазой образец белка. Раствор белка, полученный в соответствии с описанной выше методикой, подвергали обмену буфера путем центрифугирования с фильтрованием в буферный раствор 50 ммоль/л Трис-HCl (рН 7,6) и разводили до концентрации 2,5 мг/л раствором 6 моль/л мочевины. Разведенный раствор белка подвергали обработке протеазой. В качестве протеазы использовали модифицированную протеазу свиньи Glu-C степени чистоты для секвенирования (Promega, г. Мэдисон, штат Висконсин, США) и проводили обработку протеазой в соответствии с протоколом производителя. После обработки протеазой полученный раствор обработанного протеазой белка подвергали обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и квадруполь-времяпролетной масс-спектрометрии (Q-TOF-MS). Путем анализа пиков определили, что пики на ВЭЖХ и МС соответствуют пептидному фрагменту MAKTQAE, имеющему происхождение из антибактериального белка, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, и пептидному фрагменту AKTQAE, имеющему происхождение из антибактериального белка, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, на основании установленного образца расщепления протеазой и расчетов массы. Пики на ВЭЖХ и МС были дополнительно подтверждены путем сравнения с образцами пиков, полученным при использовании химически синтезированных пептидов (MAKTQAE и AKTQAE) в качестве образцов. Впоследствии определили долю в композиции антибактериального белка, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, в препарате антибактериального белка путем анализа методом обращенно-фазовой ВЭЖХ образца обработанного протеазой белка и химически синтезированных пептидов (MAKTQAE и AKTQAE), основываясь на корреляции концентрации пептида и соответствующей ей площади пика. В результате анализа, проведенного на трех партиях антибактериального белка, определили, что доля в композиции антибактериального белка, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, составляет 25, 27 и 29 мол. %, а доля в композиции антибактериального белка, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, составляет 75, 73 и 72 мол. % соответственно.
Пример 2: Приготовление фармацевтической композиции
Фармацевтическую композицию для лечения стафилококковых инфекций, содержащую антибактериальные белки по настоящему изобретению, готовили путем заменой буфера. В этом препарате использовали раствор белка, полученный в примере 1, и проводили замену буфера путем выполнения традиционной диафильтрации в буфер для лекарственной формы (1,56 г/л L-гистидина (рН 6,0), 50 г/л D-сорбита, 1,47 г/л CaCl2⋅2Н2О и 1 г/л полоксамера 188).
Пример 3: Исследование антибактериальной активности против штаммов Staphylococcus
Для оценки антибактериальной активности фармацевтической композиции по настоящему изобретению проводили тест на антибактериальную активность, используя фармацевтическую композицию, приготовленную, как описано в примере 2. Для тестирования антибактериальной активности выполняли анализ методом спот-теста на бактериальном газоне и теста на снижения мутности.
Спот-тест на бактериальном газоне выполняли, как описано ниже: на чашки Петри с ТСА (триптиказо-соевый агар; гидролизат казеина, 17 г/л; папаиновый гидролизат сои, 3 г/л; хлорид натрия, 5 г/л, агар, 15 г/л) наслаивали 2 мл культуры каждого штамма Staphylococcus (стандарт мутности по МакФарланду был равен 0,5). После высушивания на воздухе чашки инкубировали в течение ночи при 37°С. После инкубации 10 мкл разведения фармацевтической композиции, приготовленной, как описано в примере 2 (конечная концентрация антибактериального белка: 1 мкг/мл), наносили точечно на бактериальный газон, и чашки дополнительно инкубировали при 37°С в течение 30 минут. После инкубации исследовали образование чистой зоны (ореола лизиса), указывающей на бактерицидный эффект фармацевтической композиции.
Тест на снижение мутности выполняли, как описано ниже: фармацевтическую композицию, приготовленную, как описано в примере 2, добавляли к каждой суспензии штамма Staphylococcus (OD600=0,5) фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБ) 10 ммоль/л (рН 7,2) до конечной концентрации антибактериального белка 0,1 мкг/мл (в некоторых случаях также использовали 0,5 мкг/мл или 1,0 мкг/мл). Изменения плотности бактериальных клеток (OD600) регистрировали каждые 30 секунд в течение 15 минут. В результате этого эксперимента получили TOD50 (время до полулогарифмического снижения исходной концентрации жизнеспособных бактерий в минутах).
В этих экспериментах в качестве штаммов Staphylococcus использовали приведенные ниже штаммы.
Результаты представлены на Фиг. 1-22. Результаты, показанные на Фиг. 1-22, явно указывают на то, что фармацевтическая композиция по настоящему изобретению (т.е. антибактериальная композиция по настоящему изобретению или антибактериальные белки по настоящему изобретению) обладают быстрой и эффективной бактерицидной активностью против различных штаммов Staphylococcus. TOD50 фармацевтической композиции составляло менее 20 минут против всех тестируемых штаммов Staphylococcus.
В то же время исследовали антибактериальную активность фармацевтической композиции по настоящему изобретению против штаммов бактерий, отличающихся от Staphylococcus. В качестве штаммов бактерий, отличающихся от Staphylococcus, тестировали 5 штаммов Enterococcus faecalis, 5 штаммов Enterococcus faecium, 2 штамма Streptococcus mitis, 1 штамм Streptococcus uberis, 10 штаммов Escherichia coli и 7 штаммов Salmonella. В результате показали, что фармацевтическая композиция по настоящему изобретению не обладает антибактериальной активностью против тестируемых штаммов бактерий, отличающихся от Staphylococcus (таблица 2).
Таким образом, заключили, что фармацевтическая композиция по настоящему изобретению специфична к Staphylococcus и обладает широким спектром антибактериальной активности в пределах Staphylococcus, что позволяет предположить возможность применения фармацевтической композиции по настоящему изобретению в качестве терапевтического агента против стафилококковых инфекций.
Пример 4: Терапевтическое действие фармацевтической композиции на одиночную стафилококковую инфекцию
Терапевтическое действие фармацевтической композиции по настоящему изобретению на одиночные стафилококковые инфекции исследовали с помощью животной модели. В этом эксперименте в качестве модельных штаммов Staphylococcus были выбраны Staphylococcus epidermidis и Staphylococcus haemolyticus.
Для эксперимента на Staphylococcus epidermidis использовали самок мышей линии ICR [свободной от специфической патогенной микрофлоры (SPF)] с массой тела 23 г ± 20% (возраст 5 недель). Мышам в общем количестве 20, разделенным на две группы (10 мышей на группу), вводили внутривенно путем инъекции инокулят штамма Staphylococcus epidermidis CCARM 3751 (1⋅108 колониеобразующих единиц (КОЕ)/мышь). Животным одной группы (т.е. контрольной группы) вводили внутривенно только буфер для лекарственной формы (1,56 г/л L-гистидина (рН 6,0), 50 г/л D-сорбита, 1,47 г/л CaCl2⋅2H2O и 1 г/л полоксамера 188) три раза через 30 минут, 12 часов и 24 часа после контрольного заражения бактериями. Животным другой группы (т.е. экспериментальной группы) вводили внутривенно фармацевтическую композицию, приготовленную, как описано в примере 2 (доза: 25 мг/кг), три раза через 30 минут, 12 часов и 24 часа после контрольного заражения бактериями. Ежедневно регистрировали количество погибших мышей и наблюдали за клиническими признаками. Способность фармацевтической композиции по настоящему изобретению к устранению бактерий из кровотока исследовали, используя кровь, собранную через 5 дней после контрольного заражения бактериями (конечная точка эксперимента), путем традиционного подсчета колоний.
Для эксперимента на Staphylococcus haemolyticus использовали самок мышей линии ICR [свободной от специфической патогенной микрофлоры (SPF)] с массой тела 22 г ± 20% (возраст 5 недель). Мышам в общем количестве 20, разделенным на две группы (10 мышей на группу), вводили внутривенно путем инъекции инокулят штамма Staphylococcus haemolyticus CCARM 3733 (1⋅108 КОЕ/мышь). Животным одной группы (т.е. контрольной группы) вводили внутривенно только буфер для лекарственной формы (1,56 г/л L-гистидина (рН 6,0), 50 г/л D-сорбита, 1,47 г/л CaCl2⋅2H2O и 1 г/л полоксамера 188) три раза через 30 минут, 12 часов и 24 часа после контрольного заражения бактериями. Животным другой группы (т.е. экспериментальной группы) вводили внутривенно фармацевтическую композицию, приготовленную, как описано в примере 2 (доза: 25 мг/кг), три раза через 30 минут, 12 часов и 24 часа после контрольного заражения бактериями. Ежедневно регистрировали количество погибших мышей и наблюдали за клиническими признаками. Способность фармацевтической композиции по настоящему изобретению к устранению бактерий из кровотока исследовали, используя кровь, собранную через 5 дней после контрольного заражения бактериями (конечная точка эксперимента), путем традиционного подсчета колоний.
В результате наблюдали очевидные терапевтические эффекты. В двух экспериментах были показаны сходные результаты. Что касается клинических признаков, если мыши в экспериментальной группе соответсвовали норме в течение всего периода эксперимента, у мышей в контрольной группе, начиная с 2 дней после контрольного заражения бактериями, проявлялись различные клинические признаки, включающие покраснение по краю века, сниженную локомоторную активность, выпадение шерсти, птоз, пилоэрекцию и вращательные движения. В результате внутривенной инъекции фармацевтической композиции по настоящему изобретению выживаемость статистически значимо повысилась (таблица 3).
Кроме того, в результате внутривенной инъекции фармацевтической композиции по настоящему изобретению количество бактерий в крови статистически значимо уменьшилось. В сыворотке крови, собранной у мышей контрольной группы в эксперименте с Staphylococcus epidermidis, среднее арифметическое КОЕ/мл составляло более 1⋅106, а в сыворотке крови от мышей контрольной группы в эксперименте с Staphylococcus haemolyticus - более 1⋅105, при этом у мышей обеих экспериментальных групп в сыворотке крови бактериальные колонии не выявлены.
На основании описанных выше результатов подтвердили, что фармацевтическая композиция, приготовленная в соответствии с настоящим изобретением, обладала эффективностью в лечении отдельных стафилококковых инфекций. Таким образом, был сделан вывод, что фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно эффективно применять для лечения стафилококковых инфекций.
Пример 5: Терапевтическое действие фармацевтической композиции на множественную стафилококковую инфекцию
Терапевтическое действие фармацевтической композиции по настоящему изобретению на множественные стафилококковые инфекции исследовали с помощью животной модели. В этом эксперименте в качестве модельных штаммов Staphylococcus были выбраны Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus lugdunensis и Staphylococcus warneri.
Использовали самок мышей линии ICR [свободной от специфической патогенной микрофлоры (SPF)] с массой тела 23 г ± 20% (возраст 5 недель). Мышам в общем количестве 20, разделенным на две группы (10 мышей на группу), вводили внутривенно путем инъекции смешанный инокулят штаммов Staphylococcus epidermidis CCARM 3751, Staphylococcus lugdunensis CCARM 3734 и Staphylococcus warneri KCTC 3340 (ATCC 27836) (1⋅108 КОЕ каждого штамма/мышь). Животным одной группы (т.е. контрольной группы) вводили внутривенно только буфер для лекарственной формы (1,56 г/л L-гистидина (рН 6,0), 50 г/л D-сорбита, 1,47 г/л CaCl2⋅2H2O и 1 г/л полоксамера 188) три раза через 30 минут, 12 часов и 24 часа после контрольного заражения бактериями. Животным другой группы (т.е. экспериментальной группы) вводили внутривенно фармацевтическую композицию, приготовленную, как описано в примере 2 (доза: 25 мг/кг), три раза через 30 минут, 12 часов и 24 часа после контрольного заражения бактериями. Ежедневно регистрировали количество погибших мышей и наблюдали за клиническими признаками. Способность фармацевтической композиции по настоящему изобретению к устранению бактерий из кровотока исследовали, используя кровь, собранную через 5 дней после контрольного заражения бактериями (конечная точка эксперимента), путем традиционного подсчета колоний.
В результате наблюдали очевидные терапевтические эффекты. Что касается клинических признаков, если мыши в экспериментальной группе соответсвовали норме в течение всего периода эксперимента, у мышей в контрольной группе проявлялись различные клинические признаки, включающие покраснение по краю века, сниженную локомоторную активность, выпадение шерсти, птоз и пилоэрекцию. В результате внутривенной инъекции фармацевтической композиции по настоящему изобретению выживаемость статистически значимо повысилась (как показано в таблице 4).
Кроме того, в результате внутривенной инъекции фармацевтической композиции по настоящему изобретению количество бактерий в крови статистически значимо уменьшилось. В сыворотке крови, собранной у мышей контрольной группы, среднее арифметическое КОЕ/мл составляло более 1⋅106, а у мышей в экспериментальной группе бактериальных колоний не выявлено.
На основании описанных выше результатов подтвердили, что фармацевтическая композиция, приготовленная в соответствии с настоящим изобретением, обладала эффективностью в лечении множественных стафилококковых инфекций. Таким образом, был сделан вывод, что фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно эффективно применять для лечения стафилококковых инфекций.
Специалистам в данной области техники будет понятно, что концепции и конкретные воплощения, раскрытые в приведенном выше описании, можно легко использовать как основу для модификации или разработки других вариантов осуществления изобретения для осуществления тех же целей настоящего изобретения. Специалистам в данной области техники также будет понятно, что такие эквивалентные варианты осуществления не отклоняются от сущности и объема изобретения, которые представлены в прилагаемой формуле изобретения.
Специалистам в данной области техники будет очевидно, что в настоящем изобретении могут быть выполнены различные модификации и изменения без отклонения от сущности и объема изобретения. Таким образом, подразумевают, что настоящее изобретение охватывает модификации и вариации данного изобретения при условии их соответствия объему прилагаемой формулы изобретения и ее эквивалентов.
Группа изобретений относится к медицине и касается способа лечения стафилококковых инфекций, включающего введение субъекту эффективного количества антибактериальной композиции, обладающей широким спектром бактерицидной активности против по меньшей мере одного или нескольких видов Staphylococcus, где антибактериальная композиция включает в себя первый антибактериальный белок, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1, и второй антибактериальный белок, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2. Группа изобретений также касается антибактериальной композиции, содержащей первый антибактериальный белок, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1, и второй антибактериальный белок, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2. Группа изобретений обеспечивает лечение множественных стафилококковых инфекций. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 5 пр., 22 ил., 4 табл.
1. Способ лечения стафилококковых инфекций, включающий: введение субъекту эффективного количества антибактериальной композиции, обладающей широким спектром бактерицидной активности против по меньшей мере одного или всех из следующих видов Staphylococcus: Staphylococcus arlettae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus auricularis, Staphylococcus carnosus, Staphylococcus carprae, Staphylococcus chromogenes, Staphylococcus cohnii, Staphylococcus delphini, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus equorum, Staphylococcus gallinarum, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus kloosii, Staphylococcus lentus, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus muscae, Staphylococcus pasteuri, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus warneri и Staphylococcus xylosus, где антибактериальная композиция включает в себя первый антибактериальный белок, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1, и второй антибактериальный белок, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2.
2. Способ по п. 1, где антибактериальная композиция включает в себя 15–35 мол.% первого антибактериального белка и 55–85 мол.% второго антибактериального белка.
3. Способ по п. 2, где антибактериальная композиция включает в себя 25 мол.% первого антибактериального белка и 75 мол.% второго антибактериального белка.
4. Способ по п. 1, где стафилококковые инфекции представляют собой кожные инфекции, инфекции мягких тканей, синдром токсического шока, молниеносную пурпуру, эндокардит, остеомиелит, пневмонию, инфекции, связанные с протезными устройствами или инфекции мочевыводящих путей.
5. Способ по п. 4, где кожные инфекции представляют собой фолликулит, фурункулы, импетиго, раневые инфекции или синдром токсического эпидермального некролиза.
6. Способ по п. 4, где инфекции мягких тканей представляют собой пиомиозит, септический бурсит или септический артрит.
7. Способ по п. 4, где протезные устройства представляют собой протезы суставов и сердечных клапанов, сосудистые шунты, трансплантаты или катетеры.
8. Антибактериальная композиция, содержащая первый антибактериальный белок, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1, и второй антибактериальный белок, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2,
где антибактериальная композиция обладает широким спектром бактерицидной активности против по меньшей мере одного или всех из следующих видов Staphylococcus: Staphylococcus arlettae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus auricularis, Staphylococcus carnosus, Staphylococcus carprae, Staphylococcus chromogenes, Staphylococcus cohnii, Staphylococcus delphini, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus equorum, Staphylococcus gallinarum, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus kloosii, Staphylococcus lentus, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus muscae, Staphylococcus pasteuri, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus warneri и Staphylococcus xylosus.
9. Композиция по п. 8, включающая в себя 15–35 мол.% первого антибактериального белка и 55–85 мол.% второго антибактериального белка.
10. Композиция по п. 9, включающая в себя 25 мол.% первого антибактериального белка и 75 мол.% второго антибактериального белка.
| US8232370 B2, 31.07.2012 | |||
| AKASHI K., et al., Effect of N-methionine-free, bacterially synthesized recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor in a primate model.Eur J Haematol | |||
| Способ приготовления консистентных мазей | 1919 |
|
SU1990A1 |
| US2010203019 A1, 12.08.2010 | |||
| BECKERS T., et al., Analysis of a soluble mutant des-methionine interleukin-2 receptor alpha | |||
